El cáncer de pulmón no célula pequeña es la neoplasia más frecuente en la actualidad en los países industrializados, siendo la primera causa de mortalidad por cáncer en el varón. Su incidencia continúa aumentando progresivamente, y su tratamiento, pese a los esfuerzos de investigación de los últimos años, sigue siendo poco efectivo en la mayor parte de los casos, situándose la supervivencia global a los cinco años alrededor del 13%. La alta tasa de recaída, incluso en estadios iniciales susceptibles de cirugías radicales, justifica el interés de estudiar marcadores pronósticos de supervivencia y recaída. Esto nos ayudaría a distinguir grupos de riesgo, cuyo interés radica en ayudarnos a conocer la necesidad y efecto de los tratamientos adyuvantes, con quimioterapia y radioterapia así como abrir la puerta a posibles nuevas armas terapéuticas. Dada la alta incidencia de alteraciones en la vía de p53 en el cáncer de pulmón no célula pequeña, y su probable valor pronóstico, nuestra hipótesis es que existen alteraciones en los niveles de expresión de los miRNAs directamente regulados por p53, así como en los reguladores intermedios de la función de p53, con posible valor pronóstico en recaída y supervivencia de pacientes operados de cáncer de pulmón no célula pequeña o no microcítico(CPNCP). Tratamos pues de identificar el papel que juegan los miRNAs como marcadores útiles en el pronóstico del CPNCP en estadios iniciales, tras cirugía radical. De forma más específica determinar el posible papel pronóstico en recaída y en supervivencia de los miRNAs de la familia de miR-34: miR-34a, miR-34b y miR-34c, cuya transcripción es activada por p53. También definir el posible papel pronóstico en recaída y en supervivencia de los miRNAs miR-16 y miR-143, cuyos niveles finales en la célula, están modulados por p53. Así como, conocer si existen posibles interacciones entre miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-16 y miR-143 a nivel pronóstico. Para ello, hemos planteado un estudio retrospectivo, con las muestras de tejido tumoral y normal pareado de 70 pacientes, diagnosticados y tratado, de cáncer de pulmón no microcítico estadios I-III, entre Febrero de 1996 y Septiembre de 2002, en el Hospital Clínic de Barcelona. Se realizaron la extracción y cuantificación de RNA. Determinación de los niveles de los microRNAs mencionados. Determinación del estado de metilación de la región promotora del gen MIR34A. Determinación de la presencia de mutaciones de P53 entre los exones 5-8. Tras estos estudios los resultado obtenidos se han publicado en dos artículos. El primero de ellos en la revista “Carcinogenesis” y el segundo en la revista “Journal of Surgical Oncology”. En el primer artículo, titulado “miR-34a as a prognostic marker of relapse in surgically resected non-small-cell lung cancer”, relacionamos los niveles de miR-34a con la recaída tumoral, estableciendo tres grupos en función de esta tasa de recaída: el grupo con niveles bajos de miR34a, con un 67% de recaída, los que tenían niveles altos, con un 43% de recaída y los que tenían los niveles más altos con un 0% de recaída. Además, en el análisis univariado para riesgo de recaída, el estado mutacional de P53, los niveles de miR-34a y el estadio IA vs el resto, se correlacionaron con probabilidad de recaída. Se realizaron dos análisis mutilvariados, incluyendo o no el estado mutacional de P53, permaneciendo en ambos análisis la expresión de miR-34a, como factor independiente para recaída tumoral. Se observó que los pacientes con mutaciones de P53 presentaban una media de expresión de miR-34a más baja. Se observó que el subgrupo de pacientes en el que los niveles de expresión de miR-34a baja coincidían con presencia de mutaciones de P53, presentaban una alta tasa de recaída. En los pacientes sin mutaciones de de P53, existe una diferencia significativa en los niveles de expresión de miR-34a entre los pacientes que presentaban la región promotora de MIR34A metilada vs los que no. Por todo esto, encontramos que miR-34a se demuestra como un nuevo marcador biológico con significación en el pronóstico de la recaída de pacientes sometidos a cirugía del CPNCP, abriendo la posibilidad de una futura herramienta en el algoritmo de decisiones terapéuticas. En el segundo artículo, titulado “Prognostic Implications of miR-16 