Personnaliser les traitements anticancéreux sur base moléculaire consiste à optimiser la thérapie en fonction des profils d'expression de gènes des cellules saines et tumorales du patient. Les différences au niveau moléculaire entre tissus normaux et cancéreux sont exploitées afin de maximiser l'efficacité du traitement et minimiser sa toxicité. Cette thèse propose une approche pluridisciplinaire expérimentale et mathématique ayant pur but la détermination de stratégies anticancéreuses optimales sur base moléculaire. Cette approche est, tout d'abord, mise en œuvre pour la personnalisation de la chronothérapeutique des cancers, puis pour l'optimisation de la thérapie anticancéreuse dans le cas d'une mutation de l'oncogène SRC. La plupart des fonctions physiologiques chez les mammifères présentent une rythmicité circadienne, c'est-à-dire de période environ égale à 24 h. C'est par exemple le cas de l'alternance activité-repos, de la température corporelle, et de la concentration intracellulaire d'enzymes du métabolisme. Ces rythmes ont pour conséquence une variation de la toxicité et de l'efficacité d'un grand nombre de médicaments anticancéreux selon leur heure circadienne d'administration. De récentes études soulignent la nécessité d'adapter les schémas d'injection chronomodulés au profil moléculaire du patient. La première partie de cette thèse propose une approche combinée expérimentale et modélisatrice pour personnaliser sur base moléculaire la chronothérapie. La première étape a consisté en une preuve de concept impliquant des expérimentations in vitro sur cultures de cellules humaines et des travaux de modélisation in silico. Nous nous sommes focalisés sur l'étude de l'irinotecan (CPT11), un médicament anticancéreux actuellement utilisé en clinique dans le traitement des cancers colorectaux, et présentant des rythmes de chronotoxicité et de chronoefficacité chez la souris et chez l'homme. Sa pharmacocinétique (PK) et pharmacodynamie (PD) moléculaires ont été étudiées dans la lignée de cellules d'adénocarcinome colorectal humain Caco-2. Un modèle mathématique de la PK-PD moléculaire du CPT11, à base d'équations différentielles ordinaires, a été conçu. Il a guidé l'expérimentation qui a été réalisée dans le but de d'évaluer les paramètres du modèle. L'utilisation de procédures d'optimisation, appliquées au modèle calibré aux données biologiques, a permis la conception de schéma d'exposition au CPT11 théoriquement optimaux dans le cas particulier des cellules Caco-2. Le CPT11 s'est accumulé dans les cellules Caco-2 où il a été biotransformé en son métabolite actif le SN38, sous l'action des carboxylestérases (CES). La pré-incubation des cellules avec du verapamil, un inhibiteur non spécifique des transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) a permis la mise en évidence du rôle de ces pompes d'efflux ABC dans le transport du CPT11. Après synchronisation des cellules par choc sérique, qui définit le temps circadien (CT) 0, des rythmes circadiens d'une période de 26 h 50 (SD 63 min) ont été mis en évidence pour l'expression de trois gènes de l'horloge circadienne: REV-ERBα, PER2, et BMAL1; et six gènes de la pharmacologie du CPT11: la cible du médicament la topoisomerase 1 (TOP1), l'enzyme d'activation CES2, l'enzyme de désactivation UGT1A1, et les quatre transporteurs ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCG2. Au contraire, l'expression protéique et l'activité de la TOP1 sont restées constantes. Enfin, la quantité de TOP1 liée à l'ADN en présence de CPT11, un marqueur de la PD du médicament, a été plus importante pour une exposition à CT14 (47±5.2% de la quantité totale de TOP1), que pour une exposition à CT28 (35.5±1.8%). Les paramètres du modèle mathématique de la PK-PD du CPT11 ont ensuite été estimés par une approche de bootstrap, en utilisant des résultats expérimentaux obtenus sur les cellules Caco-2, combinés aux données de la littérature. Ensuite, des algorithmes d'optimisation ont été utilisés pour concevoir les schémas d'exposition théoriquement optimaux des cellules Caco-2 à l'irinotecan. Les cellules synchronisées par un choc sérique ont été considérées comme les cellules saines et les cellules non-synchronisées ont joué le rôle de cellules cancéreuses puisque l'organisation circadienne est souvent perturbée dans les tissus tumoraux. La stratégie thérapeutique optimale a été définie comme celle qui maximise l'efficacité sur les cellules cancéreuses, sous une contrainte de toxicité maximale sur les cellules saines. Les schémas d'administration considérés ont pris la forme d'une exposition à une concentration donnée de CPT11, débutant à un CT particulier, sur une durée comprise entre 0 et 27 h. Les simulations numériques prédisent que toute dose de CPT11 devrait être optimalement administrée sur une durée de 3h40 à 7h10, débutant entre CT2h10 et CT2h30, un intervalle de temps correspondant à 1h30 à 1h50 avant le minimum des rythmes de bioactivation du CPT11 par les CES. Une interprétation clinique peut être établie en ramenant à 24 h ces résultats pour les cellules Caco-2 qui présentent une période de 27 h. Ainsi, une administration optimale du CPT11 chez le patient cancéreux résulterait en une présence du médicament dans le sang pendant 3h30 à 6h30, débutant de 1h30 à 1h40 avant le minimum des rythmes d'activité des CES chez le patient. La deuxième étape de nos travaux a consisté à adapter l'approche mise en œuvre pour optimiser l'exposition des cellules Caco-2 au CPT11, pour l'optimisation de l'administration du médicament chez la souris. Des études récentes mettent en évidence trois classes de chronotoxicité à l'irinotecan chez la souris. La classe 1, les souris de la lignée B6D2F1 femelles, présentent la pire tolérabilité au CPT11 après une administration à ZT3, et la meilleure pour une administration à ZT15, où ZT est le temps de Zeitgeber, ZT0 définissant le début de la phase de lumière. La classe 2, les souris B6D2F1 mâles, montrent une pire heure d'administration à ZT23 et une meilleure à ZT11. Enfin, la classe 3, les B6CBAF1 femelles présentent la pire tolérabilité pour une injection à ZT7, et la meilleure pour ZT15. Nous avons entrepris une approche pluridisciplinaire in vivo et in silico dont le but est la caractérisation moléculaire des trois classes de chronotoxicité, ainsi que la conception de schémas optimaux d'administration pour chacune d'elles. Le modèle mathématique mis au point pour une population de cellules en culture a été adapté pour la construction d'un modèle "corps entier" à base physiologique de la PK-PD de l'irinotecan. Un ensemble de paramètres a été estimé pour la classe 2, en utilisant deux sortes de résultats expérimentaux: d'une part, les concentrations sanguines et tissulaires (foie, colon, moelle osseuse, tumeur) du CPT11 administré aux pire et meilleure heures circadiennes de tolérabilité, et d'autre part, les variations circadiennes des protéines de la pharmacologie du médicament dans le foie et l'intestin. Le modèle ainsi calibré reproduit de façon satisfaisante les données biologiques. Cette étude est en cours pour les classes 1 et 3. Une fois les ensembles de paramètres validés pour chacune des trois classes, ils seront comparés entre eux pour mettre en évidence de possibles différences moléculaires. L'étape suivante consiste en l'application d'algorithmes d'optimisation sur le modèle corps entier pour définir des schémas d'administration chronomodulés optimaux pour chaque classe. La deuxième partie de cette thèse s'intéresse à l'étude de la tyrosine kinase SRC, dont l'expression est dérégulée dans de nombreux cancers. Des études récentes montrent un contrôle de SRC sur la voie mitochondriale de l'apoptose dans des fibroblastes de souris NIH-3T3 transfectés avec l'oncogène v-src, cette régulation étant inexistante dans les cellules parentales. L'oncogène SRC active la voie RAS / RAK / MEK1/2 / ERK1/2 qui augmente la vitesse de phosphorylation de la protéine pro-apoptotique BIK, menant ainsi à sa dégradation par le protéasome. La faible expression de BIK résultant de ce mécanisme rendrait ainsi les cellules v-src résistantes