Orientadores: Joyce Maria Annichino-Bizacchi, Nelci Fenalti Hoher / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T09:49:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pazzini_Carla_M.pdf: 2143259 bytes, checksum: b3ff6eb2527b691a4021526983ef2aeb (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A heparina é um anticoagulante amplamente empregado no tratamento e profilaxia da trombose venosa profunda (TVP). Algumas limitações do seu uso são o custo e a via de administração, endovenosa ou subcutânea, às vezes em doses repetidas em 24 horas. Assim, o desenvolvimento de um produto que possa ser administrado por via subcutânea em um menor número de aplicações ou por via oral, torna-se um importante desafio, e de grande aplicabilidade clínica. A utilização de um sistema de liberação sustentada de fármacos pode vir ao encontro desse objetivo, pois permite que o agente seja protegido e liberado gradativamente. Este projeto consistiu na preparação e caracterização de nanopartículas biodegradáveis de poli (e-caprolactona) (PCL) como carreador de heparina de baixo peso molecular, e avaliação de sua atividade anticoagulante e antitrombótica in vivo. As nanopartículas foram preparadas pelo método de dupla emulsão a/o/a e evaporação de solvente. A caracterização das nanopartículas foi realizada por microscopia eletrônica de varredura (MEV), observando-se nanopartículas esféricas e homogêneas. O diâmetro médio das nanopartículas foi de 269 ± 36 nm e o potencial zeta foi de -1,20 ± 1,93 mV, indicando que as mesmas apresentam carga negativa. A eficiência de encapsulação, analisada pelo método Azure II, foi de 80 ± 2,3%. A liberação da heparina in vitro, avaliada pelo método de Azure II, no período de 24 horas foi de 4 ± 1,8%. Após a adição da esterase houve um aumento para 10 ± 1,9% na liberação de heparina, provavelmente pela aceleração da degradação das partículas pela enzima. A liberação in vivo da heparina encapsulada, após aplicação subcutânea em ratos, foi avaliada pela atividade anti-Xa plasmática através do método colorimétrico, e os resultados foram comparados aos obtidos com heparina livre. A dose de heparina encapsulada teve que ser 5 vezes maior que a dose de heparina livre. A heparina encapsulada em nanopartículas apresentou uma liberação sustentada por até 12 horas, por um período significativamente mais prolongado (P<0,01), mas com menor atividade anti-Xa. Esses dados sugerem que as nanopartículas podem permitir que a heparina seja liberada de uma forma mais gradual, e mesmo em dose mais elevada, não parece estar associada a um risco de atividade acima da faixa terapêutica. Quando se comparou a atividade anti-Xa obtida pela injeção subcutânea de nanopartículas com heparina em doses diversas, 800 UI/Kg e 1000 UI/Kg, ficou demonstrado que o efeito e o tempo de ação dependem da dose aplicada. Para avaliação da ação antitrombótica foi padronizado o modelo de TVP por estase em ratos. As doses de nanopartículas empregadas para a avaliação da ação antitrombótica foram calculadas pela atividade anti-Xa semelhante à obtida com a heparina livre, de 0,3 a 0,7 UI/mL. A heparina livre ou encapsulada em nanopartículas foi aplicada em uma única dose, por via subcutânea. Os resultados mostraram que houve diminuição significativa do trombo formado com a utilização de heparina livre, em comparação ao grupo controle (P=0,004). Praticamente não houve a formação de trombose venosa em nenhum dos ratos que receberam a heparina encapsulada em nanopartículas, com uma diferença significativa tanto em relação ao grupo controle (P<0,001) como ao grupo com heparina livre (P<0,001). Em resumo, o método de dupla emulsão a/o/a mostrou-se um método eficiente para o encapsulamento de heparina, proporcionando a obtenção de nanopartículas esféricas e com alta eficiência de encapsulação. Pelos estudos in vivo, a heparina encapsulada não liofilizada mostrou uma liberação sustentada, por um período superior ao obtido com a heparina livre, e com excelente ação antitrombótica. Caso esses resultados se confirmem através da continuidade deste estudo, a utilização de heparina encapsulada em nanopartículas na prática clínica poderá ser uma realidade com grandes vantagens para o paciente. / Abstract: Heparin is an anticoagulant widely used in the treatment and prophylaxis of deep vein thrombosis (DVT). Some limitations of its use is the cost and route of administration, intravenous or subcutaneous, sometimes in repeated doses in 24 hours. Thus, the development of a product that can be administered subcutaneously in a smaller number of applications or orally becomes a major challenge, with interesting clinical applications. The use of a system for sustained release of drugs can come to meeting that goal, because it allows the agent to be protected and released gradually. This project consisted of the preparation and characterization of biodegradable nanoparticles of poly (e-caprolactone) (PCL) as a carrier of heparin of low molecular weight, and its evaluation of anticoagulant and antithrombotic activity in vivo. The nanoparticles were prepared by the method of double emulsion w/o/w and evaporation of solvent. The characterization of nanoparticles was performed by scanning electron microscopy (SEM), which showed homogeneous spherical nanoparticles. The average diameter of nanoparticles was 269±36 nm and zeta potential was -1.20±1.93 mV, indicating negative charge. The encapsulation efficiency, assayed by Azure II, was 80±2.3%. The release of heparin in vitro, at the 24-hour period was 4±1.8%. After the addition of esterase the release of heparin was increased to 10±1.9%, probably by accelerating the degradation of particles by the enzyme. The in vivo release of encapsulated heparin after subcutaneous administration in rats, was assessed by anti-Xa plasma activity and the results were compared with free heparin. The dose of heparin encapsulated had to be 5 times the dose of heparin free. Heparin-encapsulated nanoparticles showed a sustained release for up to 12 hours for a period significantly longer (P<0.01), but with lower anti-Xa activity. These data suggest that nanoparticles may allow heparin to be released in a more gradual, but with lower activity. When comparing the anti-Xa activity obtained by subcutaneous injection of nanoparticles with different doses of heparin, 800 IU/kg and 1000 IU/kg, demonstrated that the effect and duration of action depends on the dose applied. To evaluate the antithrombotic action of nanoparticles with heparin a model of DVT by stasis in rats was used. The doses of nanoparticles used