Orientadores: Nicola Amanda Conran Zorzetto, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T05:42:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dominical_VeninaMarcela_D.pdf: 4297524 bytes, checksum: 86e7e426a479616f71a78d95e3333914 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A anemia falciforme (AF) é uma hemoglobinopatia hereditária que resulta de uma mutação no gene da globina beta. Essa mutação leva a formação de uma hemoglobina (Hb) com propriedades físico-químicas anormais, denominada HbS. A vaso-oclusão é a principal complicação aguda e a principal causa de morbidade da doença falciforme, compreendendo um processo multicelular que parece ser iniciado pela adesão de hemácias e leucócitos ao endotélio ativado, causando a obstrução vascular e isquemia tecidual. A adesão de hemácias ao endotélio contribui para a redução do fluxo sanguíneo na AF, entretanto, leucócitos também parecem exercer um papel fundamental neste processo, pois são células maiores, menos flexíveis e seu recrutamento para a microvasculatura e subsequente interação com as células circulantes sanguíneas promove a redução do fluxo sanguíneo nos vasos. Assim, investigações na dinâmica de interações heterocelulares são áreas potencialmente atrativas para pesquisa, pois elas podem contribuir para melhorar o entendimento de mecanismos de inflamação vascular e para o desenvolvimento de novos alvos terapêuticos para doenças como a AF. O objetivo deste projeto foi estudar as interações heterotípicas dos neutrófilos a plaquetas, células vermelhas e células endoteliais em células de pacientes com AF e as moléculas de adesão celular envolvidas nestas interações, utilizando uma plataforma microfluidica (quantifica adesão celular em fluxo em biochips com canais paralelos), citometria de fluxo com imagem (imagem simultânea das células obtidas pelo citômetro) e o desenvolvimento de um biochip para estudo dos processos vaso-oclusivos (para utilização na plataforma microfluídica). Sangue periférico de indivíduos saudáveis (controles) e pacientes com anemia falciforme (em uso ou não da terapia de hidroxiureia ¿ HU) foi coletado e os experimentos realizados. Observamos que células vermelhas de pacientes AF sem uso da HU aderem mais, quando em fluxo, à laminina e interagem mais aos neutrófilos autólogos aderidos ao endotélio ativado. Quando avaliada a participação das principais moléculas de adesão expressas no endotélio, E-selectina e ICAM-1, na promoção das interações de eritrócitos a neutrófilos aderidos, observamos que a duração destas interações heterotípicas, em células provenientes dos pacientes AF, é mais prolongada na presença do ligante E-selectina. Neutrófilos de pacientes com AF também circulam mais em agregados a plaquetas ou células vermelhas no sangue periférico, comparados aos neutrófilos de indivíduos saudáveis. Os reticulócitos demonstraram ser o principal tipo de eritrócito envolvido nos agregados de neutrófilos circulantes e os níveis de hemoglobina fetal correlacionaram-se inversamente à porcentagem encontrada de agregados de neutrófilo-reticulócito no sangue periférico destes pacientes. As plaquetas demonstraram papel de destaque na formação e participação nos agregados circulantes de neutrófilos a células vermelhas e experimentos utilizando anticorpos bloqueadores ou inibidor, indicaram que as moléculas de adesão P-selectina, na plaqueta, Mac-1 no neutrófilo, VLA-4 nos reticulócitos e ICAM-4 nas hemácias podem ser as responsáveis pela interação dos neutrófilos a estas células. Neutrófilos de pacientes AF também obstruíram significativamente mais os microcanais com diâmetros de 25 a 40µm do biochip desenvolvido por nós para estudar os processos vaso-oclusivos, comparados aos neutrófilos de indivíduos controle. Quando misturamos suspensões de neutrófilos a eritrócitos, observamos uma obstrução ainda maior destes microcanais. Diante destes resultados, é possível concluir que neutrófilos de pacientes AF interagem significativamente mais às células vermelhas quando aderidos ao endotélio, circulam agregados a eritrócitos e plaquetas no sangue, além de possuírem maior capacidade de obstrução in vitro em microcanais que mimetizam vênulas de pequeno calibre. A terapia com HU parece afetar apenas as interações de neutrófilo na presença do endotélio vascular. Terapias que visem à inibição das moléculas de adesão Mac-1 e P-selectina na patologia da anemia falciforme parecem ser promissoras / Abstract: Sickle cell anemia (SCA) is a hereditary hemoglobinopathy that results from a mutation in the beta globin gene. This mutation leads to the formation of an abnormal hemoglobin (Hb), known as HbS. Vaso-occlusion is the major acute complication and the major cause of morbidity in SCA; it comprises a multicellular process that appears to be initiated by the adhesion of red blood cells (RBCs) and leukocytes to the activated endothelium, causing vascular obstruction and tissue ischemia. The adhesion of sickle RBCs to the endothelium contributes to decrease blood flow; however, leukocytes also seem to play a key role in this process as these cells are bigger, less flexible and their recruitment to the microvasculature and subsequent interaction with circulating blood cells promotes reduced blood flow in vessels. Research into the dynamics of heterocellular interactions is a potentially attractive area of research, since such data may improve our understanding of the mechanisms involved in vascular inflammation and contribute to the development of new therapeutic targets in diseases such as SCA. The aim of this project was to study the heterotypic interactions of neutrophils with platelets, red cells and endothelial cells in cells from SCA individuals and the possible adhesion molecules involved in these interactions, using microfluidic techniques (cell adhesion flow in biochips with parallel channels), imaging flow cytometry (simultaneous imagery of cells acquired by flow cytometry) and the development of a biochip for the study of vaso-occlusive processes (for use in conjunction with the microfluidic platform). Peripheral blood from healthy individuals (controls) and sickle cell anemia patients (with or without hydroxyurea therapy - HU) were collected and the experiments were performed. RBCs from SCA patients without HU were observed to adhere more, under flow, to laminin-coated biochips and they interact more with autologous neutrophils previously adhered to an activated endothelium. When evaluating the participation of the two main adhesion molecules expressed on activated endothelium, E- selectin and ICAM-1, in promoting interactions of RBCs to adherent neutrophils, we found that the duration of these heterotypic interactions for cells from SCA patients was longer in the presence of E-selectin ligand. Neutrophils from SCA patients also circulate aggregated to platelets or RBCs in the peripheral blood significantly more than the neutrophils of healthy individuals. Reticulocytes were the main RBC type involved in these neutrophil-RBC aggregates and the levels of fetal hemoglobin were inversely correlated to the percentage of the neutrophil- reticulocyte aggregates found in the peripheral blood of these patients. Platelets demonstrated a prominent role in the formation of the circulating neutrophil-RBCs aggregates, and function-blocking antibodies or inhibitors indicated that the adhesion molecules P-selectin, on platelets, Mac-1, on neutrophils, VLA-4, on reticulocytes, and ICAM-4, on mature erythrocytes, may be responsible for the interactions of neutrophils with these cells. Neutrophils from SCA patients also demonstrated a significant capacity to obstruct microchannels with diameters of between 25 and 40?m, of the biochip developed by us to study vaso-occlusive processes, compared to the cells from control subjects. When mixed suspensions of neutrophils and autologous RBCs were applied to the chips, we observed an even greater obstruction of these microchannels. In summary, we conclude that SCA neutrophils interact significantly more with red cells when adhered to endothelial cells, circulate aggregated to erythrocytes in the peripheral blood of these patients, and present a greater capacity to obstruct microchannels that mimic small venules in vitro. HU therapy appears to affect only neutrophil interactions in the presence of the vascular endothelium. Therapies that target molecules such Mac-1 and P-selectin in sickle cell disease seem to be promising strategies / Doutorado / Fisiopatologia Médica / Doutora em Ciências

