La régulation de l'homéostasie intestinale est de la plus haute importance en raison de la constante exposition de l'intestin aux antigènes alimentaires et à la flore commensale. La perturbation de la flore intestinale est souvent associée à diverses maladies telles que l'allergie, l'obésité et certaines maladies inflammatoires. La plupart des individus sont tolérant aux antigènes alimentaires et ne développe pas de réponse immunitaire sauf en cas de prédisposition génétique ou d'exposition à un environnement défavorable. La réponse allergique se caractérise par la production d'IgE stimulé par les lymphocytes Th2. Les symptômes allergiques sont très variés et affectent plusieurs parties de l'organisme. La plupart des travaux de recherche se sont focalisé jusqu'à présent sur le rôle des cellules de l'immunité adaptative dans le développement de l'allergie en sous-estimant le rôle majeur des cellules épithéliales et des cellules de l'immunité innée. L'objectif de ce projet est de comprendre comment les cellules épithéliales intestinales modulent la réponse immunitaire à distance vers la muqueuse pulmonaire ou la peau après stimulation allergique. L'ingestion de l'antigène associé à l'adjuvant de la toxine cholérique permet d'étudier la réponse allergique chez l'animal. Nous avons démontré sur ce modèle animal que l'absence de la kinase inhibitrice IKKb dans la voie de signalisation du facteur de transcription NF-kB altère la composition de la flore intestinal d'une part et transforme la réponse immunitaire inflammatoire au niveau pulmonaire et de la peau grâce à la présence d'IgA et de lymphocyte Th17 d'autre part. En adéquation avec les observations cliniques rapportées chez les patients allergiques (allergies alimentaires, asthme, dermatite atopique), nos résultats identifient IKKb dans la cellule épithéliale intestinale comme cible potentielle pour traiter les allergies alimentaires. De futurs efforts devront être faits pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques qui considèrent la muqueuse intestinale, la production d'IgA et l'importance des bactéries commensales dans le traitement des allergies. / Immune homeostasis is of paramount importance in the gastrointestinal tract, which is constantly exposed to ingested antigens and commensal microbiota. The gut microbiota can be perturbed by endogenous or exogenous factors and it is now established that microbial dysbiosis is associated with allergy, obesity, and inflammatory diseases. Ingestion of food antigens generally fails to promote brisk immune responses but rather results in a state of immune tolerance. However, aberrant immune responses can develop in individuals with a genetic predisposition. Food allergies are generally regarded as pathologic responses to food antigens mediated by excessive Th2 responses and antigen-specific IgE antibody responses. Clinical manifestations of food allergies are very broad and symptoms can affect different organs. While past research on allergy focused on the role of cells and molecules involved in adaptive immunity, epithelial cells lining the sites of antigen entry and innate immune responses have recently emerged as important players in allergy. This project was undertaken to understand the mechanisms employed by intestinal epithelial cells (IECs) to shape immune responses to allergens and influence allergic manifestations in distant mucosal sites such as the airways or the skin. Oral administration of food antigen with cholera toxin as adjuvant in experimental animals is a well-accepted model to study allergic sensitization to food antigens. Using this model, we show that a localized impairment of the canonical NF-κB pathway through deletion of IkB kinase (IKKβ) in IECs alters the gut microbiota during oral allergic sensitization and regulates the magnitude of allergic inflammatory responses at distant sites of the airway and the skin through enhancement of IgA Abs and Th17 responses. Consistent with the clinical observations linking atopic diseases (food allergy, allergic asthma, atopic dermatitis), our results identify IKKβ in IECs as a potential therapeutic target for treatment of food allergies and subsequent disease. They also suggest that future efforts for controlling allergic responses in the airways and the skin could include strategies that use the gut microbiota and promote IgA Ab responses and prevent IL-17 responses.

