Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-09-04T12:06:25Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_CaracterizacaoMolecularKlebsiella.pdf: 3383189 bytes, checksum: 1b8dc4391b448cb697a3dd6a7612a585 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-09-04T17:57:15Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_CaracterizacaoMolecularKlebsiella.pdf: 3383189 bytes, checksum: 1b8dc4391b448cb697a3dd6a7612a585 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-09-04T17:57:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_CaracterizacaoMolecularKlebsiella.pdf: 3383189 bytes, checksum: 1b8dc4391b448cb697a3dd6a7612a585 (MD5) Previous issue date: 2016-12-13 / A resistência aos antimicrobianos em bactérias da família Enterobacteriaceae está aumentando de forma alarmante no mundo todo. As K. pneumoniae constituem um importante grupo de patógenos humanos, causadores de infecções hospitalares e comunitárias. Nestas bactérias, a produção de beta-lactamases é um dos principais mecanismos de resistência aos antimicrobianos e responsável pela falha da terapia antimicrobiana. Este trabalho teve como objetivo realizar a caracterização molecular de espécimes de K. pneumoniae produtoras de ESBL e KPC quanto a resistência aos antimicrobianos em pacientes hospitalizados em Belém-PA. Foram analisadas 124 espécimes de K. pneumoniae oriundas de um hospital público de Belém-Pará. Foram realizadas nesses espécimes testes de suscetibilidade a antimicrobianos, testes fenotípicos para detecção de betalactamases de espectro ampliado (ESBL) e K. pneumoniae produtora de carbapenemase (KPC). Posteriormente foram realizadas reações de cadeia de polimerase (PCR) e o sequenciamento de DNA para identificar os genes determinantes de resistência aos antimicrobianos. Foi observado que 83% dos isolados apresentaram o gene bla CTX-M, 85,5% o bla SHV, 83% o bla TEM e 5% o gene bla KPC. Quanto aos genes que codificam ESBL o gene bla CTX-M-71 foi isolado com maior freqüência e foi identificado em 60% dos isolados analisados. Os outros genes que codificam ESBL foram bla SHV-38 (5%), bla SHV-100 (5%) and bla SHV-12 (3,5%). O gene bla KPC-2 foi detectado em 100% dos isolados. Estas enterobactérias apresentaram fenótipos de multidroga resistência com elevados níveis para os quinolonas e aminoglicosideos. Foram observadas associações entre os genótipos e à resistência aos antibióticos. A presença de micro-organismos multirresistentes em unidades hospitalares reforça a necessidade de medidas para a rápida contenção de possíveis infecções causadas por esses patógenos. / The antimicrobial resistance in Enterobacteriaceae is increasing worldwide. The K. pneumoniae constitute an important group of human patogen, causing of hospital and communitarian infections. In these bacteria, the production of extended spectrum beta-lactamases (ESBL) is one of the main mechanisms of resistance the antimicrobials, responsible for the imperfection of the therapy against infections for gram-negative bacilli. This work aimed to do the molecular characterization of the K. pneumoniae producing ESBL and KPC about antimicrobial resistence in pacients from Belém-PA. A total of 124 K. pneumoniae isolates were collected from public hospital from Belém-PA and susceptibility test was performed to detect its susceptibility patterns antibiotics. Phenotypic tests for extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs) and carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae (KPC) producing strains were performed to detect the resistance phenotype of the isolates. Then PCR amplification and sequencing analysis were performed for the drug resistance determinants genes. The results showed that 83% strains harbored bla CTX-M gene, 85,5% carried bla SHV , 83% carried bla TEM and 5% carried bla KPC. The most frequent gene ESBL detected was bla CTX-M-71, which was observed in 60% of isolates. Other ESBL genes were bla SHV-38 (5% of isolates), bla SHV-100 (5% of isolates) and bla SHV-12 (3,5% of isolates). O gene bla KPC-2 was detected in 100% of isolates.These enterobacterias showed multidrug resistance phenotypes with high levels for quinolones and aminoglycosides. Associations between genotypes and antibiotic resistance were observed.The presence of multidrug resistant micro-organisms in hospitals, reinforces the need for measures for rapid containment of possibles infections caused by these pathogens.