Orientador: Cláudia Herrera Tambeli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Teixeira_JulianaMaia_D.pdf: 23889164 bytes, checksum: c8f281ea2cb5d4c68fb62ac535731385 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa e progressiva, caracterizada pela degradação da cartilagem que reveste as extremidades ósseas e inflamação da membrana sinovial, causando incapacidade física, inchaço articular e dor. Embora o alívio da dor severa seja o principal objetivo no tratamento agudo, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos no desenvolvimento da dor na OA. Estudos demonstram a participação do ATP (adenosina 5¿-trifosfato) em processos de hiperalgesia através da ativação dos receptores purinérgicos P2X3, P2X2/3 e P2X7. Portanto, os objetivos deste estudo foram: (1) investigar a participação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 na hiperalgesia articular em modelo de artrite na articulação do joelho de ratos machos e fêmeas em estro e se há diferenças sexuais no efeito induzido pelos antagonistas de receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7. (2) testar a hipótese de que a inflamação articular induzida pela carragenina aumenta a expressão do receptor P2X3 nos condrócitos da cartilagem articular da articulação do joelho de ratos. (3) verificar se o mecanismo pelo qual a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 contribui para a hiperalgesia articular depende da liberação prévia de citocinas pró-inflamatórias e da migração de neutrófilos. (4) investigar se a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 induz hiperalgesia na articulação do joelho de ratos dependente da liberação de mediadores inflamatórios. (5) testar a hipótese de que a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 contribui para a hiperalgesia articular induzida pelos mediadores inflamatórios: bradicinina, citocinas pró-inflamatórias, PGE2 e dopamina. Para os objetivos 1, 4 e 5, a hiperalgesia articular foi quantificada através do teste de Incapacitação Articular. Para o objetivo 2, foi utilizado o ensaio de imunofluorescência. Para os objetivos 3 e 4 foram utilizados os ensaios imuno-enzimáticos ELISA e MPO. Os resultados demonstram que a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 pelo ATP endógeno é essencial para o desenvolvimento da hiperalgesia articular induzida pela carragenina na articulação do joelho de ratos machos e fêmeas em estro, que são mais sensíveis do que os machos aos efeitos anti-hiperalgésicos e anti-inflamatórios induzidos pelo antagonista de receptor P2X7. Durante a inflamação articular induzida pela carragenina ocorre um aumento na expressão dos receptores P2X3 nos condrócitos da cartilagem articular. O papel dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 na hiperalgesia articular é mediado pela sensibilização indireta dos nociceptores aferentes primários, dependente da liberação prévia de citocinas pró-inflamatórias e da migração de neutrófilos. Além disso, a ativação dos receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 induz hiperalgesia articular dependente da liberação de bradicinina, aminas simpatomiméticas, prostaglandinas e citocinas pró-inflamatórias. Finalmente, a hiperalgesia articular induzida pelos mediadores inflamatórios bradicinina, PGE2 e dopamina depende da ativação de receptores P2X3 e P2X2/3, enquanto que a ativação de receptor P2X7 contribui para a hiperalgesia articular induzida pela bradicinina e dopamina. Concluindo, os resultados apresentados sugerem que os receptores P2X3, P2X2/3 e P2X7 são alvos farmacológicos interessantes para o tratamento das doenças inflamatórias articulares como a osteoartrite. Particularmente em relação ao receptor P2X7, antagonistas seletivos podem ser usados para reduzir a dor e inflamação no joelho, especialmente em mulheres / Abstract: Osteoarthritis (OA) is a degenerative and progressive disease, characterized by cartilage breakdown which covers the bone ends and by synovial membrane inflammation, causing disability, joint swelling and pain. The relief of severe pain is the main goal of the acute treatment, but little is known about the mechanisms involved in the development of pain in OA. It has been demonstrated the role of ATP (adenosine 5'-triphosphate) in processes of hyperalgesia through activation of purinergic receptors P2X3, P2X2/3 and P2X7. Therefore, the aims of this study were: (1) to investigate the role of P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors in articular hyperalgesia in the knee joint arthritis model in males and estrus females rats and, if so, whether there are sex differences in the effect induced by the selective P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors antagonists. (2) to test the hypothesis that the carrageenan-induced articular inflammation increases the expression of P2X3 receptor in chondrocytes of articular cartilage of the knee joint. (3) to verify whether the mechanism by which the P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors activation contributes to articular hyperalgesia depends on previous pro-inflammatory cytokines release and neutrophil migration. (4) to investigate whether the P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors activation induces articular hyperalgesia in the rat¿s knee joint which depends on release of inflammatory mediators. (5) to verify whether the activation of P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors contributes to the articular hyperalgesia induced by the inflammatory mediators bradykinin, pro-inflammatory cytokines, PGE2 and dopamine. For the aims 1, 4 and 5, the articular hyperalgesia was quantified by the rat knee joint Incapacitation Test. The immuno?uorescence method was used for the aim 2. For aims 3 and 4, the ELISA and MPO immunoenzymatic assays were used. The results demonstrate that P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors activation by endogenous ATP is essential for the development of carrageenan-induced articular hyperalgesia in the knee joint of male and estrus female rats, which are more sensitive than males to anti-hyperalgesic and anti-inflammatory effects induced by the P2X7 receptor antagonist. During carrageenan-induced joint inflammation occurs an increased of P2X3 receptors expression in chondrocytes of the articular cartilage. The essential role played by P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors in the development of articular hyperalgesia is mediated by an indirect sensitization of the primary afferent nociceptors dependent on the previous pro-inflammatory cytokines release and neutrophil migration. Moreover, the P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors activation induces articular hyperalgesia which depends on bradykinin, sympathomimetic amines, prostaglandins and pro-inflammatory cytokines release. Finally, the articular hyperalgesia induced by inflammatory mediators bradykinin, PGE2 and dopamine depends on the P2X3 and P2X2/3 receptors activation, while the P2X7 receptor activation contributes to the bradykinin- and dopamine-induced articular hyperalgesia. In conclusion, our results suggest that P2X3, P2X2/3 and P2X7 receptors are interesting pharmacological targets for the treatment of inflammatory joint diseases such as osteoarthritis. In particular, selective P2X7 receptor antagonists can be used to reduce inflammation and pain in the knee joint, especially in women / Doutorado / Fisiologia / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

Orientadores: Pedro Luiz Rosalen, Severino Matias de Alencar, Hyun Koo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-19T19:12:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bueno-Silva_Bruno_D.pdf: 2632427 bytes, checksum: b52293c180ef623f98558731cc4ce2fe (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A própolis brasileira destaca-se entre os produtos naturais por ser considerada uma rica fonte para a descoberta de novos compostos bioativos. Entre as própolis brasileiras, destaca-se a vermelha (tipo 13), a qual apresentou atividade antimicrobiana, antioxidante e antitumoral, sendo que seu principal constituinte químico são as isoflavonas, diferentemente de qualquer outro tipo de própolis brasileira. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar as propriedades antibacteriana, anticárie e antiinflamatória da própolis vermelha, identificando os possíveis compostos ativos responsávelis por estas atividades biológicas. Este objetivo foi atingido por meio das seguintes metodologias: 1- fracionamento bioguiado do extrato etanólico da própolis vermelha (EEP); 2- identificação e isolamento dos compostos ativos, 3- avaliação do potencial anticárie dos compostos ativos utilizando modelos: a) in vitro de inibição de biofilme oral monoespécie nos níveis molecular, estrutural e bioquímico; b) de cárie animal submetido a um severo desafio cariogênico; e 4- avaliação das propriedades anti-inflamatórias do EEP e de seus compostos isolados. Como resultado do fracionamento bioguiado, foram isolados e identificados 2 compostos: neovestitol e vestitol. Para os testes antimicrobianos e anti-cárie foi utilizada a fração 4.2 que continha os dois compostos isolados enquanto que para os testes anti-inflamatórios os compostos foram testados separadamente. A fração inibiu o desenvolvimento de biofilme em discos de hidroxiapatita na concentração de 800 ?g/mL, através da inibição da formação dos polissacarídeos e do teor protéico. Essa inibição foi observada através de: a) análise dos dados bioquímicos (redução de 40% da quantidade de políssacarídeos e 20% da quantidade protéica); b) redução da atividade das enzimas produtoras de políssacarídeos (glucanos), as glucosiltransferases B, C e D em aproximadamente 60%; c) redução da biomassa do biofilme e espessura da matrix de políssacarídeos extracelular sem afetar a viabilidade bacteriana, observada através da análise computadorizada das imagens obtidas com o microscópio confocal laser; d) alteração da