Au cours de l’infection par le virus Ebola (EBOV), plusieurs glycoprotéines solubles sont massivement libérées à partir de cellules infectées mais le rôle précis de ces protéines virales n’a pas encore été identifié. Nous émettons l'hypothèse que l'altération de l’hémostase et du système et vasculaires observée au cours de l'infection à virus Ebola pourrait être, au moins en partie causée par ces glycoprotéines solubles. Ainsi pour la première fois, nous avons identifié les cibles cellulaires de la protéine soluble « shed GP » d’Ebola et nous avons démontré que sa partie glycosylé peut activer les cellules dendritiques et les macrophages non infectés, induisant, par le récepteur TLR4, la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Nous démontrons aussi que l'activité de la shed GP est neutralisé lors de l'addition de la MBL, une protéine connue pour interagir avec certains motifs glycosylés présents à la surface de différents micro-organismes. Nous avons également montré que la shed GP active la perméabilité des HUVEC de façon directe et indirecte, via la libération de cytokines. En conclusion, cette étude suggère que la shed GP peut être l'un des principaux facteurs responsables de la stimulation précoce des cellules immunitaires qui produisent alors de grandes quantités de cytokines pro-inflammatoires, des éléments qui, combinés avec la réplication massive du virus et les dommages cellulaires induits par le virus, peuvent conduire à un syndrome de type choc septique et une mortalité élevée. / During Ebola virus (EBOV) infection several soluble glycoproteins are released in high amounts from infected cells but as yet still no clear role has been identified for these viral proteins. We hypothesized that the impairment of coagulation and vascular systems observed during EBOV infection could be, at least in part, due to these soluble glycoproteins.Here, for the first time we identify the cellular targets of EBOV soluble protein shed GP and provide evidence that through its glycosylation, shed GP can activate non-infected dendritic cells and macrophages, inducing, through TLR4, the secretion of pro-inflammatory cytokines. We also demonstrate that shed GP activity is negated upon addition of Mannose-Binding sera Lectin (MBL), a molecule known to interact with sugar arrays present on the surface of different microorganisms. We have also revealed that shed GP activates permeability of HUVECs both directly and indirectly through cytokine release. Overall, this study suggests that shed GP may be one of the principal factors responsible for the early stimulation of immune cells that then produce high amounts of proinflammatory cytokines that, combined with massive virus replication and virus-induced cell damage, can lead to a septic shock-like syndrome and high mortality.

No description available.

Le risque de LH est augmenté en cas de déficit immunitaire acquis ou inné. Les déficits immunitaires innés associés à un risque accru de LH, sont les DICV (Déficit Immunitaire Commun Variable), XLP (Syndrome lymphoprolifératif lié au chromosome X) et ALPS (Syndrome lymphoprolifératif Autoimmun). L’objectif de notre travail était d’évaluer la prévalence de ces déficits immunitaires chez des enfants atteints de LH. Nous avons reçu, 395 prélèvements de patients atteints de LH au diagnostic. L’âge médian de la population étudiée est de 13 ans, allant de 3 à 18 ans. Le sex-ratio M/F est de 1.1. Il augmente à 3 au dessous de l’âge de 10 ans. Parmi les biopsies (n=84) qui ont été relues, 87% sont de type scléro-nodulaires (SN), 7% à cellularité mixte (CM) et 6% non spécifié. L’EBV est détecté in situ dans 23% des cas de LH. Les patients atteints de LH-EBV+ sont significativement plus jeunes que ceux atteints de LH-EBV- (p=3.10-4). Ce sont plus fréquemment des garçons que des filles (63% ; M/F : 1,7) et fréquemment de sous-type CM (40%). Enfin, ils ont une charge virale EBV significativement plus élevée (p=3.10-3) que les enfants qui ont un LH-EBV-.Parmi les 83 premiers enfants analysés, un immunophénotypage approfondi a montré une diminution de la population lymphocytaire par rapport aux témoins et une lymphopénie B fréquente (31 patients sur 83 soit 37% des patients). La lymphopénie B était corrélée aux facteurs pronostiques connus du LH. Dans un cas parmi les 31, une baisse des immunoglobulines a été mise en évidence ce qui est évocateur de DICV. Nous avons montré que dans les autres cas, les lymphopénies se corrigeaient à distance de la maladie. La recherche de profil cytokinique associé à ces lymphopénies (TGF, BAFF, IL-7) n’a pas permis de mettre en évidence de mécanisme physiopathologique simple pour expliquer ces lymphopénies. Nous émettons