Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000389155-Texto+Parcial-0.pdf: 120483 bytes, checksum: 667f3c4666244e3dd47637233492ec4f (MD5) Previous issue date: 2007 / Diferentes estudos têm demonstrado que a Hsp70 de Mycobacterium tuberculosis (TBHsp70) pode induzir a remissão de modelos de doenças auto-imunes. Entretanto, o mecanismo pelo qual esta proteína exibe propriedades imunorregulatórias necessita ser elucidado. Neste estudo, nos perguntamos se a TBHsp70 poderia suprimir a rejeição em um sistema de transplante alogeneico de tumor. Nós observamos que enquanto camundongos BALB/c (H-2d) rejeitam melanócitos B16F10 (H-2b) implantados de forma subcutânea, animais BALB/c tratados com TBHsp70 não rejeitam o enxerto de forma similar aos tratados com Dexametasona (DEXA). O tratamento com TBHsp70 inibiu a proliferação de células T induzidas por mitógeno no linfonodo drenante e, finalmente, células T CD4, CD25 e Foxp3 foram observadas no sítio de enxertia e nos linfonodos drenantes de animais tratados com esta proteína. Nossos resultados apontam para um papel imunossupressor da TBHsp70, e sugerem que a indução de células T regulatórias poderia ser o mecanismo pelo qual esta proteína suprime a rejeição ao enxerto.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:53Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-11-29Bitstream added on 2014-06-13T19:22:40Z : No. of bitstreams: 1 miyata_m_dr_arafcf.pdf: 1125608 bytes, checksum: 1f8f6a7c62d2f6a383319def72bb3a51 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / De acordo com a Organização Mundial de Saúde em 2009, 9,27 milhões de novos casos de tuberculose ocorreram em 2007. Destes novos casos, 4,9% eram multidroga resistentes. Muitas pesquisas são realizadas na procura de novas drogas com atividade contra o bacilo da tuberculose, havendo então a necessidade de se entender os mecanismos de ação destes novos compostos. Este projeto objetivou propiciar ferramentas para compreender um pouco mais sobre os mecanismos de ação de novas drogas. Isolados clínicos de M. tuberculosis foram caracterizados quanto ao seu perfil de susceptibilidade aos fármacos do esquema terapêutico e foram determinadas as mutações responsáveis por estas resistências. Com os isolados caracterizados, foi construído um painel de M. tuberculosis. Pelo REMA, os isolados foram analisados quanto ao seu perfil de susceptibilidade aos fármacos (INH, RMP, STR e ETB) e avaliados quanto à presença de mutações nos genes de resistência (inhA, katG, ahpC, rpoβ, rpsL, rrs e embB) empregando a PCR-SSCP. Pelo REMA foram avaliados 80 isolados clínicos, sendo observada a resistência a INH em 74,7%, a RMP em 51,2%, a STR em 53,7% e ao ETB em 58,7%. Nos isolados resistentes, a porcentagem de mutações encontradas nos genes foi de 20,6% para inhA, 50% para katG, 6,3% para ahpC, 60% para rpoβ, 20% para rpsL e 0% para rrs e embB. Um painel com 12 isolados foi testado frente a três novos compostos, dois derivados de INH (Cu-INH1 e Cu-INH2) e um de RMP (Cu-RMP). Verificou-se que os isolados resistentes a INH foram também resistentes a Cu-INH1 e Cu-INH2. A mesma situação foi verificada em relação à RMP, com o composto Cu-RMP. Provavelmente, estes novos compostos têm os mesmos mecanismos de ação da INH e da RMP, que são os fármacos que lhes deram origem / According to World Health Organization in 2009, 9.27 million new TB cases occurred in 2007. Among these new cases, 4.9% were multidrug resistant. Many surveys are conducted in the search for new drugs with activity against the tuberculosis bacillus, therefore there is a need to understand the action mechanism of these new compounds. This project aimed to provide tools to understand about the action mechanisms of new drugs. M. tuberculosis clinical isolates were analyzed for their susceptibility profile to drugs, mutations responsible for resistance and a panel of these characterized isolates. The isolates were analyzed for susceptibility profile to drugs (INH, RIF, STR and ETB) and evaluated for presence of mutations in the resistance genes (inhA, katG, ahpC, rpoβ, rpsL, rrs and embB) applying the PCR-SSCP. REMA evaluated 85 clinical isolates and the resistance was observed in 