expressão de 59 genes (52 dowregulated e 6 upregulated) de S. mutans observadas por microarray, sendo que os resultados dos genes: copY, copA, copZ, sloA, gtfD e amyA foram validados por qRT-PCR. A fração com os dois compostos também foi efetiva em reduzir a incidência e severidade das lesões de cárie em estudo animal sem afetar a viabilidade bacteriana. Em relação à atividade anti-inflamatória, tanto EEP quanto neovestitol e vestitol foram capazes de reduzir a migração leucocitária no processo inflamatório assim como inibiram a produção de citocinas pró-inflamatórias. Portanto, o fracionamento bioguiado revelou-se um processo eficaz para obtenção de novos compostos bioativos e tanto o EEP quanto seus compostos isolados (neovestitol e vestitol) apresentaram atividade anti-cárie e anti-inflamatória, revelando-se compostos promissores para o desenvolvimento de novos medicamentos / Abstract: The Brazilian propolis stands out among the natural products because it is considered a rich source for discovering new bioactive compounds. Among Brazilian propolis, the red one (type 13) exhibited antimicrobial, antitumor and antioxidant activities. Moreover, the main chemical constituents are the isoflavones, which are distinctive from other types of Brazilian propolis. Therefore, this study aimed to evaluate the antibacterial, anticaries and anti-inflammatory properties of red propolis, identifying the putative active(s) compound(s) that could be responsible for the biological activities. This objective was reached through the following methods: 1 - bioassay-guided fractionation of the ethanolic extract of propolis (EEP), 2 - identification and isolation of active compounds, 3 - evaluation of the anticaries potential of active compounds using the following models: a) in vitro monospecies biofilm and analyzed in the molecular, structural and biochemical levels b) in vivo rodent model of dental caries using a severe cariogenic challenge, and 4 - evaluation of anti-inflammatory properties of EEP and isolated compounds. As a result of bioassay-guided fractionation two compounds were isolated and identified: neovestitol and vestitol. A fraction 4.2 contains mostly these two compounds, was used for antimicrobial and anti-caries evaluations. For anti-inflammatory evaluation, the compounds were tested separately. The bioactive fraction at 800 ?g/mL decreased the development of biofilm on hydroxyapatite discs, by reducing the formation of extracellular polysaccharides (EPS) and the protein content. This inhibition was observed through four different methodologies: a) analysis of biochemical data (reduction of 40% of EPS and 20% of protein content), b) reduction of approximately 60% of activity of enzymes glucosiltransferases B, C and D that produces polysaccharides (ie. Glucans), c) reduction of biofilm biomass and thickness of EPS-matrix without affecting bacterial cell viability, as determined by confocal laser microscopy and computational analysis; d) disruption of expression of 59 genes (52 upregulated and 7 dowregulated) as determined by microarray, copY, copZ, sloA, gtfD and amyA were validated by qRT-PCR. Also, fraction containing vestitol and neovestitol was effective in reducing the incidence and severity of caries in vivo without affect viability of bacterial cells. In relation to anti-inflammatory activity, EEP, neovestitol and vestitol were able to reduce leukocyte migration during inflammation process and also, inhibited pro-inflammatory cytokines release. Therefore, the bioassay-guided fractionation identified bioactive compounds, which along with EEP exhibited anti-caries and anti-inflammatory activities. The agents may be promising compounds for the development of new drugs against oral diseases / Doutorado / Farmacologia, Anestesiologia e Terapeutica / Doutor em Odontologia

Em trabalho anterior verificamos que neutrófilos oxidam o hormônio melatonina a N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina (AFMK), numa reação catalisada por mieloperoxidase e dependente de ânion superóxido. Neste trabalho acompanhamos a cinética de formação de AFMK e de seu produto de deformilação N1-acetil-5-metoxiquinuramina (AMK) quando neutrófilos foram ativados por diferentes estímulos. No sentido de obtermos informações sobre a relevância biológica destas reações, avaliamos o efeito de melatonina, AFMK e AMK sobre a formação de HOCl, sobre a liberação de citocinas pró-inflamatórias (TNF-&#945 e IL-8) e sobre a apoptose de neutrófilos. Uma forte inibição da liberação de HOCl foi observada em concentrações de melatonina igual ou superior a 0,05 mM. Embora menos efetivo, AMK também inibiu a formação de HOCl, enquanto AFMK não teve efeito. Adicionalmente mostramos que todos estes compostos inibiram a produção de TNF-α e IL-8 por neutrófilos ativados e que AFMK foi o mais potente deles. Por exemplo, enquanto 1µM de AFMK inibiu eficientemente a liberação de TNF-α, efeito similar foi obtido com melatonina apenas a partir de 1mM. O mesmo padrão de resposta foi observado na morte celular. AFMK e AMK (1mM), mas não melatonina, inibiram significativamente (aproximadamente 25%) a morte celular de neutrófilos. Nossos dados sugerem que neutrófilos são um alvo importante para AFMK e que a rota de metabolização da melatonina pode ser útil no controle da intensidade do processo inflamatório através do consumo de ERO, controle da liberação de citocinas e da sobrevida dos neutrófilos. Este conjunto de dados associados com o fato de que células mononucleares ativadas sintetizam melatonina e que o foco inflamatório é uma fonte de espécies reativas de oxigênio (ERO), levou-nos a verificar se a oxidação de melatonina ocorreria in vivo em situações inflamatórias. Para isso, analisamos amostras de liquor de pacientes com meningite viral. AFMK foi detectado em 16 das 20 amostras de liquor de pacientes com meningite viral e em nenhuma das 8 amostras controle. Das 16 amostras nas quais AFMK foi detectado, ele pôde ser quantificado em 6 (concentrações variando de 50 a 500 nM). Adicionalmente analisamos a correlação entre a presença de AFMK com alguns parâmetros inflamatórios como: celularidade, concentração de proteínas totais, TNF-α, IL-8 e IL-1β. Verificamos que todos estes parâmetros diminuíram nas amostras de liquor onde a concentração de AFMK era maior. Em conjunto, nossos resultados mostram que pelo menos parte dos efeitos antiinflamatórios descritos para melatonina pode ser originado da ação de seus produtos de oxidação. Nossos resultados contribuem significativamente para a compreensão do papel biológico da melatonina e seus produtos de oxidação na imunomodulação durante a inflamação. / In a previous study we described that activated neutrophils are able to oxidize the pineal hormone melatonin to N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK) in a reaction dependent on myeloperoxidase and superoxide anion. Here we followed the formation of AFMK and its deformylated product N1-acetil-5-metoxiquinuramina (AMK) when neutrophils were activated by different stimuli. The biological significance of this reaction has been one of our research interests, therefore we study the effect of melatonin, AFMK and AMK on the HOCl formation, on the release of pro-inflammatory cytokines (TNFα- and IL-8) and on the apoptosis process. Melatonin caused an almost complete inhibition of HOCl formation at concentrations up to 0.05 mM. Although less effective, AMK also inhibited HOCl formation, while AFMK had no effect. Additionally all the compounds assayed efficiently inhibited the production of TNF-α and IL-8 by activated neutrophils. Moreover, the inhibitory activity of AFMK was stronger than that of melatonin and could be observed already at 1µM. A significant inhibition of neutrophil death (approximately 25 %) was triggered by AFMK and AMK (1 mM) but not by melatonin. Our data suggest that neutrophils are an important target for AFMK and that the route of melatonin metabolism may be useful in controlling the intensity of the inflammatory process by the consumption of reactive oxygen species, control of cytokine production and neutrophils life span. These findings, associated with the efficient synthesis of melatonin by activated-mononuclear cells and the presence of reactive oxygen species in the inflammatory focus, led us to verify if inflammation triggers the oxidation of melatonin in vivo. In this way we analyzed the cerebrospinal fluid (CSF) of patients with meningitis. AFMK was detected in 16 CSF from 20 samples of patients with viral meningitis and in none of 8 control samples. From the 16 samples in which AFMK was detected, it was quantified in 6 (at the concentration range of 50 500 nM). We also analyzed the correlation between the presences of AFMK with some inflammatory parameters like: cellularity and concentration of total proteins, TNF-α, IL-8 and IL-1β. We verify that all these parameters were decreased in samples in which AFMK was in higher concentrations. Our results show that, at least part of the antiinflammatory effects described for melatonin is indeed caused by its oxidation product. These findings add a new insight in the comprehension of the biological role of melatonin and its oxidation products in immunomodulation and during inflammation.