à la plupart des stress apoptotiques. Notre étude a consisté à déterminer, par une approche combinée mathématique et expérimentale, les stratégies thérapeutiques optimales lorsque les cellules NIH-3T3 parentales jouent le rôle de cellules saines, et les fibroblastes transformés celui de cellules cancéreuses. Pour cela, nous avons, tout d'abord, construit un modèle mathématique de la cinétique de BIK en conditions non-apoptotiques. L'estimation des paramètres de ce modèle, en utilisant des données expérimentales existantes, confirme que la phosphorylation de BIK sous le contrôle de SRC est inactive dans les cellules normales. L'étude exprimentale de l'évolution de BIK après le signal apoptotique que constitue une exposition à la staurosporine, démontre une relocalisation de BIK aux mitochondries, la concentration totale de la protéine restant constante durant le stress. Nous avons ensuite conçu un modèle mathématique de la voie mitochondriale de l'apoptose mettant en jeu les protéines anti-apoptotiques de type Bcl2, les protéines effectrices de type BAX, les protéines BH3-only activatrices et les BH3-only sensibilisatrices. Un ensemble de paramètres a été déterminé pour les cellules NIH-3T3 parentales, et celles transformées v-src, en comparant le modèle aux données expérimentales. Le modèle reproduit le fait expérimentalement démontré que la préincubation des cellules v-src avec un inhibiteur de la tyrosine kinase SRC, avant l'exposition à la staurosporine, annihile la résistance des fibroblastes transformés au stress apoptotique. Le modèle prédit que l'administration de l'ABT-737, un inhibiteur de protéines anti-apoptotiques, avant l'exposition à la staurosporine, ne devrait pas être entreprise dans notre systéme biologique, ce qui a été expérimentalement validé. Enfin, le modèle a été utilisé dans des procédures d'optimisation pour déterminer la stratégie thérapeutique théoriquement optimale, lorsque les cellules normales et transformées sont exposées aux mêmes médicaments. Les combinaisons médicamenteuses considérées consiste en une exposition à la staurosporine, précédée d'une exposition à des répresseurs ou activateurs d'expression des protéines de la famille Bcl2. La stratégie optimale est définie comme celle qui maximise le pourcentage de cellules apoptotiques dans les fibroblastes v-src, sous la contrainte que celui dans les cellules normales reste au-dessous d'un seuil de tolérabilité. Les simulations numériques nous permettent de conclure à une combinaison médicamenteuse optimale constituée d'une exposition à la staurosporine, précédée d'une exposition à un répresseur de l'expression de BAX (de manière à diminuer sa concentration en-dessous du seuil apoptotique dans les cellules normales, mais pas dans les cellules cancéreuses), combinée à un répresseur de BCL2 ou un inhibiteur de tyrosines kinases SRC. Cette stratégie optimale aboutit à moins d'1% de cellules apoptotiques dans les cellules saines et plus de 98% dans les cellules cancéreuses. / Personalizing anticancer treatment on molecular basis consists in optimizing the therapy according to the gene expression profiles of healthy and cancer cells of the patient. The molecular differences between normal and tumor tissues are exploited in order to maximize the treatment efficacy and minimize its toxicities. This PhD thesis presents a combined mathematical and experimental approach to optimize anticancer therapeutic strategies on molecular basis. This approach has been undertaken at first for the personalization of cancer chronotherapeutics, and secondly for the optimization of anticancer therapy in the case of mutated SRC oncogene. Most of the physiological functions in mammals display rhythms of period around 24, also called circadian rhythms. For instance, rest-activity rhythm, core temperature, or intracellular concentrations of metabolic enzymes show variations over the 24 h span. Those rhythms result in variations in the toxicity and efficacy of many anticancer drug with respect to their circadian time of administration. Recent studies highlight the need for chronomodulated injection scheme which would be tailored to the patient's molecular profile. Thus the first sections of this thesis propose a combined experimental and mathematical approach for personalizing cancer chronotherapeutics on molecular basis. The first step consisted in a proof of concept which involved in vitro experiments on human cell culture and in silico mathematical modeling. We focused on the anticancer drug irinotecan (CPT11), which is currently used in the treatment of colorectal cancer and displays chronotoxicity and chronoefficacy rhythms both in mice and in cancer patients. Its molecular pharmacokinetics (PK) and pharmacodynamics (PD) were studied in human colorectal adenocarcinoma Caco-2 cells. An ODE-based mathematical model of its PK-PD was built. It guided the design of experiments which were performed in order to estimate parameter values of the model. Optimization procedures were then applied to this data-calibrated model in order to compute theoretically optimal exposure schemes for the Caco-2 cell line. CPT11 accumulated in Caco-2 cells where it was bioactivated into SN38 under the catalytic activity of carboxylesterases (CES). The pre-incubation of cells with verapamil, a non-specific inhibitor of ATP-Binding Cassette (ABC) transporters, increased CPT11 intracellular accumulation, thus demonstrating the involvement of those efflux pumps in CPT11 transport. After cell synchronization by a seric shock which defines the circadian time (CT) 0, circadian rhythm of period 26 h 50 (SD 63 min) were observed for the expression of the three clock genes REV-ERBα, PER2, and BMAL1; and of six metabolic genes: the drug target topoisomerase 1 (TOP1), the activation enzyme CES2, the deactivation enzyme UGT1A1, and the four ABC transporters ABCB1, ABCC1, ABCC2, ABCG2. On the contrary, TOP1 proteic level and activity remained constant. The amount of DNA-bound TOP1 in the presence of CPT11 is a PD marker of the drug and displayed circadian rhythms as it was equal to 47±5.2% of the total amount of TOP1 protein after an exposure at CT14, as compared to 35.5±1.8% after an exposure at CT28. Parameters of CPT11 PK-PD model were estimated from experimental data in Caco-2 cells combined to information from literature by a bootstrap approach. Optimization procedures were then applied to the data-calibrated model in order to compute theoretically optimal exposure schemes for Caco-2 cells. Synchronized cells were considered as healthy cells and non-synchronized cells as cancer ones as the circadian organization is often disrupted in tumor tissues. The adopted therapeutics strategy consisted in maximizing DNA damage in cancer cells under the constraint that DNA damage in the healthy population remained under a tolerability threshold. We considered administration schemes in the form of a cell exposure to an initial extracellular concentration of CPT11, over 1 to 27 h, starting at a particular CT. Numerical procedures predicted that, for all considered doses of CPT11, the optimal exposure lasted from 3h40 to 7h10, and started between CT2h10 and CT2h30, a time interval corresponding to 1h30 to 1h50 before the minimum value of CES activity. A clinical interpretation can be obtained by rescaling to 24 h those results for Caco-2 cells which displayed a period of 26 h 50. Thus, an optimal administration of CPT11 to cancer patients should result in the presence of the drug in the blood during 3h30 to 6h30, starting 1h30 to 1h40 before the minimum value of CES activity in the patient. The second section of our research works has consisted in adapting the pluridisciplinary approach we have undertaken for optimizing CPT11 exposure in Caco-2 cells, for the optimization of CPT11 administration in mice. Recent experimental studies demonstrated the existence of three classes of mice regarding CPT11 chronotoxicity. Female mice of the strain B6D2F1 represented the first class and showed worst tolerability after an injection of CPT11 at ZT3 and best tolerability at ZT15, where ZT is Zeitgeber