74.7% to INH, 51.5% to RIF, 53.7% to STR and 58.7% to ETB. In the resistant isolates, percentage of mutations found in the genes was 20.6% for inhA, 50% for katG, 6.3% for ahpC, 60% for rpoβ, 20% for rpsL and 0% for rrs and embB. A panel of 12 isolates was tested against three new compounds, two INH-derivatives (Cu-INH1 and Cu-INH2) and one RMP-derivative (Cu-RMP). The isolates resistant to INH were also resistant to Cu-INH1 and Cu-INH2 compounds. The same situation was verified in relation to the RMP with the Cu-RMP compound, indicating that probably these three new compounds have the same action mechanism of INH and RMP drugs

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-02Bitstream added on 2014-06-13T18:44:31Z : No. of bitstreams: 1 silva_p_dr_arafcf.pdf: 2320520 bytes, checksum: 5b67cf713d666bdba286bd22e1e7c114 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As bactérias Gram-positivas que contêm ácidos micólicos na parede celular estão classificadas no grupo dos actinomicetos aeróbios ou bactérias corineformes e nocardioformes. Nesse grupo encontra-se o Rhodococcus equi, o qual é relevante à medicina veterinária e humana tal como as micobactérias, causando doença pulmonar que pode mimetizar casos de tuberculose. R. equi é considerado como agente patogênico em potros e tem emergido como oportunista em humanos, especialmente, associado à infecção pelo vírus da imunodeficiência humana. Assim como nos animais, a rodococose humana afeta principalmente, os pulmões, com características clínicas e patológicas, similares à tuberculose pulmonar, em pacientes imunocomprometidos ou não. A identificação de Rhodococcus equi pode ser realizada com base numa variedade de características, fenotípicas, genotípicas e técnicas cromatográficas. Morfologia das colônias, morfologia celular e resistência parcial ao álcool ácido são características chaves para a caracterização inicial. R. equi não oxida ou fermenta carboidratos e nem utiliza acetato, citrato e malonato, como única fonte de carbono, produz catalase, o fator equi (teste de CAMP) e lipase. Não produz amilase, b-galactosidase (ONPG), casease, DNase, esculinase, gelatinase, H2S, indol, lecitinase e oxidase. Demonstra comportamento variável para as provas de nitrato redutase, urease e redução do hipurato, decompõe a adenina, mas não hipoxantina, tirosina e xantina. O método molecular para a identificação de R. equi utiliza a PCR para amplificar um fragmento de 959 pares de base do gene choE, o qual codifica a enzima cholesterol oxidase (COX). Na identificação química, semelhante às espécies do gênero Mycobacterium, membros do gênero Rhodococcus contêm ácidos micólicos plausíveis de serem identificados pela cromatografia... / Gram-positive bacteria, containing mycolic acids in the cellular wall are classified in aerobic actinomycetes or corineform and nocardioform bacteria group. Rhodococcus equi is included in this group, and it is very important to the veterinary and human medicine. Rhodococcus equi is a well-recognized bacterial pathogen in veterinary medicine. First isolated from foals, it causes an important chronic granulomatous pneumonia and lung abscesses. The infection also occurs in humans, often following immunosuppression of various causes. The increased number of human cases reported recently is partly the result of the spread of AIDS but may also reflect the increasing awareness by medical laboratories of this opportunistic pathogen and their improved ability to identify it rather than to dismiss it as a contaminating micrococcus or diphtheroid. R. equi can be identified on the basis of a variety of conventional phenotypic characteristics including microscopic (Gram and acidfast staining) and macroscopic morphologies, growth requirements, metabolism of glucose, and phenotypic molecular characteristics including the presence of mycolic acid composition, which is detected by thin-layer chromatography. The colonial morphology of R. equi is diverse and consists of three major varieties: pale pink and slimy, coral and non-slimy, and pale yellow in color, non-slimy. Colorless colonial variants may also occur. R. equi is a non-motile gram-positive pleomorphic coccobacillus, varying from distinctly coccoid to bacillary depending on growth conditions. All of the rhodococci from clinical specimens are generally weakly acid fast when stained either by the modified Kinyoun method or by the Ziehl-Neelsen method. Regarding biochemical characteristics, the organism is generally biochemically unreactive. It fails to oxidize or ferment carbohydrates, neither uses sodium... (Complete abstract click electronic access below)