Orientador : Silvia Regina Brandalise / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T08:42:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sasse_EmmaChen_M.pdf: 4520508 bytes, checksum: cde9370337d0056099ac5dae2084f075 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: RAZÕES: A mielossupressão e conseqüente neutropenia febril, causadas pela quimioterapia intensiva no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA) pediátrica são complicações graves e de alto risco. Os fatores estimuladores de colônias (FEC) são citoquinas usadas para elevar o número de neutrófilos circulantes e reduzir as complicações decorrentes da neutropenia, apesar de não haver consenso sobre seu uso em crianças na literatura. Existem alguns estudos randomizados com resultados conflitantes quanto ao benefício dos FEC nestes pacientes. A falta de dados conclusivos provenientes de estudos conflitantes exige a realização de uma revisão sistemática da literatura sobre o uso profilático dos FEC. MÉTODOS: Revisão sistemática da literatura que incluiu estudos randomizados com desenho paralelo, comparando o uso de FEC versus placebo ou observação em crianças com LLA em quimioterapia não ablativa. A pesquisa englobou bases de dados computadorizados (MEDLINE@,EMBASE@, LILACS@, CANCERLIT@,BIBLIOTECA COCHRANE@), pesquisa manual em periódicos especializados, procura pelas referências dos artigos e consulta a especialistas sobre trabalhos em andamento. A metanálise foi realizada utilizando o software Review Manager 4.1. Dados dicotômicos foram analisados usando Odds Ratio de Peto (OR) e os dados contínuos foram analisados usando a diferença ponderada entre as médias (DPM). RESULTADOS: No total, 5463 referências foram analisadas, onde treze estudos foram localizados e destes, seis estudos preencheram os critérios de inclusão com um total de trezentos e trinta e dois pacientes. Cento e sessenta e um deles foram randomizados para o grupo FEC e cento e setenta e um para o grupo controle (placebo ou observação). Na metanálise, o uso de FEC reduziu o tempo de hospitalização [DPM: -3,44, IC 95% -4,76 a -2,12; p< 0,00001], diminuiu o atraso na quimioterapia em 19% [OR=0,4, IC 95%: 0,18 a 0,89; p=0,03] e os episódios de infecção em 12% [OR= 0,46; IC 95% 0,26 a 0,82; p=0,009]. A metanálise para avaliar episódios de neutropenia febril mostrou uma tendência ao benefício do uso de FEC, mas não atingiu o nível de significância de 5% [OR=0,57; IC 95%: 0,31 a 1,05; p=0.07]. Um efeito significante para o grupo tratado com FEC foi detectado no tempo de duração de neutropenia [DPM= -3,44; IC 95%: -4,76 a -2,12; p<0,00001]. Dados sobre mortalidade global, efeitos colaterais e duração de antibioticoterapia endovenosa não puderam ser combinados na metanálise. CONCLUSÃO: O uso de FEC não traz beneficios significativos na redução de episódios de neutropenia febril em crianças com LLA em quimioterapia intensiva. Porém estes pacientes podem se beneficiar do uso de FEC reduzindo o tempo de hospitalização, diminuindo o atraso na quimioterapia e reduzindo episódios de infecção. Porém, os estudos eram de curta duração na maioria das vezes e não existe consenso quanto à dose ideal de FEC. Existe a necessidade de novos estudos controlados de longa duração para elucidar estas questões e determinar a segurança do FEC na LLA pediátrica / Abstract: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) represents about 30% of hematologic malignancies in the childhood. Chemotherapy induced febrile neutropenia in these patients is a frequent event and it is the most feared side effect as it is potentially a life threatening situation. The current treatment is supportive care plus antibiotics. Colony-stimulating factors are cytokines that stimulate and accelerate the production of one or more cellular lineages in bone marrow and some of these has been tested in clinical trials as additional therapy to prevent febrile neutropenia in children with ALL, but the results are conflicting. Systematic review will provide the most reliable assessment and the best recommendations for practice. Objectives: To evaluate the safety and effectiveness of the addition of G-CSF or GM-CSF to prevent the chemotherapy induced febrile neutropenia in children with acute lymphoblastic leukemia. Search strategy The search covered the principal electronic databases: CANCERLIT, EMBASE, LILACS, MEDLINE, SCI and The Cochrane Controlled Clinical Trials Database. Experts were consulted and references ftom the relevant articles were also scanned. Selection criteria. We searched for all Randomised Controlled Trials (RCT) that compared CSF versus placebo or no treatment prior to installation of chemotherapy-induced febrile neutropenia in children with ALL. Data collection & analysis Two of the reviewers selected, critically appraised and extracted data of the studies independently. The end points of interest were number of febrile neutropenia episodes, length of neutropenia, length of hospitalization, delay of chemotherapy, number of infections, length of antibiotics use, side effects, and mortality. A meta-analysis of these end points were performed and the results were expressed as Peto's odds ratio and for continuous outcomes we calculated a weighted mean difference and a standardized mean difference. Main results More than 5000 references were screened and 6 studies were included. The number of febrile neutropenia episodes was not influenced by the use of CSF [OR=0.57; CI 95%=0.31 to 1.05; p=0.07]. The group ofpatients treated with CSF had a shorter length of neutropenia [WMD=-3.44; CI 95%=-4.76 to -2.12; p<0.00001]but this result was highly influenced by one study. The use of CSF showed significant benefit for reducing the length of hospitalization, [WMD=-1.58; CI 95%= -3 to -0.15; p=0.03] and treatment delays [OR=0.4;CI 95%=0.18 to 0.89; p=0.03]. Conclusion Children with ALL that use CSF have a shorter length of hospitalization and less episodes of treatment delays. But a possible effect on the incidence of febrile neutropenia and the time to neutrophil recovery were not clear / Mestrado / Pediatria / Mestre em Saude da Criança e do Adolescente

Orientadores: Joyce Maria Annichino-Bizzacchi, Nicola Amanda Conran Zorzetto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T04:29:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zapponi_KiaraCristinaSenger_M.pdf: 3766938 bytes, checksum: e4531f39f9f53ff883ad33f684d56647 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Tromboembolismo venoso (TEV) é uma doença multifatorial que afeta 1-3:1000 indivíduos mundialmente. A formação do trombo venoso na superfície endotelial é um processo multicelular, de estrutura laminar composta por camadas de plaquetas, leucócitos, eritrócitos e fibrina, originando uma resposta inflamatória loco-regional. A relação entre inflamação e coagulação é bidirecional. e tem sido principalmente avaliada através de interações de proteínas entre citocinas próinflamatórias e elementos da cascata de coagulação. As células inflamatórias tais como neutrófilos, não foram previamente correlacionadas com os processos trombóticos ou pró-coagulantes. Objetivo: Avaliar as propriedades adesivas de neutrófilos, eritrócitos e plaquetas, assim como a expressão das moléculas de adesão de superfície dos neutrófilos em pacientes com TEV, correlacionando-os com marcadores sistêmicos da resposta inflamatória, presença de trombo residual e D-dímero aumentado. Pacientes e Métodos: Foram incluídos neste estudo 10 pacientes com TEV agudo atendidos no Hospital de Clínicas da Unicamp (HCUNICAMP), 30 pacientes com TEV crônico (1 a 6 anos após o evento agudo), atendidos no Hemocentro de Campinas-UNICAMP, e controles normais pareados aos pacientes por idade, gênero e etnia. A adesão de neutrófilos, eritrócitos e plaquetas foram determinados através de