Expression Levels in Resected Non-Small-Cell Lung Cancer”, desde la hipótesis de que P53 activa la transcripción de la familia de miRNAs de miR-34 y regula la maduración de miR-16 y miR143, se estudiaron los niveles de expresión de miR-143 y miR-16 en el tejido normal y tumoral pareado de cada paciente de la serie, antes mencionada, de 70 pacientes. Así los pacientes se clasificaron de acuerdo a los niveles de expresión de miR-16(alto, normal y bajo). Aquellos pacientes con niveles normales tuvieron la mejor evolución, mientras que aquellos con niveles más altos tuvieron la peor. La supervivencia libre de enfermedad (SLE) era de 22,4 meses para los pacientes con niveles altos de miR-16, 71,8 meses para los de niveles normales y de 55,8 meses para los de niveles bajos. La supervivencia global (SG) fue de 23,9 meses para los que tenían niveles altos de miR-16, de 97,6 meses para los que tenían niveles normales y 63,5 meses para aquellos con niveles bajos. No se observó correlación entre los niveles de miR-143 y la evolución clínica de los pacientes. El análisis multivariado mostró a miR-16 como factor pronóstico independiente de SLE Y SG. En un análisis secundario, examinamos la correlación potencial entre la expresión de miR-16 y miR-34a y el estado mutacional de P53.No hubo correlación entre el estado mutacional de P53 y miR-16, pero si se observó una interacción entre miR-16 y miR-34a. En los pacientes con niveles altos de miR-34a, se observaron diferencias entre SLE Y SG, de acuerdo a los niveles de expresión de miR-16, mientras que en los pacientes con niveles bajos de miR-34a presentaban un pobre pronóstico, independientemente de los niveles de expresión de miR-16. Estos resultados nos indican el posible valor pronóstico de miR-16 en pacientes intervenidos de CPNCP, además del posible sinergismo entre miR-34a y miR16. / Non small cell lung cancer is more common today, in industrialized countries and is the leading cause of cancer death in men. Its incidence continues to increase gradually, and their treatment, despite the research efforts of recent years, it remains ineffective in most cases, putting the overall survival at five years about 13%. The high rate of relapse, even in early stages susceptible to radical surgery, justifies the interest in studying prognostic markers of survival and relapse. This would help us distinguish risk groups, whose interest lies in helping to meet the need and effect of adjuvant treatment with chemotherapy and radiotherapy as well as opening the door to possible new therapeutic tools. Given the high incidence of alterations in the p53 pathway in non small cell lung cancer, and likely its prognostic role, our hypothesis is that there are alterations in the expression levels of miRNAs directly regulated by p53, as well as in intermediate regulators of p53 function with potential prognostic value on relapse and survival of patients undergoing non small cell lung cancer (NSCLC). Then, we try to identify the role of miRNAs as useful markers for the prognosis of NSCLC in initial stages, after radical surgery. More specifically determine the possible prognostic role in relapse and survival of the family miRNAs miR-34: miR-34a, miR-34b and miR-34c, whose transcription is activated by p53. Also define the possible prognostic role in relapse and survival of the miRNAs miR-16 and miR-143, whose final levels in the cell are modulated by p53. And, determine whether there are possible interactions between miR-34a, miR-34b, miR-34c, miR-16 and miR-143 as regards prognosis. To do this, we have proposed a retrospective study, with the tumor tissue and paired normal in 70 patients, diagnosed and treated of non small cell lung cancer stages I-III, between February 1996 and September 2002, at the Hospital Clínic, in Barcelona. We performed RNA extraction and quantification. Determining levels of microRNAs mentioned. Determining the status of methylation of the promoter region of the gene MIR34A. Determining the presence of p53 mutations between exons 5-8. Following, the results obtained from these studies have been published in two articles. The first in the journal "Carcinogenesis" and the second in the "Journal of Surgical Oncology." In the first article, entitled "miR-34a as a Prognostic marker of relapse in surgically resected non-small-cell