Time, ZT0 defining the beginning of the light phase. Class 2 was constituted by B6D2F1 male mice and displayed worst toxicity at ZT23 and best toxicity at ZT11. Finally, class 3 was B6CBAF1 female mice and showed worst tolerability at ZT7 and best tolerability at ZT15. Our combined in vivo and in silico approach aimed at characterizing the three chronotoxicity classes at the molecular level and at designing optimal administration schemes for each of them. The mathematical model which was built for Caco-2 cell culture was adapted to design a whole body physiologically based model of CPT11 PK-PD. Parameters were estimated for class 2 by fitting both blood and tissular pharmacokinetics data and measurements of circadian rhythms of proteins involved in CPT11 pharmacology. The calibrated model fitted the biological data. Similar parameter estimations are ongoing for classes 1 and 3. Once three parameter sets are estimated, their comparaison will allow the determination of differences in protein activities and therefore the molecular characterization of the three classes. The next step consists in applying optimization procedures to the calibrated whole body model in order to design theoretically optimal administration schemes for each class. The second project presented in this thesis focuses on the tyrosine kinase SRC, which is deregulated in numerous cancer diseases. Recent studies showed that SRC exerted a control on the mitochondrial pathway of apoptosis in NIH-3T3 mice fibroblasts which were transfected with the oncogene v-src, whereas this control was not observed in parental NIH-3T3 cells. SRC activated the RAS / RAK / MEK1/2 / ERK1/2 pathway which enhanced the phosphorylation of the pro-apoptotic enzyme BIK, thus leading to the protein degradation by the proteasome. As a result, BIK protein expression was low in v-src transformed fibroblasts which possibly contributed to the resistance of those cells to most apoptotic stresses. Our work consisted in designing optimal therapeutics strategies in which parental NIH-3T3 fibroblasts stands for healthy cells and v-src transformed ones for cancer cells. Once again, a combined experimental and mathematical approach was undertaken. First, we built a model for BIK kinetics in non-apoptotic conditions and fitted its parameters to existing experimental data. Estimated parameter values confirmed that SRC-dependent phosphorylation of BIK was inactive in normal cells. Then, we biologically and mathematically investigated BIK kinetics in response to a death signal. We showed a relocalization of BIK to the mitochondria in the first hours of staurosporine exposure, whereas BIK protein total amount remained constant during the apoptotic stress. We then conceived a mathematical model of the mitochondrial pathway of apoptosis in NIH-3T3 cells. It modeled molecular interactions between the anti-apoptotic proteins as BCL2, and the pro-apoptotic enzymes which were divided into three subgroups: the BAX-like effector proteins, the BH3-only activator proteins and the BH3-only sensitizer proteins. Parameters were estimated by fitting experimental results in normal and v-src transformed fibroblasts. The model reproduced the experimentally-demonstrated fact that pre-incubating v-src fibroblasts with an inhibitor of SRC before staurosporine exposure annihilated the cell resistance. The model predicted that an administration of ABT-737, an inhibitor of anti-apoptotic proteins, before staurosporine exposure, should not be undertaken in our particular biological systems, which was experimentally validated. Finally, optimization procedures were applied to the model in order to design optimal therapeutics strategies when both normal and cancer cells were exposed to the same drugs. Considered exposure scheme consisted in the administration of staurosporine after an exposure to activator or of proteins of the mitochondrial pathway of apoptosis. Optimal strategies were defined as the ones which maximized the percentage of apoptotic cells in the cancer cell population, under the constraint that that in the healthy population remained below a toxicity threshold. Optimization procedures allowed to conclude that the optimal drug combinaison consisted in exposing cells to staurosporine after an exposure to a chemical able to repress BAX expression such that its concentration in normal cells was below the needed amount to trigger apoptosis, combined either to a repressor of anti-apoptotic proteins, or an inhibitor of SRC. These optimal strategies led to less than 1% of apoptotic cells in healthy cells, and more than 98% in cancer cells.

Mes travaux s'inscrivent dans le cadre général de la modélisation en pharmacologie. Je m'intéresse à la modélisation de relations entre les doses administrées, les concentrations observées et les effets, bénéfiques ou indésirables, de molécules administrées dans un organisme, afin d'expliquer et prédire l'action des médicaments. Cette discipline joue un rôle grandissant dans le développement de nouveaux médicaments, et fait notamment partie des dossiers d'autorisation de mise sur le marché de toute nouvelle molécule. Mais la modélisation se poursuit bien au-delà lors de la vie du médicament, et la pharmacométrie est encore à l'honneur dans l'analyse des essais cliniques permettant d'explorer de nouvelles populations ou de nouvelles pathologies, dans la surveillance thérapeutique où elle est utilisée pour prédire le meilleur traitement à administrer à un patient, ou dans la pharmacovigilance permettant de surveiller les effets indésirables. Les méthodes statistiques permettant d'analyser les données dans ce contexte reposent principalement sur l'utilisation de modèles à effets mixtes, capables de distinguer un profil moyen d'évolution du système et une variabilité expliquant les différences entre individus. Les modèles utilisés pour décrire le système sont le plus souvent dynamiques (en évolution dans le temps), et non-linéaires dans leurs paramètres. Ces modèles posent donc, comme nous le verrons dans ce travail, de nombreux problèmes méthodologiques. On peut ainsi citer, parmi les questions faisant l'objet à l'heure actuelle de nombreux travaux : les méthodes et algorithmes permettant d'estimer les paramètres de ces modèles ; les stratégies de construction de modèles ; l'évaluation de modèles ; le choix du protocole expérimental et le calcul du nombre de sujets nécessaires ; le traitement de données manquantes ; la nature des données, comme le fait de devoir traiter des données catégorielles ou la combinaison de plusieurs variables d'intérêt dans des modèles à réponses multiples. Cet ouvrage commence par une introduction générale à la pharmacométrie, avec un bref historique et une description des méthodologies utilisées dans cette discipline. Dans ce premier chapitre, je développerai plus en détail les éléments auxquels je me suis particulièrement intéressée. Dans le chapitre suivant, j'exposerai mes travaux en les classant par grandes thématiques. Mes travaux peuvent être regroupés pour la plupart en trois grands thèmes : la modélisation, avec un intérêt particulier pour les données de pharmacogénétique, thème que je développe au travers de collaborations extérieures et du co-encadrement d'une thèse ; l'évaluation de modèles, un sujet sur lequel j'ai co-encadré une thèse et qui continue de faire l'objet de développements auxquels s'intéresse la communauté scientifique ; l'optimisation de protocoles, sujet important au sein de mon unité d'accueil mais pour lequel j'ai également mes propres projets. D'autres projets sont également nés au travers de collaborations diverses. Le troisième chapitre contient les éléments d'appréciation de mon parcours, cursus, intégration dans l'unité et collaborations, ainsi que la liste de publications auxquelles j'ai été associée. Le dernier chapitre du manuscrit donne un bref résumé de 10 articles récents concernant mes trois principales thématiques, et en explicite les messages majeurs ainsi que ma contribution personnelle. Une annexe séparée contient la reproduction de ces 10 articles (non jointe pour des problèmes de copyright).

