Les mutacions germinals en el gen APC són les responsables de la majoria de casos de poliposi adenomatosa familiar. APC participa en diferents processos cel·lulars que inclouen la regulació del cicle cel·lular, l'apoptosi, l'adhesió cel·lular, la migració cel·lular, la transducció de senyals, l'acoblament de microtúbuls i la segregació dels cromosomes. Encara que tots aquests processos estan potencialment lligats amb el càncer, sembla que la funció supressora tumoral del gen resideix en la seva capacitat per regular de manera acurada els nivells intracel·lulars de la β-catenina, component central de la via de Wnt. Aquesta via és important en el desenvolupament embrionari per determinar llinatges cel·lulars específics i en l'homeòstasi cel·lular de determinats teixits com la mucosa intestinal. A part del seu paper clau en la via de Wnt, APC participa en la inestabilitat cromosòmica del càncer colorectal, encara que els mecanismes concrets a través dels quals actua són encara desconeguts en bona part. Els resultats descrits en els tres capítols d'aquesta tesi donen lloc al concepte global que és en les lesions benignes del còlon, els adenomes, ja siguin de pacients de FAP com de càncer colorectal esporàdic, on s'acumulen gran nombre d'alteracions genètiques que afecten a mecanismes molt diversos del funcionament cel·lular, essent especialment importants aquelles alteracions que afecten a la via de Wnt. Totes les alteracions detectades permeten la progressió tumoral ja que afecten a la proliferació, mitosi i moltes altres funcions importants per la cèl·lula. El coneixement de les alteracions moleculars que afecten als adenomes és important per proporcionar més evidències dels mecanismes moleculars i cel·lulars implicats en els primers estadis de la progressió tumoral i donar lloc a noves estratègies de diagnòstic precoç i teràpies preventives, tan importants en la lluita contra el càncer. / Classical Familial Adenomatous Polyposis (FAP) syndrome is caused by APC germline mutations. APC plays important roles in different cellular processes such as cell cycle regulation, apoptosis, cellular adhesion, cellular migration, signal transduction, microtubule binding and chromosome segregation. Although all these processes are potentially related to cancer, it seems that the main tumoral suppressor activity is mediated by its capacity to accurately regulate the β-catenin intracellular levels, which is a central member of the Wnt signalling pathway. This pathway is important in the embryonic development and in cellular homeostasis in certain tissues such as intestinal mucosa. In colorectal cancer, APC is not only believed to be playing a key role in Wnt signalling, but also it is important in chromosomal instability (CIN), although the mechanisms in which APC is participating are still largely unknown.The results presented in this thesis and divided in 3 chapters give us the general idea that in the benign lesions of the colon, called adenomas, in FAP and in sporadic colorectal cancer patients, is where a great number of genetic alterations are accumulated affecting different functional mechanisms in the cell. Those aberrations that alter the Wnt signalling pathway are especially important in the process of tumorigenesis. All the reported alterations enable the tumoral progression because they target proliferation, mitosis and other important functions of the cell. A better understanding of the molecular defects in adenomas is crucial to discover all the molecular and cellular mechanisms operating in the early stages of colorectal cancer and give clues for early diagnosis and prevention.

Les mutacions germinals d'elevada penetrància del gen APC que originen una proteïna truncada són les responsables de la majoria de casos de poliposi, mentre que les variants missense, que canvien un aminoàcid de la proteïna, es detecten en una minoria dels casos. S'han identificat diverses variants missense en el gen APC, però el seu potencial patogènic és encara motiu de controvèrsia, el què limita la utilitat de la seva detecció en el consell genètic. L'estudi de la presència de les variants en la població control i en les diferents poblacions de càncer colorectal (CCR) esporàdic i hereditari, juntament amb la realització d'anàlisis funcionals, podrien ajudar a conèixer l'impacte de les variants del gen APC en el desenvolupament del CCR. El nostre objectiu és determinar el significat funcional de les variants identificades en el gen APC en pacients afectes de poliposi adenomatosa familiar en relació al risc de desenvolupar CCR tant esporàdic com hereditari.L'anàlisi molecular de la regió codificant del gen APC realitzat en 138 famílies amb poliposi adenomatosa familiar clàssica (n= 98) i poliposi adenomatosa familiar atenuada (n= 40) ha permès la identificació de deu variants missense del gen APC: G101E, K957N, N1026S, L1129S, I1307K, E1317Q, D1822V, A2274V, G2502S i P2681L. En el nostre estudi s'han caracteritzat amb diferent profunditat set d'aquestes deu variants: G101E, N1026S, L1129S, D1822V, A2274V, G2502S i P2681L. La variant APC G101E, identificada en una família de poliposi clàssica, no s'associa a la malaltia ni sembla tenir cap funció modificadora del fenotip de poliposi. L'efecte biològic de les variants APC A2274V i APC P2681L, identificades en dues famílies de poliposi, és encara desconegut. La variant APC G2502S és un polimorfisme que no sembla tenir rellevància clínica. La variant APC L1129S, identificada en dues