l’hypothèse qu’elles sont liées à l’exposition au contact des cellules tumorales à des signaux favorisant l’apopotose.En ce qui concerne la recherche d’autres déficits immunitaires innés, aucun cas évocateur de XLP n’a été mis en évidence sur la base de la quantification des lymphocytes NKT. Cinq cas parmi les 83 (6%) avaient une expansion de lymphocytes T DN (Lymphocytes TCRαβ CD4-CD8-) dans le sang périphérique. Des dosages de Fas ligand et d’IL-10 plasmatiques ont permis d’exclure un ALPS. Au total, nous n’avons pas pu affirmer de défaut qualitatif des sous-populations lymphocytaires évoquant les déficits immunitaires de type XLP et ALPS. Seule une lymphopénie B avec baisse des IgG est évocatrice de DICV. Nous avons étendu l’analyse à l’ensemble des patients (395patients) avec un contrôle à distance du diagnostic pour ceux qui étaient anormaux. Nous avons identifié 4 patients potentiellement atteints de DICV, 1,5%. Parallèlement, nous avons recherché un déficit de la réponse T anti-EBV par cytomètrie de flux et l’Elispot. L’étude de la réponse T anti-EBV par la cytométrie de flux, a montré une tendance vers une baisse de la production d’IL-2 par les CD4 et les CD8 de patients avec une charge virale EBV élevée en réponse à une stimulation par des peptides EBV en présence de lignées autologues. L’étude de la réponse T anti EBV par la technique d’ELISPOT sur 9 patients n’a pas montré globalement de déficit du contrôle de l’EBV sauf pour une jeune patiente de 10 ans ayant une charge virale EBV très élevée sans réponse T anti-EBV efficace. Les résultats que nous avons obtenus restent à approfondir, ce qui permettra d’enrichir les connaissances actuelles sur cette pathologie. / Hodgkin’s Lymphoma (HL) is one of the most frequent lymphomas occurring in childhood. In young children, there is a high predominance in boys and frequent association with Epstein-Barr Virus (EBV). Cohort studies have shown that patients affected by several immune deficiency syndromes - e.g. X-linked lymphoproliferative syndrome (XLP), functional deficit of Fas/FasL pathway and common variable immunodeficiency (CVID) - are risk factors of HL. We intend to search for qualitative and quantitative immune deficiencies as susceptibility factors to child's HL in a prospective study related to Euronet –PHL C1 protocol. Eighty-three patients at diagnosis of HL have been analysed. Median age of the study population is 13 years, (5-18 years). Gender-ratio M/F is 1.1 with a larger male predominance before the age of 10 (gender-ratio of 3). The search for a defect of NKT population that would be suggesting of XLP was negative in all patients. A moderate expansion of circulating TCRαβ+ double negative cells (DNT) has been detected in 5 patients. This expansion has been further explored in the hypothesis of a defect of Fas/FasL pathway by plasmatic quantification of Fas ligand and Il-10. This led to the exclusionof the diagnosis of ALPS. An unexpected high frequency of B-cell lymphopenia has been detected in 31 out of 83 patients (37%). Peripheral B cell lymphopenia was associated with the following poor prognostic factors: advanced stages (p<0.04), low hemoglobin (p<0.06) and B symptoms (p<0.01). B-cell lymphopenia was not statistically correlated with morphology (subtype, amount of tumor cells and necrosis). Remarkably, B-lymphocytic counts were significantly higher in patients with in situ EBV (<0.05).Only a B lymphopenia with low IgG level suggesting DICV was detected. We extended the analysis to all the 395 patients included in the protocol EURONET, so we identified 4 patients with CVID. These cases will be further explored by molecular analyses. In parallel, the specific T-cells response against EBV was studied by flow cytometry in 15 patients and ELISPOT assay in 9 patients with HL. Flow cytometry , suggested a decrease in production of IL-2 by CD4 T cells in patients with high EBV viral load in response to EBV latent and lytic-cycle peptides and autologous lymphoblatoid cells lines compared to controls or patients with LH-EBV-. The ELISPOT-IFNγ assay was used to determine the frequency of T cells that produced IFNγ in response to peptides. One patient demonstrated inappropriate EBV-specific T-cell IFNγ production (<10 IFNγ secreted T cells and >1,000 EBV copies per 250000 PBMCs). These cases will be further explored by molecular analyses.Our findings confirm the known epidemiological data of HL now mainly associated to NS subtype in children and adolescents and EBV status in HL at this age. We show that peripheral B cell lymphopenia in paediatric and adolescent HL patients is frequent and associated with poor prognosis factors. We confirm the association between CVID and HL.