Le tiludronate (Tildren, CEVA Santé Animale, Libourne, France) est un bisphosphonate récemment introduit sur le marché dans plusieurs pays européens pour le traitement du syndrome podotrochléaire (syndrome naviculaire) et de lostéoarthrose des articulations intertarsienne distale et tarso-métatarsienne (éparvin) chez le cheval. Il est le premier bisphosphonate disponible en médecine vétérinaire en général, et en médecine équine en particulier. La posologie de tiludronate qui a fait lobjet dun enregistrement dans différents pays dEurope est de 10 administrations quotidiennes consécutives de 0.1 mg/kg sous forme de bolus intraveineux (IV). Or, il ressort de la pratique courante que ladministration de la dose totale de 1 mg/kg en une perfusion lente unique est préférée par les utilisateurs pour des raisons pratiques et financières. Il ressort aussi de différentes études que cette forme dadministration est bien tolérée (Varela et al., 2002) et efficace dans certaines pathologies (Coudry et al., 2007). La première étude de ce travail a consisté en la comparaison pharmacologique de ces deux schémas posologiques. Il en est ressorti quils produisaient une même exposition plasmatique totale et des effets similaires sur le marqueur plasmatique de résorption osseuse carboxy-télopeptide du collagène de type I (CTX-1). Il en a été conclu que les dix administrations quotidiennes consécutives de 0.1 mg/kg pouvaient être remplacées par la perfusion IV lente unique de 1 mg/kg. Les bisphosphonates sont caractérisés par des propriétés pharmacologiques très spécifiques et inhabituelles, de par leur forte affinité pour los et leur stockage à long terme dans ce compartiment profond. De ce fait, les modèles PK-PD classiques qui mettent en relation mathématique les concentrations plasmatiques avec les effets du médicament sont inadaptés pour décrire le comportement pharmacologique des bisphosphonates, et il est suggéré que les concentrations osseuses doivent être davantage prises en compte pour le développement de tels modèles (Cremers et al., 2005). Dans le but final de développer un modèle PK-PD du tiludronate chez le cheval, une méthode de biopsie osseuse permettant la répétition de dosages de tiludronate osseux a été validée dans la seconde étude de cette thèse. Dans celle-ci, huit chevaux ont subi des biopsies osseuses bilatéralement en quatre sites (le tuber coxae, le métacarpien principal, la 13ème côte et los cuboïde) à différentes échéances sétalant de 1 jour à 1 an après 1 (n=4) ou 2 (n=4, à 4 semaines dintervalle) traitement(s) au tiludronate à raison de 1 mg/kg par voie IV. En chaque site, les biopsies osseuses ont été effectuées à la fois à laide dune fraise électrique de 5 mm de diamètre interne (Implanteo, Anthogyr) pour léchantillon test et dun ostéotome ou dune scie oscillante pour léchantillon de référence. Le tuber coxae sest avéré être le meilleur site de biopsie, à la fois accessible, facile à biopsier, et sur lequel les dosages de tiludronate ne présentaient pas de difficultés techniques et étaient fiables. Malheureusement, ces biopsies noffraient pas un matériel qualitativement et quantitativement suffisant que pour permettre des analyses histologiques et histomorphométriques. Dans une troisième étude, a donc été testée sur quatre chevaux la validité pour ce type danalyses dune autre technique de biopsies, utilisant un plus grand trocart que dans létude 2 (15 versus 5 mm de diamètre interne), et de type manuel. Les biopsies ont été réalisées sur cheval debout au niveau du tuber coxae immédiatement avant (côté gauche) et 48 h après (côté droit) ladministration dune perfusion IV lente de 1 mg/kg de tiludronate. Les biopsies ainsi réalisées ont permis deffectuer les analyses escomptées. Cependant, aucun effet précoce du traitement au tiludronate na pu être mis en évidence sur les paramètres histologiques et histomorphométriques étudiés. Aucun modèle expérimental équin relatif aux pathologies pour lesquelles le tiludronate a été enregistré nexiste. Or il est indispensable, pour mieux en cerner les propriétés pharmacologiques et les applications cliniques potentielles, de tester son efficacité en conditions standardisées. Limmobilisation dun membre sous plâtre est connue pour induire de lostéopénie de non usage chez le cheval (Buckingham et Jeffcott, 1991; van Harreveld et al., 2002). Dans la quatrième étude de ce travail, lefficacité clinique du tiludronate versus placebo a été testée dans les conditions standardisées dun modèle équin dostéopénie induite par immobilisation sous plâtre dun membre antérieur pendant huit semaines. Seize chevaux ont ainsi été immobilisés, dont huit ont reçu un placebo, et huit ont été traités au tiludronate à raison de 1 mg/kg en perfusion IV lente deux fois à quatre semaines dintervalle, soit en début et à mi-immobilisation. Après la période dimmobilisation, les chevaux ont été progressivement remobilisés pendant 4 semaines puis ont subi un entraînement standardisé pendant 8 semaines. Le traitement au tiludronate a permis de prévenir la chute significative de densité minérale osseuse (DMO) mesurée par absorptiométrie biphotonique à rayons X (DEXA) observée à long terme au niveau du membre immobilisé des chevaux du groupe placebo. Cet effet préventif ne sest pas marqué sur le membre controlatéral. Le tiludronate a également induit chez les chevaux traités une chute rapide et significative du taux de CTX-1 sérique, contrairement aux chevaux du groupe placebo chez qui ce taux est resté élevé pendant la quasi-totalité de limmobilisation. Aucun effet du tiludronate na été constaté sur lactivité des iso-enzymes osseuses des phosphatases alcalines (bone ALP), marqueur de formation osseuse, ni sur les caractéristiques du cortex superficiel du canon du membre immobilisé évaluées par ultrasonographie quantitative (QUS). De lensemble de ces travaux, il a été conclu que (1) le CTX-1 sanguin est un marqueur de résorption osseuse sensible et adéquat pour le suivi dun traitement au tiludronate chez le cheval ; (2) le tuber coxae est un site de biopsie osseuse adéquat pour effectuer les analyses nécessaires à lélaboration dun modèle PK-PD du tiludronate chez le cheval ; (3) le tiludronate administré deux fois à quatre semaines dintervalle à la dose de 1 mg/kg IV est capable dinhiber la résorption osseuse dans un modèle dimmobilisation chez le cheval, et la DEXA est une méthode suffisamment sensible pour lobjectiver en quelques mois ; (4) de nouvelles études pharmacologiques devraient être menées afin de documenter laccumulation osseuse et les effets du tiludronate sur différents paramètres pharmacodynamiques en cas dadministrations répétées de perfusions de 1 mg/kg chez le cheval. Pour ce faire, des techniques plus sensibles de dosage du tiludronate devraient idéalement être utilisées dans un souci dexactitude des données. Dautre part, de nouvelles études cliniques defficacité sur des chevaux souffrant de pathologies osseuses devraient être menées en incluant des mesures de CTX-1 sanguin, et si possible des mesures de DMO à différents sites dintérêt.

L’immunosuppression optimale après greffe d’organe solide est une balance délicate et propre à chaque individu entre le risque de rejet et les risques liés à une surexposition au traitement immunosuppresseur. L’évaluation de la fonction résiduelle des lymphocytes T après stimulation par un mitogène (pharmacodynamie effective) devrait permettre de mesurer l’effet direct des médicaments immunosuppresseurs sur leur cible. Nous avons étudié différents paramètres de pharmacodynamie effective chez 34 receveurs pédiatriques de greffe d’organes solides traités par tacrolimus et mycophénolate. Les tests proposés dans ce travail sont adaptés au milieu pédiatrique et à une réalisation en temps réel. La quantification du CD25 parmi les CD4 activés par l’OKT3 permet de distinguer deux groupes de patients selon leur degré d’immunosuppression. L’âge médian est plus bas et la concentration plasmatique médiane en MPA plus élevée dans le groupe de patients plus fortement immunosupprimés. L’étude des paramètres immunologiques pouvant influencer la réponse (sécrétion des interleukines, proportion des sous-populations lymphocytaires CD4, CD8, T naïfs et Trég) ainsi que l’étude du pouvoir de restauration de la fonction lymphocytaire par l’Il-2, la guanosine ou la xanthosine, ne permettent pas de mieux comprendre les variabilités interindividuelles observées. Ces résultats devront être confirmés sur une cohorte plus grande de patients afin de juger de leur intérêt en pratique clinique. / Optimal immunosuppression following solid organ transplantation is unique to each individual and requires a balance between risks of rejection and overexposure to immunosuppressive therapy. The evaluation of residual function of T lymphocytes after mitogen stimulation (effective pharmacodynamic monitoring) should allow measurement of the direct effect of immunosuppressive drugs on their target. We studied various parameters of effective pharmacodynamic monitoring in 34 paediatric patients receiving solid organ transplants and treated with tacrolimus and mycophenolate (MPA). The tests proposed in this work are adapted to the paediatric setting in real time. Quantification of CD25 among CD4 cells activated by OKT3 can differentiate two groups of patients according to their degree of immunosuppression. Median values for age and MPA plasma concentration are lower and higher, respectively, in the patient group most heavily immunosuppressed. Neither study of the parameters that may influence the response (secretion of interleukins, proportion of lymphocyte subpopulations CD4, CD8, naive and regulatory T cells) nor study of the restoration of basal cell function brought about by Il2, guanosine or xanthosine, helped to explain the observed inter-individual variability. These results should be confirmed in a larger cohort of patients in order to test their relevance in clinical practice.