for the evaluation of antithrombotic action were calculated by anti-Xa activity similar to that obtained with free heparin, 0.3 to 0.7 IU/mL. Heparin free or encapsulated in nanoparticles was applied in a single dose subcutaneously. The results showed a significant decrease of thrombus formed with the use of free heparin, compared with the control group (P=0.004). There were virtually no formation of venous thrombosis in any of the rats that received heparin encapsulated in nanoparticles, with a significant difference both in the control group (P<0.001) and the group with free heparin (P<0.001). In summary, the method of double emulsion w/o/w proved an efficient method for the encapsulation of heparin, providing spherical homogeneous nanoparticles with high encapsulation efficiency. For in vivo studies, heparin encapsulated showed a sustained release for a period greater than that of free heparin, and with excellent antithrombotic action. If these results are confirmed by the continuity of this study, the use of heparin encapsulated in nanoparticles in clinical practice can be of great benefits for the patient. / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

Introdução: A evolução clínica da trombose venosa cerebral (TVC) pode variar desde a recuperação completa ao óbito. Séries européias e um estudo multicêntrico identificaram alguns fatores indicativos de prognóstico da TVC, dado importante na decisão da melhor terapêutica para os pacientes. Este estudo busca identificar, a partir do seguimento prospectivo de cento e onze pacientes com TVC, os fatores prognósticos envolvidos na evolução clínica durante o período de 2 anos. Pacientes Métodos: Foram acompanhados prospectivamente 111 pacientes com diagnóstico de TVC desde a fase aguda do diagnóstico, confirmado por meio de RM de encéfalo e/ou angiografia cerebral (ARM, ATC ou angiografia digital). Obtidos dados do quadro clínico e seguimento por um protocolo clínico. 96% dos pacientes foram anticoagulados na fase aguda com heparina e seguida de anticoagulação com warfarina. Submetidos a investigação para os fatores predisponentes para TVC. A evolução clínica foi quantificada por meio da escala modificada de Rankin (EMR) após 3, 6, 12 e 24 meses, definindo os pacientes de bom prognóstico EMR 1, e mau prognóstico EMR 2. Comparamos dados clínicos da fase aguda e resultados encontrados nos exames de imagem e laboratoriais como possíveis fatores prognósticos, através da análise univariada pelo teste 2 e os fatores de significância estatística (p<0,1), foram analisados com regressão logística ajustada e cálculo da razão de chances (RC), (intervalo de confiança IC=95%). Resultados: A média da idade dos pacientes foi de 35 anos, 72% mulheres, 40% afro-brasileiros. As principais manifestações clínicas foram: cefaléia 97%, déficit focal 47%, crise epiléptica 40%, alteração da consciência 28%, síndrome de HIC (SHIC) isolada 40%. Quanto aos fatores predisponentes; 75% das mulheres usavam anticoncepcional, 31% dos pacientes apresentavam trombofilia hereditária, 13% SAAF, 6% eram portadores de vasculites, 25% outros estados pro trombóticos, 7 % apresentavam fatores locais (infecciosos ou MAV); e 5% das mulheres estavam no puerpério ou gestação. Os dados de neuroimagem revelaram que 42% apresentaram trombose em mais de um sistema venoso, 33% tiveram infartos hemorrágicos e 18% infartos venosos isquêmicos, e 20% dos pacientes apresentaram trombose de veias e seios profundos. Após 24 meses 18 pacientes (17%) apresentaram EMR 2 e os fatores determinantes de pior prognóstico foram: a etnia afro-brasileira p=0,001; RC= 11,37 (95% IC 2.81- 46,08), alteração do nível de consciência p=0,007; RC=4.56 (95% IC 1.61-19.45), sexo masculino p=0,049 RC=3.55 (95% IC 1.00-12.55) e idade acima de 32 anos p=0,05 RC = 3.95 (95% IC 0,97-15.20). A presença isolada de ACO como fator predisponente está associado ao melhor prognóstico p = 0,016; RC=5,17(95% IC 1.37-19.57) e após 24 meses a mortalidade foi de 4,5%. Conclusão: A análise deste trabalho evidencia que a maioria dos pacientes portadores de TVC (83%) apresenta uma evolução benigna com o tratamento, estando após 24 meses assintomáticos ou com sintomas mínimos, e a presença de ACO como fator predisponente isolado a TVC está relacionado ao melhor prognóstico. Os pacientes com pior evolução clínica têm a raça afro-brasileira, a alteração do nível de consciência, sexo masculino e idade acima de 32 anos como fatores determinantes de pior prognóstico em vinte e quatro meses. A identificação destes fatores é importante por direcionar um melhor tratamento na fase aguda da TVC para casos selecionados / Introduction: The cerebral venous thrombosis (CVT) clinical evolution is quite variable from complete recovery to death. Some European series and a multicenter study had identified prognostic factors related to CVT prognosis. The identification of these factors is important for the best therapeutic decision to patients. This study aims to identify the prognostic factors enrolled in clinical evolution of 111 patients with CVT in a prospective outcome clinical trial during two years. Subjects and Methods: One hundred and eleven patients were prospective followed with the diagnosis of CVT since acute phase diagnosis, confirmed by brain MRI and/or brain angiography (MRA , CTA or digital angiography). Information about clinical features and follow-up were filled on a clinical form. 96% of the patients were anticoagulated on heparin followed by warfarin treatment. The patients were investigated to predisposing factors to CVT. The clinical evaluation was accessed by the modified Rakin scale (mRs) after 3, 6, 12 and 24 months, considering patients with good outcome when mRs 2. The acute phase clinical features, laboratory and imaging data were compared as possible prognosis factors beyond univariate 2 test and the factors with statistical significance (p<0,1) and then analyzed by logistic regression adjusted and Odds Ratio values (confidence interval CI=95%). Results: The mean age of the patients was 35 years, 72% were women, and 40% were African Brazilian. The main clinical features observed were: headache 97%, focal sign 47%, epileptic seizure 40%, isolated ICH syndrome 40% and altered mental status 28%. All the patients were investigated to predisposing factors; 75% of the women were on oral contraceptive, 31% of the patients presented hereditary thrombophilia, 13 % antiphospholipid syndrome, 6% presented vasculitis, 25% other protrhrombotic state, 7% presented some local feature (arterialvenous malformation or infection) and 