famílies de poliposi, no altera la interacció de la proteïna APC 4x15 amb la beta-catenina. La variant APC D1822V és un polimorfisme que incrementa el risc de desenvolupar CCR en pacients amb història prèvia d'adenomes i no s'associa amb la història familiar de CCR. La variant APC N1026S, que està present de forma exclusiva en una família de poliposi adenomatosa familiar atenuada, disminueix la unió d'APC amb beta-catenina i activa moderadament la transcripció mitjançada pel complex beta-catenina/Tcf-4. Aquests resultats indiquen que la variant APC N1026S és patogènica i és la mutació responsable del desenvolupament de la poliposi atenuada a la família on es va identificar.La caracterització funcional de les variants del gen APC és de gran importància per conèixer la seva contribució en el desenvolupament de la poliposi i facilitar l'assessorament genètic. / Truncating germline mutations in the APC gene are responsible for the majority of Familial Adenomatous Polyposis (FAP) cases, while in a minority of cases missense mutations, leading to single amino acid changes, are detected. Germline missense variants in the APC gene have been reported although their contribution to FAP is controversial, limiting their use in genetic counseling. The aim of this thesis is to determine the functional relevance of the variants identified in the APC gene in FAP patients in order to establish its pathogenicity.The molecular analysis of the APC gene was performed in 138 classical (n= 98) and attenuated (n= 40) FAP families and allowed the identification of ten missense variants. In this thesis, seven out of these ten APC variants have been characterised: G101E, N1026S, L1129S, D1822V, A2274V, G2502S and P2681L. The APC G101E variant, identified in a classical FAP family, is not associated with the disease. The biological effect of APC A2274V and APC P2681L variants, identified in two FAP families, remains unknown. The APC G2502S variant is a polymorphism without clinical relevance. The APC L1129S variant, identified in two FAP families, does not modify the interaction of the APC 4x15 protein with beta-catenin. The APC D1822V variant is a polymorphism associated with an increased risk of adenoma transformation and does not associate with family history of colorectal cancer. The APC N1026S variant, identified for the first time in an attenuated FAP family, diminishes beta-catenin binding to APC and moderately activates beta-catenin/Tcf-4-mediated transcription. These findings strongly support a pathogenic role of the APC N1026S variant in the AFAP phenotype.In summary, functional characterization of APC variants is crucial to elucidate their contribution to FAP and improve genetic counseling.

DE LA TESI:La metàstasi és un procés histopatològic especialment complex per al seu estudi. Aquesta complexitat es deriva tant de la implicación de tots els nivells d'organització de l'organisme afectat (molecular, cel.lular, tisular, orgànic i sistèmic) com de l'alta diversitat inherent a cadascun d'ells. Una eina essencial de treball és la disposició de models cel.lulars que permetin tant l'estudi específic i puntual d'alguns aspectes del desenvolupament de la patologia com la seva integración en el conjunt del procés. A partir d'aquests principis estratègics hem disposat, pel desenvolupament d'aquest estudi, de dues línies cel.lulars d'adenocarcinoma de pulmó humà derivades d'una mateixa població parental (Inufusa et al., 1991). Aquestes línies, caracteritzades per una alta (HAL-8) i nul.la (HAL-24) capacitat metastàsica, proporcionen un model molt sòlid per a la validació dels resultats diferencials. És així que ens varem plantejar com a objectiu general la caracterització d'expressions diferencials que, de manera constitutiva o regulada, presentessin ambdós tipus cel.lulars. Donat que les cèl.lules HAL-8 sobreexposen l'antigen sialil-Lewis(x) dimèric en relació a les cèl.lules HAL-24, ens varem proposar com a primer objectiu caracteritzar l'expressió d'altres oligossacàrids fucosilats més relacionats amb la metàstasi i determinar el seu paper a l'adhesió d'aquestes cèl.lules tumorals a l'endoteli. Donades les diferències d'expressió que varem observar en algunes d'aquestes mol.lècules, ens varem plantejar l'estudi de l'expressió dels gens de les Fucosiltransferases del tipus alfa(1,3), enzims responsables de la seva síntesi. (Capítol I: "Enhaced expresión of alpha(1-3)-Fucosyltransferase genes correlates with E-selectin-mediated adhesion and metastasic potencial of human lung adenocarcinoma cells"). Un cop demostrat el paper clau del sialil-Lewis(x) a l'adhesió de les cel.lules HAL-8 així com la relació entre l'expressió dels gens de les Fucosiltransferases del tipus alfa(1,3) i la capacitat metastàsica d'aquestes cèl.lules, el següent objectiu plantejat va ser determinat si la sobreexpressió de determinades Fucosiltransferases alfa(1,2) modifica les propietats adhesives i el potencial colonitzador de pulmó de les cèl.lules no metastàtiques HAL-24 (Capítol II: "Overexpression of alpha(1,3)-fucosyltransferase VII is sufficient for the acquisition of lung colonization phenotype in human lung adenocarcinoma HAL-24Luc cells)".Caracteritzat el model d'adhesió a l'endoteli de les cèl.lules HAL-8 i HAL-24, i demostrat el paper de l'alfa(1,3)-Fucosiltransferasa VII en aquesta etapa de la metàstcasi, ens varem proposar estudiar la implicación de les metal.loproteases en la migración transendotelial de les cèl.lules metastàsiques d'adenocarcinoma de pulmó així com la regulació de la seva expressió tant per integrines com per la matriu extracel.lular (Capítol III: "Expressió de les metal.loprotesases de matriu i la regulació de la seva activitat a cèl.lules d'adenocarcinoma de pulmó humà)".Donat el caracter multiènic del desenvolupament de les metàstasis i l'interès en trobar gens responsables d'aquest procés, com a objectiu final ens varem plantejar l'anàlisi de l'expressió gènica diferencial de les cèl.lules HAL-8 i HAL-24 (Capítol IV: "Identification of semaphorin E gene expresión in metastasic human lung adenocarcinoma cells by mRNA differential display").