Considerando as limitações do diagnóstico convencional da tuberculose (TB) e o avanço das tecnologias de diagnóstico, nosso grupo desenvolveu o ensaio in house TaqMan-IS6110 para a detecção do DNA do complexo Mycobacterium tuberculosis. O objetivo deste estudo foi determinar a acurácia do Detect-TB e do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com os métodos de diagnóstico padrão ouro para a TB e o desfecho clínico. Um total de 216 amostras clínicas de escarro espontâneo de pacientes com suspeita de TB foram incluídas. A sensibilidade (SE) e especificidade (SP) do Detect-TB em comparação com a baciloscopia e/ou cultura (n= 109) foram de 89,4% e 70,4%. A SE e SP do Detect-TB em comparação com o desfecho clínico (n= 197) foram de 86,6% e 66,4%. A SE e SP do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com a baciloscopia e/ou cultura (n= 109) foram 92,1% e 62,0%. A SE e SP do ensaio TaqMan-IS6110 em comparação com o desfecho clínico (n= 197) foram de 93,3% e 55,5%. A concordância entre os testes foi demonstrada pelo índice Kappa de 0,56 (P < 0,001) (n= 197). O Detect-TB e o ensaio TaqMan-IS6110 apresentaram valores de SE consistentes e SP inferiores quando comparados com outros testes moleculares in house e kits comerciais. O ensaio TaqMan-IS6110 deve ser avaliado com um maior número amostral para poder ser validado e para, eventualmente, poder ser implementado comercialmente. / Considering the limitations of conventional tuberculosis (TB) diagnosis and the advancement of diagnostic technologies, our group developed an in house IS6110-TaqMan assay for the detection of Mycobacterium tuberculosis complex DNA. The aim of the study was to determine the accuracy of the commercial molecular diagnostic assay Detect-TB and the IS6110-TaqMan assay compared to the TB gold standard diagnostic methods and the clinical outcome. A total of 216 clinical specimens of spontaneous sputum from TB suspected patients were included. Detect-TB sensitivity (SE) and specificity (SP) compared with the smear microscopy and/or culture (n= 109) were 89.4% and 70.4%. Detect-TB SE and SP compared with the clinical outcome (n= 197) were 86.6% and 66.4%. IS6110-TaqMan assay SE and SP compared with the smear microscopy and/or culture (n= 109) were 92.1% and 62.0%. IS6110-TaqMan assay SE and SP compared with the clinical outcome (n= 197) were 93.3% and 55.5%. The concordance among the tests were demonstrated by the Kappa index of 0.56 (P < 0.001) (n= 197). IS6110-TaqMan assay and Detect-TB showed consistent SE and lower SP when compared with other current molecular in house and commercial kits. IS6110-TaqMan assay should be evaluated with a larger number of samples to be validated and may eventually be implemented commercially.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-07-26T12:46:39Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Santos Nascimento.pdf: 390426 bytes, checksum: 2708fb8205c805d25a600799b987bcaa (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T12:46:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Santos Nascimento.pdf: 390426 bytes, checksum: 2708fb8205c805d25a600799b987bcaa (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz / [INTRODUÇÃO]. O Mycobacterium tuberculosis é responsável por 100.000 novos casos de tuberculose anualmente no Brasil. Diante desta alta incidência, é imperativo a busca de estudos que possam melhor elucidar a interação dos componentes do bacilo com o sistema imune .A resposta imune para muitos componentes do bacilo parece não estar clara. Entre as proteínas que compõe a parede celular do bacilo, algumas tem sido estudada, mas a maioria delas tem sua função ainda desconhecida. Recentemente uma nova proteína do M.tuberculosis, MCEP (Mycobacterium cell entry