Les effets des catécholamines en réanimation sont peu prédictibles. La variabilité interindividuelle des observations est d'origine multifactorielle dont des facteurs pharmacocinétiques et pharmacodynamiques, dépendant de caractéristiques constitutionnelles et acquises de chaque individu. Les posologies de l'adrénaline et de la noradrénaline chez l'enfant sont extrapolées des données adultes. Pourtant l'âge est une source de grande variabilité liée au développement. Un modèle pharmaco- statistique de l'adrénaline et de la noradrénaline a été établi chez l'enfant en insuffisance circulatoire aigüe. Il a permis d'identifier des facteurs de variabilité entre les individus ainsi que de proposer des schémas de prescription des deux molécules en fonction de l'effet souhaité et des caractéristiques de l'enfant. La pharmacocinétique de l'adrénaline chez 39 enfants en prévention du syndrome de bas débit cardiaque postopératoire suivait un modèle monocompartimental. La clairance augmentait avec le poids selon le principe de l'allométrie. Les augmentations résultantes de la fréquence cardiaque et de la pression artérielle moyenne suivaient un modèle d'effet direct Emax. Elles étaient influencées par l'âge et la gravité des patients. Les augmentations de glycémie et lactatémie suivaient un modèle d'effet indirect. Pour la noradrénaline, chez 38 enfants atteints d'hypotension artérielle systémique, la pharmacocinétique était mono-compartimentale. La clairance était influencée par le poids (allométrie). L'augmentation induite de la pression artérielle moyenne suivait un modèle direct Emax. Elle était fonction de l'âge et de la gravité des patients. Les posologies de l'adrénaline et de la noradrénaline chez l'enfant devraient tenir compte du poids, de l'âge et de la gravité du patient : plus jeune est l'enfant et plus grave est son état, plus la posologie doit être élevée pour satisfaire les objectifs hémodynamiques.

Les effets des catécholamines en réanimation sont peu prédictibles. La variabilité interindividuelle des observations est d’origine multifactorielle dont des facteurs pharmacocinétiques et pharmacodynamiques, dépendant de caractéristiques constitutionnelles et acquises de chaque individu. Les posologies de l’adrénaline et de la noradrénaline chez l’enfant sont extrapolées des données adultes. Pourtant l’âge est une source de grande variabilité liée au développement. Un modèle pharmaco- statistique de l’adrénaline et de la noradrénaline a été établi chez l’enfant en insuffisance circulatoire aigüe. Il a permis d’identifier des facteurs de variabilité entre les individus ainsi que de proposer des schémas de prescription des deux molécules en fonction de l’effet souhaité et des caractéristiques de l’enfant. La pharmacocinétique de l’adrénaline chez 39 enfants en prévention du syndrome de bas débit cardiaque postopératoire suivait un modèle monocompartimental. La clairance augmentait avec le poids selon le principe de l’allométrie. Les augmentations résultantes de la fréquence cardiaque et de la pression artérielle moyenne suivaient un modèle d’effet direct Emax. Elles étaient influencées par l’âge et la gravité des patients. Les augmentations de glycémie et lactatémie suivaient un modèle d’effet indirect. Pour la noradrénaline, chez 38 enfants atteints d’hypotension artérielle systémique, la pharmacocinétique était mono-compartimentale. La clairance était influencée par le poids (allométrie). L’augmentation induite de la pression artérielle moyenne suivait un modèle direct Emax. Elle était fonction de l’âge et de la gravité des patients. Les posologies de l’adrénaline et de la noradrénaline chez l’enfant devraient tenir compte du poids, de l’âge et de la gravité du patient : plus jeune est l’enfant et plus grave est son état, plus la posologie doit être élevée pour satisfaire les objectifs hémodynamiques. / The effects of catecholamines are difficult to predict. The between-subject variability observed in clinical setting is multifactorial including constitutional and acquired characteristics of each individual. Epinephrine and norepinephrine dosages are usually extrapolated from adult data. Yet, age is a source of high variability due to development- related phenomena. A population model of epinephrine or norepinephrine was developed in haemodynamically critically ill children. This allowed to identify between-subject variability factors as well as to propose individualized dosage regimens of these two catecholamines according to the desired effect and child characteristics. Epinephrine pharmacokinetics in 39 children at high risk of postoperative low cardiac output syndrome followed a one-compartment model. Clearance increased with bodyweight according to the allometric rule. The resulting increases in heart rate and mean arterial pressure followed a direct Emax model. These were related to age and illness severity. A turn-over model described the increases in blood glucose and lactate. Norepinephrine pharmacokinetics in 38 hypotensive critically ill children followed a one compartment model. Clearance increased with bodyweight (allometry). The resulting increase in mean arterial pressure followed a direct Emax model. This was a function of age and illness severity. The dosage of epinephrine and norepinephrine in children should take into account the bodyweight, age and illness severity of the patient: the younger the child and the more serious the condition, the higher the dosage in order to meet the haemodynamic goals.

Notre travail porte sur l’évaluation de l’utilisation et des risques associés aux neuroleptiques en population générale. Nous avons organisé notre travail selon deux approches. D’abord, de façon classique en pharmaco-épidémiologie, une « approche « pragmatique » a permis d’étudier en « vie réelle », (i) l’utilisation des neuroleptiques dans la population générale en France à partir des données de l’Echantillon Généraliste des Bénéficiaires (EGB) et de la base Midi-Pyrénées de Pharmacovigilance (BMPPV), ainsi que dans une population de femmes enceintes à partir de la base de données EFEMERIS (Evaluation chez la Femme Enceinte des MEdicaments et de leurs RISques); (ii) les risques associés à cette utilisation à partir de la BMPPV, de la base mondiale de pharmacovigilance, VigiBase® et de la base de données EFEMERIS. Deuxièmement, nous avons testé une approche originale « explicative » à partir de VigiBase®, la méthode PE-PD (PharmacoEpidémiologie-PharmacoDynamie) pouvant potentiellement mettre en évidence le mécanisme d’action de certains effets indésirables. Nous avons étudié pour cela l’exemple largement connu des mouvements anormaux induits par les neuroleptiques. Pour l’approche « pragmatique », l’analyse montre une modification de l’utilisation des neuroleptiques en population générale et chez la femme enceinte, avec un report des prescriptions des neuroleptiques de première génération (NL1G) vers ceux de deuxième génération (NL2G). Si l’utilisation reste globalement stable, on note un accroissement de l’utilisation des NL2G dans deux populations vulnérables vis-à-vis des effets indésirables : les enfants/adolescents et les femmes enceintes. Malgré le report NL1G vers les NL2G, la prescription des médicaments à fort poids atropinique est élevée et stable au cours des dernières années. Concernant les risques associés, nous n’avons pas pu confirmer dans la base EFEMERIS, le signal retrouvé dans VigiBase de malformations congénitales gastro-intestinales avec les neuroleptiques. Pour les mouvements anormaux, le risque apparait moins important avec la clozapine qu’avec les autres neuroleptiques. Des différences existent entre les classes d’âge, avec, par exemple, moins d’akathisie, mais plus de dystonie aiguë chez les moins de 18 ans. Pour l’approche « explicative », la méthode PE-PD a permis de mettre en évidence l’un des mécanismes potentiels responsables de la réduction des mouvements anormaux sous neuroleptique, à savoir l’action antagoniste sur les récepteurs sérotoninergique 5-HT2A et muscariniques M1. Notre travail de thèse nous a permis à travers l’étude des neuroleptiques de discuter, (1) d’abord au niveau méthodologique, de la complémentarité entre les bases médicamenteuses (type EGB et EFEMERIS) et les bases de pharmacovigilance pour les études d’utilisation des médicaments et des risques associés, avec, en particulier, l’opportunité d’étudier le risque malformatif des médicaments avec les bases de pharmacovigilance. Ensuite, (2), au niveau pharmacologique, de mettre en évidence la problématique du poids atropinique des prescriptions associées aux neuroleptiques sur les bénéfices et/ou les dommages. Enfin, (3), dans une approche de pharmacologie sociale, en partant des résultats de la méthode PE-PD, de discuter de la place du mécanisme d’action des médicaments dans leur évaluation, de la pharmacologie fondamentale, en passant par la pharmacologie clinique, et de son éventuelle intégration en pharmaco-épidémiologie. / Our works deals with the use of antipsychotic drugs and risks associated with their use in general population. First, a “pragmatic” approach of pharmacoepidemiology was performed to evaluate in real life, (i) the use of antipsychotics in the French general population by using data from EGB (Echantillon Généraliste des Bénéficiaires) and from the Midi-Pyrénées Pharmacovigilance database (BMPPV), as well as in pregnant women with data from EFEMERIS (Evaluation chez la Femme Enceinte des MEdicaments et de leurs RISques); (ii) the risks associated with antipsychotics by using the BMPPV, VigiBase® the World Health Organization (WHO) Global Individual Case Safety Report (ICSR) and data from EFEMERIS. Secondly, we examined an original “explanatory” approach with VigiBase®, the PE-PD method (Pharmacoepidemiologic-Pharmacodynamic method) to investigate potential mechanisms of adverse drug reactions (ADRs). We deliberately selected an ADR with a well-established mechanism – i.e. movement disorders – in order to test the validity of the PE-PD method. For the “pragmatic approach”, our analysis found marked changes in antipsychotics use both in the general population and in pregnant women, with a switch from first generation antipsychotics (FGAPs) to second generation antipsychotics (SGAPs). The use of antipsychotics in general population remained relatively constant but a raise was observed for SGAPs in two vulnerable populations concerning ADRs: children/adolescents and pregnant women. Despite the switch (from FGAPs to SGAPs), associated use of drugs with high atropinic properties was highly prevalent and constant during the recent years. Concerning risks, no association was found in EFEMERIS data, not allowing to confirm the signal of gastrointestinal congenital malformations associated with antipsychotic use described in VigiBase®. For movement disorders, the risk found was lower with clozapine than with other antipsychotics. Risks of movement disorders differed according to age classes, with less akathisia, but more acute dystonia in children and adolescents (< 18 years). For the “explanatory approach”, the PE-PD method found an inverse correlation between serotonergic 5-HT2A or muscarinic M1 receptor occupancies and reports of movement disorders involving APs. Our thesis work allowed, through the study of neuroleptics (1) first, discussing, from a methodological point of view, the complementarity between French drugs databases (EGB and EFEMERIS) and pharmacovigilance databases for studying drug utilization and risks associated, in particular the opportunity to study the risk of malformations associated with drug use; then, (2) at the pharmacological level, highlighting the issues on the benefits and / or harms of the atropinic burden of prescriptions associated with antipsychotics; finally, (3) in a social pharmacology approach, starting from the results of the PE-PD method, discussing the place of the mechanism of drug action in drug evaluation, from basic to clinical pharmacology, and its possible integration into pharmacoepidemiology.