ensaio estático usando fibronectina (FN) e fibrinogênio (FB) como ligantes. A expressão das moléculas de adesão dos neutrófilos (CD11a, CD11b, CD18) foi avaliada por citometria de fluxo. Os níveis dos marcadores inflamatórios (IL-6, IL-8, TNF-_ e PCR) foram avaliados por ELISA e nefelometria. O trombo residual (TR) por ultrassom com Doppler e o Dímero-D (DD) por método coagulométrico. Resultados: A adesão de plaquetas ao fibrinogênio com e sem estímulo de trombina em pacientes dos grupos agudo e crônico foi semelhante ao observado nos controles normais. Da mesma forma, não houve diferença da adesão de eritrócitos à fibronectina nesses mesmos grupos analisados. No subgrupo de pacientes com alto risco de recorrência de TEV definido pela presença de altos níveis de D-dímero (>0,55mg/L) e trombo residual observou-se um aumento significativo da adesão de neutrófilos em relação aos controles (24.68% vs 19.07%, P<0.05). A atividade inflamatória também estava aumentada neste subgrupo em comparação aos outros pacientes, demonstrada pelo aumento significativo dos níveis séricos de IL-6, IL-8, TNF-_ e PCR (2.08pg/mL VS 0.90pg/mL, P=0.01; 28.72pg/mL vs 16.46pg/mL, P=0.02; 4.50pg/mL vs 2.11pg/mL, P=0.04; 0.35 pg/mL vs 0.14 pg/mL, P=0.09, respectivamente). Houve uma correlação das propriedades adesivas de neutrófilos com IL-6 (r=0.3815 e P=0.0375), e D-dímero (r=0.3831 e P=0.0367). A quantificação das proteínas de superfície (CD11a, CD11b e CD18) de neutrófilos não foi diferente entre os grupos analisados. Conclusão: Nossos resultados sugerem que pacientes com TEV não apresentam aumento das propriedades adesivas de plaquetas e eritrócitos. Entretanto, as propriedades adesivas dos neutrófilos foram aumentadas em pacientes com D-dímero aumentado e presença de trombo residual, independente da expressão quantitativa das proteínas de superfície em sua membrana. A hipótese para este aumento pode ser devido as alterações na afinidade das moléculas de adesão de superfície aos seus ligantes, como consequência do processo inflamatório associado com a hipercoagulabilidade que é característica desta doença / Abstract: Venous Thromboembolism (VTE) is a multifactorial disease that affects 1-3:1000 individuals worldwide. The venous thrombus develops via a multicellular process on the surface of the endothelium and presents a laminar structure comprised of layers of platelets, leukocytes, erythrocytes and fibrin. The relationship between inflammation and coagulation is bidirectional, and has been mainly evaluated through protein interactions between pro-inflammatory cytokines and elements of the coagulation cascade. Inflammatory cells such as neutrophils, have not been previously correlated with thrombotic or procoagulant processes. Objective: To evaluate the adhesive properties of neutrophils, erythrocytes and platelets, as well as the expression of neutrophil adhesion molecules in patients with VTE, correlating them with markers of the systemic inflammatory response, and with the presence of residual vein obstruction (RVO) and higher D-dimer (DD). Patients and Methods: Study group consisted of 30 chronic VTE patients (1-6 years after the acute episode) followed in our outpatient clinic, and 10 patients with VTE during the acute episode treated at the Hospital of Clinics (HC-UNICAMP) Campinas, as well as age, gender and ethnic background-matched healthy. Adhesive properties of neutrophils, erythrocytes and platelets were determined by a static adhesion assay using ligands such as fibrinogen (FB) and fibronectin (FN). The expression of neutrophils adhesion molecules (CD11a, CD11b, CD18) was evaluated by flow cytometry. Levels of inflammatory markers (IL-6, IL-8, TNF-_, PCR) were evaluated by ELISA and nephelometry. RVO was evaluated by Doppler ultrasound and DD by coagulometric method. Results: No significant difference could be observed in the platelets adhesion (basal: 16.37% vs. 14.59%, p=0.309; and stimulated with thrombin: 33.45% vs. 26.62%, p=0.200) and erythrocytes adhesion (7.28% vs 7.49%, p=0.859) between chronic VTE patients and healthy individuals. Similarly, no statistical differences were observed in the platelets adhesion (basal: 28.36% vs. 21.63%, p=0.109; and stimulated with thrombin: 38.45% vs. 30.15%, p=0.715) and erythrocytes adhesion (6.00% vs 4.62%, p=0.326) in the VTE acute xxii patients when compared to their respective controls. Interestingly, in patients with a higher risk of recurrent VTE (defined by the presence of high levels of DD and RVO), a significant increase in neutrophils adhesion was observed when compared to healthy individuals (24.68% vs. 19.07%, p <0.05). Inflammatory markers (IL-6, IL-8, TNF-_ and CRP) were significantly elevated (2.08pg/mL vs 0.90pg/mL, p=0.01; 28.72pg/mL vs 16.46pg/mL, p=0.02; 4.50pg/mL vs 2.11pg/mL, p=0.04; 0.35 pg/mL vs 0.14 pg/mL, p=0.09, respectively) in this subgroup of patients when compared to the other patients. Adhesive properties of neutrophils were correlated with IL-6 (r= 0.3815 and p= 0.0375) and D-dimer levels (r= 0.3831 and p= 0.0367). Neutrophils adhesion molecules (CD11a, CD11b and CD18) were not altered in any of the groups. Conclusion: Our results suggest that VTE patients do not exhibit increased adhesive properties of platelets and erythrocytes. Neutrophils adhesive properties were increased in patients with higher D-dimer levels and RVO, independently of the expression of neutrophil adhesion molecules. A hypothesis for this increase is alterations in affinity of surface adhesion molecules to their ligands, as a response to inflammatory processes associated with the hypercoagulability demonstrated in this subgroup of patients / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestra em Fisiopatologia Médica

Orientador: Nicola Amanda Conran Zorzetto / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T23:21:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vital_DaianaMorelli_M.pdf: 1971637 bytes, checksum: 022329e1e83ad1bd2ea02de3d37d61c9 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A inflamação é uma resposta fisiológica normal à infecção ou lesão tecidual que permite a sobrevivência do indivíduo a diversos agentes lesivos e mantém a homeostase dos tecidos sob uma variedade de condições nocivas. Os neutrófilos têm um papel importante em processos inflamatórios e, na presença de estímulos inflamatórios, como citocinas e quimiocinas, são recrutados da circulação para o tecido inflamado por uma sequência de interações adesivas. Recentemente, novas técnicas in vitro têm levado a importantes avanços no entendimento de patologias vasculares e hematológicas e sistemas microfluídicos, que mimetizam a microcirculação humana, demonstrando a utilidade para o estudo de interações adesivas de células inflamatórias. As interações dos neutrófilos e outros leucócitos com a parede vascular tem contribuição importante para as doenças inflamatórias crônicas, como a anemia falciforme (AF) e aterosclerose, pois podem participar em processos de oclusão vascular. O objetivo deste trabalho foi avaliar se a hidroxiureia (HU), uma droga utilizada como terapia na AF, modula as propriedades adesivas de neutrófilos quando incubados in vitro com a droga e frente um estímulo inflamatório. Os neutrófilos, isolados do sangue periférico de indivíduos saudáveis, foram estimulados com a citocina TNF-? (Fator de Necrose Tumoral alfa) e tratados com HU em três concentrações (100, 500, 1000 ?M); as propriedades adesivas das células foram avaliadas por ensaios de adesão estática e por ensaios microfluídicos, utilizando como ligantes proteínas expressas no endotélio (ICAM-1 e E-selectina), proteínas da matriz extracelular (fibronectina - FN) e células endoteliais (HUVEC). Além disso, foi analisada a ativação celular (spreading celular, observado como o espalhamento das células redondas que