lung cancer", we relate the levels of miR-34a with the tumor relapse, establishing three groups according to the rate of relapse: the group with low levels of miR34a, with 67% relapse, those with high levels, with 43% relapse and those with the highest levels with a 0% relapse. Furthermore, in univariate analysis for risk of relapse, the mutational status of p53, the levels of miR-34a and stage IA vs the rest, were correlated with likelihood of relapse. Two multivariate analyzes were performed, including or not the P53 mutational status, remaining in both analyzes the expression of miR-34a, as an independent factor for tumor relapse. It was observed that patients with p53 mutations had a mean expression of miR-34a lower. It was noted that the subgroup of patients in which the expression levels of miR-34a low coincided with the presence of p53 mutations, had a high rate of relapse. In patients without mutations of p53, there is a significant difference in expression levels of miR-34a between the patients with the methylated promoter region MIR34A vs. those without. For all this, we found that miR-34a is shown as a novel biomarker with prognostic significance in patients relapsed NSCLC undergoing surgery, opening the possibility of a future tool in the therapeutic decision algorithm. In the second article, entitled "Prognostic Implications of miR-16 Expression Levels in Resected Non-Small-Cell Lung Cancer", from the hypothesis that p53 activates transcription of the family of miRNAs miR-34 and regulates the maturation of miR-16 to miR-143, we studied the expression levels of miR-143 and miR-16 in the paired normal and tumor tissue of each patient in the series, mentioned above, in 70 patients. So patients were classified according to the expression levels of miR-16 (high, normal and low). Patients with normal levels had the best clinical course, while those with higher levels had the worst. The disease-free survival (DFS) was 22.4 months for patients with high levels of miR-16, 71.8 months for normal levels of 55.8 months for low levels. Overall survival (OS) was 23.9 months for those with high levels of miR-16, from 97.6 months for those with normal levels and 63.5 months for those with low levels. No correlation was observed between the levels of miR-143 and the clinical course of patients. Multivariate analysis showed miR-16 as an independent prognostic factor for DFS and OS. In a secondary analysis, we examined the potential correlation between the expression of miR-16 and miR-34a and the mutational status of P53. There was no correlation between p53 mutational status and miR-16, but observed an interaction between miR-16 and miR-34a. In patients with high levels of miR-34a, there were differences between DFS and OS, according to the expression levels of miR-16, whereas in patients with low levels of miR-34a had a poor prognosis, regardless of expression levels of miR-16. These results indicate the possible prognostic value of miR-16 in patients operated for NSCLC, as well as possible synergism between miR-34a and miR16

1 INTRODUCCIÓNEl cáncer colorrectal (CCR) es la tercera causa de diagnóstico de cáncer en todo el mundo. El 11-27% de pacientes se diagnostican en estadio avanzado o metastático. De los inicialmente diagnosticados de CCR localizado, un 25-50% acabarán presentando metástasis. En los últimos años hemos asistido a un leve decremento de la incidencia y de la mortalidad por CCR, probablemente debido a la mejora en los programas de ¨screening¨ y a las mejoras en las estrategias terapéuticas. El CCRM tiene un pronóstico pésimo. La supervivencia global se sitúa entre los 5-6 meses, en pacientes que no reciben tratamiento. En los últimos años, la implementación de las nuevas terapias ha elevado esta media hasta los 15-18 meses. En la actualidad, ¿existe alguna manera para reconocer con que tipo de CCRM estamos tratando? ¿Cómo podemos determinar de antemano como se comportará el CCRM, en términos de pronóstico y respuesta a los tratamientos? Hasta la fecha se han realizado multitud de estudios con la intención de determinar factores pronósticos y predictivos de respuesta en CCRM. En el texto se recogen detalladamente los más importantes. Sin embargo, existen diferentes factores que explican que estos factores no se hayan implementado en la práctica clínica habitual. Entre ellos está la falta de estudios clínicos prospectivos confirmativos y, por otra parte está la heterogeneidad que impera a la hora de realizar los estudios sobre marcadores. Para solventar este último punto, el Nacional Cancer Institute ha creado unas guías a seguir (REMARK). Actualmente hace falta diseñar convenientemente estudios prospectivos confirmativos. En el Hospital Clínic de Barcelona hemos desarrollado (2001) un algoritmo terapéutico basado en el patrón de metástasis al debut de la enfermedad y los algunos de los factores más utilizados como pronósticos. 