Tot i que la hipometilació global i regional del DNA va ser la primera alteració epigenètica detectada en tumors, les dificultats en el seu estudi, així com la manca de metodologies específiques que en permetin un anàlisi detallat, han fet que desconeguem en gran mesura els efectes que aquest fenomen té per a la cèl·lula tumoral. En aquesta tesi ens vàrem proposar realitzar estudis globals i específics que permetessin establir possibles associacions entre la hipometilació i la inestabilitat genètica en tumors primaris humans. En primer lloc es va dur a terme la caracterització dels patrons de metilació globals en una sèrie de tumors colorectals. Aquest anàlisi ens va permetre observar una correlació positiva entre el grau de desmetilació dels tumors primaris i el nombre d'alteracions cromosòmiques que aquests acumulen. Per a continuar aprofundint en l'estudi de la hipometilació en tumors, i donada la manca de metodologies específiques per a realitzar aquesta mena d'estudis, ens vàrem proposar desenvolupar una nova metodologia d'anàlisi de la metilació, centrada en l'anàlisi dels elements repetitius dispersos Alu, els quals contenen una fracció important de la metilació del DNA en humans. Així es com va sorgir la nova metodologia Amplification of UnMethylated Alu (AUMA), recollida en el segon treball. L'aplicació d'AUMA a una sèrie de tumors colorectals ens ha permès identificar elements repetitius Alu desmetilats al llarg de tot el genoma i també ens ha permès identificar elements Alu amb alteracions de la metilació en tumors. Un anàlisi bioinformàtic paral·lel ens ha permès complementar els resultats obtinguts experimentalment. En aquest treball hem desenvolupat també una nova metodologia de quantificació d'elements Alu desmetilats, la qual hem anomenat Quantification of UnMethylated Alu (QUMA) i de la qual no hi ha cap precedent en la literatura. De l'estudi d'una de les alteracions de la metilació detectades en patrons AUMA n'ha sorgit el tercer treball d'aquesta tesi. En aquest cas hem fixat la nostra atenció en un element repetitiu MIR desmetilat en teixit normal, el qual s'hipermetila en tumors amb una elevada freqüència. L'estudi de l'estat de metilació de les illes CpG dels gens adjacents a aquest element MIR ens ha conduït a la identificació de 8 noves illes CpG hipermetilades en tumors i línies cel·lulars de càncer colorectal. L'anàlisi de les modificacions d'histones associades al silenciament d'aquests gens ens ha permès identificar patrons de cromatina molt semblants als descoberts recentment en cèl·lules mare embrionàries, connectant així la biologia de les cèl·lules mare amb el desenvolupament del càncer. / Although hypomethylation was the first tumor-associated DNA methylation alteration in tumors to be discovered, its role in tumorigenesis has remained basically unexplored, mainly due to the lack of specific methodologies of study. In the first work, we performed a global analysis of DNA methylation and genetic alterations in a series of colorectal tumors. Results indicate that a positive correlation exists between the degree of DNA hypomethylation and the number of genetic alterations that a tumor cell accumulates. In order to gain insight into the role that DNA hypomethylation might play in tumor development, we proposed to develop new methodologies that would allow performing both global and specific analyses of DNA hypomethylation, constituting the second work in this thesis. The new methodology mainly targets Alu repeats, which have been previously found to be heavily methylated in most somatic tissues, and has been therefore named Amplification of unMethylated Alu (AUMA). AUMA application to a series of primary colorectal tumors allowed the genome-wide identification of multiple unmethylated Alu elements in normal tissues, as well as Alu elements with altered methylation patterns in tumors. We also aimed to develop a quantification method, which was named Quantification of UnMethylated Alu (QUMA). Both AUMA and QUMA experimental results were complemented using a bioinformatic approach, which indicated that there is a stronger pressure to methylate younger Alu elements, among which there are elements able to retrotranspose. In a third work, we focused on the specific analysis of an AUMA target. A MIR element unmethylated in normal colorectal mucosa was found to undergo extensive hypermethylation in a large proportion of tumors. DNA methylation analysis of promoter CpG methylation of genes around the MIR element allowed the identification of 8 clustered genes whose CpG islands become hypermethylated in colorectal tumors and cell lines. Histone modification profiling across the promoters of the DNA methylated genes identified chromatin profiles that closely resemble those found in embryonic stem cells, therefore linking stem cells biology with cancer development.