5% of women were pregnant or on puerperium. The neuroimaging data showed that 42% of the patients presented thrombosis in more than one venous system, 33% had hemorrhage infarcts, 18% ischemic venous infarcts and 20% of the patients had thrombosis of the deep venous system. After two years 17% had a mRs > 2 and the features enrolled on poor prognosis were: African Brazilian patients p=0,001; OR= 11,37 (95% IC 2.81- 46,08), altered mental status p=0,007; OR=4.56 (95% IC 1.61-19.45), male gender p=0,049 OR=3.55 (95% IC 1.00-12.55) and age over 32 years p=0,05 OR = 3.95 (95% IC 0,97- 15.20). The presence of oral contraceptives as isolated predisposing factor was related to good outcome CVT p=0,016; OR=5,17(95% IC 1.37-19.57) and after two years the mortality rate was 4,5%. Conclusion: This study data show that most patients with the diagnosis of CVT (83%) has a good outcome with the treatment, after two years follow up they have no symptoms or minimal deficits, and the presence of oral contraceptives as isolated predisposing factor was related to better outcome CVT. The patients with poor prognosis have the African Brazilian ethnic group, altered mental status, male gender and age over 32 years as the factors enrolled on bad clinical evolution in two years. The identification of these factors can have future value on treatment better choice on acute phase to selected CVT patients

Orientador: Joyce Maria Annichino-Bizzacchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T22:14:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prado_LucasBessa_M.pdf: 3008068 bytes, checksum: 3758f8a952dfe1f77c113246b8e2a0bd (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A Trombose Venosa Profunda (TVP) é definida como uma oclusão parcial ou total da circulação venosa profunda. A heparina é um fármaco com ação anticoagulante e antitrombótica utilizado desde 1930. O custo, a via de administração (endovenosa ou subcutânea) e as doses repetidas são algumas das limitações do seu uso. Assim, o desenvolvimento de um produto que possa ser administrado por via subcutânea ou oral em um menor número de aplicações, torna-se um importante desafio e de grande aplicabilidade clínica. Sistemas de liberação sustentada permitem que o fármaco seja encapsulado e liberado gradativamente. Este estudo constituiu na preparação, caracterização e avaliação in vivo de nanopartículas de poli (?-caprolactona) (PCL) e quitosana como carreadores de heparina de baixo peso molecular (enoxaparina). As nanopartículas foram preparadas pelo método de dupla emulsão água/óleo/água e evaporação do solvente. A caracterização das nanopartículas foi realizada por microscopia eletrônica de varredura (MEV), onde foram observadas partículas esféricas e homogêneas. O diâmetro médio das nanopartículas foi de 512,8 ± 13,8 nm e o potencial zeta foi de +30,9 ± 1,3 mV. A eficiência de encapsulamento, analisada pelo método Azure II foi de 99,04 ± 0,001 %. A atividade anticoagulante in vivo da enoxaparina encapsulada foi avaliada pela atividade anti-Xa plasmática, através de método colorimétrico. Quando a enoxaparina livre foi administrada por via subcutânea observou-se um pico de atividade (0,5 UI/mL) em 1 hora, com um decréscimo gradual até 6 horas. A atividade anticoagulante da enoxaparina encapsulada em nanopartículas manteve-se por até 14 horas, quando foi administrada por via subcutânea, sugerindo que as nanopartículas podem permitir que a enoxaparina seja liberada de forma gradual, podendo ser uma vantagem na prática clínica. Após a administração das nanopartículas por via oral não se observou nenhuma atividade em até 14 horas, sugerindo que as nanopartículas não tenham sido absorvidas ou a enoxaparina tenha sido degradada no trato gastrointestinal. Para avaliação do efeito antitrombótico foi padronizado o modelo de TVP por estase e hipercoagulabilidade em ratos. Após administração subcutânea, houve uma significativa diminuição do tamanho do trombo formado tanto com o emprego de enoxaparina livre (p= 0,002) como após encapsulamento em nanopartículas (p= 0,0411) em comparação ao grupo controle. Quando foram administradas nanopartículas por via oral, os resultados mostraram que não houve diferença estatística em comparação ao grupo controle (p= 0,9476) e a um grupo de nanopartículas vazias (p= 0,9372). Em resumo, o método de dupla emulsão a/o/a mostrou-se eficiente para o encapsulamento de enoxaparina, proporcionando a obtenção de nanopartículas esféricas e com alta eficiência de encapsulamento. Pelos estudos in vivo, a enoxaparina encapsulada mostrou uma atividade anticoagulante com liberação sustentada, por um período superior ao obtido com a enoxaparina livre, com excelente efeito antitrombótico quando administrada por via subcutânea. Contudo, não se observou nenhum efeito anticoagulante ou antitrombótico quando as nanopartículas foram administradas por via oral. Novos experimentos com quitosanas de diferentes massas molares serão necessários na tentativa de possibilitar a absorção oral dessas nanopartículas / Abstract: Deep vein thrombosis (DVT) is defined as partial or total occlusion of the deep venous circulation. Heparin is a drug with anticoagulant and antithrombotic action used since 1930. The costs, administration vias (intravenous or subcutaneous) and the repeated doses are some limitations of its use. Thus, the development of a product that could be administered subcutaneous or orally in a smaller number of applications becomes a major challenge with huge clinical applicability. Sustained release systems allow the medication to be gradually encapsulated and released. This study was based on the preparation, characterization and in vivo evaluation of nanoparticles of poly (?