2 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS: En nuestra hipótesis, hemos seleccionado dos determinantes moleculares (MMP-7 y sFAS/sFASL) como potenciales marcadores pro'osticos y predictivos de respuesta a terapia en CCRM. Matrilisina o metaloproteasa-7 (MMP-7) es una enzima proteolítica perteneciente a la familia de las metaloproteasas. Es sintetizada y secretada al medio por células tumorales. Detalles sobre la regulación de su expresión y función pueden hallarse en el texto original. Entre sus actividades destacamos su capacidad de cortar la proteína de membrana FASL. El receptor FAS y su ligando FASL son receptores transmebrana. Su interacción induce la activación de la vía extrínseca de apoptosis. Existen fracciones solubles de estas proteínas: sFAS y sFASL. sFAS es resultante de fenómenos de "splicing" alternativo. Su función es predominantemente proapoptótica. sFASL resulta de cortar la proteína de membrana, a cargo de proteasas como MMP-7. La función de sFASL es básicamente antiapoptótica. Las fracciones solubles pueden anularse entre sí. Su función final depende de los balances entre ellas, por lo que el ratio pude ser un estimador de la función apoptótica final. FAS y FASL son proteínas que se han relacionado con la respuesta apoptótica al tratamiento quimioterápico. El CCRM muestra un patrón de resistencia a la inducción de apoptosis vía FAS-FASL. El papel de las formas solubles sFAS y sFASL en quimioresistencia nunca ha sido evaluado. MMP-7 se ha relacionado con un fenotipo agresivo de CCRM, aunque también con quimioresistencia, debido a su capacidad de corte de FASL. Los niveles séricos de sFAS han demostrado estar aumentados en pacientes con CCRM. La medición de los niveles séricos de sFASL y MMP-7 nunca se ha llevado a cabo en pacientes con CCRM.Nuestra hipótesis es que los niveles séricos de MMP-7, sFAS y sFASL en pacientes con CCRM puden ser marcadores biológicos que estimen la agresividad y la quimioresistencia. A modo de concepto nuevo y, teniendo en cuenta que el tumor varía en el tiempo, está el hecho que los marcadores biológicos deberían poderse obtener no solo en el momento del diagnóstico sino en cualquier momento durante la evolución de la enfermedad. Si esto fuera así, el método de obtención debería ser fácil y no invasivo. Los niveles séricos de MMP-7, sFAS y sFASL y sus variaciones durante el tiempo deberían ser predictores de quimioresistencia en CCRM en cualquier momento durante la enfermedad.Los objetivos se pueden resumir en:A) Determinar si los niveles séricos basales de MMP-7 en pacientes con CCRM y establecer su valor pronóstico. B) Determinar los niveles séricos de sFAS y sFASL en pacientes con CCRM, antes y durante el tratamiento quimioterápico, y establecer una correlación con la respuesta tumoral, de manera que podamos valorar su papel como marcador predictivo de respuesta. C) En función de los resultados obtenidos, diseñar estudios clínicos prospectivos para validar el valor de los niveles séricos de MMP-7 y sFAS/sFASL como nuevos marcadores solubles de pronóstico y respuesta al tratamiento en CCRM. 3. RESULTADOS: Los resultados han sido hechos públicos en dos artículos, uno de ellos aparecido en 2005 y otro de ellos en prensa. Ambos se recogen en la tesis. 4. CONCLUSIONES: En resumen, concluimos que:-MMP-7 puede medirse en el suero y sus niveles basales son un factor pronóstico independiente en pacientes con CCRM.-Las variaciones de los niveles séricos de sFAS/FASL en pacientes con CCRM en tratamiento quimioterápico correlacionan con la respuesta tumoral.-La detección de un descenso del los valores séricos del ratio sFAS/sFASL, habitualmente debido al incremento de sFASL, se relaciona con quimioresistencia.