A bacteriospermia pode prejudicar a qualidade das doses de sêmen suíno. Desta forma, a adição de antimicrobianos (ATM) aos diluentes de sêmen é imprescindível para a manutenção da qualidade das doses inseminantes. Contudo, a crescente ocorrência de resistência bacteriana tem impulsionado a redução do uso de ATM na suinocultura. Nesse sentido, o armazenamento das doses inseminantes em baixas temperaturas pode ser uma alternativa para a remoção dos ATM dos diluentes comerciais. Sendo assim, no presente estudo, foram realizados dois experimentos para avaliar a qualidade espermática e a contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL) de doses de sêmen suíno submetidas a baixas temperaturas de armazenamento, na ausência ou presença de ATM. No experimento 1, as motilidades (total e progressiva) das doses com ATM foram maiores conforme aumentou a temperatura de armazenamento (P<0,01). Nas doses sem ATM, as motilidades foram inferiores nas mantidas a 5 °C do que nas demais (P<0,05). O número de UFC/mL foi menor nas doses sem ATM mantidas a 5 e 10 °C do que a 17 °C (P<0,05), mas não houve diferença entre as temperaturas de armazenamento nas doses com ATM (P>0,05). As integridades de acrossoma e de membrana plasmática não foram afetadas (P>0,05) pelo uso de ATM, mas foram influenciadas pela temperatura de armazenamento (P<0,0001) No experimento 2, os machos foram categorizados em BONS e RUINS de acordo com a motilidade progressiva das doses com ATM armazenadas a 5 °C nas 120 h, sendo investigado o efeito dessas categorias sobre as variáveis estudadas. A motilidade total das doses armazenadas a 17 °C foi superior à das mantidas a 5 °C diluídas sem ATM (P<0,05). Os percentuais de motilidade progressiva e de acrossomas normais foram superiores nas doses mantidas a 17 °C do que nas mantidas a 5 °C, com ou sem ATM (P<0,05). O número de UFC/ml foi maior nas doses diluídas sem ATM do que nas demais (P<0,05). Após a categorização dos machos, as motilidades (total e progressiva) foram maiores nos machos BONS do que nos RUINS (P<0,05), sem diferença significativa (P>0,05) nas integridades (acrossomal e de membrana plasmática). Apesar de a qualidade espermática ter sido afetada negativamente pelas baixas temperaturas, o armazenamento das doses de sêmen suíno a 5 °C é possível, uma vez que foi mantida a viabilidade espermática in vitro, por até 5 dias, acima do nível mínimo considerado adequado para a inseminação artificial. Contudo, o uso de doses sem antimicrobianos ainda precisa de otimização, posto que que as baixas temperaturas de armazenamento reduzem, mas não inibem por completo o crescimento bacteriano. / Bacteriospermia can impair boar semen dose quality. Thus, the addition of antibiotics (ATB) is indispensable for maintaining semen doses quality. Nevertheless, growing bacterial resistance occurrence have had driven to a reduction in use of ATB in pig industry. In this sense, storage of semen doses at low temperature may be an alternative to removal ATB of commercial semen extenders. Therefore, the aim of the present study was to assess sperm quality and number of colony-forming units (CFU mL-1) in boar semen doses stored at low storage temperatures with or without ATB, in two experiments. In experiment 1, in semen doses with ATB, total and progressive motility increased as the storage temperature increased (P<0.01). In semen doses without ATB, total and progressive motility were observed to be lower when stored at 5 °C than at 10 and 17 °C (P<0.05). The number of CFU mL-1 was lower in semen doses without ATB stored at 5 and 10 °C than at 17 °C (P<0.05), but there was no difference among storage temperatures in doses with ATB (P>0.05). Acrosome and sperm membrane integrity were not influenced (P>0.05) by using ATB, but they were influenced by storage temperature (P<0,0001) In experiment 2, boars were grouped in GOOD and POOR according to progressive motility in doses stored for up to 120 h at 5 °C. So, the effect of this classification on assessed variables, was investigated. Total motility was higher in doses stored at 17 °C than in doses without ATB stored at 5 °C (P<0.05). The percentages of progressive motility and normal acrosomes were higher in doses stored at 17 °C than in doses stored at 5 °C, with or without ATB (P<0.05). The number of CFU mL-1 was higher in doses without ATB than in remaining ones (P<0.05). Total and progressive motility were observed to be higher in GOOD than in POOR boars (P<0.05). There was no difference between groups of boars in acrosome and membrane integrity (P>0.05). Despite sperm quality was negatively affected by low temperatures, the storage of boar semen doses at 5 °C is possible, since sperm viability in vitro was maintained for up to 5 days, fulfilling the requirements of semen quality to be used in artificial insemination. Nevertheless, the use of semen doses without ATB will need optimization, since low storage temperatures decreased bacterial growth, but not completely inhibit it.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-06-26T15:18:47Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AtividadeAntimicrobianaAntioxidante.pdf: 2908572 bytes, checksum: e12ae6d5a92fa7674e91793cb3fff4f9 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-06-27T16:05:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AtividadeAntimicrobianaAntioxidante.pdf: 2908572 bytes, checksum: e12ae6d5a92fa7674e91793cb3fff4f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-27T16:05:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AtividadeAntimicrobianaAntioxidante.pdf: 2908572 bytes, checksum: e12ae6d5a92fa7674e91793cb3fff4f9 (MD5) Previous issue date: 2016-09-15 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A sepse é uma disfunção orgânica causada por uma resposta imune desregulada a uma infecção. Na abordagem terapêutica inicial da sepse são utilizados antimicrobianos de amplo espectro, que não é suficiente para o controle da infecção, sendo necessário associações com outras terapias. Dessa forma, o Ilex paraguariensis por ser um potente antimicrobiano, antioxidante, e Agaricus brasiliensis possui propriedades imunomoduladora poderiam ser uma nova fonte de terapia. Assim, o presente estudo visou avaliar o efeito antimicrobiano, antioxidante e imunomodulador in vitro e in vivo dos extratos. Para tanto, neste estudo, foi avaliada a ação antimicrobiana in vitro dos extratos aquosos de A.brasiliensis e I. paraguariensis frente à Staphylococcus aureus e Escherichia coli pelo método da microdiluição e espectrofotmétrico