-caprolactone) (PCL) and chitosan as carriers of low molecular weight heparin (enoxaparin). The nanoparticles were prepared by the double emulsion water/oil/water method and solvent evaporation. The nanoparticles characterization was performed by scanning electron microscopy (SEM), in which were observed spherical and homogeneous particles. The average diameter of the nanoparticles was 512.8 ± 13.8 nm and the zeta potential was +30.9 ± 1.3 mV. The encapsulation efficiency, analyzed by Azure II method, was 99.04 ± 0.001%. The in vivo anticoagulant activity of the encapsulated enoxaparin was evaluated by plasmatic anti-Xa activity performed by colorimetric method. When the free enoxaparin was subcutaneously administered a peak of activity was observed (0.5 IU/mL) in 1 hour with a gradual decrease until 6 hours. The anticoagulant activity of the nanoparticles encapsulated enoxaparin was kept until 14 hours when it was administered subcutaneously, suggesting that nanoparticles may allow the enoxaparin release by a gradual way, what could be an advantage on clinical practice. After the oral administration of the nanoparticles, any activity could be observed in until 14 hours, suggesting that or the nanoparticles might be not absorbed or the enoxaparin might be degraded on the gastrointestinal tract. In order to evaluate its antithrombotic effect, it was standardized a model of DVT by stasis and hypercoagulability in rats. After subcutaneous administration, there was a significative reduction on the thrombus size both with free enoxaparin (p= 0.002) and after encapsulation (p= 0.0411) in comparison with control group. When nanoparticles were administered orally, the results showed no statistical difference compared to the control group (p = 0.9476) and to a group of empty nanoparticles (p = 0.9372). In summary, the double emulsion method w/o/w was efficient for the enoxaparin encapsulation, providing the obtainment of spherical nanoparticles with high encapsulation efficiency. For in vivo studies, the encapsulated enoxaparin showed a sustained release anticoagulant activity for a higher period than that obtained with free enoxaparin, with an excellent antithrombotic effect when administered subcutaneously. However, there was no anticoagulant or antithrombotic effect when the nanoparticles were administered orally. Further experiments with chitosans of different molecular weights will be needed on the attempt to allow the oral absorption of these nanoparticles / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientador: Joyce Maria Annichino-Bizzacchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-23T21:41:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_LucianaPuglieseda_M.pdf: 3815168 bytes, checksum: ffcaf6b4e7787d8b4fd4365accf237c7 (MD5) Previous issue date: 1998 / Resumo: A proteína S humana é uma glicoproteína plasmática vitamina K-dependente que age como cofator não enzimático da proteína C ativada na Via Anticoagulante da Proteína C. Além disso, a proteína S desempenha um papel independente da proteína C ativada inativando os fatores V e X ativados. A concentração plasmática da Proteína S é regulada por uma proteína de ligação que atua na Via Clássica do Complemento, a C4b. A proteína C4b forma complexos inativos com aproximadamente 60% da proteína S total, e somente a proteína S na sua forma livre pode exercer sua atividade de cofator da proteína C ativada. A deficiência hereditária de proteína S é uma causa comum de trombose venosa recorrente, e ocorre pela diminuição da atividade anticoagulante da proteína S. É uma doença relativamente rara e tem padrão de herança autossômico dominante o gene que controla a produção- da proteína S (PROS1) está localizado no cromossomo 3, próximo à região do centrômero, na posição 3p11.1 - 3q11.2. É constituído por 15 exons e 14 introns, abrangendo uma região de mais de 80 kb, que origina um mRNA de 3,5 a 4,0 kb. Nesta mesma região do cromossomo 3 há um pseudogene (PROS2) que possui 97% de homologia com a região codificadora do gene ativo. De acordo com um "database" de mutações no gene da proteína S, publicado em 1997 por GANDRILLE et aI., foram descritas 71 diferentes mutações de ponto sendo 19,8% mutações missense, 65,3% mutações missense, 12,8% mutações em sítio de "splicing" e 2% aboliam o codon de terminação natural da proteína. Foram também descritas 16 diferentes inserções/deleções e duas grandes deleções. Um total de doze polimorfismos raros foram descritos, incluindo o polimorfismo Heerlen, além de um polimorfismo freqüente, o dismorfismo neutro CCA/CCG. Os métodos de SSCP e CSGE possibilitam o rastreamento rápido e eficaz de mutações. O seqüenciamento de DNA permite a determinação precisa da alteração molecular responsável pela doença. No presente trabalho, estes métodos foram empregados no estudo do gene da proteína S (PROS1) de 8 pacientes com deficiência de proteína S que apresentaram trombose espontânea. Outras deficiências que predispõem à trombose foram avaliadas e não detectadas nestes pacientes. Com o emprego dessa estratégia metodológica foi possível detectar e identificar sete mutações de ponto em quatro dos oito pacientes estudados, incluindo uma mutação silenciosa, além de um polimorfismos em outro paciente. Das mutações encontradas somente uma foi detectada pelo método de SSCP. Considerando-se o quadro clínico/laboratorial dos pacientes estudados e a análise familiar, os resultados deste estudo sugerem que as mutações identificadas seriam responsáveis pela deficiência hereditária de proteína S. A identificação das mutações e sua correlação com o quadro clínico dos pacientes estudados neste trabalho contribuem para a compreensão da relação estrutura-função desta proteína. Também foram determinadas as freqüências, em diferentes grupos da população brasileira (recém-nascidos, caucasóides, negróides, índios e pacientes com trombose) do polimorfismo Heerlen e do dismorfismo neutro CCA/CCG. Os resultados obtidos nos diferentes grupos estudados, para polimorfismo Heerlen, não diferiram significativamente dos descritos anteriormente na literatura por BERTINA et aI., 1990. Este polimorfismo não foi identificado em nenhum dos pacientes estudados. As freqüências alélicas do dismorfismo neutro CCA/CCG não diferiram significativamente dos descritos na literatura por DIEPSTRATEN, et aI., 1991 e GANDRILLE et aI., 1995. Nossos resultados revelaram que na população negróides pode ter ocorrido um grau de miscigenação, já que a freqüência de heterozigotos foi elevada. A população indígena, apesar de ser considerada um isolado genético, mostrou um predomínio do genótipo heterozigoto. O polimorfismo CCA/CCG também foi empregado para análise de segregação nas famílias com deficiência de proteína S, e mostrou-se informativo em três famílias analisadas / Abstract: Human protein S is a plasmatic vitamin-K dependent glicoprotein that acts as a non-enzimatic cofactor of activated protein C in the protein C anticoagulant pathway. In addition to this protein S has an independent role that activated protein C, which is to inactivate factors Va and Xa. The plasmatic concentration of protein S is regulated by a C4b binding protein that acts on the Complement Classical Pathway. C4b protein forms inactive complexes with approximately 60% of total protein S, and only the free form of protein S its can act as a cofactor of activated protein C. The hereditary deficiency of protein S is a common