se tornam achatadas sobre um substrato sólido 2D). Observamos que os neutrófilos, quando estimulados com TNF-?, demonstram aumentos significantes na adesão e spreading celular. O pré-tratamento das células com HU reduziu significativamente o spreading dos neutrófilos nas três proteínas estudas (FN, ICAM-1 e E-selectina). Sob condições estáticas, o pré e o pós-tratamento dos neutrófilos com a HU diminuiu significativamente a adesão à FN quando comparados ao estimulados por TNF-?. Nos ensaios de adesão em fluxo, foi possível observar que o pré-tratamento com HU nas três concentrações (100, 500 e 1000 ?M) diminuiu significativamente a adesão dos neutrófilos a FN e o pós-tratamento com HU diminuiu apenas na concentração de 100 ?M. Avaliamos a adesão em fluxo de neutrófilos aderidos a proteínas de adesão presentes no endotélio, ICAM-1 e E-selectina; o pré e o pós-tratamento de neutrófilos com HU diminuiu a suas propriedades adesivas frente ao estímulo inflamatório de TNF-? à proteína E-selectina, enquanto que o pré-tratamento nas três concentrações diminuiu a adesão dos neutrófilos ao ICAM-1 e ao ICAM-1 e E-selectina adicionados juntos ao chip. A técnica de citometria de fluxo demonstrou que as integrinas LFA-1 (CD11a) e Mac-1 (CD11b), mostraram-se aumentadas na superfície dos neutrófilos após estímulo com TNF-?. Todavia, a expressão da L-selectina, mostrou-se diminuída com este potente estímulo inflamatório, provavelmente devido o mecanismo de "shedding" celular. A incubação dos neutrófilos com HU, após o estímulo com o TNF-?, reduziu significativamente a expressão de CD11a nos neutrófilos tratados com HU nas concentrações de 100 e 1000 ?M para níveis de expressão equivalentes ao grupo de neutrófilos não estimulados com TNF-?. Observamos também que houve aumento da presença da integrina LFA-1 (CD11a) na sua conformação ativada, após estímulo com TNF-? e que a pós-incubação das células estimuladas com HU na concentração de 1000 ?M, reduziu a ativação da subunidade CD11a da molécula de adesão LFA-1, comparado ao grupo apenas estimulado com TNF-?. Diante destes resultados, é possível concluir que o tratamento de neutrófilos com HU foi capaz de proteger ou até reverter algumas das ações inflamatórias do TNF-?. A HU é utilizada como uma terapia de uso crônico em pacientes com AF, mas estes dados indicam que a HU também pode exercer efeitos imediatos que são independentes da elevação de hemoglobina fetal. Dados melhor clarificam o mecanismo de ação de HU na AF e sugerem que a droga pode ter potencial para uso em outras doenças inflamatórias. Ainda será necessário entender como a HU exerce estes efeitos anti-inflamatórios nos neutrófilos / Abstract: Inflammation is a normal physiological response to infection or tissue injury that defends against various damaging agents and maintains tissue homeostasis in a variety of deleterious conditions. Neutrophils play an important role in inflammatory processes and, in the presence of inflammatory stimuli, such as cytokines and chemokines, are recruited from the circulation into the inflamed tissue by a sequence of adhesive interactions. Recently, new in vitro techniques have led to significant advances in our understanding of vascular and hematological conditions and microfluidic systems that mimic the human microcirculation have been shown to be useful for the study of adhesive interactions in inflammatory cells. The interaction of neutrophils and other leukocytes with the vascular wall makes an important contribution to chronic inflammatory diseases, such as sickle cell anemia (SCA) and atherosclerosis, as these may participate in vascular occlusion processes. The aim of this study was to evaluate whether hydroxyurea (HU), a drug used as a therapy in SCA, modulates the adhesive properties of neutrophils in vitro under an inflammatory stimulus. The neutrophils isolated from the peripheral blood of healthy subjects were stimulated with the cytokine TNF-? (Tumor Necrosis Factor alpha) and treated with HU in three concentrations (100, 500, 1000 ?M); the adhesive properties of the cells were evaluated by static adhesion assays and microfluidic assays using ligands such as proteins expressed on the endothelium (ICAM-1 and E-selectin), extracellular matrix proteins (fibronectin - FN) and endothelial cells (HUVEC). Furthermore, cellular activation was evaluated as cell spreading (observed when round cells become flattened and spread on a 2D solid substrate). When stimulated with TNF-?, neutrophils presented a significant increase in cell adhesion and spreading. Pre-treatment of cells with HU significantly reduced neutrophil spreading on all three proteins studied (FN, ICAM-1 and E-selectin). Under static conditions, the pre-treatment and post-treatment of neutrophils with HU significantly decreased adhesion to FN, compared to TNF-?-stimulated cells. In the flow adhesion assays, pre-treatment of neutrophils with HU at three concentrations (100, 500 and 1000 ?M) significantly reduced the adhesion of neutrophils to FN and post-treatment with HU decreased only at the concentration of 100 ?M. We evaluated the in vitro flow adhesion of neutrophils to proteins present on endothelial cells, ICAM-1 and E-selectin; pre-treatment and post-treatment of neutrophils with HU decreased their adhesive properties after TNF-? inflammatory stimulus to the E-selectin ligand, while pre-treatment in the three concentrations decreased neutrophil adherence to ICAM-1 ligand and ICAM-1/E-selectin ligands added together to the chip. Flow cytometry demonstrated that the expressions of the integrins LFA-1 (CD11a) and Mac-1 (CD11b) were elevated on the surface of neutrophils after a TNF-? stimulus. However, L-selectin expression was reduced with this potent inflammatory stimulus, probably due to the mechanism of "shedding". Incubation of neutrophils with HU (100 and 1000 ?M), after stimulation with TNF-?, significantly reduced the CD11a expression on neutrophils to levels similar to those found on the neutrophils of the non-TNF-?-stimulated group. We also observed that there was an increased expression of the LFA-1 (CD11a) integrin in its active conformation after stimulation with TNF-? and that, post-incubation with HU (1000 ?M) was able to reduce the activation of the adhesion molecule CD11a (LFA-1 subunit), compared to the group with TNF-? stimulus only. Given these results, it is possible to conclude that treatment of neutrophils with HU was able to protect or even reverse some of the inflammatory actions of TNF-?. HU is used as a chronic therapy in patients with SCA, but our data indicate that HU may also have immediate effects that are independent of the increase in fetal hemoglobin usually observed in patients in therapy. Our results further clarify the mechanism of action of HU in SCA and suggest that this drug may have potential for use in other inflammatory diseases. Further studies will be needed to better comprehend how these HU anti-inflammatory effects act on neutrophils / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências

Temos mostrado que os glicocorticóides endógenos (GE) modulam o rolling e a aderência de neutrófilos in vivo, mediando a expressão de moléculas de adesão no leucócito e no endotélio. Adicionalmente, os GE controlam a maturação neutrofílica na medula e a sua mobilização para o sangue periférico. O presente trabalho visou investigar os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na modulação exercida pelos GE neste processo. Utilizando ratos Wistar submetidos à adrenalectomia bilateral, tratados com RU 38486 ou controles (falso-operados, tratados com veículo ou não manipulados), foi demonstrado que: 1) os GE controlam, negativamente, a expressão de L-selectina em neutrófilos circulantes e ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1, VAP-1 na célula endotelial e, positivamente, a expressão de L-selectina em granulócitos da medula óssea via seu receptor citosólico (GCR); 2) o mecanismo envolvido no controle dos GE sobre a expressão de L-selectina é independente de ação sobre sua expressão gênica ou da atividade de NFkB, mas dependente da expressão de anexina-A1, como verificado em camundongos knockouts (KO) para esta proteína 3) o controle da expressão de moléculas de adesão endotelial é dependente de ações sobre a expressão gênica, via translocação nuclear do NFkB; 4) a neutrofilia detectada em animais adrenalectomizados (ADR) é mediada pelo GCR, e dependente de anexina- A1; 5) a neutrofilia parece ser dependente da ação da anexina-A1 sobre a secreção de SDF-1 na medula óssea e expressão de CXCR-4 em neutrófilos circulantes e da medula; 6) concentrações circulantes elevadas de GE induzidas pela administração de ACTH confirmaram o controle dos GE, via anexina A-1, sobre o tráfego de neutrófilos da medula óssea para o sangue, mas sugerem um controle diferencial dos GE e anexina A-1 sobre a expressão de L-selectina em células da medula e do sangue circulante. Estes dados mostram mecanismos inéditos do controle dos GE sobre o tráfego de neutrófilos, que diferem em cada microambiente e tipo celular envolvido neste complexo fenômeno. / We have shown that endogenous glucocorticoids (GE) modulate the rolling and adhesion of neutrophils in vivo, mediating the expression of adhesion molecules on leukocytes and the endothelium. Additionally, the GE control neutrophil maturation in bone marrow and mobilization to peripheral blood. This work aimed to investigate the molecular and cellular mechanisms involved in the modulation exerted by GE in this process. Using male Wistar rats, submitted to bilateral adrenalectomy, treatment with RU 38 486 or controls (sham operated, vehicle or non manipulated), it was shown that: 1) GE control, negatively, L-selectin expression on circulating neutrophils and ICAM-1, VCAM-1, PECAM-1, VAP-1 on endothelial cell and, positively, L-selectin expression on bone marrow granulocytes via their cytosolic receptor (GCR); 2) the mechanism involved in the control of GE on the L-selectin expression is independent of its action on gene expression or NFkB activity, but dependent on the expression of anexina-A1, as observed in mice knockouts for this protein; 3) the control of endothelial adhesion molecules is dependent on gene expression, via NFkB translocation; 4) the neutrophilia detected in adrenalectomized animals (ADR) is mediated by GCR, and dependent on anexina-A1; 5) the neutrophilia seems to be dependent on the action of annexin A-1 on SDF-1&#945; secretion in bone marrow and expression of CXCR-4 in peripheral blood and bone marrow; 6) high circulating concentrations of GE induced by administration of ACTH confirmed the control of GE, via the annexin-1, on the traffic of neutrophils from the bone marrow to the blood, but suggest a differential control of GE and annexin A-1 on the L-selectin expression in the bone marrow and circulating blood. These data indicate unpublished mechanisms of control of GE on the traffic of neutrophils, which differ in each microenvironment and cell type involved in this complex phenomenon.

A galectina-1 (Gal-1) é uma lectina que reconhece ?-galactosídeos e participa de vários processos biológicos, incluindo a modulação da resposta inflamatória. Dados da literatura mostram a participação desta lectina na indução da exposição de fosfatidilserina (FS - um marcador de apoptose), na geração de espécies reativas do oxigênio (EROs) e na modulação quimiotática de neutrófilos. Entretanto, ainda são escassos os dados relacionados ao impacto biológico da Gal-1, exógena e endógena, sobre a biologia destas células. Neste trabalho foram avaliados, in vitro, alguns aspectos funcionais da interação Gal-1/neutrófilo. Determinou-se o nível de expressão da Gal-1 (Western Blotting) e de seu mRNA (PCR real time), em leucócitos humanos obtidos do sangue periférico de doadores sadios e em células da linhagem promielocítica humana (HL-60). Leucócitos do sangue periférico e células HL-60 não expressam níveis detectáveis da proteína e também do mRNA para Gal-1. Por meio de ensaios de quimiluminescência (QL) foi possível analisar a capacidade da Gal-1 recombinante humana de induzir e modular a produção de EROs em neutrófilos humanos não ativados e ativados com fMLP (n-Formil-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine). A Gal-1 induz a produção de EROs de modo dose-dependente em neutrófilos ativados com fMLP. Entretanto, em neutrófilos não ativados esta lectina não induz o metabolismo oxidativo e, além disso, é capaz de modular negativamente a produção de EROs em resposta ao fMLP. Tanto nas células não ativadas quanto ativadas com fMLP, os efeitos da Gal-1 na produção de EROs estão parcialmente associados a sua propriedade lectínica. Na literatura ainda não há relatos sobre a interferência da Gal-1 no metabolismo oxidativo em neutrófilos ativados com repetidas doses de fMLP. Sabe-se que o tratamento sucessivo com fMLP reduz os níveis de produção de EROs por neutrófilos, no entanto, a presença de Gal-1 não interferiu neste processo. Interessantemente, neutrófilos recuperados do peritônio de camundongos Gal-1-/- liberam mais EROs em resposta ao fMLP e a Gal-1 exógena quando comparado aos neutrófilos de animais selvagens. Com base nos achados in vitro e sabendo que na sepse polimicrobiana o neutrófilo desempenha um papel importante, o próximo passo foi utilizar o modelo de M-CLP (sepse moderada) em camundongos destituídos (Gal-1-/-) ou não (Gal-1+/+) do gene da Gal-1. Animais Gal-1-/-, apresentam menor taxa de sobrevivência. O influxo de neutrófilos e a carga bacteriana no peritônio são maiores nos animais Gal-1-/- apesar da menor quantidade de bactérias detectadas no sangue, em relação aos animais selvagens. No pulmão, o influxo de neutrófilos é semelhante para ambos os grupos. No entanto, após a injeção intraperitoneal de 107 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) de bactérias, camundongos Gal-1-/- apresentam maior atividade bactericida no lavado peritoneal e sangue, em relação aos selvagens. A participação da Gal-1 na homeostase de neutrófilos foi demonstrada in vitro, por citometria de fluxo (anexina-V-FITC), onde a indução de FS nos neutrófilos tratados com Gal-1 favoreceu a fagocitose destas células por macrófagos. Portanto, este conjunto de resultados sugere que a Gal-1, exógena ou endógena, pode modular funções imunológicas de neutrófilos e participar da regulação do processo inflamatório/infeccioso sistêmico. / Galectin-1 (Gal-1) is a lectin that recognizes ?-galactosides and participates in biological processes, including modulation of the inflammatory response. Literature data show the involvement of this lectin to induce exposure of phosphatidylserine (PS - a marker of apoptosis), in the generation of reactive oxygen species (ROS) and in modulation of neutrophil chemotaxis. However, there are few data related to the biological impact of exogenous and endogenous Gal-1 on the biology of these cells. This study evaluated, in vitro, some functional aspects of the interaction of Gal-1 and neutrophil. It was determined the expression level of Gal-1 (Western blotting) and its mRNA (real time PCR) on human leukocytes obtained from peripheral blood of healthy donors and human promyelocytic cell line (HL-60). Peripheral blood leukocytes and HL-60 cells do not express detectable levels of this protein as well as the Gal-1 mRNA. Through chemiluminescence testing (CL) it was possible to analyze the ability of recombinant human Gal-1 to induce and modulate the production of ROS in naïve and activated (n-Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine-fMLP) human neutrophils. Gal-1 induces ROS production in a dose-dependent