para determinação de concentração inibitória Mínima e técnica de cultivo em placa de petri para a concentração bactericida mínima. Foi também avaliada a citotoxicidade em macrófagos, produção de óxido nítrico (NO), proliferação, fagocitose, capacidade antioxidante equivalente ao Trolox (TEAC) e determinação da atividade antioxidante total pela captura do radical livre e produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). In vivo, os camundongos swiss com sepse induzida foram pré-tratados com os extratos aquosos de A.brasiliensis e I. paraguariensis e após 12 e 24 horas suas amostras coletadas,e avaliado a sobrevida, migração leucocitária, hemograma, carga bacteriana, produção de NO, níveis de malonaldeído, TEAC em ex vivo avaliou-se capacidade fagocítica e liberação de EROs. O A.brasiliensis não apresentou atividade antimicrobiana in vitro, manteve as células viáveis, reduziu a capacidade fagocítica, aumentou NO, mas na presença de LPS reduziu o NO, apresentou efeito proliferativo, mas na presença do mitógeno teve efeito antiproliferativo e possui uma forte atividade antioxidante e capacidade de sequestro de radicais in vitro. O I.paraguariensis apresentou atividade antimicrobiana assim como efeito citotóxico, induziu à capacidade fagocítica dos leucócitos, aumentou NO, mas na presença de LPS reduziu, teve efeito proliferativo e atividade antioxidante com capacidade de sequestro de radicais in vitro. Em modelo de sepse in vivo, ambos aumentaram da sobrevida dos animais. O A.brasiliensis reduziu o influxo de leucócitos enquanto que o I. paraguariensis aumentou. Somente A.brasiliensis teve o hemograma semelhante ao sham, ambos extratos reduziram a carga bacteriana e diminuíram os níveis de NO, MDA e aumentaram os níveis de antioxidante nos tecidos, além disso, ambos diminuíram a produção de ERO. Apesar de ambos extratos apresentarem excelente resultados in vitro, o extrato aquoso de A.brasiliensis mostrou ser mais promissor que o extrato de I.paraguariensis como uma terapia adjuvante na sepse, devido sua elevada atividade antimicrobiana, antioxidante e anti-inflamatória in vivo. / Sepsis is an organ dysfunction caused by a dysregulated immune response to an infection, the initial therapeutic approach to sepsis are broad spectrum antimicrobials, which is not sufficient for control of infection, requiring association with other therapies. Thus, Ilex paraguariensis where to be a potent antimicrobial, antioxidant and Agaricus brasiliensis has immunomodulatory properties could be a new source of therapy. Thus, this study aimed to evaluate the antimicrobial effect, antioxidant and immunomodulatory in vitro and in vivo of the extracts. Therefore, in this study, we evaluated the in vitro antimicrobial activity of aqueous extracts from A.brasiliensis and I. paraguariensis against Staphylococcus aureus and Escherichia coli by the method of microdilution and by spectophotometry for determination of minimum inhibitory concentration and cultivation technique on petri dish for minimum bactericidal concentration, cytotoxicity in macrophages was evaluated, nitric oxide (NO) production, proliferation, phagocytosis, equivalent antioxidant capacity to Trolox (TEAC) and determination of the total antioxidant activity by capturing the free radical and reactive species production oxygen (ROS). In the swiss mice with induced sepsis were pretreated with aqueous extracts of A.brasiliensis and I. paraguariensis, after 12 and 24 hours collected their samples and evaluated the survival, leukocyte migration, hemogram, bacterial load, NO production, malondialdehyde (MDA), TEAC and ex vivo we evaluated phagocytic capacity and release of ROS. The A.brasiliensis showed no antimicrobial activity in vitro, remained viable cells reduced the phagocytic capacity, increased NO, but in the presence of LPS reduced, showed proliferative effect, but in the presence of mitogen had antiproliferative effect and has a strong antioxidant activity and capacity to sequester radicals in vitro. I.paraguariensis presented antimicrobial activity as well as cytotoxic effect induced phagocytic capacity increased NO, but in the presence of LPS reduced, had proliferative effect, antioxidant activity and capacity to sequester radicals in vitro. In vivo model of sepsis, both increased the survival of animals, A.brasiliensis reduced leukocyte influx while Ilex increased, only A.brasiliensis had hemogram similar to sham, both extracts reduced bacterial load and levels decreased NO, MDA and increased antioxidant levels in the tissues, in addition, both reduced the production of both extracts present ERO. Although excellent in vitro results, the aqueous extract from A.brasiliensis was found to be most promising as an adjuvant therapy in sepsis that I. paraguariensis due to its high antimicrobial activity, antioxidant and anti-inflammatory in vivo.

The objective of this study was to evaluate the antimicrobial and anti-caries effects of two plant extracts. The first chapter dealt with a review of the literature whose objective was to discuss the antimicrobial potential of Brazilian natural agents on the biofilm related to dental caries and gingivitis/periodontal disease. The research of the articles was carried out using PubMed. We found a total of 23 papers. Most of the studies were performed using planktonic microorganisms or under clinical trials. Nineteen articles were focused on cariogenic bacteria. From these nineteen articles, eleven were also about periodontopathogenic bacteria. Four studies addressed only periodontopathogenic bacteria. The most tested Brazilian natural agents were green propolis, essential oils of Lippia sidoides and Copaifera sp. Most of the tested agents showed similar results when compared to positive control (essential oils and extracts) or better effect than negative control (green propolis). More studies involving protocols closer to the clinical condition and the use of response variables that allows understanding the mechanism of action of natural agents are necessary before the incorporation of these natural agents into dental products. The second chapter aimed to test the effect of the hydroalcoholic extracts of Myracrodruon urundeuva All. and Qualea grandiflora Mart. leaves on the viability of the microcosm biofilm and on the prevention of enamel demineralization. The microcosm biofilm was produced on bovine enamel, using human saliva pool mixed with McBain saliva (0.2% sucrose) for 14 days. The biofilm was treated daily with the extracts for 1 min. M. urundeuva at 100, 10 and 