-Los valores séricos del ratio sFAS/sFASL podrían utilizarse como un predictor dinámico de respuesta al tratamiento quimioterápico en pacientes con CCRM y su valor debería validarse en estudios clínicos prospectivos. -Nuestras observaciones, en los campos básico y clínico, indican que MMP-7 estaría implicada en quimioresistencia primaria o intrínseca y adquirida, en CCRM.-Una hipótesis generada "de novo" es que un patrón sérico consistente en niveles altos de MMP-7 y de FASL, tanto si se detecta antes de iniciar el tratamiento como durante éste, implicaría qumioresistencia y, en consecuencia, mal pronóstico. -MMP-7 y sFAS/sFASL, los nuevos marcadores solubles que proponemos, se pueden detector fácilmente a través de una técnica no invasiva.-MMP-7 y sFAS/sFASL, los nuevos marcadores solubles propuestos, se pueden detectar en cualquier momento a lo largo de la enfermedad y refleja la biología tumoral cambiante, de una manera dinámica. -De acuerdo a los resultados presentados y las hipótesis generadas a partir de éstos, hemos diseñado estudios clínicos prospectivos para determinar la relevancia clínica de los niveles séricos de MMP-7 y sFAS/sFASL, como nuevos marcadores solubles de quimioresistencia en CCRM.

Als països desenvolupats, una de cada cinc persones morirà a causa del càncer. S'ha descrit que les cèl·lules canceroses presenten modificacions en els glicans presents a la superfície cel·lular i aquesta glicosilació anòmala podria reflectir-se en les glicoproteïnes de secreció. Per aquest motiu es planteja l'estudi de la glicosilació de dues proteïnes de secreció en situació normal i tumoral: la ribonucleasa pancreática humana (RNasa 1) i l'antigen prostàtic específic (PSA).La RNasa 1 és una glicoproteïna secretada majoritàriament pel pàncreas. S'ha desenvolupat un mètode immunològic per a detectar els nivells de RNasa 1 en sèrum. Malgrat la millora de la sensibilitat, respecte d'estudis anteriors, no s'han observat diferències significatives entre la concentració de RNasa 1 en sèrum de pacients control sans, afectats de neoplàsia pancreàtica, de pancreatitis o d'altres patologies.L'estudi de les estructures glucídiques de la RNasa 1, mitjançant assaigs immunològics, permet observar diferències importants en la glicosilació entre la situació normal i tumoral: Els antígens sialilats sLex i sLea només apareixen en la RNasa 1 de medi de cultiu de cèl·lules d'adenocarcinoma pancreàtic Capan-1 i MDAPanc-3 i l'antigen fucosilat Ley només apareix en la RNasa 1 de pàncreas de donant. S'ha purificat la RNasa 1 secretada per la línia MDAPanc-3, cosa que ha permès seqüenciar-ne les estructures glucídiques i comparar-les amb les de la RNasa 1 purificada del medi de les cèl·lules Capan-1 i de pàncreas de donant, corroborant els resultats abans esmentats.L'antigen prostàtic específic (PSA) és una glicoproteïna secretada principalment per la pròstata. Els seus nivells sèrics s'utilitzen actualment com a marcador del càncer de pròstata, però la seva especificitat no permet diferenciar clarament una situació benigna d'una maligna.La purificació i caracterització glucídica del PSA secretat per les cèl·lules de carcinoma prostàtic LNCaP mostren diferències molt clares amb la glicosilació que presenta el PSA purificat de plasma seminal de donant. Principalment, el PSA present en situació tumoral, purificat de les cèl·lules de carcinoma prostàtic, no conté àcid siàlic, però presenta nivells més alts de fucosilació que el PSA en situació normal. El PSA purificat de plasma seminal de donant sí que conté àcid siàlic. Aquests resultats s'han obtingut mitjançant assaigs immunològics amb detecció per lectines i s'han corroborat per seqüenciació glucídica. D'acord amb les estructures glucídiques que millor diferencien el PSA de situació normal i tumoral, s'ha portat a terme la caracterització glucídica de mostres biològiques que contenen PSA. S'han desenvolupat diferents assaigs immunològics de detecció per lectines o associats a l'activitat sialiltransferasa, amb un enriquiment previ en PSA per immunoadsorció indirecta o cromatografia per interacció tiofílica. Els resultats dels diferents assaigs permeten concloure que el PSA del sèrum de pacients de neoplàsia prostàtica presenten un contingut en àcid siàlic similar al del plasma seminal de donant, encara que són lleugerament menys sialilats. Aquests resultats s'adiuen amb els determinats sobre mostres de PSA purificat.La separació del PSA per electroforesi bidimensional mostra diverses formes amb pI àcid en el PSA de plasma seminal, explicades per la presència d'àcid siàlic. Es detecten formes de pI més bàsic que el teòric per al PSA en el secretat per les cèl·lules LNCaP, que correspon a formes pPSA. Al sèrum de pacients de neoplàsia prostàtica s'hi observen formes sialilades.Les proteïnes de secreció, RNasa 1 i PSA, es troben alterades a nivell glucídic en situació tumoral, cosa que podria ser d'utilitat per a finalitats diagnòstiques.