way in fMLP activated neutrophils. However, in naive neutrophils this lectin does not induce oxidative stress and can negatively modulate ROS production in response to fMLP. The effects of Gal-1 on ROS production in both non-activated cells and activated cells are partially associated with their lectin property. In the literature there are no data about the interference of Gal-1 on ROS production in activated neutrophils with repeated doses of fMLP. It is known that the subsequent treatment with fMLP reduced levels of ROS production by neutrophils; however, the presence of Gal-1 did not affect this process. Interestingly, peritoneum neutrophils from Gal-1-/- mice release more ROS in response to fMLP and exogenous Gal-1 when compared to neutrophils from wild type animals. Based on the in vitro findings and considering that in polymicrobial sepsis, neutrophils play an important role, the next step was to use the M-CLP model (moderate sepsis) in mice lacking (Gal-1-/-) or not (Gal-1+/+) Gal-1 gene. Gal-1-/- animals present lower survival rate and fewer bacteria in the blood despite having higher bacterial load in infectious focus in relation to wild type mice. The rates of neutrophils influx into the peritoneum and lungs are similar for both groups. The participation of Gal-1 in the homeostasis of neutrophils was demonstrated in vitro by flow cytometry (annexin V-FITC), where induced PS by Gal-1 in the neutrophils enhanced the phagocytosis of these cells by macrophages. Therefore, this set of results suggests that Gal-1, exogenous or endogenous, can modulate immune functions of neutrophils and participate in the regulation of inflammatory/infectious disorders.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2015-07-21T14:58:44Z No. of bitstreams: 1 Manoel Carneiro de Oliveira Junior.pdf: 4260915 bytes, checksum: ba3950686530a475258ace49a0675cdd (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-21T14:58:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Manoel Carneiro de Oliveira Junior.pdf: 4260915 bytes, checksum: ba3950686530a475258ace49a0675cdd (MD5) Previous issue date: 2013-09-30 / Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is a syndrome that presents high mortality rates, and the results of both insults pulmonary or extra-pulmonary (pneumonia or septic shock) are high, and is a disease characterized by respiratory insufficiency from the inflammatory response that leads to alteration of alveolar-capillary permeability, pulmonary edema and hypoxemia refractory to high flow oxygen. One of the most important mechanisms that determined the severity of this injury is the magnitude of the injury of alveolar epithelial barrier. The possibility of repairing epithelial at an early stage is the major determinant of recovery. Many of therapeutic modalities based on the attempt to decrease lung inflammation to minimize the initial injury and much of the inflammatory process occurs through activation of local and systemic cytokines such as TNF-α and IL-1β. A growing number of studies report that Low Level Laser Therapy (LLLT) have anti-inflammatory effects in models of LPS-induced pulmonary ARDS, however, so far, only the red spectrum lasers were studied. Therefore, this study aimed to investigate the role of infra red laser (830nm), 3J/cm2, 35mw, 80 seconds per point (03 points per application), in pulmonary inflammation, lung using LPS model (intratracheal) and also extrapulmonary (intraperitoneal) inducing ARDS. The laser application was performed directly in contact with the skin in the chest three points (corresponding to the end of the trachea - Section 01 right lung - point 02 and left lung - point 03), three times, beginning 01 hour after LPS administration. BALB / c mice (n = 40) were divided into control (n = 08; not administered LPS), IT (n = 07; intratracheal administered LPS (10 µg / mouse), IT + LLLT (n = 09; intratracheal LPS administered (10 µg / mouse) + LLLT), IP (n = 07; LPS administered intraperitoneal (100 µg / mouse), IP + LLLT (n = 09; administered intraperitoneal LPS (100 µg / mouse) + LLLT). Twenty-four hours after administration of LPS and Laser, animals were euthanized and the lungs removed for studies of pulmonary inflammation: Total cell count and differential, bronchoalveolar lavage (BAL), cytokines (IL-1beta, IL-6, IL-10, KC and TNF-α), BAL levels were also analyzed quantitatively the number of neutrophils in the lung parenchyma in lung tissue using histomorphometry techniques. Results showed that LLLT significantly reduced pulmonary and extra-pulmonary LPS induced in both configurations Experimental of ARDS, as evidenced by a reduction in the number of total cells and neutrophils in BAL, reduced levels of IL-1β, IL-6, KC, and TNF-α in BAL fluid as well as the number of neutrophils in the lung parenchyma. Therefore, we conclude that the 830nm infrared laser is effective in reducing pulmonary inflammation in both models pulmonary or extrapulmonary LPS-induced experimental ARDS. / A síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA) é uma síndrome que apresenta altas taxas de mortalidade, que pode ser resultante tanto de insultos pulmonares como extrapulmonares. A síndrome é caracterizada pela insuficiência respiratória proveniente da resposta inflamatória que cursa com alteração de permeabilidade alvéolo-capilar, edema e hipoxemia refratária aos altos fluxos de oxigênio. Um dos mais importantes mecanismos que determinam a severidade desta injúria é a magnitude da lesão da barreira epitélio alveolar. A possibilidade de reparação do epitélio em um estágio precoce é o maior determinante da recuperação. Muitas das modalidades terapêuticas baseiam-se na tentativa de diminuição da inflamação pulmonar para minimizar a lesão inicial, a qual se deve em grande parte ao processo inflamatório mediado pela ativação local e sistêmica por citocinas como TNF-α e IL-1β. Um número crescente de estudos relata que o laser de baixa intensidade apresenta efeitos antiinflamatórios em modelos de SDRA induzida por LPS e isquemia e reperfusão da artéria pulmonar. No entanto, até o momento, apenas lasers no espectro vermelho (650 – 655 nm) foram estudados. Portanto, o presente estudo tem como objetivo investigar o papel do laser de baixa intensidade (LBI), na faixa do infravermelho (830nm), 3J/cm2, 35mw, 80 segundos por ponto (03 pontos por aplicação), na inflamação pulmonar, usando um modelo de SDRA de origem pulmonar (LPS intratraqueal) e também extrapulmonar (LPS intraperitoneal). A aplicação do laser foi realizada diretamente em contato com a pele, em três pontos do tórax (correspondente ao final da traquéia - ponto 01, pulmão direito - ponto 02 e do pulmão esquerdo ponto 03), por três vezes, 01 hora após a administração de LPS. Camundongos BALB/c (n = 40) machos foram distribuídos em Controle (n = 08; não administrado com LPS), IT 10 (n = 07; LPS intratraqueal; 10 µg/camundongo), IT + Laser (n = 09; LPS intratraqueal; 10µg/camundongo + Laser), IP (n= 07; LPS intraperitoneal; 100µg/ camundongo), IP + Laser (n = 09; LPS intraperitoneal; 100 µg/camundongo + Laser). Os animais foram eutanaziados vinte e quatro horas após a administração de LPS. Foi avaliada a contagem de células totais e diferenciais no lavado bronco alveolar (LBA), os níveis de citocinas (IL-1β, IL-6, IL 10, KC e TNF-α), a densidade de neutrófilos no parênquima pulmonar. Os resultados demonstraram que o LBI significativamente reduziu o número de células totais e de neutrófilos no Lavado Bronco Alveolar (LBA), o número de neutrófilos no parênquima pulmonar, e os níveis de citocinas pró-inflamatórias no LBA tanto no modelo de SDRA pulmonar quanto extrapulmonar. Portanto, concluímos que o laser infravermelho 830nm é eficaz para reduzir a inflamação pulmonar, em ambos os modelos de SDRA intrapulmonar e extrapulmonar induzida por LPS.