0.1 g/ml and Q. grandiflora at 100 and 0.1 g/ml reduced cell viability similarly to the positive control and significantly more than negative control. M. urundeuva at 1000, 100 and 0.1 g/ml were able to reduce the counting formation unit-CFU counting of lactobacilli sp. and Streptococcus mutans, while Q. grandiflora at 1000 and 1.0 g/ml significantly reduced the S. mutans CFU counting. On the other hand, the natural extracts did not reduce the production of extracellular polyssacharides, lactic acid and the development of enamel caries lesions. The third chapter aimed to evaluate the effect of hydroalcoholic extracts of M. urundeuva and Q. grandiflora (alone or combined) on the viability of S. mutans biofilm and the prevention of enamel demineralization. S. mutans strain (ATCC 21175) was reactivated in BHI broth. Minimum inhibitory concentration, minimum bactericidal concentration, minimum biofilm inhibitory concentration and minimum biofilm eradication concentration were determined to choose the concentrations to be tested under the biofilm model. S. mutans biofilm (5x105 CFU/ml) was produced on bovine enamel using McBain saliva with 0.2% sucrose for 3 days. The biofilm was treated daily with the extracts for 1 min. M. urundeuva (isolated or combined) at concentrations equal or higher than 0.625 mg/ml was able to reduce the bacteria viability, whereas Q. grandiflora extract alone showed antimicrobial effect at 5 mg/ml only (p<0.05). On the other hand, none of the extracts was able to reduce the development of enamel caries lesions. Despite the tested natural extracts have antimicrobial effect; they are unable to prevent caries in enamel. / O objetivo foi avaliar os efeitos antimicrobiano e anti-cárie de dois extratos de plantas. O primeiro capítulo se referiu a uma revisão da literatura cujo objetivo foi discutir o potencial antimicrobiano dos agentes naturais brasileiros sobre o biofilme relacionado à cárie dentária e à gengivite/doença periodontal. A pesquisa dos artigos foi realizada usando o PubMed. Foram encontrados 23 trabalhos. A maioria dos estudos foi realizada utilizando microorganismos na fase planctônica ou ensaios clínicos. Dezenove artigos foram focados em bactérias cariogênicas. Dos dezenove artigos, onze também eram sobre bactérias periodontopatogênicas. Quatro estudos abordaram apenas bactérias periodontopatogênicas. Os agentes naturais brasileiros mais testados foram própolis verde, óleos essenciais de Lippia sidoides e Copaifera sp. Os agentes testados apresentaram resultados similares quando comparados ao controle positivo (óleos essenciais e extratos) ou melhor efeito que o controle negativo (própolis verde). Mais estudos próximos da condição clínica e o uso de variáveis de resposta que permitam entender o mecanismo de ação são necessários, para permitir a incorporação desses agentes naturais em produtos odontológicos. O segundo capítulo teve como objetivo testar o efeito dos extratos hidroalcoólicos de Myracrodruon urundeuva All. e Qualea grandiflora Mart. sobre a viabilidade do biofilme microcosmo e na prevenção da desmineralização do esmalte. O biofilme microcosmo foi produzido em esmalte bovino, utilizando pool de saliva humana misturada à saliva de McBain (0,2% de sacarose) durante 14 dias. O biofilme foi tratado diariamente com os extratos durante 1 min. M. urundeuva a 100, 10 e 0,1 g/ml e Q. grandiflora a 100 e 0,1 g/ml reduziram a viabilidade dos microrganismos de forma semelhante ao controle positivo e significativamente maior do que o controle negativo. M. urundeuva a 1000, 100 e 0,1 g/ml foi capaz de reduzir a contagem de Unidade formadora de colônia-UFC para Lactobacilos totais e Streptococcus mutans, enquanto a Q. grandiflora a 1000 e 1,0 g/ml reduziu significativamente a contagem de UFC para S. mutans. Os extratos naturais não conseguiram reduzir a produção de polissacarídeos extracelulares-PEC, ácido lático e o desenvolvimento da lesão cariosa em esmalte. O terceiro capítulo teve como objetivo avaliar o efeito dos extratos hidroalcoólicos de M. urundeuva. e Q. grandiflora (sozinhos ou combinados) sobre a viabilidade do biofilme de S. mutans e na prevenção da desmineralização do esmalte. Cepa de S. mutans (ATCC 21175) foi reativada em caldo BHI. Concentração inibitória mínima, concentração bactericida mínima, concentração inibitória mínima de biofilme e concentração de erradicação mínima de biofilme foram determinadas para escolher as concentrações a serem testadas sob o modelo de biofilme. O biofilme de S. mutans (5x105 CFU/ml) foi produzido em esmalte bovino, utilizando saliva de McBain com 0,2% de sacarose durante 3 dias. O biofilme foi tratado diariamente com os extratos durante 1 min. M. urundeuva (isolada ou combinada) nas concentrações iguais ou superiores a 0,625 mg/ml foi capaz de reduzir a viabilidade das bactérias, enquanto que o extrato da Q. grandflora apresentou efeito antimicrobiano somente a 5 mg/ml (p<0,05). Nenhum dos extratos reduziu o desenvolvimento da lesão da cárie. Apesar dos extratos naturais terem efeito antimicrobiano, são incapazes de prevenir o desenvolvimento da lesão cariosa em esmalte.

O carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus é o principal vetor da riquétsia Anaplasma marginale, o agente etiológico da anaplasmose, uma doença que acomete os rebanhos e causa sérios prejuízos econômicos à pecuária no Brasil. Estabelecemos em nosso laboratório o cultivo da linhagem de células BME26 que são originárias do R. (B.) microplus e também a infecção dessas células por A. marginale, um patógeno que é naturalmente transmitido pelo carrapato. Detectamos que a expressão gênica da defensina e da ixodidina nas células é aumentada frente à infecção por A. marginale, embora nenhuma alteração da expressão gênica da microplusina foi constatada. As células foram expostas a microorganismos inativados por calor e LPS, sendo que a expressão gênica da microplusina é aumentada frente a todos os estímulos. Na exposição das células BME26 com a bactéria Microccocus luteus, a expressão gênica da defensina e da ixodidina não foi alterada e no estimulo com leveduras a expressão gênica da ixodidina foi reprimida. Frente à infecção por A. marginale detectamos, aumento expressão da defensina e ixodidina. Os genes da microplusina e defensina foram silenciadas por RNAi em células infectadas por A. marginale, mas não houve alteração no número de riquétsias / The cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus is the main vector of the rickettsia Anaplasma marginale, the etiological agent of anaplasmosis, a