En dehors des effets cytostatiques ou cytotoxiques sur les cellules tumorales, certaines thérapies anti-cancéreuses peuvent déclencher la mort cellulaire immunogénique, libérant les signaux de danger pour alerter le système immunitaire. Les cellules T CD8+ T (Tc1) productrices d’IFN- et spécifiques de la tumeur sont nécessaires pour le succès de la chimiothérapie et la diminution de la croissance tumorale. L’amorçage d’une réponse bénéfique Tc1 dépend de la sécrétion d'IL-1β par les cellules dendritiques confrontées à des cellules tumorales traitées avec de l’anthracycline libérant de l’ATP. Pour identifier les composants inflammatoires qui lient les réponses immunitaires innées et adaptatives, nous avons analysé l'influence de la chimiothérapie immunogène sur le microenvironnement de la tumeur. Nous avons identifié une up-régulation de gènes associés à la réponse Th1 et Th17 dans un modèle de tumeur répondant au traitement par les anthracyclines par un retard de croissance. En interférant avec les voies IFN- ou l'IL-17A, l'effet thérapeutique de la doxorubicine et l'oxaliplatine a été aboli et le vaccin à base de cellules tumorales mortes ne protège plus les souris de la réintroduction de cellules tumorales vivantes. Nous avons également découvert que des sous-populations distinctes de lymphocytes T  (V4+ et V6+) colonisent des tumeurs peu de temps après la chimiothérapie, où ils ont proliféré et sont devenus producteurs majeurs de l’IL-17 au sein de la tumeur. Nous avons constaté une forte corrélation entre la présence de lymphocytes T  producteurs d’IL-17 ( T17) et de TIL CD8+ (Tc1) dans trois modèles différents de tumeurs traitées par la chimiothérapie ou la radiothérapie. IL-17A agit sur la signalisation en amont de l'IFN- puisqu’un défaut d’expression d’IL-17RA conduit à la perte complète de la production des Tc1 spécifiques de l’antigène. La contribution des cellules  T17 (V4+ et V6+) dans l’effet bénéfique de la chimiothérapie est essentielle puisque les souris V4/6-/-. L’axe IL-1β/IL-1R, mais pas IL-23/IL-23R, est essentielle pour la production d'IL-17 par les cellules T et l’effet bénéfique de la chimiothérapie. Le transfert adoptif de lymphocytes  T peut rétablir l'efficacité de la chimiothérapie dans le modèle de souris IL-17A-/- et améliorer l'effet de la chimiothérapie chez la souris wt, s'ils conservent l'expression de l'IL-1R et de l'IL-17A. Nos résultats suggèrent l’existence d’un axe fonctionnel: DC (IL-1β) → cellules T (IL-17) → Tc1 (IFN-), déclenché par la chimiothérapie induisant la mort des cellules tumorales, phénomène essentiel pour une réponse thérapeutique favorable. Pour renforcer la réponse immunitaire, nous essayons de combiner la chimiothérapie « immunogène » avec le vaccin anti-tumoral en présence d’adjuvants (poly (A:U), l'agoniste de TLR3).Ce type de thérapie séquentielle combinée, appelé VCT, pourrait retarder considérablement la croissance des tumeurs, voire l’éradiquer complètement et établir une protection spécifique à long terme. Pour décortiquer l'effet de la poly (A:U) sur le système immunitaire et sur les cellules tumorales exprimant le TLR3, nous avons effectué un traitement VCT chez la souris nude, TRIF-/- et les souris présentant une diminution de l’expression de TRIF au niveau des cellules tumorales. Ainsi l'effet anti-tumoral de VCT requiert les lymphocytes T et la voie de signalisation TRIF intacte au niveau de l'hôte et des cellules tumorales. Le traitement poly (A:U) peut induire un niveau élevé de production de certaines chimiokines associées à la réponse de type Th1 (CCL5 et CXCL10 ) par les cellules tumorales in vitro et in vivo, ce qui peut influencer négativement et positivement les résultats thérapeutiques. Le découplage de l’action de CCL5 et de XCL10, pourrait améliorer le traitement par la VCT. Notre étude souligne ainsi le rôle des facteurs inflammatoires dérivés de la tumeur et de l’hôte dans la régulation de la réponse immunitaire anti-tumorale. / Besides exerting cytostatic or cytotoxic effects on tumor cells, some anti-cancer therapies (anthracyclines, oxaliplatin, X-Rays) could trigger an immunogenic cell death modality, releasing danger signals to alert immune system. We have shown that tumor-specific IFN- producing CD8+ T cells (Tc1) are mandatory for the success of chemotherapy to prevent tumor outgrowth. Priming of Tc1 response depends on IL-1β secretion by DC confronted with anthracycline-treated tumor cells releasing ATP. To identify the inflammatory components which link innate and cognate immune responses, we analyzed the influence of immunogenic chemotherapy on tumor microenvironment. We found an upregulated Th1- and Th17-related gene expression pattern in growth-retarded tumor after anthracycline treatment. By interfering with IFN- or IL-17A pathways, therapeutic effect of doxorubicin and oxaliplatin was abolished and dying tumor cell-based vaccine lost its efficacy to protect mice from live tumor cell rechallenge. Interestingly, we discovered that distinct subsets of  T lymphocytes (V4+ and V6+) colonized tumors shortly after chemotherapy, where they proliferated and became the dominant IL-17 producers within tumor beds. In three tumor models treated with chemotherapy or radiotherapy, a strong correlation between the presence of