La ultrasonografía endoscópica (USE) combina la endoscopia con la ecografía para conseguir imágenes ecográficas de 360º desde el interior del tubo digestivo. Ello permite una muy buena visualización de las diferentes capas de la pared y de las estructuras de vecindad. Por otro lado, existe un ecoendoscopio sectorial que permite introducir una aguja por el canal operativo y realizar la punción con aguja fina guiada por USE en tiempo real desde el interior del tubo digestivo y obtener material citológico para el diagnóstico (USE-PAAF). Asi pues, la USE y la USE-PAAF constituyen unas técnicas idóneas para estudiar el engrosamiento de los pliegues gástricos, explorar tanto las lesiones focales como la patología difusa del páncreas, y realizar la estadificación locoregional de los tumores digestivos asi como para la obtención de material para el diagnóstico citológico. A pesar de la conocida utilidad de la USE y USE-PAAF en Oncología, existen patologías de difícil manejo clínico en los que el rendimiento de esta técnica no ha sido evaluado adecuadamente. Además, tampoco se han analizado cuáles son las circunstancias que permiten obtener un mayor rendimiento de la USE-PAAF. Por otro lado, la combinación de una técnica diagnóstica novedosa como es la USE-PAAF con los métodos de biología molecular podría suponer un verdadero avance en el diagnóstico de las neoplasias digestivas y pulmonares.La presente Tesis Doctoral está constituida por cuatro trabajos originales encaminados a resolver estas cuestiones y cuyos resultados permiten extraer las siguientes conclusiones:1. El engrosamiento de las capas profundas de la pared gástrica (submucosa y/o muscular) es el único criterio endosonográfico independiente predictivo de malignidad en pacientes con pliegues gástricos engrosados y biopsias negativas. 2. Utilizando este criterio, la USE es una técnica muy precisa y con un importante impacto clínico en el manejo de este grupo de pacientes. 3. En los pacientes referidos para USE-PAAF, esta técnica aumenta significativamente el porcentaje de diagnósticos correctos en cuanto a benignidad y malignidad con respecto a la USE, en especial en adenopatías y lesiones quísticas. 4. La localización intraparietal de la lesión es el único factor asociado a una mayor probabilidad de obtener un diagnóstico incorrecto por USE-PAAF. 5. La presencia de un patólogo en la sala de exploración aumenta el rendimiento de la USE-PAAF al reducir el número de pases necesarios para obtener un diagnóstico correcto y es una estrategia coste-eficaz.6. Es posible efectuar el análisis mutacional del gen KRAS en el material obtenido por USE-PAAF, con una elevada rentabilidad. 7. La citología convencional es la estrategia más precisa para el diagnóstico del cáncer de páncreas, pudiendo el análisis molecular incrementar su rendimiento en los pocos casos en los que la primera no es diagnóstica. 8. Es posible detectar la presencia de micrometástasis ganglionares mediante determinación de patrones de metilación aberrante en material obtenido por USE-PAAF.9. La combinación de este análisis con la citología convencional puede ser una aproximación útil en el diagnóstico de extensión de los pacientes con neoplasias digestivas y pulmonares. / Endoscopic ultrasound (EUS) consists in a high-frequency transducer placed at the tip of an endoscope. This technique permits to obtain high-resolution transmural sonographic images of the intestinal wall and surrounding structures. Moreover, it is possible to obtain cytological material from lesions located around the intestinal wall by means of FNA guided by EUS. EUS and EUS-FNA have become well-established procedures for diagnosing and staging both gastrointestinal and lung cancer as well as to study the