El càncer colorectal és una de les neoplàsies més prevalents als països occidentals. Des d'un punt de vista epidemiològic es pot classificar el CCR en 5 grups: esporàdic, familiar, hereditari no associat a poliposi (CCHNP), associat a poliposi adenomatosa familiar (PAF) i associat a la malaltia inflamatòria intestinal. Actualment no es coneix la incidència d´aquests 5 grups de CCR a Espanya ja que la majoria d'estudis han estat realitzats als Estats Units o en països del nord d'Europa. El CCHNP és el tipus més freqüent de CCR hereditari, oscil·lant entre l'1 i el 5% dels total de casos de CCR i les mutacions germinals en els gens reparadors dels errors de replicació de l'ADN, principalment MSH2 i MLH1, constitueixen la seva base genètica. La instauració dels criteris d'Amsterdam va ser cabdals per a definir el CCHNP i identificar la seva base molecular. Posteriorment aquests criteris varen ser modificats per considerar-se massa restrictius (criteris d´Amsterdam II). Després, l'any 1996, el National Cancer Institute va proposar els criteris de Bethesda, els quals tenien com objectiu identificar aquells pacients amb una major probabilitat de CCHNP i que haurien de ser avaluats mitjançant estudi d'inestabilitat de microsatèl·lits i/o anàlisi genètic. Aquests criteris han estat recentment revisats, però fins a l'actualitat no s'ha avaluat el seu rendiment. En relació a la base molecular de la síndrome de Lynch o CCHNP se sap que més del 90% de casos presenta inestabilitat de microsatèl·lits, pel que determinar si un tumor presenta aquesta alteració pot ser una estratègia adequada per a seleccionar els individus tributaris d'ulterior estudi genètic. Per altra banda, la majoria de mutacions en els gens MSH2 i MLH1 comporten l'anul·lació de l'expressió de les proteïnes codificades per aquests. D´aquesta manera, l´absència d'expressió de les proteïnes reparadores de l'ADN determinada mitjançant tècniques immunohistoquímiques podria traduir la presència d'inestabilitat de microsatèl·lits. Fins el moment actual no hi ha una estratègia definida per a identificar aquests individus ni indicar quins serien tributaris d´anàlisi genètic.Un altre aspecte a tenir present és que els pacients amb antecedent de neoplàsia colorectal tenen un major risc de presentar una neoplàsia sincrònica o metacrònica, situació coneguda com a multicentricitat tumoral. En el primer estudi es demostra que un 2,5% dels casos de CCR diagnosticats de novo a Espanya acompleixen els criteris clínics de CCHNP (criteris d'Àmsterdam II), una xifra semblant a la d'estudis realitzats a altres països occidentals. Per altra banda, , prop d'un 20% del total de CCR acompleixen els criteris de Bethesda i, conseqüentment, haurien de ser sotmesos a un estudi molecular.En el segon estudi remarca la importància d'identificar pacients amb CCR i tendència a desenvolupar una segona neoplàsia colorectal. Els resultats mostren que l'antecedent personal d'adenoma colorectal i les característiques del tumor primari (la localització proximal, l´estadi TNM II i la presència de component mucós) es correlacionen amb la mutlicentricitat tumoral, en quant a l'existència d'adenomes o carcinomes colorectals sincrònics en els pacients amb CCR.El tercer estudi posa de manifest que la freqüència de CCHNP associat a MSH2 / MLH1 a Espanya és del 0,9%. A més els resultats de l´estudi suggereixen que l´estudi de la IMS i la IHQ de proteïnes reparadores són estratègies equivalents en termes d'eficàcia i cost-eficàcia, i que quan qualsevol d'aquests mètodes es realitza en pacients prèviament seleccionats d'acord als criteris revisats de Bethesda el seu rendiment encara és més alt. per a la identificació dels pacients amb CCHNP associat a MSH2/MLH1. Considerant aquesta equivalència, i donada la major facilitat per a realitzar IHQ que estudis d´IMS en la pràctica clínica diaria, l'aplicació dels criteris de Bethesda seguit de la IHQ per a MSH2 / MLH1 pot ésser una alternativa vàlida per al cribratge del CCHNP..