disease that affects cattle and causes serious economic losses to the Brazilian cattle industry. We established in our laboratory the embryonic cell culture line BME26 from R. (B.) microplus and infection by A. marginale, a pathogen naturally transmitted by R. (B.) microplus. We verified that defensin and ixodidin gene expression increased in these cells after an infection by A. marginale and no alteration in microplusin gene expression was detected. The BME26 cells were exposed to heat-inactivated microorganims or to LPS, microplusin gene expression increased after all stimuli. After exposure of BME26 cells to Micrococcus luteus, expression levels of defensin and ixodidin did not change and ixodidin gene expression reduced after exposure of these cells to yeast. In the infection by A. marginale we detected defensin and ixodidin gene expression. Also, microplusin and defensin genes were silenced by RNA interference (RNAi) in A. marginale-infected BME26 cells, but we did not observe alteration in the number of MSP4 rickettsias

Neste estudo foram realizados inicialmente, experimentos para avaliar a ação sinérgica do peptídeo antimicrobiano P34 com sobrenadantes de culturas de algumas bactérias lácticas selecionadas e isoladas de queijo Minas Frescal. Foi investigada a influência deste peptídeo na expressão de genes em L. monocytogenes e L. seeligeri, sua citotoxicidade em diferentes células eucarióticas e toxicidade “in vivo”. Também foram realizados alguns testes para avaliar a citotoxicidade do peptídeo antimicrobiano P40. A adição do peptídeo P34 no queijo provocou uma diminuição de até 3 ciclos logarítmicos na contagem de células viáveis de L. monocytogenes inoculada artificialmente. Um aumento significativo na expressão dos genes dltA, Imo 1695 e mptA de L. monocytogenes foi observado após 96 h com a presença do peptídeo P34 no queijo. A influência do peptídeo P34 na expressão de genes associados aos componentes do envelope celular de L. monocytogenes e L. seeligeri, promoveu um aumento não significativo nos níveis de transcrição de genes dltA, Imo1695 e mptA observados em L. monocytogenes após inoculação em placas e incubação por 24 h a 37°C ou 240 h a 4°C. Em L. seeligeri uma diminuição significativa na expressão do gene dltA foi observada. Os genes Imo1695 e mptA demonstraram uma diminuição significativa de sua expressão (2000 e 31872 vezes, respectivamente) na presença do peptídeo P34 e incubação por 24 h a 37°C. A inoculação da placa com o peptídeo P34 e incubação por 240 h a 4ºC não promoveu diminuição significativa da expressão do gene mptA. A citotoxicidade dos peptídeos P34 e P40 foi avaliada em células VERO, tratadas com diferentes concentrações (0,02 - 2,5 μg ml-1). Nos ensaios de MTT, NRU e LDH as EC50 para o peptídeo P34 foram 0.60, 1.25, 0.65 μg ml-1 e do peptídeo P40 foram 0,30, 0,51 e 0,57 μg ml-1, respectivamente. A atividade hemolítica em eritrócitos humanos foi de (5,8%) e (19%), respectivamente. Os efeitos sobre a viabilidade, motilidade e exocitose acrossomal de espermatozóides humanos também foram avaliadas para o peptídeo P34. Não houve reações de hipersensibilidade ou aumento significativo de títulos de anticorpos durante os experimentos imunogenicidade ou morte dos animais durante experimentos de toxicidade aguda ou subcrônica. A DL50 foi superior a 332,3 ± 0,76 mg/kg. Não foram observadas alterações significativas nos parâmetros bioquímicos séricos nos animais tratados com o peptídeo P34. Não foram detectados sinais de possível toxicidade nos animais do grupo tratado com 0,825 mg/ kg/dia do peptídeo P34. Neste grupo apenas alterações histológicas no baço com a presença de megacariócitos foram observadas. A partir destes resultados evidencia-se o potencial do peptídeo P34 para ser utilizado como bioconservante em alimentos. / In this study initial experiments were performed to evaluate synergistic action of the antimicrobial peptide P34 and culture supernatants of some selected lactic acid bacteria isolated from Minas Frescal cheese. The influence of this peptide in the expression of genes in L. monocytogenes and L. seeligeri, their cytotoxicity in differents eukaryotic cells and “in vivo” toxicity was investigated. Also, some tests were carried out o evaluate the cytotoxicity of the antimicrobial peptide P40. The peptide P34 caused a decrease of up to 3 log cycles in viable counts of L. monocytogenes artificially inoculated in cheese. A significant increase in expression of genes dltA, Imo1695 mptA of L. monocytogenes was observed after 96 h incubation of the peptide P34 in cheese. The influence of peptide P34 on the expression of genes associated to components of cell envelope of L. monocytogenes and L. seeligeri, promoted a non significant increase in the levels of transcription of genes dltA, Imo1695 and mptA were observed after incubation of L. monocytogenes for 24 hs at 37°C and 240 hs at 4°C in plates. In L. seeligeri a significant decrease was observed in gene expression dltA. The gene Imo1695 showed a significant decrease in its expression (2000-fold) after inoculation with the peptide P34. A significant decrease of expression was also observed for the gene mptA (31872 - times) after inoculation with the peptide P34 and incubation for 24 hours at 37°C. The inoculation of the plate with the P34 peptide and incubated for 240 hrs at 4°C, showed a non-significant decrease of gene expression. The cytotoxicity of the peptide P34 and P40 was assessed in VERO cells treated with different concentrations (0.02 - 2.5 μg ml- 1). In MTT, NRU and LDH assays the EC50 to the peptide P34 were 0.60, 1.25, 0.65 μg ml-1 and the peptide P40 were 0.30, 0.51 and 0.57 μg ml-1, respectively. The hemolytical activity on human erythrocytes was of (5.8%) and (19%), respectively. The effects on viability, motility and acrosomal exocytosis of humam sperm were also evaluated for peptideP34. There were no hypersensitivity reactions or significant increase in antibody titer during the immunogenicity experiment or death of animals during the acute or subchronic toxicity tests. The LD50 was more the 332.3 ± 0.76 mg/kg. No significant changes in the serum biochemical parameters were observed in the animals treated with the peptide P34. Signs of possible toxicity were no detected in animals in the group treated with 0.825 mg/kg day of peptide P34. In this group only histological changes in the spleen with the presence of megakaryocytes were observed. From these results show the potential o peptide P34 to be used in future as biopreservative in foods.