protein) foi clonada e sequenciada. MCEP é uma proteína de 52kD que medeia a entrada e sobrevivência do M. tuberculosis em células não fagocíticas e em macrófagos humanos. [OBJETIVO] . Estudar a resposta imune humoral e celular contra MCEP em indivíduos PPD-, PPD+ e pacientes com tuberculose pulmonar. [GRUPOS DE ESTUDO E MÉTODOS]. Dez indivíduos PPD-, dez PPD+ e dez pacientes com tuberculose pulmonar foram incluídos neste estudo. Foram coletados soro dos indivíduos dos grupos estudados para determinação dos títulos de anticorpos contra MCEP através da técnica de ELISA. As placas foram sensibilizadas com 1 ug/ml do antígeno solúvel de MCEP onde foi incubada e em seguida processada as lavagens e finalizando a detecção através da adição do substrato. Para avaliar a imunidade celular células mononucleares foram isoladas do sangue periférico pelo gradiente de Ficoll-hypaque e cultivados na estufa à 370C com 5% de CO2 por 5 dias na presença do antígeno total do M. tuberculosis (1ug/ml), MCEP (1ug/ml), pokeweed mitógeno-PWM (1/100), conA (10ug/ml) e anti-TGF β(10ng/ml). A transformação blástica induzida por MCEP e a sua capacidade de inibir a proliferação celular induzida por ConA foi mensurada por incorporação de H-tymidine. Concentrações de IL-2, IFNγ, TNFα,IL-10 e TGFβ foram determinadas nos sobrenadantes pela técnica de ELISA (ENDOGEN). [RESULTADOS]. Este estudo demonstra que MCEP induziu baixos níveis de IgG no soro. A proliferação celular em resposta à MCEP foi muito baixa em todos os grupos estudados. A mediana de IL-2 em resposta a MCEP foi de 20 pg/ml, 6pg/ml e 17 pg/ml nos sobrenadantes do grupos PPD-, PPD+ e pacientes com tuberculose pulmonar. A produção de IFNγ em reposta à MCEP foi de 11pg/ml, 1pg/ml e 5pg/ml e de TNFα foi de 1pg/ml, 4pg/ml e 58pg/ml nos mesmos grupos estudados. Em adição MCEP induziu concentrações baixas de IL-10. Contudo, MCEP induz uma grande produção de TGFβ em células mononucleares de ambos grupos controles e pacientes avaliados respectivamente 1742pg/ml, 1773pg/ml e 2361 pg/ml. A capacidade de proliferação induzida por ConA foi inibida pela adição de MCEP e revertida pelo ix anti - TGFβ. [CONCLUSÕES]. MCEP foi capaz de induzir IgG total no soro. A capacidade de ativação linfoblástica não foi observada. Não se observou a produção de citocinas ativadoras do sistema imune como IL-2, IFNγ e TNFα nas células mononucleares de todos os grupos estudados. Mcep não induziu produção de IL-10, porém induziu uma alta produção de TGFβ nos sobrenadantes dos grupos estudados. MCEP inibiu a capacidade estimulatória de ConA sobre as células monoucleares. Este efeito de MCEP foi mediado por TGF β.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-24T23:44:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 294418.pdf: 1061040 bytes, checksum: 208afd9a3637548afef095f87e292252 (MD5) / A vetorização de agentes tuberculostáticos através de nanopartículas é uma estratégia promissora para o tratamento da tuberculose pulmonar. Dentre os fármacos integrantes do esquema terapêutico, a isoniazida (INH) é o mais antigo e utilizado, apresentando excelente atividade antimicobacteriana. Embora amplamente utilizada, a INH acarreta efeitos adversos relacionados à sua toxicidade hepática e neuronal, além do rápido desenvolvimento de resistência do bacilo devido principalmente à baixa penetração intracelular do fármaco. Mecanismos de resistência rapidamente desenvolvidos por este patógeno intracelular têm intensificado a busca por novas estratégias terapêuticas, bem como por moléculas com atividade antimicobacteriana. Além disso, problemas relacionados à baixa eficiência de encapsulação da isoniazida em nanopartículas poliméricas requerem o aprimoramento da formulação farmacêutica. Assim, o presente trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento de nanopartículas de PLGA contendo isoniazida e seu análogo, denominado JVA 001, bem como a avaliação comparativa da atividade antimicobacteriana de cada sistema. Para a obtenção de nanopartículas, foram testadas as técnicas de dupla-emulsão com evaporação do solvente, nanoprecipitação e salting-out. Após a padronização da formulação estéril, a eficiência de encapsulação e o teor de fármaco