El treball presentat en aquesta tesi es centra en l'anàlisi de la mortalitat per càncer de mama a Europa. Concretament, hem realitzat una anàlisi estadística i epidemiològica de la tendència de la mortalitat, per a un conjunt de 32 països europeus, en els darrers 10 anys disponibles (fins a l'any 2005) i també hem proporcionat les projeccions per a les taxes de mortalitat per a l'any 2015. Els resultats obtinguts mostren que, en general, la tendència de la mortalitat a Europa és decreixent, situant-se al voltant d'un decrement del 2% anual. Tanmateix, en la majoria de països de l'Europa del Centre i de l'Est, només s'observa aquesta disminució per als grups de dones més joves, podent-se constatar tendències fins i tot creixents per a les dones d'edat més avançada. Hem estimat que a Europa, l'any 2015 hi haurà 127.983 defuncions per càncer de mama en dones majors de 35 anys, el que representa un augment del 4,68% respecte les dades absolutes de l'any 2005. D'aquestes defuncions, 10.288 (8,04%) correspondran a dones entre 35 i 49 anys, 54.226 (42,37%) a dones entre 50 i 69 anys i,finalment, 63.469 (49,59%) a dones majors de 70 anys. El major nombre de defuncions s'observarà en països de l'Europa de l'Est i del Centre (38,69%), seguit per dones de l'Europa de l'Oest (30,19%) i, en una magnitud menor, dones del Sud i del Nord d'Europa (17,98% i 13,14% respectivament). Pel que fa a l'augment del nombre de defuncions de l'any 2015 respecte l'any 2005 en un 4,68%, aquest pot descomposar-se en tres parts: un augment del 5,28% degut a un creixement de la població europea, un augment del 6,20% degut a un envelliment d'aquesta població i, finalment, un decrement del 6,8% atribuïble a una disminució del risc de morir per aquesta malaltia. D'aquesta forma hem pogut constatar que el risc de morir per càncer de mama disminuirà de forma important, essent aquest decrement del 14% al Nord d'Europa, del 10,61% i 7,37% a l'Europa de l'Oest i del Sud respectivament, i per a l'Europa del Centre i Est es constata un augment del risc del 0,49%.Pel que fa a la metodologia estadística, en aquesta tesi aportem un marc de modelització que permet analitzar eficientment dades de mortalitat o d'incidència durant un període de temps i, mitjançant models edat-període, obtindre projeccions en el futur. L'estratègia de modelització ha donat lloc a uns resultats raonablement acceptables per a analitzar la mortalitat per càncer de mama a Europa. Hem desenvolupat un conjunt de funcions en el programa "R" que són lliurement accessibles i que permeten reproduir els resultats o bé aplicar la metodologia en altres àmbits i dades. També s'ha implementat una eina web que permet analitzar quina part de les diferències observades en la mortalitat o incidència d'una malaltia entre dos moments són degudes a factors demogràfics respecte el risc de desenvolupar o morir per la malaltia. / In this work, we present a statistical and epidemiological analysis of the breast cancer mortality in Europe. More particularly we have analyzed its recent trend up to 2005, for 32 European countries, and we provide projections for breast cancer mortality for the year 2015. Our results indicate that the trend is decreasing, with a diminution around 2% each year. However in most countries for Eastern and Center Europe this decrease affects only to younger women, while for older ones we detect an increasing trend. We have estimated for the year 2015 127,983 deaths from breast cancer in Europe, which represents a global increase of 4.68% respect to the number observed in 2005. Furthermore, this increase can be decomposed in three components: an increase of 5.28% due to the fact that European population will increase; and increase of 6.20% due to the aging of the European population and, finally, a decrement of 6.8% which can be attributed to a decrease of the risk of dying from breast cancer. Therefore, we have stated that, in fact, the risk associated to die from breast cancer will decrease in the years to come, more importantly in the North (14%), followed by the West and South of Europe (10.61% and 7.37% respectively). However in Eastern and Central Europe it is expected an increase of this risk (0.49%).Regarding statistical methodology, we provide a modeling frame which is efficient for analyzing incidende or mortality data for a given disease, by means of using age-period models and providing also projections for the future. We have developed a set of functions in R code, which are freely available.