A prospecção e síntese de novos derivados de 8-hidroxiquinolina está em ascensão devido às suas diversas atividades biológicas. Neste trabalho é relatada a síntese e avaliação da atividade antimicrobiana de novos derivados contendo uma sulfonamida substituída na posição 5 da 8-hidroxiquinolina ou um grupamento aminossubstituído na posição 7 da 5-cloro-8-hidroxiquinolina ou 5-cloro-8-metoxiquinolina. Os derivados 5-sulfonamidas foram preparados por clorossulfonação seguida da reação com a amina apropriada. Os derivados 7-aminossubstituído foram sintetizados através da metilação da hidroxila da posição 8, seguida da reação de cross-coupling catalisada por paládio e desmetilação. A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada através do método de microdiluição em caldo. Dentre os compostos sintetizados, 5a (da série 5-sulfonamidas) foi o mais potente, sendo ativo contra todas as espécies fúngicas testadas, além de apresentar importante atividade contra cepas de Staphylococcus aureus, e baixa toxicidade contra células VERO. Isso sugere que a introdução de um grupamento retirador de elétrons em para no substituinte arila da posição 5 é importante para a atividade antimicrobiana. Ainda, a nanoemulsão preparada contendo 5a manteve a atividade antifúngica da substância contra espécies de Candida spp. A série 7-aminossubstituído também apresentou resultados muito interessantes. Desta série, o composto 5i foi o mais potente. Isso sugere que grupamentos heterocíclicos hidrofílicos na posição 7 podem favorecer a atividade antifúngica. A presença da hidroxila livre na posição 8 parece ser essencial para a atividade antifúngica, pois os derivados protegidos por uma metila foram pouco ativos. Os derivados de 8-hidroxiquinolina 5a e 5i podem ser considerados para estudos posteriores na busca de novos agentes antimicrobianos. / The synthesis and screening of new 8-hydroxyquinoline derivatives is growing, due to their various biological activities. In this work, the synthesis and antimicrobial evaluation of new derivatives containing a substituted 5-sulfonamide in the 8-hydroxyquinoline or a substituted amino group at the 7-position of the 5-chloro-8-hydroxyquinoline or 5-chloro-8-methoxyquinoline is reported. The 5-sulfonamide derivatives were prepared by chlorosulfonation followed by the reaction with the appropriate amine. The 7-amino derivatives were synthesized by methylation of the 8-hydroxyquinoline, followed by palladium-catalyzed cross-coupling reaction and demethylation. The antimicrobial evaluation was tested by the broth microdilution method. Among all the prepared compounds, 5a (from the 5-sulfonamide series) was the most potent, being active against all the fungal species tested, while also showing important activity against Staphylococcus aureus strains, and low toxicity against VERO cells. This suggests that the introduction of an electron-withdrawing group at para-position of the N-aryl substituent is important for the activity. In addition, the prepared 5a nanoemulsion maintained the antifungal activity of the compound against Candida spp. The 7-amino series has also presented interesting results. In this series, 5i was the most potent compound. This suggests that the hydrophilic heterocyclic substituent at the 7-position was favorable to antifungal activity. The presence of the free hydroxyl at the 8-position is important for the antifungal activity, since the methyl-protected derivatives were poorly active. The 8-hydroxyquinoline derivatives 5a and 5i may be considered for further studies in the search for novel antimicrobial agents.

?rea de concentra??o: Qu?mica org?nica. / Submitted by Alexandre Soares (alexandredesoares@yahoo.com.br) on 2016-08-25T12:50:30Z No. of bitstreams: 1 eduardo_ferreira_coelho_junior.pdf: 3071757 bytes, checksum: e9deb6aa475b6a67aeab117cf2df4603 (MD5) / Approved for entry into archive by Rodrigo Martins Cruz (rodrigo.cruz@ufvjm.edu.br) on 2016-09-08T17:54:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 eduardo_ferreira_coelho_junior.pdf: 3071757 bytes, checksum: e9deb6aa475b6a67aeab117cf2df4603 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-08T17:54:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 eduardo_ferreira_coelho_junior.pdf: 3071757 bytes, checksum: e9deb6aa475b6a67aeab117cf2df4603 (MD5) Previous issue date: 2015 / O presente trabalho prop?e a glicosila??o do pept?deo antimicrobiano HSP-1, composto por 14 res?duos de amino?cidos e isolado originalmente da esp?cie Hyla punctata (PRATES et al., 2004) empregando-se a s?ntese de pept?deos em fase s?lida associada a rea??o de cicloadi??o catalisada por cobre (SHARPLESS et al., 2002). Para isto, foi realizada a s?ntese do pept?deo HSP-1 propargilado ([PAG1]HSP-1) atrav?s da metodologia de s?ntese de pept?deo em fase s?lida (SPFS) via estrat?gia Fmoc. Ap?s a confirma??o da obten??o do [PAG1]HSP-1 por espectrometria de massa (MALDI-ToF), foi realizada a glicosila??o com as inser??es dos derivados azido acetilado de