IL-17-producing  T ( T17) and IFN--producing CD8+ TIL (Tc1) was discovered. IL-17A signaling acts as upstream of IFN- since defect in IL-17RA led to complete loss of antigen specific Tc1 priming. The contribution of  T17 cells (V4+ and V6+) to chemotherapy is critical as V4/6-/- mice showed reduced sensitivity to chemotherapy and vaccination. Also, tumor infiltrating  T17 and Tc1 cells were reduced to basal level in this strain. IL-1β/IL-1R, but not IL-23/IL-23R, is pivotal for IL-17 production by  T cells and the success of chemotherapy. Importantly, adoptive transfer of  T cells could restore the efficacy of chemotherapy in IL-17A-/- mice and ameliorate the effect of chemotherapy in wild type host, provided that they retain the expression of IL-1R and IL-17A. Our research suggest a DC (IL-1β) →  T cells (IL-17) → Tc1 (IFN-) immune axis triggered by chemotherapy-induced dying tumor cells, which is critical for the favorable therapeutic response. To boost the immune system, we try to combine immunogenic chemotherapy with tumor vaccine in the presence of TLR3 agonist Poly (A:U). This sequential combined therapy, which we named VCT, could significantly retard tumor growth or even completely eradicate tumor and establish long-term protection against rechallenge in highly tumorigenic models. To dissect the effect of Poly (A:U) on immune system and that on TLR3 expressing-tumor cells, we performed VCT treatment in nude mice, TRIF-/- mice and with TRIF-silencing tumors. Interestingly, our results suggested that anti-tumor effect of VCT required T cells and intact TRIF signaling pathway at the level of the host and that of tumor cells. Poly (A:U) treatment could induce high level of CCL5 and CXCL10 production from tumor cells both in vitro and in vivo, which could negatively and positively influence the therapeutic outcome. By uncoupling the effect of CCL5 from that of CXCL10, the VCT treatment can be ameliorated. Our study emphasizes that both tumor and host derived inflammatory factors participate in regulating anti-tumor response. We also highlight that therapeutic application of TLR agonists can be optimized through regulating the profile of chemokines and their downstream signaling events.

Au cours de la réponse immunitaire antitumorale, l’instabilité génétique des tumeurs combinée à la pression de sélection du système immunitaire peut conduire, via l’immunoediting, à l’émergence de variants tumoraux résistants à la lyse par les effecteurs cytotoxiques. Une meilleure compréhension de ces mécanismes potentiellement impliqués dans la susceptibilité tumorale à la lyse naturelle et/ou spécifique pourrait permettre le développement de stratégies d’immunothérapie intégratives plus efficaces. Dans ce cadre nous avons étudié un modèle de résistance à la lyse spécifique impliquant un remaniement du cytosquelette d’actine (i). Nous avons pu mettre en évidence que l’inhibition conjointe de protéines interagissant avec l’actine (caldesmone, ézrine, radixine et moésine) générait une réduction de la susceptibilité des cellules tumorales à la lyse par les lymphocytes T cytotoxiques (CTLs). Parallèlement, nous avons identifié les microARNs différentiellement exprimés entre le variant résistant et la lignée parentale et étudié leur implication dans la susceptibilité tumorale à la lyse par les CTLs. Dans le but de déterminer le rôle d’une pression de sélection par les cellules tueuses naturelles (NK pour Natural Killer), de l’immunité innée, sur les cellules tumorales et l’émergence de variants résistants, nous avons aussi établi un modèle de coculture continue de cellules tumorales de mélanomes avec des cellules NK (ii). Les cellules tumorales obtenues sont résistantes à la lyse NK (mais toujours sensibles à la lyse spécifique par un clone lymphocytaire T cytotoxique) et établissent moins de contact et de synapse immunologique avec les cellules NK que la lignée parentale. L’analyse transcriptomique a révélé la baisse d'expression de B7-H6 (ligand d'un récepteur activateur des cellules NK) qui contribue partiellement au phénomène de résistance. De nombreux gènes impliqués dans les phénomènes de migration/invasion/adhérence sont également modulés et certaines propriétés cellulaires (croissance en milieu semi-solide, adhérence, migration) semblent refléter l’acquisition d’une agressivité tumorale accrue suite à la coculture. Nous avons finalement analysé l’impact sur la réponse antitumorale de la connexine-43, impliquée dans la formation des jonctions communicantes (GJ pour Gap Junction) (iii). Nous avons montré que sa présence à la synapse entre cellules tumorales et CTL n'exerce aucun impact sur la susceptibilité à la lyse. Néanmoins, les GJs sont impliquées dans l’émergence par stimulation antigénique de lymphocyte T CD8+ spécifique hautement réactif. / During antitumor immune response, cancer cells genetic instability combined with immune system selective pressure may drive to the emergence of tumor variant resistant to lysis by cytotoxic effector cells through a phenomenon called immunoediting. A better understanding of those mechanisms putatively involved in tumor susceptibility to natural and/or specific lysis would enable new integrative and more effective immunotherapeutic strategies. In this context, we studied a model of