Breast cancer is the main cause of cancer death in women. Improved treatments, prevention programs and earlier detection are reducing the rate of death; however, there is still a high percentage of mortality by this cancer. Identification of novel targets to predict response to specific treatments is a key goal for personalizing breast cancer therapy and to improve survival. Few years ago, PARP inhibitors appeared as a promising therapy, particularly in BRCA-mutated cancers. However, there was a clear need to conduct further preclinical and translational work to improve the rational development of PARP inhibition in breast cancer. In this work we described PARP1 expression in breast tumour samples and characterized the effects of its inhibition in preclinical models. We found that nuclear PARP1 protein overexpression was associated with malignant transformation and poor prognosis in breast cancer. PARP1 overexpression was more common in triple negative subtype, but was also detectable in small subsets of estrogen receptor positive and HER2 positive breast cancers. In preclinical models, PARP1 played distinct roles in different molecular subtypes of breast cancer. Moreover, we described that olaparib (novel PARP inhibitor) had antitumour effects in different breast cancer subtypes, and its combination with trastuzumab (anti-HER2 antibody) enhanced the antitumour effects of this therapy. / El càncer de mama és la principal causa de mort per càncer en dones. La millora dels tractaments i la detecció precoç estan reduint la taxa de mort, però segueix sent elevada. Identificar noves dianes per predir la resposta a tractaments és clau per millorar les teràpies contra aquest càncer i la supervivència. Els inhibidors de PARP van aparèixer com una teràpia prometedora, particularment en càncers BRCA-mutants, però, cal dur a terme més estudis preclínics i translacionals per fomentar un desenvolupament racional d’aquesta teràpia en càncer de mama. Aquest treball descriu l’expressió de PARP1 en mostres de tumors mamaris i caracteritza els efectes de la seva inhibició a models preclínics. Vam observar que la sobreexpressió nuclear de la proteïna PARP1 fou associada amb: la transformació maligna; mal pronòstic en càncer de mama; i fou més freqüent al subtipus triple-negatiu, però també es va detectar en un subgrup de càncers de mama receptors d’estrogen positius i HER2 positius. En models preclínics, PARP1 va exercir rols diferents als diferents subtipus de càncer de mama. Per altra banda, vam descriure que olaparib (inhibidor de PARP) té efectes antitumorals en els diversos subtipus, i combinat amb trastuzumab (anticòs anti-HER2) potencia els efectes antitumorals d’aquesta teràpia.

Per aprofundir en les causes genètiques de l’anèmia de Fanconi (FA) i la susceptibilitat al càncer de mama (BrCa), així com en els mecanismes moleculars de reparació del dany al DNA per part de la via de senyalització FA/BrCa, s’ha dut a terme un cribatge massiu d’interaccions proteïna-proteïna per 34 components involucrats en aquesta via. Aquest estudi ha identificat 25 noves interaccions d’alta fiabilitat, la majoria de les quals estan involucrades en la regulació del cicle cel•lular o la resposta al dany al DNA. Algunes d’aquestes interaccions han estat validades mitjançant estudis de co-immunoprecipitació endògena i sobreexpressió en cèl•lules de mamífer. En aquesta tesi doctoral hem caracteritzat la nova interacció entre FANCN/PALB2 ¡ MORF4L1/MRG15. S’han realitzat estudis bioquímics i funcionals amb la finalitat de caracteritzar-la tan molecularment com funcionalment en cèl•lules d’humans, de ratolí i Caenorhabditis elegans. Els resultats obtinguts ens permeten dibuixar un possible mòdul funcional entre BRCA2, PALB2, RAD51 i RPA1 que suggereixen una implicació de MRG15 en la reparació dels trencaments de doble cadena (DSB) en el DNA. Els nostres resultats no mostren alteracions patogèniques de MORF4L1/MRG15 en els pacients FA amb mutació desconeguda. Pel que fa a l’estudi de dos variants genètiques comunes en el locus MORF4L1, tampoc s’observa una associació significativa amb el risc a càncer de mama entre els portadors de mutació BRCA1 i BRCA2; tot i que s’observa una tendència entre els portadors de mutacions BRCA2. És per aquest motiu, que serà necessari un anàlisi amb sèries de portadors més grans. / Towards a full model of the molecular network altered in Fanconi anemia and breast cancer Proteins encoded by Fanconi anemia (FA) and/or breast cancer (BrCa) susceptibility genes cooperate in a common DNA damage repair signaling pathway. There are fiveteen FA complementation groups (FANCs) that encode for proteins of this pathway and three of these genes overlap between FA and BrCa. With the objective to gain deeper insight into this pathway and its influence on cancer risk, we search for novel components through protein physical interaction screens. Protein physical interactions were screened using the yeast two-hybrid system (Y2H). Novel interactions were validated through co-immunoprecipitation and co-affinity purification assays. A previously identified co-purifying protein with PALB2 was indentified MRG15 (MORF4L4 gene). Biochemical and functional assays were performed to characterize the molecular interaction in human, mouse and Caenorhabditis elegans. Results obtanined draw molecular and functional relationships with BRCA2, RAD51 and RPA that suggest a role for MRG15 in the repair of DNA double-strand breaks. Mrg15 deficient murine embryonic fibroblast showed intermediate sensitivity to γ-radiation relative to controls and impaired Rad51 foci formation. No alterations or mutations were identified for MORF4L1 in unclassified FA patients and BrCa familial cases. However, a potential modifier effect for a common genetic variation in MORF4L1 can not be ruled out among BRCA2 mutation carriers.