cause of recurrent venous thrombosis, and occurs due to the decrease of the anticoagulant activity of protein S. It is a relatively rare disease and it has a dominant autossomic hereditary patteFI1. The gene which controls the production of protein S (PROS1) is Ipcated in chromosome 3, near the centromer region at position 3p11.1 - 3q11.2. It is formed by 15 exons and 14 introns comprising a region of over 80kb, which originates a mRNA of 3,5 to 4,0 kb. In this same region of chromosome 3 there is a pseudogene (PROS2) which is 97% homologous to the codifying region of the active gene. According to the protein S gene mutation database published by GANDRILLE et aI., 71 different point mutations were described, 19.8% were nonsense mutations, 65,3% were missense mutations, 12,8% were splice site mutations, and 2% abolished the natural codon termination of the protein. Sixteen different insertions/deletions and two large deletions were also described. A total of twelve rare polymorphisms were described including the Heerlen polymorphism and a frequent polymorphism, the neutral dimorphism CCA/CCG. The SSCP and CSGE analysis permit the quick and efficient screening of the mutations. Direct DNA sequencing permit the precise determination of the molecular alteration responsible for the disease. In this study these methods were used in the study of protein S gene (PROS1) of eight patients with protein S deficiency which presented spontaneous thrombosis. Other deficiencies which predispose to thrombosis were evaluated but were not detected. With the use of this methodology it was possible to detect and identify seven point mutations in four of the eight patients studied, including a silent mutation in addition to a polymorphism in another patient. Of the mutation found only one was detected by the SSCP method. Considering the clinical and laboratory data of the patients studied, together with the analysis of the family, the results of this study suggest that the mutations identified are responsible for the hereditary protein S deficiency. The identification of the mutations and its correlation to the clinical data of the patients studied contribute to the comprehension of the structural-functional relation of this protein. The frequencies of the Heerlen polymorphism and the neutral dimorphism CCA/CCG, in different groups of the Brazilian population (newborns, caucasoides, Black population, Indians and patients with thrombosis) were also determined. The results obtained in the different groups studied, for Heerlen polymorphism, did not differ significantly from those described previously in the literature by BERTINA et al, 1990. This polymorphism was not identified in any of the patients studied. The allelic frequencies of the neutral dismorphism CCA/CCG do not differ significantly from those described in literature by DIEPSTRATEN, et aI., 1991 and GANDRILLE et aI., 1995. Our results revealed that the miscigenation may have occurred in the Black population, in spite of being considered as a genetic isolate, showed a predomination of the heterozygous genotype. The CCA/CCG polymorphism was also used to analyze the segregation in families with protein S deficiency and was informative in three families that were analyzed. / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Ciências Médicas

Ruptura da placa aterosclerótica e trombose, processos frequentemente desencadeados por atividades do paciente, são atualmente reconhecidos como as causas que desencadeiam as síndromes coronarianas agudas. O entendimento deste fenômeno desencadeante poderia ser melhorado se dispuséssemos de modelos animais confiáveis de ruptura de placa e trombose. O objetivo do presente trabalho foi reproduzir e melhor caracterizar um modelo animal de aterosclerose e trombose arterial induzida agudamente, em coelhos, descrito por Constatinides e Chakravarti há mais de 30 anos e não mais utilizado. Também foi avaliada a viabilidade deste modelo para testes de intervenção farmacológica e o efeito da lesão arterial com cateter balão sobre o tempo requerido para indução do processo de ruptura de placa e trombose arterial. A aterosclerose foi induzida por dieta enriquecida com colesterol, pela lesão mecânica do vaso arterial ou por ambas intervenções. O desencadear de trombose foi feito pela administração de veneno da víbora Russellis, um proteolítico e procoagulante, assocado à histamina, um vasoconstritor em coelhos. No estudo 1, testou-se o modelo de 8 meses, descrito originalmente, e o efeito da lesão arterial com cateter balão, associada ou não à dieta rica em colesterol, sobre a fraquência e a extensão da trombose, independentemente de ter recebido, ou não, a dieta rica em colesterol. No estudo 2, relizou-se um experimento piloto com oácido lisino-salicílico, um reconhecido agente antitrombótico, para testar a viabilidade deste modelo para testes de intervenção farmacológica. Não se detectou diferença significativa tanto no número, quanto no tamanho dos trombos, prossivelmente em função do pequeno número de animais estudados. No estudo 3, verificou-se o efeito da lesão com balão, sem intervenção dietética, sobre a produção de placas vulneráveis à trombose, após 4 meses. Demonstrou-se 80% de trombose nos animais que tiveram sua aorta lesada e uma forte correlação entre um escore de intensidade das lesões histológicas e a extensão da trombose arterial. No estudo 4, testou-se o efeio da vitamina E, um reconhecido agente antioxidadente, sobre a extensão da trombose arterial e a intensidade das lesões histológicas após 4 meses sem intervenção dietética. A vitamina E não reduziu a extensão da trombose nem a intensidade das lesões histológicas. Conclui-se que este modelo pode ser reproduzido e presta-se ao estudo do fenômeno da ruptura de placa e trombose. A lesão mecânica arterial com balão, associada ou não à dieta rica em colesterol, propicia um forte estímulo à formação de placas vulneráveis ao desendeamento agudo de trombose arterial. Por outro lado, as artérias normais foram resistentes ao tramento indutor de trombose. Este modelo represneta um método que pode ser útil para avaliar agentes que diminuem a ocorrência de plavas vulneráveis ou que diminuem a extensão da trombose formada após indução. Este modelo pode ser útil para identificar aspectos relacionados à vulnerabidlidade das placas à ruptura e os agentes farmacológicos que desencadeiam ruptura de placa e trombose. Entretanto, em função do intenso estímulo trombogênico gerado, sugere-se a redução da intensidade da lesão ou das alterações da coagulação ou da vasoconstrição.