resistance to specific lysis linked to actin cytoskeleton remodeling (i). We showed that combined inhibition of actin interacting protein (caldesmone, ezrin, radixin and moesin) reduced tumor cells susceptibility to cytotoxic T lymphocytes (CTLs) lysis. Moreover, we identified microRNAs differentially expressed between parental cell line and resistant variant and are currently studying their impact on tumor susceptibility to CTLs lysis. In order to depict the role of innate immunity Natural Killer (NK) cells selective pressure, on tumor cells and on the emergence of resistant variants, we also established a maintained coculture model of melanoma cells with NK cells (ii). Selected cells obtained were resistant to NK cells-mediated lysis (but still susceptible to CTLs-mediated specific lysis) and formed less contact and immune synapse with NK cells than parental cell line. Transcriptomic analysis revealed the reduced expression of B7-H6 (ligand of an NK cells activating receptor) partially contributing to the resistance phenotype. The expression of several genes involved in migration/invasion/adhesion is also modulated and some cell characteristics (cell growth in semi-solid medium, adhesion, migration) tend to reflect the acquisition through coculture of an increased aggressiveness. Finally, we evaluated the impact of connexin-43 (Cx43), involved in the establishment of Gap Junctions (GJs), on antitumor response (iii). We showed that despite localization at the immune synapse between tumor target cell and CTL, Cx43 and GJs do not modulate susceptibility to CTL-mediated specific lysis. Nevertheless, GJs contribute to the emergence of highly reactive specific CD8+ T lymphocytes following antigen stimulation.

Les élevages des poissons sont soumis à des épisodes de mortalité anormale. Les bactéries du genre Vibrio sont connues comme des pathogènes opportunistes et ont été associées à ces épisodes de mortalité. Pour faire face à ces problèmes d’épizooties, les pisciculteurs ont le plus souvent recours à l’utilisation des antibiotiques. Néanmoins, des abus dans son utilisation ont malheureusement conduit à l’apparition des souches résistantes et à des fréquents échecs de traitement. Actuellement, les traitements par des bactéries lactiques probiotiques permettent d’améliorer la qualité des alevins produits pour les besoins de l’aquaculture, tout en limitant le recours aux antibiotiques. Pour qu’un micro-organisme soit reconnu comme étant potentiellement probiotique, une évaluation de ce produit basée sur plusieurs critères doit être établie. Dans une première étape, nous avons sélectionné et caractérisé 55 souches de bactéries lactiques isolées en écloserie. Le premier critère de sélection a porté sur l’inhibition de souches de vibrions pathogènes in vitro. Les bactéries lactiques ayant un effet anti Vibrio ont subi des tests de formation de biofilms et des tests de caractérisations phénotypiques, enzymatiques, physiologiques et génétiques, afin de procéder à leur identification. Puis des tests de compétition avec V. aligonlyticus ont été pratiqués in vivo sur des larves d’Artemia. Ce travail nous a permis de sélectionner la souche Lactobacillus casei (X2), car elle présentait la meilleure combinaison de propriétés requises pour un probiotique. Elle possède en effet une bonne activité antagoniste, elle n’est pas hémolytique, elle présente une forte adhérence sur plaque polystyrène et elle offre la meilleure protection contre V. alginolyticus lors du test de challenge avec Artemia. Dans une deuxième étape, la souche retenue (La. casei X2) et une autre déjà commercialisée sous le nom de Bactocell (Pediococcus acidilactici) ont été testées sur des larves de bar, afin d'évaluer les effets sur la qualité des alevins, leur réponse immunitaire et la microflore associée. Nous avons vérifié que les deux probiotiques (La. Casei et P. acidilactici) diminuaient la charge en vibrions et en microflore totale chez les larves de bar. La souche P. acidilactici a également affecté les profils de la communauté bactérienne intestinale des larves de bar. Par contre, La. casei n’a pas affecté la structure de la communauté bactérienne, bien que la souche soit présente chez les larves au jour 40 à une concentration élevée. Ces deux bactéries ont pu améliorer la croissance en longueur des larves aux jours 30 et 45 et la croissance en poids au jour 20. L’étude de l’influence des deux probiotiques sur des marqueurs de la physiologie des larves a montré qu’au jour 41, P. acidilactici était plus efficace que La. casei dans la régulation du stress oxydatif. Néanmoins, P. acidilactici a engendré des effets inflammatoires chez les larves à j20, et elle a induit un retard dans le développement osseux. Bien que La. casei ait accéléré le processus d’ossification chez les larves à j20, l’étude histopathologique a révélé une forte incidence des malformations vertébrales avec les larves à j62. A l’inverse, les larves alimentées avec P. acidilactici ont présenté un taux supérieur d’ossification normale et complète. / Diseases cause major production losses in fish farms. Bacteria of the genus Vibrio are known as opportunistic pathogens, and have been associated with mass-mortality episodes. To cope with these disease outbreaks, fish farmers often resort