El càncer de pròstata és un tipus de càncer de creixement lent, estructura heterogènia, etiologia desconeguda diagnosticat generalment en homes d'edat avançada (>50 anys). Excloent el càncer de pell no melanocític, és el tumor més freqüent (19,6%) en els homes a Catalunya. De manera natural evoluciona cap a la independència hormonal, tot i que es creu que aquesta transició és accelerada pel tractament amb antiandrògens. La interacció entre estroma i epiteli és d'una gran importància per a l'evolució del tumor.El concepte de cèl·lula mare cancerosa fa referència a una suposada població cel·lular tumoral, amb característiques anàlogues a les de les cèl·lules mare normals, responsable de la generació i manteniment tumorals. La side population (SP), és un conjunt de cèl·lules discriminat per citometria de flux amb capacitat per bombejar certes drogues, xenobiòtics, hormones i altres compostos, que s'ha vist que està enriquida en cèl·lules mare en alguns sistemes.En aquest treball es va proposar de trobar cèl·lules mare canceroses bàsicament en dos models de càncer de pròstata diferents: les línies cel·lulars LNCaP i PC-3 i el model animal PAC-120 (xenotrasplantament d'adenocarcinoma hormonodependent que recapitula de manera fiable el càncer de pròstata). Per tal d'assolir el primer objectiu d'identificar-les, es va proposar l'assaig de side population, per tal i com s'ha demostrat la seva validesa per aïllar poblacions enriquides en cèl·lules mare i és un assaig que dóna informació funcional sobre les cèl·lules i en manté la seva viabilitat. A més, aquesta tècnica permetia també assolir el segon objectiu i parcialment el tercer, és a dir aïllarles i caracteritzar-les.Partint de la hipòtesi nul·la que hi ha cèl·lules amb característiques de cèl·lules mare al càncer de pròstata, els objectius d'aquesta tesi per punts han estat:1. Identificar i aïllar cèl·lules de la side population tant als tumors del PAC-120 com a les línies cel·lulars LNCaP i PC-3.2. Caracteritzar els perfils gènics de les cèl·lules de la side population aïllades.3. Comprovar la seva naturalesa progenitora mitjançant assaigs de diferenciació in Vitro o de tumorigènesi in vivo.4. Analitzar l'existència de cèl·lules tumorals disseminades al moll d'os del model PAC-120 i estudiar la seva possible naturalesa progenitora.Els resultats d'aquest treball demostren que el tumor del model PAC-120, format per una barreja d'epiteli humà i estroma murí, conté cèl·lules de la side population i que els cultius del tumor PAC-120 també contenen cèl·lules de la side population. La separació i anàlisi clonal de les cèl·lules de la side population dels cultius revelen que aquestes tenen una capacitat variable de donar lloc a cèl·lules de la side population. A més, l'estudi dels perfils gènics d'aquestes cèl·lules, la seva expressió proteica (immunofenotip Cd45- Sca-1+ Cd81+), la seva adherència al plàstic, la seva morfologia fibroblastoide, la seva gran capacitat proliferativa i la seva capacitat de diferenciació revelen que són cèl·lules multipotents estromals. Per tant, el tumor PAC-120 conté cèl·lules multipotents estromals que poden ser aïllades mitjançant l'assaig de la side population. Així mateix, el fenotip SP d'aquestes cèl·lules està associat amb el seu estat de diferenciació, ja que la seva diferenciació en comporta la pèrdua.D'altra banda, s'ha demostrat que les cèl·lules multipotents estromals aïllades secreten TGF-beta de manera autocrina i tenen la via del TGF-beta activa. El TGF-beta manté la proliferació i inhibeix la diferenciació de les cèl·lules multipotents estromals obtingudes del tumor.Quant a les línies, en aquest treball s'ha demostrat que tant LNCaP i PC-3 contenen cèl·lules de la side population, i presenten RNA i proteïna del transportador ABCG2. El promotor d'ABCG2 està parcialment desmetilat a la línia cel·lular LNCaP i molt metilat a PC-3. L'addició del composta bloquejador de la metilació de novo 5-aza afavoreix la desmetilació del promotor d'ABCG2, la transcripció del gen, la traducció de la proteïna i l'augment de la side population. A més, el sèrum i l'estradiol regulen a l'alça la transcripció d'ABCG2 i, en el cas del sèrum, també de la side population a la línia cel·lular LNCaP. / Cancer Stem Cells are a distinct cellular population that is believed to be responsible for tumor initiation and