glicose e N-acetilglicosamina na presen?a de sulfato de cobre penta hidratado (CuSO4.5H2O) e de ascorbato de s?dio como agente redutor para obten??o dos glicopept?deo-triaz?is [Glc-trz-G14]HSP-1 e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1. Os produtos das s?nteses foram purificados por cromatografia l?quida de alta efici?ncia de fase reversa (CLAE-FR) e tamb?m caracterizados por espectrometria de massa (MALDI-ToF), confirmando a forma??o regiosseletiva dos glicopept?deo-triaz?is sem produ??o de subprodutos da glicosila??o. Os estudos biol?gicos comparativos entre o pept?deo HSP-1 e de suas formas glicosiladas revelaram que as modifica??es qu?micas n?o alteraram significativamente a efic?cia do HSP-1 contra agentes bacterianos. Entretanto, os testes antif?ngicos demonstraram melhor atividade fungicida para os glicopept?deos quando comparado ao pept?deo HSP-1. Foram ainda realizados estudos conformacionais e de intera??o entre o pept?deo e os glicopept?deos com ves?culas fosfolip?dicas de car?ter zwitteri?nico (POPC) e ani?nico (POPC/POPG). Os estudos conformacionais empregando-se a t?cnica de Dicro?smo Circular (CD) revelaram menor teor de helicidade tanto em LUV?s de POPC quanto de POPC/POPG para os glicopept?deos em rela??o a HSP-1. Os estudos de intera??o foram realizados empregando-se as t?cnicas de espalhamento de luz din?mico (DLS), potencial zeta (?) e extravasamento de carboxifluoresce?na (CF). De uma maneira geral, verifica-se que a varia??o no di?metro hidrodin?mico (?Dh) para ves?culas ii zwitteri?nicas POPC e ani?nicas POPC/POPG ? maior para os glicopept?deos [Glc-trz-G14]HSP-1e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1 em rela??o ao HSP-1. Por outro lado, a varia??o do potencial zeta tanto em ves?culas zwitteri?nicas quanto em ves?culas predominantemente negativas causada por HSP-1 foi maior em compara??o ao efeito causado pelas formas glicosiladas. E por fim, os resultados de extravasamento de carboxifluoresce?na induzida por cada esp?cie (HSP-1, [Glc-trz-G14]HSP-1 e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1) mostrou que a capacidade l?tica dos glicopept?deos ? ligeiramente maior em ambos os meios biomim?ticos quando comparados com o pept?deo HSP-1. Assim sendo, este trabalho mostrou que a presen?a do anel triaz?lico pode ser respons?vel pela maior atividade antif?ngica dos glicopept?deos [Glc-trz-G14]HSP-1 e [GlcNAc-trz-G14]HSP-1 em rela??o ao pept?deo HSP-1. / Disserta??o (Mestrado) ? Programa de P?s-Gradua??o em Qu?mica, Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, 2015. / ABSTRACT This work proposes the glycosylation of the antimicrobial peptide HSP-1, containing 14 amino acid residues and originally isolated from Hyla punctata species (PRATES et al., 2004) by solid phase peptides synthesis associated with cycloaddition reaction copper catalyzed (SHARPLESS et al., 2002). The synthesis of propargylated HSP-1 ([PAG1] HSP-1) was carried out by solid phase peptide synthesis using Fmoc strategy and characterized by mass spectrometry (MALDI-ToF). In order to obtain the glycopeptide triazoles [Glc-trz-G14]HSP-1 and [GlcNAc-trz-G14]HSP-1, azide derivatives acetylated glucose and N-acetylglucosamine were used in the presence of copper sulfate pentahydrate (CuSO4. 5H2O) and sodium ascorbate as a reducing agent. The products were purified by reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and characterized by mass spectrometry (MALDI-ToF), confirming the regioselective reaction without glycosylation secondary products. Comparative studies among HSP-1 peptide and their glycosylated forms don?t show significant changes in antibacterial assays. However, the antifungal tests have shown a significant increase in fungicidal activity for glycopeptides when compared to HSP-1 peptide. Furthermore, it were carried out conformational and interaction studies among the peptide and glycopeptides with zwitterionic (POPC) and anionic (POPC/POPG) phospholipid vesicles. The circular dichroism (CD) spectra have revealed lower helicity to glycopeptides relative HSP-1 in both zwitterionic and anionic LUV's. Interaction studies were performed employing the dynamic light scattering (DLS), zeta potential and leakage carboxyfluorescein (CF) techniques. Summing up, the hydrodynamic diameter variation (?Dh) for zwitterionic and anionic vesicles is greater for glycopeptides [Glc-trz-G14]HSP-1 and [GlcNAc-trz-G14]HSP-1 when compared with HSP-1. On the other hand, the zeta potential variation in zwitterionic or negative vesicles caused by HSP-1 was higher compared to the effect caused by glycosylated forms. Finally, the results of carboxyfluorescein leakage induced by each species (HSP- iv 1 [Glc-trz-G14] HSP-1 and [GlcNAc-trz-G14] HSP-1) showed a higher lytic capacity of glycopeptides in both media in relation to the HSP-1 peptide. Thus, it showed that the presence of triazole rings may be responsible for the higher antifungal activity of derivatives [Glc-trz-G14] HSP-1 and [GlcNAc trz-G14] HSP-1.