INTRODUÇÃO: Um grande número de estudos epidemiológicos têm demonstrado que o fibrinogênio é fator de risco consistente e independente para doença cardiovascular. O fibrinogênio, além de ser um determinante de trombose arterial foi considerado fator de risco de trombose venosa. Foram avaliados os níveis plasmáticos do fibrinogênio em indivíduos que apresentaram algum tipo de trombose não influenciada por reação de fase aguda ou resposta inflamatória. MÉTODOS: Neste estudo de caso-controle realizado entre julho de 2003 a abril de 2005 foram incluídos 39 pacientes, entre 25 e 65 anos, com diagnóstico objetivamente confirmado de trombose, sem antecedentes de neoplasia e colagenose. O tempo mínimo entre a evento e a coleta da amostra de sangue foi de 6 meses. O grupo controle foi constituído de doadores e funcionários voluntários do Hemocentro Regional de Juiz de Fora. A concentração plasmática de fibrinogênio e a medida da Proteína C Reativa foram realizados nos dois grupos. RESULTADOS:Os níveis médios de fibrinogênio foram significativamente maiores nos pacientes ( 316)que no grupo controle (259), p=0,0002. a média de idade foi 48,3 para os pacientes e 45,5 para o controle. A aplicação do teste qui quadrado demonstrou que não houve diferenças significativas nos grupos de pacientes e controles (30,8% e 27%, respectivamente) em relação ao tabagismo(pvalor = 0,72). A frequência de hipertensão foi significativamente maior no grupo de pacientes (28,2%) que no controle (5,4%) (p-valor=0,008). O teste t para a diferença dos níveis médios de fibrinogênio entre os grupos de trombose venosa e arterial não apresentou resultado estatisticamente significante (p-valor = 0,69). CONCLUSÃO: Com base nos dados deste estudo, os níveis de fibrinogênio estão relacionados com trombose, independente se arterial ou venosa. / INTRODUCTION: A great number of prospective epidemiologic studies have reported that fibrinogen is consistently and independently risk factor for the cardiovascular disease. The fibrinogen, a determinant of arterial thrombosis, was also considered a risk factor for the venous thrombosis. It was valued the fibrinogen plasmatic level in patients that had showed some kind of thrombosis event without influence by acute phase reactions or ongoing inflamatory responses. METHODS: In this cases-control study, fulfilled between july 2003 and april 2005, was included 39 patients, among 25 e 65 ears, with confirmed diagnosis of thrombosis and none neoplasis and collagenosis antecedent. Six months was the minimum time between event and blood sample collect. The control group was composed by blood donor and voluntary employee of the Hemocentro Regional de Juiz de Fora. The fibrinogen plasmatic concentration and the C-reactive proteins measure was made in both groups. RESULTS: The medium levels of fibrinogen were significantly higher in patients (316) than the control group (259), p=0,0002. The age average was 48,3 for the patients and 45,5 for the control. The “qui-quadrado" test application proved there wasn’t any significatives differences in both groups, patients (30,8%) and control (27%), in the relation with smoking (p-value = 0,72). The frequency of arterial hypertension was significantly higher in patient group (28,2%) than the control group (5,4%) (p-value = 0,008). The t-test for the differences of the fibrinogen average levels between venous and arterial thrombosis didn’t present any significant statistic result. CONCLUSION: Established in this research, the higher levels of fibrinogen are associated with thrombosis, independently if arterial or venous.

INTRODUÇÃO: Um grande número de estudos epidemiológicos têm demonstrado que o fibrinogênio é fator de risco consistente e independente para doença cardiovascular. O fibrinogênio, além de ser um determinante de trombose arterial foi considerado fator de risco de trombose venosa. Foram avaliados os níveis plasmáticos do fibrinogênio em indivíduos que apresentaram algum tipo de trombose não influenciada por reação de fase aguda ou resposta inflamatória. MÉTODOS: Neste estudo de caso-controle realizado entre julho de 2003 a abril de 2005 foram incluídos 39 pacientes, entre 25 e 65 anos, com diagnóstico objetivamente confirmado de trombose, sem antecedentes de neoplasia e colagenose. O tempo mínimo entre a evento e a coleta da amostra de sangue foi de 6 meses. O grupo controle foi constituído de doadores e funcionários voluntários do Hemocentro Regional de Juiz de Fora. A concentração plasmática de fibrinogênio e a medida da Proteína C Reativa foram realizados nos dois grupos. RESULTADOS:Os níveis médios de fibrinogênio foram significativamente maiores nos pacientes ( 316)que no grupo controle (259), p=0,0002. a média de idade foi 48,3 para os pacientes e 45,5 para o controle. A aplicação do teste qui quadrado demonstrou que não houve diferenças significativas nos grupos de pacientes e controles (30,8% e 27%, respectivamente) em relação ao tabagismo(pvalor = 0,72). A frequência de hipertensão foi significativamente maior no grupo de pacientes (28,2%) que no controle (5,4%) (p-valor=0,008). O teste t para a diferença dos níveis médios de fibrinogênio entre os grupos de trombose venosa e arterial não apresentou resultado estatisticamente significante (p-valor = 0,69). CONCLUSÃO: Com base nos dados deste estudo, os níveis de fibrinogênio estão relacionados com trombose, independente se arterial ou venosa. / INTRODUCTION: A great number of prospective epidemiologic studies have reported that fibrinogen is consistently and independently risk factor for the cardiovascular disease. The fibrinogen, a determinant of arterial thrombosis, was also considered a risk factor for the venous thrombosis. It was valued the fibrinogen plasmatic level in patients that had showed some kind of thrombosis event without influence by acute phase reactions or ongoing inflamatory responses. METHODS: In this cases-control study, fulfilled between july 2003 and april 2005, was included 39 patients, among 25 e 65 ears, with confirmed diagnosis of thrombosis and none neoplasis and collagenosis antecedent. Six months was the minimum time between event and blood sample collect. The control group was composed by blood donor and voluntary employee of the Hemocentro Regional de Juiz de Fora. The fibrinogen plasmatic concentration and the C-reactive proteins measure was made in both groups. RESULTS: The medium levels of fibrinogen were significantly higher in patients (316) than the control group (259), p=0,0002. The age average was 48,3 for the patients and 45,5 for the control. The “qui-quadrado” test application proved there wasn’t any significatives differences in both groups, patients (30,8%) and control (27%), in the relation with smoking (p-value = 0,72). The frequency of arterial hypertension was significantly higher in patient group (28,2%) than the control group (5,4%) (p-value = 0,008). The t-test for the differences of the fibrinogen average levels between venous and arterial thrombosis didn’t present any significant statistic result. CONCLUSION: Established in this research, the higher levels of fibrinogen are associated with thrombosis, independently if arterial or venous.