pancreas. The aims of the present Doctoral Thesis were:1) to assess the predictive variables of malignancy in EUS, and the impact of EUS in patients with large gastric folds at endoscopy and endoscopic biopsies negative for malignancy; 2) To evaluate factors that permit to obtain a correct diagnosis by EUS-FNA and to establish the usefulness of disposing of an attendant pathologist; 3) To establish the usefulness of KRAS mutational analysis in the diagnosis of pancreatic adenocarcinoma by comparing this technique with conventional cytology in aspirates obtained by means of EUS-FNA; and, 4) to evaluate whether hypermethylation gene promoter analysis was feasible on samples obtained by EUS-FNA from lymph nodes, as well as to establish the usefulness of this strategy for the detection of micrometastases in patients with gastrointestinal and non-small cell lung cancer.Results obtained permitted to conclude that: 1) the enlargement of deep layers is the only independent predictive factor for malignancy in patients with large gastric folds at endoscopy and biopsies negative for malignancy and that EUS has a high clinical impact in these patients; 2) The availability of an attendant pathologist seems to increase the diagnostic yield of the FNA, minimizing the number of passes and resulting in a cost-effective strategy. In absence of on-site evaluation the number of passes to perform should be 3 to 4 depending on the type of lesion; 3) Cytology from aspirates obtained by EUS-FNA is the most precise single technique for the diagnosis of pancreatic adenocarcinoma. However, when adequate specimens are not available to reach a cytological diagnosis, the addition of KRAS mutational analysis represents the best strategy; and, 4) It is feasible to detect occult neoplastic cells in EUS-FNA samples by hypermethylation gene promoter analysis. Moreover, addition of methylation analysis to conventional cytology may increase its sensitivity at the expenses of a decrease in its specificity.

This Doctoral Thesis project is part of a broader research program whose global aim is to better understand key molecular and cellular events in tumor metastasis, in particular those associated with prostate cancer, in order to identify regulatory molecules, gene networks and biochemical pathways, to propose relevant biomarkers and, finally, to provide proof-of-concept validations for potential therapeutic targets. As a starting point, this particular project has relied on comparative analyses between isogenic tumor cells with high vs. low metastatic potentials. The results of this Thesis project are reflected in two different but closely related studies. Article 1, the main publication of this project, focuses on how phenotypic switches and interactions between distinct tumor cell subpopulations engage or suppress metastasis, and which are the genetic programs that may govern such transformations. Article 2 is more focused on specific molecular post-transcriptional regulatory mechanisms that influence the latter steps of metastatic colonization. 1) Malignant progression in cancer requires populations of tumor-initiating cells (TICs) endowed with unlimited self-renewal, survival under stress and establishment of distant metastases. Additionally, the acquisition of invasive properties driven by epithelial-mesenchymal transition (EMT) is critical for the evolution of neoplastic cells into fully metastatic populations. Here we characterize cellular models derived from prostate and bladder cancer cell lines in which tumor subpopulations expressing a strong epithelial gene program are enriched in highly metastatic TICs, while a second subpopulation with stable mesenchymal traits is impoverished in TICs. Constitutive overexpression of the transcription factor Snai1 in the epithelial/TIC-enriched populations engaged a mesenchymal gene program and suppressed their self-renewal and metastatic phenotypes. Conversely, knockdown of EMT factors in the mesenchymal-like prostate cancer cell subpopulation caused a gain in epithelial features and properties of TICs. Both tumor cell subpopulations cooperated among them, such that the non-metastatic mesenchymal-like prostate cancer subpopulation enhanced the in vitro invasiveness of the metastatic epithelial subpopulation and, in vivo, promoted the escape of the latter from primary implantation sites and accelerated their metastatic colonization. Our models provide new insights into how dynamic interactions between epithelial, self-renewal and mesenchymal gene programs determine the plasticity of epithelial tumor-initiating cells. 