maintenance. Recent data suggest that solid tumors also contain another type of stem cells, the mesenchymal stem cells or multipotent mesenchymal stromal cells (MSC), which contribute to the formation of tumor-associated stroma.The Hoechst 33342 efflux assay has proved useful to identify a rare cellular fraction, named Side Population (SP), enriched in cells with stem-like properties. Using this assay, we identified SP in a prostate cancer xenograft containing human prostate cancer cells and mouse stromal cells. The SP isolation, subculture and sequential sorting allowed the generation of single-cell-derived clones of murine origin that were recognized as MSC by their morphology, plastic adherence, proliferative potential, adipogenic and osteogenic differentiation ability and immunophenotype (CD45-, CD81+ and Sca-1+). We also demonstrated that SP clonal cells secrete transforming growth factor β1 (TGF-β1) and that their inhibition reduces proliferation and accelerates differentiation.These results reveal the existence of SP in the stroma of a cancer xenograft, and provide evidence supporting their MSC nature and the role of TGF-β1 in maintaining their proliferation and undifferentiated status. Our data also reveal the usefulness of the SP assay to identify and isolate MSC cells from carcinomas.Concerning to cell lines, previous studies reported the presence of SP in prostate cancer tissues but not in the most widely used prostate cancer cell lines LNCaP and PC3. Using the SP flow cytometric assay, we demonstrate that SP cells are present in LNCaP and PC3 cells and that their abundance change with the serum concentration and steroid ablation. In addition, RT-PCR analysis evidences that ABCG2 is expressed in both cell lines and that its expression significantly increases when LNCaP cells are treated with estradiol (E2) and the demethylation agent 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC). Finally, our results also show that the ABCG2 gene expression relates negatively with the number of methylated CpG islands in its promoter and positively with the abundance of SP in LNCaP cells. In conclusion, these results demonstrate that prostate cancer cell lines LNCaP and PC3 do contain SP cells and express the ABCG2 transporter, and suggest that the changes in the SP abundance in these cell lines most likely reflect the modulation of the transporter activity by the environment than an enrichment in cancer stem cells.

Este trabajo demuestra que los genes que codifican para los enzimas beta-galactosido alfa-2,3-sialiltransferasa 3 (ST3Gal III), y en menor medida beta-galactosido alfa-2,3-sialiltransferasa 4 (ST3Gal IV), están directamente implicados en etapas clave de la progresión tumoral como la adhesión, la migración y la formación de metástasis en las líneas de adenocarcinoma pancreático humano Capan-1 y MDAPanc-28. También, que las Especies Reactivas del Oxígeno (ROS) generadas durante los procesos de proliferación y diferenciación celular o debido a estímulos oxidantes externos, desempeñan un importante papel en el control de la síntesis de ST3Gal III y SLex, y por lo tanto en la regulación del fenotipo metastático. Además, junto al papel pro-adhesivo de la E-Selectina, este trabajo ha descrito efectos prometastáticos adicionales para esta molécula como inductora de la migración y de la secreción de VEGF a través de un mecanismo E-Selectina-SLex dependiente. / This work shows that genes that codifying for the enzymes beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 3 (ST3Gal III), and in a lower extent beta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferase 4 (ST3Gal IV) , are directly implicated in key steps of tumour progression such as adhesion, migration and metastasis formation in the pancreatic adenocarcinoma cell lines Capan-1 and MDAPanc-28. Moreover, Reactive Oxygen Species (ROS) generated in these cell lines during cell proliferation-differentiation processes or by external oxidant stimuli, play a role in the control of ST3Gal III and SLex levels and in the acquisition of a more aggressive phenotype. And, together with the pro-adhesive role of E-Selectin for circulating cells, this work uncovers sE-Selectin dependent migration and VEGF secretion through a SLex depending mechanism, supporting additional pro-metastatic effects for sE-Selectin-SLex interaction.