Fundamento: A ativação da cascata inflamatória está presente na insuficiência cardíaca(IC). Existe relação entre esta ativação e estado protrombótico nesta síndrome. Dentre as etiologias de IC, a cardiomiopatia chagásica (CMC) parece ter maior ativação inflamatória e prognóstico mais reservado, possivelmente por especial risco para fenômenos tromboembólicos. A relação entre atividade inflamatória e protrombótica na cardiomiopatia chagásica e em outras etiologias é obscura. Objetivo: Estudar o perfil de marcadores protrombóticos e proinflamatórios em pacientes com insuficiência cardíaca chagásica comparando-os com os de etiologia não-chagásica. Métodos: Corte transversal. Critérios de inclusão: fração de ejeção do VE (FEVE) < 45% e tempo de início de sintomas > 1 mês. Os pacientes foram divididos em dois grupos: grupo 1(G1) sorologias positivas para Chagas e grupo 2(G2) sorologia negativa para Chagas. Dosou-se como fatores proinflamatórios: fator de necrose tumoral-alfa (TNF-), interleucina-6 (IL-6) e proteína C reativa (PCR) ultrassensível; fatores protrombóticos: dímero D, P-selectina solúvel, antígeno do fator de von Willebrand, fibrinogênio, complexo trombina-anti-trombina(TAT), fator tecidual(FT) e tromboelastograma(TEG). A amostra foi calculada para poder de 90%, assumindo-se diferença de 1/3 de desvio-padrão entre os grupos; p significativo se < 0,05. Análise estatística: teste exato de Fischer para comparação de proporções; teste t de student não-pareado para variáveis contínuas de distribuição normal e teste de Mann-Whitney para variáveis contínuas de distribuição assimétrica. Realizada análise de co-variância para ajuste de potenciais influências de co-variáveis. Resultados: Entre 16 de janeiro de 2008 e 08 de abril de 2009, 287 pacientes com IC crônica foram consecutivamente selecionados em nível ambulatorial ou de internação, sendo 138 no G1 e 149 no G2. O G1 apresentava maior porcentual de pacientes internados, de CF III/IV, PA sistólica mais baixa, maior freqüência de RHJ, ascite, menor fração de ejeção e níveis mais altos de BNP. Por outro lado, a prevalência de HAS, DM e DLP foi superior no G2. Dos marcadores proinflamatórios, o TNF- foi maior no G1, independentemente de outros fatores de gravidade(p<0,0001). A IL-6, apesar de maior no G1, sofreu maior influência de outras variáveis de gravidade do que da etiologia chagásica. Os níveis de PCR ultrassensível estavam elevados em ambos os grupos embora sem diferença entre eles. Dentre os fatores protrombóticos o dímero-D(p<0,0001), o fator de von Willebrand(p<0,0001) e a P-selectina(p=0,0262) foram mais altos no G1 que no G2. Os níveis de FT e TAT foram semelhantes. O fibrinogênio foi mais alto no G2 que no G1(p=0,0424), assim como os parâmetros do TEG - MA(p=0,0044), G(p=0,0022) e TG(p=0,001), embora todos estivessem dentro dos limites de referência na maioria dos pacientes em ambos os grupos. Na análise de co-variância apenas o dímero-D e a P-selectina mantiveram-se diferentes entre os grupos, sendo que os níveis de P-selectina estavam normais na maioria dos pacientes de ambos os grupos. Conclusões: A atividade proinflamatória esteve aumentada nos pacientes com IC chagásica e não-chagásica. A inflamação medida pelo TNF- foi independentemente maior entre chagásicos.Observou-se maior estado protrombótico entre chagásicos medido pelo dímero-D, independentemente de outros fatores de gravidade. / Background: Inflammatory cascade activation is present in heart failure (HF). This activation is closely related to a prothrombotic state in this syndrome. Among HF etiologies, Chagas cardiomyopathy (CCM) seems to have greater inflammatory activation and worse prognosis, possibly because of special risk for thromboembolic phenomena. The relation of inflammatory and prothrombotic activity between CCM and other HF etiologies remains unclear. Objective: To assess the profile of prothrombotic and proinflammatory markers in patients with chagasic in comparison to non-chagasic systolic heart failure. Methods: Cross sectional study. Inclusion criteria: LV ejection fraction (LVEF) < 45% and time of symptoms onset > 1 month. Patients were divided into two groups: group 1 (G1) positive Chagas serology and group 2 (G2) negative serology. Proinflammatory factors determined: tumor necrosis factor (TNF-), interleukin-6(IL-6) and ultrasensitive C-reactive protein (CRP); prothrombotic factors: D-dimer, soluble P-selectin, von Willebrand factor(vWF), fibrinogen, thrombin-anti-thrombin complex(TAT), tissue factor(TF) and thromboelastography(TEG). Sample was calculated for an 90% power, assuming a difference of 1 / 3 of the standard deviation; p significant if < 0.05. Statistical analysis: Fischer exact test for proportions, non-paired Students t test for parametric continuous variables and Mann-Whitney test for non-parametric continuous variables. Covariance analysis was performed to adjust for possible covariables influence on results. Results: From january 16th to april 8th 2009, 287 chronic HF patients were consecutively included, 138 in G1 and 149 in G2. G1 showed larger proportion of inpatients, higher III/IV functional class, lower systolic blood pressure, higher frequency of hepatojugular reflux, ascites, lower left ventricle ejection fraction and higher levels of B-type natriuretic peptide (BNP). On the other hand, G2 had higher proportion of hypertension, diabetes and hypercholesterolemia. Among proinflammatory markers, TNF- levels were higher in G1, independently of other prognosis variables (p<0,0001). Although IL-6 levels were higher in G1, there was greater influence of other prognosis variables than chagasic etiology itself. CRP levels were above reference values but there was no difference between G1 and G2. Among prothrombotic markers, D-dimer(p<0,0001), vWF(p<0,0001) and soluble P-selectin(p=0,0262) levels were higher in G1 than in G2. TF and TAT levels were similar in both groups. Fibrinogen levels were higher in G2 than in G1 (p = 0.0424), as well as TEG parameters MA(p=0,0044), G(p=0,0022) and TG(p=0,001), even though all of them were in normal reference range in most patients in both groups. D-dimer and soluble P-selectin kept different among groups in covariance analysis. However, soluble P-selectin levels were in normal reference range in both groups. Conclusions: Proinflammatory activity was increased in both groups. Inflammation measured by TNF- was independently greater among CCM patients. Greater prothrombotic state measured by D-dimer was observed in CCM patients independently of other prognosis variables.