Introduction & Objectifs : Pour assurer l’analgésie postopératoire, l’anesthésiste dispose, en plus des différentes classes de médicaments administrés par voie orale ou intraveineuse, de diverses techniques pour bloquer l’influx nerveux douloureux en administrant les anesthésiques locaux (AL) de manière centrale ou périphérique. La ropivacaïne (ROP), un AL à longue durée d’action, est un médicament de première intention partout dans le monde, en raison de sa grande efficacité et de son faible risque de toxicité. Contrairement à certains pays, la ROP n'est toujours pas indiquée au Canada pour la rachianesthésie (bloc central) en raison d'un manque de données probantes. Jusqu'à présent, les efforts de recherche ont essentiellement porté sur la sécurité ainsi que sur la durée d’action du médicament lorsqu’administré par voie spinale. De plus, les doses optimales de ROP pour l’anesthésie régionale périphérique ne sont pas encore précisément connues. La posologie devrait être adaptée au site d’administration ainsi qu’à l’intensité et la durée du stimulus produit par la chirurgie. Ultimement, cela permettrait aux cliniciens d’identifier le régime optimal en fonction des facteurs démographiques qui pourraient affecter la pharmacocinétique (PK) et la pharmacodynamie (PD) de l’AL (objectif global de ces travaux). Validation de la Méthode Analytique Manuscrit 1 : Une méthode analytique spécifique et sensible permettant de déterminer les concentrations plasmatiques de ROP a d’abord été optimisée et validée. Validation du Biomarqueur Manuscrit 2 : Nous avons ensuite mis au point et évalué la fiabilité d’une méthode quantitative basée sur la mesure du seuil de perception sensorielle (CPT) chez le volontaire sain. Ce test nécessite l’application d’un courant électrique transcutané qui augmente graduellement et qui, selon la fréquence choisie, est capable de stimuler spécifiquement les fibres nerveuses impliquées dans le cheminement de l’influx nerveux douloureux. Les résultats obtenus chez les volontaires sains indiquent que la mesure CPT est fiable, reproductible et permet de suivre l’évolution temporelle du bloc sensitif. Études cliniques Manuscrit 3 : Nous avons ensuite caractérisé, pendant plus de 72 h, l’absorption systémique de la ROP lorsqu’administrée pour un bloc du nerf fémoral chez 19 patients subissant une chirurgie du genou. Le modèle PK populationnel utilisé pour analyser nos résultats comporte une absorption biphasique durant laquelle une fraction de la dose administrée pénètre rapidement (temps d’absorption moyen : 27 min, IC % 19 – 38 min) dans le flux sanguin systémique pendant que l’autre partie, en provenance du site de dépôt, est redistribuée beaucoup plus lentement (demi-vie (T1/2) : 2.6 h, IC % 1.6 – 4.3 h) vers la circulation systémique. Une relation statistiquement significative entre l’âge de nos patients et la redistribution de l’AL suggère que la perméabilité tissulaire est augmentée avec l’âge. Manuscrit 4 : Une analyse PK-PD du comportement sensitif du bloc fémoral (CPT) a été effectuée. Le modèle développé a estimé à 20.2 ± 10.1 mg la quantité de ROP nécessaire au site d’action pour produire 90 % de l’effet maximal (AE90). À 2 X la AE90, le modèle prédit un début d’action de 23.4 ± 12.5 min et une durée de 22.9 ± 5.3 h. Il s’agit de la première étude ayant caractérisé le comportement sensitif d’un bloc nerveux périphérique. Manuscrit 5 : La troisième et dernière étude clinique a été conduite chez les patients qui devaient subir une chirurgie du genou sous rachianesthésie. Tout comme pour le bloc du nerf fémoral, le modèle PK le plus approprié pour nos données suggère que l’absorption systémique de la ROP à partir du liquide céphalo-rachidien est biphasique; c.à.d. une phase initiale (T1/2 : 49 min, IC %: 24 – 77 min) suivie (délai: 18 ± 2 min) d'une phase légèrement plus lente (T1/2 : 66 min, IC %: 36 – 97 min). L’effet maximal a été observé beaucoup plus rapidement, soit aux environs de 12.6 ± 4.9 min, avant de revenir aux valeurs de base 210 ± 55 min suivant l’administration de l’agent. Ces données ont permis d’estimer une AE50 de 7.3 ± 2.3 mg pour l'administration spinale. Conclusion : En somme, ces modèles peuvent être utilisés pour prédire l’évolution temporelle du bloc sensitif de l’anesthésie rachidienne et périphérique (fémorale), et par conséquent, optimiser l’utilisation clinique de la ROP en fonction des besoins des cliniciens, notamment en ce qui a trait à l’âge du patient. / Background & Objectives: To provide postoperative analgesia, the anesthesiologist has at his disposal a panel of different medications and also regional techniques of neural blockade. Loco-regional analgesia (central or peripheral) blocks conduction of painful influx to the central nervous system by the use of local anesthetics (LA). Among these drugs, ropivacaine (ROP), has an enormous potential given is long-acting efficacy and low incidence of toxicity. Currently, ROP is not licensed for use in spinal anesthesia (central block) in all countries due to a lack of data from controlled clinical trials. So far, research efforts on this topic have mainly focused on safety and dose-finding issues. In addition, the most appropriate dose for a peripheral nerve block has never been estimated empirically. Dosing recommendation for LAs should be site-specific and adapted to the intensity of the stimuli produced by a surgery and to the duration of analgesia required. Ultimately, these should guide clinicians in identifying the most appropriate block for the individual patients by taking into account demographic factors that may affect the pharmacokinetics (PK) and pharmacodynamics (PD) of LA overall objective of the current research) Analytical Method Validation Manuscript 1: First, a specific and sensitive assay has been developed and validated for the determination of ROP in human plasma. Biomarker Validation Manuscript 2: Second, the reliability of a neurostimulator measuring current perception threshold (CPT) was assessed in healthy volunteers. The device uses a constant transcutaneous electrical sine wave stimulus at different frequencies specific to pain-conducting fibers. Our results suggest that CPT are reliable and can be applied to characterize, in a quantitative manner, the sensory onset of a peripheral nerve block in a clinical setting. Clinical Studies Manuscript 3: The systemic absorption of ROP after a femoral nerve block in orthopedic patients was then characterized using extended rich PK-sampling, i.e. up to 4 days post-dosing. Our model used for data analysis confirms that, in a similar manner to neuraxial sites of LAs injection, the systemic absorption of ROP from the femoral space is biphasic, i.e. a rapid initial phase (mean absorption time of 25 min, % CI: 19 – 38 min) followed by a much slower phase (half-life (T1/2) of 3.9 h, % CI: 2.9 – 6.0 h). A significant age-related increase in the permeability of the LA was also observed in our elderly patients (n = 19, age = 62.6 ± 7.1 yr). Manuscript 4: A population PK-PD analysis of the sensory anesthesia (CPT) of ROP using our PK model was also performed. The effect-site amount producing 90% of the maximum possible effect (AE90) was estimated as 20.2 ± 10.1 mg. At 2 x AE90, the sigmoid Emax model predicted an onset time of 23.4 ± 12.5 min and a duration of 22.9 ± 5.3 h. To the best of our knowledge, this is the first PK-PD model developed for a peripheral nerve block. Manuscript 5: In the third and last study, a similar approach was used to characterise the PK-PD relationship of intrathecally administered ROP in patients undergoing minor lower limb surgery. The biphasic release of the agent from the intrathecal space was modeled using a rapid initial absorption phase (T1/2 of 49 min, % CI: 24 – 77 min) followed (lag-time of ~ 18 ± 2 min) by a slightly slower input rate (T1/2 of 66 min, % CI: 36 – 97 min). ROP maximal response was observed within 12.6 ± 4.9 min of dosing, with a subsequent return to baseline 210 ± 55 min after the administration of the LA. The effect-site amount producing 50 % of the Emax (AE50) was estimated at 7.3 ± 2.3 mg. Conclusion: Altogether, the proposed models can be used to predict the time-course of sensory blockade after a femoral nerve block and spinal anesthesia using ROP and to optimize dosing regimen according to clinical needs with regard to important cofactors such as age.