foram determinados nas nanopartículas através de um método de quantificação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), da isoniazida e seu análogo, o JVA 001. A eficiência de encapsulação média obtida com a isoniazida foi de 21%, enquanto que com o JVA 001, alcançou 61%. A formulação selecionada permitiu a obtenção de partículas esféricas submicrônicas, com diâmetro médio de 142 ?m. Fotomicrografias obtidas utilizando-se microscopia eletrônica de varredura, emissão de campo ou microscopia de força atômica mostraram partículas com formato esférico e superfície lisa. A análise por calorimetria exploratória diferencial indicou a ocorrência de interações entre JVA 001 e a matriz polimérica nas nanopartículas de PLGA. Além disso, o espectro de difração de raios-X mostrou diferenças na estrutura cristalina do composto sintetizado a partir da conjugação da isoniazida com o grupamento citral. A atividade antimicobacteriana do JVA 001 foi avaliada in vitro, empregando-se o método do MTT, através do tratamento direto em culturas de Mycobacterium tuberculosis (Mtb), cepa H37Rv, e intracelularmente, em macrófagos murinos infectados. Tanto a isoniazida livre quanto nanoencapsulada reduziram significativamente a viabilidade do Mtb em cultura, de maneira dose e tempo dependente. Da mesma forma, JVA 001 inibiu o crescimento micobacteriano in vitro, entretanto, nanopartículas contendo o análogo JVA 001 foram mais efetivas na inibição do crescimento micobacteriano em macrófagos infectados, reforçando o potencial de nanopartículas poliméricas como carreador intracelular de fármacos. Os resultados obtidos neste trabalho revelam um potente análogo da INH com alta atividade contra M. tuberculosis in vitro e sugerem uma investigação mais aprofundada da utilização de sistemas carreadores nanopartículados tratamento farmacológico da tuberculose pulmonar.

Orientador: Ana Maria de Andrade Caldeira / Banca: João José Caluzi / Banca: Lilian Al-Chueyr Pereira Martins / Resumo: O médico francês Léon Charles Albert Calmette (1863-1933) é conhecido como um dos colaboradores para o desenvolvimento do bacilo nomeado BCG (bacilo Calmette-Guérin), importante na história da medicina por seu possível emprego como vacina contra a tuberculose. O nome do bacilo BCG tem sua origem por causa de seu desenvolvimento em associação com o veterinário francês Jean-Marie Camille Guérin (1872-1961). Nós organizamos as contribuições de Albert Calmette, do período de 1905 a 1933, para o desenvolvimento do bacilo BCG. Para esse propósito, utilizamos os artigos originais publicados por ele. Com esses artigos, nos mostramos as controvérsias e diálogos com outros pesquisadores, integrando uma abordagem internalista e externalista da História da Ciência, realizando uma discussão dos conceitos científicos presentes em seus trabalhos e as influências social, econômica e política do respectivo contexto histórico. Existe uma crença comum entre os alunos de que a Ciência é uma busca solitária e as ideias aparecem espontaneamente na mente dos cientistas. Trata-se de uma percepção estereotipada sobre a natureza da Ciência que procuramos superar, mostrando as pesquisas de Calmette sobre o desenvolvimento do bacilo BCG utilizando uma Rede de Sociabilidade elaborada por nós. Para ilustrar como a Rede de Sociabilidade pode explicar a natureza social da Ciência, delineamos o desenvolvimento do BCG por Calmette e Guérin. Durante este processo, eles contaram com muitos cientistas, como o mi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The French doctor Léon Charles Albert Calmette (1863-1933) is known as one of the contributors for the development of the bacillus named BCG (Bacillus Calmette-Guérin), important in medicine history due to its use as a vaccine against tuberculosis. The name bacillus BCG has its origin from its development in association with the French veterinarian Jean-Marie Camille Guérin (1872-1961). We organized the contributions of Albert Calmette, in the period of 1905 to 1933, for the development of de bacillus BCG. For this purpose, we used the original papers published by him. With these papers, we show controversies and dialogues with other researchers, integrating