Embora pacientes em terapia dupla antiplaquetária, composta de aspirina e um antagonista do receptor purinérgico P2Y12, tenham melhor prognóstico, eles ainda sofrem eventos trombóticos. Frequentemente, relaciona-se o nível de inibição plaquetária destes pacientes à ineficácia do tratamento. A reatividade plaquetária destes pacientes é uma função do nível do bloqueio do receptor P2Y12 e dos níveis de óxido nítrico e prostaciclina, importantes mediadores endoteliais, os quais agem em sinergia tripla aumentando o nível dos nucleotídeos cíclicos intraplaquetários mantendo a plaqueta em estado quiescente. Pacientes com disfunção endotelial têm menor disponibilidade destes mediadores e, consequentemente, menor inibição plaquetária in vivo. Propõe-se uma nova estratégia terapêutica composta de um inibidor do receptor purinérgico P2Y12, um ativador da enzima guanilato ciclase e um inibidor da fosfodiesterase, visando aumento dos nucleotídeos cíclicos, resultando em um forte efeito antiplaquetário localizado e tendo aplicação direta à pacientes com disfunção endotelial. / Disorders on the cardiovascular (CV) system are responsible for 31% of deaths worldwide. When inappropriately activated, platelets can cause myocardial infarction and stroke. Dual anti-platelet therapy (DAPT), composed of acetylsalicylic acid and a P2Y12 receptor blocker (clopidogrel, prasugrel, etc) is recommended for the prevention of recurrent CV events. Whilst DAPT is associated with an improvement in patient outcomes, thrombotic events do still occur. Platelet reactivity of patients under DAPT is a function of the level of P2Y12 receptor blockade and the levels of nitric oxide (NO) and prostacyclin (PGI2), two important endothelium-derived autacoids. Therefore, a new antithrombotic therapy is proposed using soluble guanylate cyclase (sGC) allosteric modulators independent of NO and phosphodiesterase (PDE) inhibitors. Based on the results observed, the combination of a sGC activator and a PDE inhibitor given at low doses, in the presence of P2Y12 receptor blocker, could produce enhanced and localized platelet inhibition.

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:50:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 385077.pdf: 420922 bytes, checksum: 0e0a5b00bb03f3c41dbc7f262cf35a36 (MD5) Previous issue date: 2006-05-04 / Introdu??o: O tromboembolismo venoso (TEV) tem como manifesta??es cl?nicas a trombose venosa profunda e o tromboembolismo pulmonar. Trata-se de uma doen?a multig?nica e multifatorial. Mais de 60% dos casos est?o relacionados com predisposi??o gen?tica e a hiperhomocisteinemia ? considerada um fator de risco estabelecido. A enzima metilenotetraidrofolato redutase (MTHFR) est? envolvida no metabolismo da homociste?na (Hcy) e do ?cido f?lico. Esta enzima catalisa a redu??o do 5,10-metilenotetraidrofolato em 5-metiltetraidrofolato, derivado do ?cido f?lico que atua como co-fator para remetila??o da homociste?na em metionina. A transi??o de uma citosina para uma timina no nucleot?deo 677 do gene da MTHFR resulta na substitui??o de uma alanina por uma valina, gerando uma variante termol?bil da MTHFR. Esta variante termol?bil apresenta uma atividade enzim?tica diminu?da, o que resulta em um aumento nos n?veis plasm?ticos de Hcy. Materiais e M?todos: Foram avaliados 70 indiv?duos com epis?dio de tromboembolismo venoso (grupo caso) e 74 indiv?duos sem hist?rico de doen?a tromboemb?lica (grupo controle). O gen?tipo da MTHFR foi determinado por rea??o em cadeia da polimerase, seguida de digest?o enzim?tica com a enzima HinfI (PCR-RFLP). Resultados: A freq??ncia do alelo T foi 46,0% entre os pacientes e 38,0% entre os controles (P=0,92; OR 0,72; 95%CI=0,45-1,15). O gen?tipo CC (homozigoto normal) foi encontrado em 40,0% dos pacientes e 41,9% dos controles (P=0,87; OR 0,92; 95%CI=0,47-1,79). O gen?tipo CT estava presente em 28,3% dos casos e 40,5% dos controles (P=0,16; OR 0,58; 95%CI=0,29-1,17). Os homozigotos para a variante termol?bil da enzima (gen?tipo TT) representaram 31,4% dos indiv?duos do grupo caso e 17,6% dos indiv?duos do grupo controle (P=0,08; OR 2,15; 95%CI=0,98-4,70). Discuss?o e Conclus?es: A freq??ncia dos alelos C e T foi semelhante entre os grupos estudados e a presen?a do alelo T n?o representou aumento no risco para TEV. Entre os gen?tipos, n?o houve diferen?a estatisticamente significativa entre os indiv?duos com e sem hist?rico de trombose. No entanto, o gen?tipo TT foi mais freq?ente no grupo caso que no grupo controle, indicando uma tend?ncia de associa??o entre o gen?tipo TT da MTHFR e o desenvolvimento de doen?as tromboemb?licas. Estes resultados representam o primeiro relato indicativo da freq??ncia deste polimorfismo na popula??o da regi?o estudada, uma vez que n?o foram encontrados dados na literatura sobre estas freq??ncias, contribuindo para a pesquisa da rela??o entre este polimorfismo e o TEV.