La circulation extracorporelle (CEC) est une technique utilisée en chirurgie cardiaque effectuée des milliers de fois chaque jour à travers le monde. L’instabilité hémodynamique associée au sevrage de la CEC difficile constitue la principale cause de mortalité en chirurgie cardiaque et l’hypertension pulmonaire (HP) a été identifiée comme un des facteurs de risque les plus importants. Récemment, une hypothèse a été émise suggérant que l'administration prophylactique (avant la CEC) de la milrinone par inhalation puisse avoir un effet préventif et faciliter le sevrage de la CEC chez les patients atteints d’HP. Toutefois, cette indication et voie d'administration pour la milrinone n'ont pas encore été approuvées par les organismes réglementaires. Jusqu'à présent, la recherche clinique sur la milrinone inhalée s’est principalement concentrée sur l’efficacité hémodynamique et l'innocuité chez les patients cardiaques, bien qu’aucun biomarqueur n’ait encore été établi. La dose la plus appropriée pour l’administration par nébulisation n'a pas été déterminée, de même que la caractérisation des profils pharmacocinétiques (PK) et pharmacodynamiques (PD) suite à l'inhalation. L'objectif de notre recherche consistait à caractériser la relation exposition-réponse de la milrinone inhalée administrée chez les patients subissant une chirurgie cardiaque sous CEC. Une méthode analytique par chromatographie liquide à haute performance couplée à un détecteur ultraviolet (HPLC-UV) a été optimisée et validée pour le dosage de la milrinone plasmatique suite à l’inhalation et s’est avérée sensible et précise. La limite de quantification (LLOQ) était de 1.25 ng/ml avec des valeurs de précision intra- et inter-dosage moyennes (CV%) <8%. Des patients souffrant d’HP pour lesquels une chirurgie cardiaque sous CEC était prévue ont d’abord été recrutés pour une étude pilote (n=12) et, par la suite, pour une étude à plus grande échelle (n=28) où la milrinone (5 mg) était administrée par inhalation pré-CEC. Dans l'étude pilote, nous avons comparé l'exposition systémique de la milrinone peu après son administration avec un nébuliseur pneumatique ou un nébuliseur à tamis vibrant. L’efficacité des nébuliseurs en termes de dose émise et dose inhalée a également été déterminée in vitro. Dans l'étude à plus grande échelle conduite en utilisant exclusivement le nébuliseur à tamis vibrant, la dose inhalée in vivo a été estimée et le profil pharmacocinétique de la milrinone inhalée a été pleinement caractérisé aux niveaux plasmatique et urinaire. Le ratio de la pression artérielle moyenne sur la pression artérielle pulmonaire moyenne (PAm/PAPm) a été choisi comme biomarqueur PD. La relation exposition-réponse de la milrinone a été caractérisée pendant la période d'inhalation en étudiant la relation entre l'aire sous la courbe de l’effet (ASCE) et l’aire sous la courbe des concentrations plasmatiques (ASC) de chacun des patients. Enfin, le ratio PAm/PAPm a été exploré comme un prédicteur potentiel de sortie de CEC difficile dans un modèle de régression logistique. Les expériences in vitro ont démontré que les doses émises étaient similaires pour les nébuliseurs pneumatique (64%) et à tamis vibrant (68%). Cependant, la dose inhalée était 2-3 fois supérieure (46% vs 17%) avec le nébuliseur à tamis vibrant, et ce, en accord avec les concentrations plasmatiques. Chez les patients, en raison des variations au niveau des facteurs liés au circuit et au ventilateur causant une plus grande dose expirée, la dose inhalée a été estimée inférieure (30%) et cela a été confirmé après récupération de la dose de milrinone dans l'urine 24 h (26%). Les concentrations plasmatiques maximales (Cmax: 41-189 ng/ml) et l'ampleur de la réponse maximale ΔRmax-R0 (0-65%) ont été observées à la fin de l'inhalation (10-30 min). Les données obtenues suite aux analyses PK sont en accord avec les données publiées pour la milrinone intraveineuse. Après la période d'inhalation, les ASCE individuelles étaient directement reliées aux ASC (P=0.045). Enfin, notre biomarqueur PD ainsi que la durée de CEC ont été identifiés comme des prédicteurs significatifs de la sortie de CEC difficile. La comparaison des ASC et ASCE correspondantes a fourni des données préliminaires supportant une preuve de concept pour l'utilisation du ratio PAm/PAPm comme biomarqueur PD prometteur et justifie de futures études PK/PD. Nous avons pu démontrer que la variation du ratio PAm/PAPm en réponse à la milrinone inhalée contribue à la prévention de la sortie de CEC difficile. / Cardiopulmonary bypass (CPB) is a technique used during cardiac surgery performed thousands of times each day worldwide. Hemodynamic complications associated with difficult separation from CPB represent a leading cause of mortality in cardiac surgery and pulmonary hypertension (PH) was identified as one of the most important predictor and risk factor. Recently, inhaled milrinone administration prior to CPB was hypothesized to have a preventive effect and facilitate separation from CPB in patients with PH. However, this indication and route of administration have not yet been approved by regulatory agencies for milrinone. So far, research efforts on inhaled milrinone have mainly focused on evidence supporting hemodynamic efficacy and safety in cardiac patients although no biomarker has been established. The most appropriate dose for nebulization has never been determined, nor have pharmacokinetic (PK) and pharmacodynamic (PD) profiles been characterized after inhalation. The objective of the current research consisted of characterizing the exposure-response relationship for milrinone administered by inhalation in patients undergoing cardiac surgery. An improved high-performance liquid chromatography (HPLC) analytical assay using UV detection was validated for the quantification of milrinone in plasma after inhalation and proved to be sensitive and accurate. The lower limit of quantification (LLOQ) was 1.25 ng/ml with mean intra-assay and inter-assay precisions (CV%) <8%. Pulmonary hypertensive patients scheduled for cardiac surgery with CPB were first recruited for a pilot (n=12) and, subsequently, a full-scale (n=28) study where milrinone (5mg) was administered by inhalation pre-CPB. In the pilot study, milrinone early systemic exposure was investigated using a jet nebulizer or a mesh nebulizer. Nebulizers performance in terms of emitted and inhaled doses were also determined in vitro. In the full-scale study, using a mesh nebulizer exclusively, in vivo inhaled dose was estimated and milrinone definite pharmacokinetics fully characterized based on blood sampling and urine collection. Mean arterial pressure to mean pulmonary arterial pressure ratio (mAP/mPAP) was selected as the PD biomarker. Milrinone exposure-response relationship was characterized during the inhalation period by studying the relationship between individual area under the effect-time curve (AUEC) and corresponding area under the plasma concentration-time curve (AUC). Finally, the mAP/mPAP ratio, among other variables, was explored as a potential predictor of difficult separation from bypass in a multiple logistic regression model. In vitro experiments demonstrated that emitted doses were similar for the jet (64%) and the mesh (68.0%) nebulizers. However, the inhaled dose was 2-3 fold higher (46% vs 17%) after mesh nebulization, which was in agreement with plasma concentrations. In patients, due to variations in circuit-related and ventilator-related factors, the inhaled dose was estimated to be lower (30%) and this was confirmed by 24-h recovery in urine (26%). Milrinone peak plasma concentrations (Cmax: 41-189 ng/ml) and magnitude of peak response ΔRmax-R0 (0-65%) were observed at the end of inhalation (10-30 min). Data obtained from PK analysis agreed with published data for intravenous milrinone. After the inhalation period, individual AUEC were directly related to AUC (P=0.045). Finally, our PD biomarker, expressed as ΔRmax-R0, as well as CPB duration, were both identified as significant predictors of DSB. The comparison of corresponding AUC and AUEC provided preliminary evidence of a proof of concept for the use of the mAP/mPAP ratio as a promising PD biomarker and warrants future PK/PD studies. Indeed, mAP/mPAP ratio variation in response to inhaled milrinone was found to contribute in the prevention of DSB.