an internalist and externalist approach of the History of Science, by doing a discussion of Scientific concepts within his papers and the social, economical and political influences in the respective Historical context. There is a common belief among students that Science is a solitary pursuit and the ideas appear spontaneously in the scientists' mind. This is a stereotyped perception about the nature of Science that we seek to disavow, showing Calmette's researches about the development of bacillus BCG using a Sociability Network elaborated by us. To illustrate how the Sociability Network can explain the social nature of Science, we delineate BCG's development by Calmette and Guérin. During this process they have counted on many scientists, such as the German microbiologist Emil von Behring (1854-1917) and the French vet... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A Tuberculose (TB) é a principal causa de óbitos entre as doenças infecciosas causadas por um único agente. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) o agente etiológico da TB no homem, o complexo Mycobacterium (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) é responsável por cerca de 8 milhões de novas infecções e 3 milhões de mortes a cada ano no mundo. No começo da década de 80, a reemergência da TB em países em desenvolvimento deve-se à crescente incidência do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), à falta de recursos para o tratamento desta doença e à proliferação de cepas resistentes a múltiplas drogas (MDR-TB). Esta situação criou a necessidade da busca por novos agentes antimicobacterianos capazes de reduzir o tempo de tratamento, melhorar a adesão dos pacientes ao mesmo e ser efetiva contra cepas MDR-TB. A via do chiquimato leva à biossíntese do corismato, o precursor de aminoácidos aromáticos, tirosina, triptofano e fenilalanina. A primeira reação na biossíntese de fenilalanina envolve a conversão de corismato a prefenato, catalisada pela corismato mutase. A segunda reação na biossíntese de fenilalanina é a descarboxilação e desidratação de prefenato a fenilpiruvato, catalisada pela prefenato desidratase. Embora ausente em mamíferos, esta via está presente em bactérias, algas, fungos, plantas e parasitos do Phyllum Apicomplexa. Esta rota é essencial em M. tuberculosis e, portanto, suas enzimas representam alvos potenciais para o desenvolvimento de novas drogas antimicobacterianas. O objetivo deste trabalho foi estudar o gene pheA da linhagem de M. tuberculosis H37Rv e seu produto, a enzima prefenato desidratase Para isso, DNA genômico de M. tuberculosis H37RV foi extraído e o gene pheA foi amplificado pela técnica de PCR, clonado no vetor de expressão pET-23a(+), seqüenciado e superexpresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). Os resultados obtidos confirmaram a região predita para o gene pheA, que foi amplificado com sucesso, mostrando 963 pb, sendo que a presença de 10% dimetil sulfoxido (DMSO) mostrou ser essencial para permitir a desnaturação do DNA rico em bases G-C. Análise da seqüência nucleotídica pelo método de Sanger confirmou a identidade do gene clonado e demonstrou que nenhuma mutação foi introduzida pelos passos de PCR e clonagem. A enzima prefenato desidratase foi superexpressa em células de E. coli BL21(DE3) eletroporadas com pET-23a(+)::pheA. Análise por SDS-PAGE mostrou expressão significativa de uma proteína com aproximadamente 33kDa, estando de acordo com a massa molecular esperada para a prefenato desidratase. A proteína recombinante foi superexpressa sem a adição de IPTG, e a presença da proteína pôde ser detectada em todos os intervalos de tempo testados (6, 9 e 24 horas depois da OD600nm alcançar o valor de 0,5). Foi realizado ensaio enzimático com a prefenato desidratase de acordo com Gething et al. (1976) utilizando prefenato de bário como substrato e coeficiente de extinção molar de 17.500 a 320 nm para calcular a concentração de fenilpiruvato. Houve um aumento de 1766 vezes na atividade específica da prefenato desidratase no extrato bruto da proteína recombinante em relação ao controle, no qual o vetor pET23a(+) sem o gene pheA foi introduzido em células de E. coli BL21(DE3).