This study is a preclinical research on the use of banana (Musa paradisiacal L.), whose main objective was to evaluate the antimicrobial potential, antiedematogenic, healing and cell viability of the extracts of the leaves and pseudostem of Musa paradisiacal L. Extracts were listed according to the plant part used, Musa 1 (ethanol extract of the leaf), Musa 2 (aqueous extract of the leaf), Musa 3 (ethanol extract pseudostem) and Musa 4 (aqueous extract pseudostem). In vitro tests were conducted cell viability by MTT method - [bromide 3 - (4,5 - dimethylthiazol - 2 - yl) tetrazolium] and for antimicrobial disk diffusion and agar drilling. For in vivo tests were used 36 Wistar rats in the experiment healing and 36 mice in Swis ear edema induced by capsaicin, provided by the Central Animal Laboratory Creation of Federal University of Alagoas, and handled in accordance with standards established by the Commission on Ethics Use of Laboratory Animals. It was found in testing antibiotics on the bacteria Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and the yeast Candida albicans, the ethanol and aqueous extracts of Musa paradisiacal L. do not inhibit microbial growth. The test was conducted cell viability at concentrations of 100, 200, 1000 and 2000 μg/mL, and showed that extracts at a concentration of 200 μg/mL did not induce cell toxicity in J774 macrophage lineage and in other concentrations there is a variation of cytotoxicity in extracts. The extracts were also tested in vivo experiments to evaluate the potential healing and antiedematogenic leaves and pseudostem of banana. It was found that no significant inhibition of ear edema formation induced by capsaicin, indicating that the extract has anti-inflammatory site. As for the healing of wounds clean, it was found that the extracts have healing action inducing epithelialization of the wound better than the positive control. / Este estudo é uma pesquisa pré-clínica sobre o uso da bananeira (Musa paradisíaca L.), cujo objetivo principal foi avaliar o potencial antimicrobiano, antiedematogênico, cicatrizante e viabilidade celular dos extratos das folhas e do pseudocaule da bananeira Musa paradisíaca L. Os extratos foram enumerados de acordo com a parte da planta utilizada, Musa 1 (extrato etanólico da folha), Musa 2 (extrato aquoso da folha), Musa 3 (extrato etanólico do pseudocaule) e Musa 4 (extrato aquoso do pseudocaule). Os testes in vitro realizados foram de viabilidade celular pelo método MTT - [brometo de 3 – (4,5 – dimetiltiazol – 2 – il) tetrazólio] e antimicrobiano por disco-difusão e perfuração em ágar. Para os testes in vivo foram utilizados 36 ratos Wistar no experimento de cicatrização e 36 camundongos Swis no edema de orelha induzido por capsaicina, disponibilizados pelo Biotério Central de Criação da Universidade Federal de Alagoas, e manipulados de acordo com normas estabelecidas pela Comissão de Ética para Utilização de Animais de Laboratório. Constatou-se nos testes antimicrobianos frente às bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, e ao fungo Candida albicans, que os extratos brutos etanólicos e aquosos da Musa paradisíaca L. não inibem o crescimento microbiano. O teste de viabilidade celular foi realizado nas concentrações de 100, 200, 1000 e 2000 μg/mL e mostrou que os extratos na concentração de 200 μg/mL não induzem toxicidade celular em macrófagos da linhagem J774 e nas demais concentrações há variação de citotoxicidade nos extratos. Os extratos também foram testados em experimentos in vivo a fim de avaliar o potencial cicatrizante e antiedematogênico das folhas e pseudocaule da bananeira. Verificou-se que não há inibição significativa na formação de edema de orelha induzido por capsaicina, indicando que os extratos não tem ação anti-inflamatória local. Quanto à cicatrização de feridas limpas, verificou-se que os extratos tem ação cicatrizante induzindo a epitelização da ferida melhor que o controle positivo.

O presente estudo teve o objetivo de avaliar o perfil de sensibilidade in vitro de 171 isolados de Staphylococcus hyicus a nove antimicrobianos utilizados na suinocultura. A coleta das amostras foi realizada através de suabes de pele de leitões das fases de maternidade e creche provenientes de casos de epidermite exsudativa. As amostras foram submetidas ao isolamento e identificação e compreenderam dois grupos, classificadas de acordo com o período em que foram coletadas. O primeiro grupo foi formado por amostras históricas (80 isolados) provenientes de estudos anteriores entre 1975 a 1984 no Rio Grande do Sul, e mantidos liofilizados no laboratório de sanidade do Setor de Suínos (FAVET-UFRGS), e o segundo grupo (91 isolados) coletados no ano de 2012 nos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná e Minas Gerais. A realização do teste de susceptibilidade foi feita utilizando a técnica de diluição em ágar conforme protocolo M31-A3 do CLSI. Através de valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM), foi obtido o perfil quantitativo de resistência em relação a nove antimicrobianos utilizados na suinocultura. A análise estatística possibilitou a avaliação de mudanças entre os dois grupos de amostras isoladas em diferentes épocas. Os resultados obtidos nesse estudo revelaram que para todas as cepas obtidas os beta-lactâmicos (ceftiofur e amoxicilina) foram os antimicrobianos mais ativos, com CIM para 90% dos isolados históricos (CIM90) de 0.5 μg/mL e 2.0 μg/mL para isolados recentes. A lincomicina, sulfametoxazol e tilmicosina foram os antimicrobianos menos ativos, com CIM90 variando de 128 a 256 μg/mL. O aumento na resistência entre o grupo de amostras históricas e recentes foi observado em seis dos nove antimicrobianos testados (amoxicilina, enrofloxacina, florfenicol, lincomicina, tilmicosina e tiamulina), em particular para a enrofloxacina e tiamulina. No caso do sulfametoxazole e tetraciclina, não foram observadas diferenças significativas na resistência, entretanto altos valores de CIM foram observados nos dois grupos avaliados (p<0,05). / This study was performed to evaluate the "in vitro" susceptibility profile of 171 Staphylococcus hyicus isolates from cases of exudative epidermitis to nine antibiotics used in pig production. Sample consisted of skin swabs from weanling and nursery piglets from farms suspected of exudative epidermitis. Samples were processed for bacterial isolation and identification and divided in two groups, according to the time of collection. The first group comprised historical samples (80 isolates) from previous studies (1975-1984) conducted in the state of Rio Grande do Sul, and stocked lyophilized in Swine Health Lab (FAVET-UFRGS), and the other group (91 isolates) formed by isolates collected in 2012 in the states of Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná and Minas Gerais, Brazil. The test was carried out using agar dilution protocol, according to M31-A3 CLSI. Through Minimal Inhibitory Concentrations (MIC) data, analysis was performed to get a quantitative profile of resistance to antimicrobials. Statistical analysis was performed to evaluate changes in resistance between the groups studied. Results showed that beta-lactam (ceftiofur and amoxicillin) were the most active antimicrobials for all strains tested, with the lowest MIC for inhibition of 90% of isolates (MIC90) of 0.5 μg/ml for historical isolates and of 2.0 μg/ml for recent isolates. Lincomycin, sulfamethoxazole and tilmicosin were the less active antimicrobials, with MIC90 varying from 128 to 256 μg/ml. Significant increase in resistance between historical and recent strains was observed for six out of nine antimicrobials tested (amoxicillin, enrofloxacin, florfenicol, lincomycin, tilmicosin and tiamulin), in particular for enrofloxacin e tiamulin. For sulfamethoxazole and tetracycline there was no significant differences in resistance between strains collected in different periods, however high MIC values were observed for these drugs.