Les immunosuppresseurs sont des médicaments ayant démontré leur efficacité dans la prévention du rejet de transplantation d’organe solide. Néanmoins, ces médicaments présentent une importante variabilité de la réponse pharmacologique notamment liée à une variation de leur pharmacocinétique. Cette variabilité peut être à l’origine d’un défaut d’efficacité du traitement ou de sur-expositions entrainant une toxicité. Le suivi thérapeutique pharmacologique (STP) des concentrations sanguines d’immunosuppresseur permet de limiter ces risques de sur ou de sous-exposition en facilitant l’adaptation de posologie de ces traitements. En dépit de l'utilisation intensive du STP des concentrations d'immunosuppresseurs chez le transplanté d'organe, la fréquence du rejet aigu a peu diminué au cours de ces dernières années et reste élevée. Le rejet aigu cellulaire peut, en outre, survenir chez le patient alors même que ses concentrations sanguines sont en zone thérapeutique. C'est pourquoi la recherche d'améliorations de ce suivi thérapeutique ainsi que la recherche de nouveaux moyens de monitoring sont des axes pertinents d'investigation en pharmacologie des immunosuppresseurs. L’objectif de ce travail de doctorat a été de développer de nouveaux outils pharmacologiques de monitoring de l’effet de deux immunosuppresseurs, l’évérolimus et le tacrolimus, dans le but de participer à la maitrise de la variabilité pharmacologique de l’effet immunosuppresseur. Pour la première fois, la pharmacocinétique de l'évérolimus chez le transplanté cardiaque a été modélisée par une approche de population. La modélisation pharmacologique est un des axes actuels d’amélioration du STP des immunosuppresseurs permettant d’évaluer l’impact de covariables démographiques, biologiques et/ou génétiques sur la pharmacocinétique de ces médicaments. L’élaboration de ce modèle doit permettre une individualisation des posologies conduisant à la limitation de la variabilité pharmacocinétique lors d’un traitement par cette molécule.Au cours de ce travail, deux méthodes analytiques ont également été développées par LC-MS/MS pour le dosage intracellulaire de l’évérolimus et du tacrolimus. La mesure des concentrations des immunosuppresseurs à l’intérieur même de la cellule, c’est à dire au niveau de son site d’action, apparait comme une mesure plus pertinente que la simple mesure des concentrations dans le sang. Ces méthodes ont ensuite été évaluées sur des petites cohortes de patients transplantés cardiaques. La faisabilité de tels dosages a été démontrée et a permis la réalisation de la dernière partie présentée au cours de ce travail. En effet, une étude clinique a été réalisée chez le patient transplanté hépatique de novo en vue de rapprocher les concentrations sanguines et intracellulaires de tacrolimus et l'effet sur la protéine cible, la calcineurine. Pour la première fois des pharmacocinétiques intracellulaires complètes ont pu être obtenues permettant la description de la cinétique intracellulaire du tacrolimus. Cette étude a également permis de mettre en évidence et de décrire la relation dose - concentration sanguine - concentration intracellulaire - effet sur la protéine cible du tacrolimus chez le transplanté hépatique. Ces travaux ont permis de jeter les bases nécessaires à la réalisation d'essais cliniques permettant d'évaluer la pertinence d'un suivi longitudinal des concentrations intracellulaires et/ou de l'activité de la calcineurine dans la prévention de rejet de transplantation. Les outils développés au cours de ce travail de doctorat visent, d’une part, à mieux appréhender la variabilité de la réponse pharmacologique au cours d’un traitement immunosuppresseur et, d’autre part, à être des outils de compréhension des mécanismes pharmacocinétiques et cellulaires de ces traitements. L'utilisation de ces outils doit concourir à la diminution de la fréquence du rejet de greffe et à l'amélioration globale de la prise en charge du patient transplanté d'organe. / Immunosuppressive drugs have proven efficacy in the prevention of acute rejection of solid organ transplantation. However, these drugs exhibit substantial variability in pharmacological response due to such a variation in their pharmacokinetics. This variability may be the cause of underexposure with a lack of efficacy or over-exposure causing toxicity. Therapeutic drug monitoring (TDM) of immunosuppressant blood levels can limit the risk of over or underexposure facilitating dosage adjustment of these treatments. Despite the extensive use of TDM, the incidence of acute rejection has declined somewhat in recent years and remains high (in the order of 8-15%). Acute cellular rejection can further occur in patients even though blood levels are within the therapeutic range. That is why improvements in the therapeutic monitoring and new ways of monitoring are relevant lines of investigation in pharmacology.The objective of this phD work was to develop new pharmacological tools for monitoring the effect of two immunosuppressive drugs, everolimus and tacrolimus in order to control the pharmacological variability of the immunosuppressive effect .For the first time, the pharmacokinetics of everolimus in heart transplant was modeled by a population approach. Pharmacological modeling is one of the current areas of improvement of immunosuppressants TDM which allows evaluating the impact of demographic, biological and / or genetic on the pharmacokinetics of these drugs covariates. The development of this model must allow individualization of dosages leading to limit pharmacokinetic variability during treatment with this drug.During this work, two analytical methods were also developed by LC-MS/MS for assaying intracellular tacrolimus and everolimus concentrations. Measuring intracellular concentrations of immunosuppressive drugs, i.e. at its site of action, appears as a more relevant than measuring blood concentrations. These methods were then evaluated on small cohorts of heart transplant patients. The feasibility of such assays has been demonstrated and led to the completion of the last part presented in this work.Indeed, a clinical study was performed in de novo liver transplant patients to evaluate blood and intracellular concentrations of tacrolimus and their effect on the target protein, calcineurin. For the first time complete intracellular pharmacokinetics have been obtained for the description of the profile of the intracellular kinetics of tacrolimus. This study also highlights and describes the relationship dose - blood concentration - intracellular concentration - effect on the target protein of tacrolimus in liver transplant patients. This work might help conducting clinical trials to assess the relevance of a longitudinal follow-up of intracellular concentrations and / or activity of calcineurin in the prevention of transplant rejection.The tools developed in this PhD work aimed, firstly, to better understand the variability of the pharmacological response in immunosuppressive therapy and, secondly, to be tools for understanding the drug mechanisms inside of the cell. The use of these tools should contribute to the decrease in the frequency of graft rejection and the overall improvement in the management of organ transplant patients.