A enzima -cetoacil-PCA redutase catalisa a redução, dependente de NADPH, de - cetoacil-PCA, a segunda etapa do sistema tipo II de elongação de ácidos graxos em bactérias, plantas e organismos apicomplexos. No presente trabalho, utilizou-se acetoacetil- CoA como substrato para caracterizar cineticamente a reação catalisada pela enzima de Mycobacterium tuberculosis, o agente etiológico da tuberculose. O mecanismo cinético da reação foi investigado pela análise de padrões de velocidade inicial, inibição por produtos e efeitos isotópicos primários cinéticos, e os resultados apontam para um mecanismo aleatório em estado estacionário. Efeitos isotópicos cinéticos primários, a-secundários, de solvente e múltiplos, bem como estudos de pH e temperatura, ressonância magnética nuclear e variação dos efeitos isotópicos primários com o pH foram utilizados para determinar o mecanismo químico da reação, e a análise dos resultados sugere que as transferências de hidreto e próton e a re-hibridização dos substratos ocorrem de modo concertado. A interação entre NADPH e enzima foi estudada tanto em condições de equilíbrio quanto em estado pré-estacionário, monitorando-se o aumento na fluorescência do nucleotídeo ao ligar na proteína. Os dados coletados em equilíbrio sugerem a presença de cooperatividade homotrópica positiva entre as subunidades do dímero, e a análise dos dados cinéticos sugere duas formas de enzima livre em solução como base para a cooperatividade. Diálise em equilíbrio foi empregada para caracterizar a ligação de acetoacetil-CoA à enzima, e os resultados indicam que não há cooperatividade na ligação deste substrato. Mecanismos cinético, químico e cooperativo para a reação catalisada pela -cetoacil-PCA redutase de M. tuberculosis são propostos com base nos dados aqui apresentados. / The -ketoacyl-ACP reductase enzyme catalyzes the NADPH-dependent reduction of -ketoacyl-ACP, the second step of type II fatty acid elongation system of bacteria, plants, and apicomplexan organisms. In the present work, acetoacetyl-CoA was utilized as substrate to kinetically characterize the reaction catalyzed by the enzyme of Mycobacterium tuberculosis, the etiogical agent of tuberculosis. The reaction kinetic mechanism was investigated by analyzing initial velocity and product inhibition patterns, and primary kinetic isotope effects, and the results point to a random steady-state mechanism. Primary, a-secondary, solvent, and multiple kinetic isotope effects, as well as pH and temperature studies, nuclear magnetic resonance, and pH variation of primary isotope effects were utilized to determine the reaction chemical mechanism, and analysis of the results suggests that hydride and proton transfer and substrate re-hybridization occur in a concerted fashion. Interaction between NADPH and enzyme was studied both in equilibrium and pre-steadystate conditions, by monitoring the enhancement in nucleotide fluorescence upon its binding to the enzyme. Data collected at equilibrium suggest the presence of positive homotropic cooperativity between subunits of the dimer, and analysis of kinetic data suggests two forms of free enzyme in solution as the basis for cooperativity. Equilibrium dialysis was employed to characterize the binding of acetoacetyl-CoA to the enzyme, and the results indicate there is no cooperativity in the binding of this substrate. Kinetic, chemical, and cooperaive mechanisms for the M. tuberculosis -ketoacyl-ACP reductasecatalyzed reaction are proposed on the basis of the data presented here.