to the use of antibiotics. However, preventive overuse has led to the emergence of resistant strains and frequent treatment failures. Probiotic lactic acid bacteria are increasingly used to improve the quality of seed production in aquaculture, while limiting antibiotic treatments. Microbial strains must fulfil several criteria to be evaluated as potential probiotics.In a first step, we selected and characterized 55 strains of lactic acid bacteria isolated from fish hatchery. The first selection criterion focused on the in-vitro inhibition of pathogenic Vibrio strains. Lactic acid bacteria with antagonistic properties were tested for biofilm formation. The strains were characterised with the phenotypes, based on enzymatic and physiological tests, and identified by genotyping. In-vivo challenges with Vibrio aligonlyticus were then performed on Artemia. Lactobacillus casei X2 was thus selected, due to the best combination of the attributes that are required for probiotics. The strain showed antagonistic activity, adhered strongly to polystyrene plate, and secured Artemia with the best protection against V. alginolyticus. In a second step, La. casei X2 and a commercial strain of probiotics (Bactocell, Pediococcus acidilactici) were tested on European sea bass larvae, with a view to assess the effects on alevin quality, immune response and associated microbiota. Both of the lactic acid bacteria, La. casei and P. acidilactici, decreased the bacterial load and Vibrio in sea bass larvae. P. acidilactici changed significantly the profile of the bacterial community associated with fish larvae, compared to the control group. La. casei did not affect the structure of the bacterial community, although the strain was detected at high concentration in the larvae at 40 day post hatch (dph). Both probiotic treatments increased fish larval growth in body mass at 20 dph, and in length at 30 and 45 dph. Two physiological markers for gene expression suggested that P. acidilactici was more efficient than La. casei for the regulation of oxidative stress in sea bass at 41 dph. P. acidilactici induced some delay in bone development, and inflammatory signs were observed in the larvae at 20 dph. Though La. casei accelerated the early ossification process in the larvae by 20 dph, the histopathological study revealed a high incidence of vertebral malformations at 62 dph. In contrast, the treatment with P. acidilactici produced the highest proportion of fish with normal and complete ossification.

Le virus de l’hépatite B (HBV) est l’agent étiologique de l’hépatite B. Ce virus est responsable d’hépatite chronique B, de cirrhose et de cancer du foie au niveau mondial. L’absence d’activation de la voie Interféron (IFN) suite à l’infection par HBV est encore mal comprise. Récemment, le senseur cellulaire cytosolic GMP-AMP synthase (cGAS) a été décrit comme un senseur efficace de DNA double brin possédant également une activité antivirale envers des virus à ADN et à ARN. Le but de mes travaux de thèse a été de contribuer à la compréhension des relations existants entre le HBV et cGAS, à des stades précoces et tardifs de l’infection HBV en utilisant des expériences de perte- et gain- de function ainsi que du profilage génomique des génes apparentés à cGAS dans un modéle cellulaire permissif au HBV. Mes travaux ont démontré (1) que cGAS exerce une forte activité antivirale envers le HBV incluant une réduction de la forme nucléaire du génome, le cccDNA; (2) alors que le rcDNA génomique nu est reconnu par la voie cGAS/STING et induit une réponse IFN efficace, la nucléocapside virale protège le DNA génomique viral et l’empêche d’être détecté par la réponse immunitaire innée; et (3) que l’infection par HBV diminue l’expression des acteurs de la voie cGAS-STING et des gènes impliqués dans la réponse immunitaire innée in vitro et in vivo. Ce dernier point met en lumière le rôle de cGAS dans un nouveau mécanisme d’échappement du HBV au système immunitaire inné dans les cellules hépatocytaires et dans ce mécanisme. / Chronic hepatitis B virus (HBV) infection is a major cause of liver disease and cancer worldwide. The mechanisms of viral genome sensing and the evasion of innate immune responses by HBV infection are still poorly understood. Recently, the cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) was identified as a DNA sensor. In this PhD work, we aimed to investigate the functional role of cGAS in sensing of HBV infection and elucidate the mechanisms of viral evasion. We performed functional studies including loss- and gain-of-function experiments combined with cGAS effector gene expression profiling in an HBV infection-susceptible cell culture model. Collectively, our data show that (1) the cGAS-STING pathway exhibits robust antiviral activity against HBV infection including reduction of viral cccDNA levels; (2) naked HBV genomic rcDNA is sensed in a cGAS-dependent manner whereas packaging of the viral genome during infection abolishes host cell recognition of viral nucleic acids; (3) HBV infection down-regulates the cGAS/STING pathway actors as well as innate immune effector gene expression in vitro and vivo. Overall, this work led to describing new aspects of the complex interaction between HBV and the DNA sensor cGAS in hepatocytes.