A tuberculose (TB) permanece como uma doença importante do ponto de vista da saúde pública. Devido ao aumento do número de casos, surgimento de cepas resistentes aos fármacos e a co-infecção pelo HIV, novas estratégias para combater a doença são urgentemente necessárias. Por isso a Organização Mundial da Saúde recomenda investimentos em novas tecnologias e estratégias que possam contribuir para o diagnóstico mais rápido, assim como a aplicação de ferramentas que permitam um melhor entendimento da epidemiologia da TB em diferentes populações. O spoligotyping é uma técnica desenvolvida para detecção e diferenciação simultânea de cepas do complexo Mycobacterium tuberculosis. A oportunidade de combinar informações diagnósticas rápidas e dados de epidemiologia molecular representa um avanço importante no controle da TB. Dados epidemiológicos, caracterização molecular a partir de amostras clínicas e geolocalização dos casos de TB, podem contribuir para o entendimento da distribuição da doença e auxiliar no desenvolvimento de estratégias mais específicas para conter sua disseminação. Para isso foi realizado um estudo prospectivo incluindo pacientes atendidos no ambulatório do Hospital Sanatório Partenon, de agosto de 2005 a abril de 2007. Foram incluídos 202 pacientes, 142 com TB e 60 sem a doença. Entre os pacientes com TB a média de idade foi mais baixa (36,96±12,17 vs 44,54±6,05), com maior frequência eram não-brancos, desempregados, sem renda, utilizavam drogas, tinham histórico de encarceramneto, eram desnutridos e tinham tido contato com paciente com TB, principalmete intradomiciliar e em prisões. Os pacientes não-brancos apresentaram maiores taxas de infecção por HIV e HCV. Alcoolismo estava associado ao abandono do tratamento. A técnica de spoligotyping apresentou um bom rendimento quando aplicada diretamente em amostras clínicas, uma vez que 89% das amostras apresentaram resultados concordantes. Entre os 135 isolados de pacientes genotipados, foram identificados 44 spoligotipos diferentes, sendo 112 isolados (83%) com padrões compartilhados e 23 (17%) com padrões únicos. A família LAM foi a mais frequente englobando 37% dos isolados. Através da geolocalização foi possível observar que há uma grande diversidade genética das cepas circulantes na região estudada, mas também alguns agrupamentos que devem ser melhor caracterizados. A estratégia proposta neste estudo, utilizar o spoligotyping diretamente em amostras clínicas, mostrou-se útil para encurtar o tempo de obtenção de informações sobre as identidades das cepas de M. tuberculosis. Pode ser utilizada em combinação com dados clínicos dos pacientes para gerar informações epidemiológicas muito mais rapidamente e auxiliar no combate à TB. / Tuberculosis (TB) remains as an important public helath issue. Because of the increase in the number of cases, emergence of drug resistant strains and HIV coinfection, new strategies to fight the disease are urgently needed. Thus, the World Health Organization recommends investiments on new approaches and technologies that can be used to fasten the diagnosis of TB, as well as the application of tools that allow a better understanding of the epidemiology of the disease in different populations. Spoligotyping is a technique which was developed for simultaneous detection and differentiation of Mycobacterium tuberculosis complex strains. The opportunity to combine rapid diagnostic information and molecular epidemiology represents an important advance in the epidemiologic control of TB. Epidemiologic data, molecular characterization from clinical samples and spatial localization of TB cases may be used for the understanding of disease distribution and can be useful for the development of more specific strategies to arrest its dissemination. Aiming at this, a prospective study was designed including patients assisted at the outpatient section of Hospital Sanatório Partenon from August 2005 to April 2007. It was included 202 patients from wich 142 had a positive diagnosis for TB and 60 had a negative diagnosis for the disease. Mean age was lower among patients diagnosed with TB (36.96±12.17 vs 44.54±6.05), they were more likely to be non-white, to be unemployed and not to have any income, to use drugs, to have incarceration history, to have malnutrition and have had contact with a patiente with TB, mainly in the household and in prisons. Non-white patients had higher rates of HIV and HCV co-infection. Alcohol abuse was associated to treatment nonadherence. Spoligotyping technique presented good results when applied directly to clinical samples, once 89% of samples presented agreeing results. Among 135 patients isolates genotyped, it was found 44 differnt spoligotypes, 112 (83%) were shared types and 23(17%) were unique. LAM family was the most frequent comprising 37% of all isolates. Spatial localization of cases demonstrated a high genetic diversity of strains circulating in the study area, but also pointed some clusters that should be better characterized. The strategy proposed in this study, applying spoligotyping directly to clinical samples, showed to be useful to shorten time in obtaining information on M. tuberculosis strains identities. It can be used in combination with clinical data of patients to yield epidemiologic inofrmation more rapidly and help to fight TB.