Seconde espèce de mollusque bivalve la plus exploitée au monde, la palourde japonaise Venerupis philippinarum représente un intérêt économique majeur. A l’échelle du bassin d’Arcachon, la maladie du muscle marron ou BMD (pour Brown Muscle Disease), pathologie émergente découverte en 2005 inquiète tout particulièrement le secteur de la pêche. Cette pathologie affecte le muscle adducteur postérieur de la palourde et perturbe l’ouverture-fermeture des valves. Cette perturbation entraine la remontée des individus à la surface du sédiment et la mort.Ces travaux de thèse ont porté d’une part sur l’épizootiologie de la maladie et son impact sur l'hôte et d’autre part sur l’identification de l’agent responsable de la maladie.Une étude sur la distribution des palourdes dans le bassin d’Arcachon (littoral Atlantique français) montre que la prévalence de la BMD a diminué entre 2010 et 2012. Toutefois cette baisse ne concerne pas les individus ayant atteint la taille légale de pêche (> 35mm). De plus, la maladie semble apparaitre chez des individus de plus en plus petit et risque donc d’accroitre la mortalité aux plus jeunes stades. L’analyse des facteurs environnementaux impliqués dans la distribution de la maladie souligne la corrélation entre la prévalence de la BMD et un hydrodynamisme relativement « calme ».La BMD affecte tout particulièrement le métabolisme énergétique de l’hôte, les mécanismes de réponse au stress oxydant et également le système immunitaire. De nombreuses fonctions sont surexprimées chez les hôtes malades mais d’autres voies comme celle de l’apoptose sont régulées négativement par l’agent infectieux.Si l’origine virale est maintenant une hypothèse solide (microscopie électronique, transcriptomique), la nature exacte de l’agent étiologique (famille virale) ne peut à ce jour être déterminée avec certitude. Des particules virales ont bien été observées dans les tissus malades mais pas dans les tissus sains, et ont pu être purifiées sur gradient de sucrose. Toutefois, les essais pour provoquer la maladie chez des individus sains ont échoué. / The Manila clam Venerupis philippinarum is the second most exploited mollusk bivalve in the world and represents a major economic interest. At the scale of Arcachon bay, the Brown Muscle Disease or BMD, an emergent pathology discovered in 2005, concerns fishing activity. This pathology affects the posterior adductor muscle of the clam and disrupts the valve opening and closing process. It induces the migration of clams to the surface and their death.This thesis concerns on the one hand the epizootiology of the disease and its impact on host and on the other hand the identification of the causal agent of the disease. A study of the clam distribution in Arcachon bay (French Atlantic coast) shows that prevalence of BMD decreased between 2010 and 2012. However this decrease doesn't affect clams of the legal harvesting size (> 35mm). Furthermore, the disease seems to appear in individuals with increasingly smaller size and thus risks to increase mortality in the youngest stages. The analysis of the environmental factors that are involved in the disease distribution highlights the correlation between prevalence of the BMD and relatively "quiet" hydrodynamism.BMD particularly affects the energy metabolism of the host, the oxidative stress response mechanisms and the immune system.Many functions are up-regulated in the BMD-affected hosts but other ways, as the apoptosis, are down-regulated by the infectious agent.Although viral origin of BMD is now a convincing hypothesis (electronic microscopy, transcriptomic), the nature of the etiological agent (viral family) cannot so far be determined with certainty. Viral particles were observed in tissues of BMD-diseased hosts but not in tissues of healthy host. They have been purified on sucrose gradient. However, the attempt to provoke the disease in healthy individuals failed.

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