2) Although the role of miR-200s in regulating E-cadherin expression and epithelial-to-mesenchymal transition is well established, their influence on metastatic colonization remains controversial. Here we have used clinical and experimental models of breast cancer metastasis to discover a pro-metastatic role of miR-200s that goes beyond their regulation of E-cadherin and epithelial phenotype. Overexpression of miR-200s is associated with increased risk of metastasis in breast cancer and promotes metastatic colonization in mouse models, phenotypes that cannot be recapitulated by E-cadherin expression alone. Genomic and proteomic analyses revealed global shifts in gene expression upon miR-200 overexpression toward that of highly metastatic cells. miR-200s promote metastatic colonization partly through direct targeting of Sec23a, which mediates secretion of metastasis-suppressive proteins, including Igfbp4 and Tinagl1, as validated by functional and clinical correlation studies. Overall, these findings suggest a pleiotropic role of miR-200s in promoting metastatic colonization by influencing E-cadherin–dependent epithelial traits and Sec23a-mediated tumor cell secretome. Both studies, when considered together, share important and novel views of metastasis, mainly in relationship with the last steps of the metastatic cascade, strongly suggesting that prostate, bladder and breast tumor cells with an epithelial non-secretory phenotype are more prone to metastatize. We propose that mesenchymal-like tumor cells with a relatively stable EMT derive from epithelial-CSC cells at the primary tumor site, largely in response to microenvironmental influences. As we have shown in the first study, both tumor cell populations, epithelial-CSC or TIC and mesenchymal-like, interact with each other, one consequence being a transient EMT of the epithelial-CSC population that had retained their epithelial state. Thus, in a given tumor microenvironment, there is a strong pressure for epithelial-CSC to drift from epithelial to mesenchymal-like phenotypes. Together, these heterogeneous populations of tumor cells are effective at overcoming the initial barriers to metastasis where invasion is required. After completing these initial steps, mesenchymal-like tumor cell populations are less critically required, while epithelial-CSC are more important and critical to finally grow metastastatic secondary tumors. There are many reasons to support that epithelial-CSC-unsecretory cells are more capable of metastatic colonization, including the facts that they can form clusters in the bloodstream for better survival, are resistant to anoikis, they show anchorage-independent growth and strong self-renewal capacity that permit them to adapt to different environments and initiate and grow secondary tumors. Very interestingly, such cells have a reduced secretion of metastatic suppressor factors which may interact in autocrine and paracrine fashion with tumoral and stromal cells at metastatic sites. / La progressió maligna en càncer requereix de poblacions iniciadores de tumors (TICs) que tenen capacitat auto-renovadora il•limitada, supervivència baix estrès i d'establir metàstasis a distància. Addicionalment, l'adquisició de propietats invasives per transició epiteli-mesènquima (EMT) és crítica per l'evolució neoplàsica en la conversió a poblacions metastàtiques. Aquí caracteritzem models cel•lulars derivats de línies de càncer de pròstata i bufeta, en les quals unes subpoblacions expressen un programa epitelial enriquit en cèl•lules metastàtiques iniciadores de tumors (TICs), mentre que una segona població presenta característiques mesenquimals i és pobre en cèl•lules iniciadores de tumors (TICs). La sobreexpressió constitutiva del factor de transcripció Snai1 en les poblacions enriquides en cèl.lules epitelials-iniciadores de tumors, indueix el fenotip mesenquimal i suprimeix l'auto-renovador i metastàtic. D'altra banda, el knock-down de factors d'EMT en la subpoblació mesenquimal va provocar el guany de propietats epitelials i de cèl•lules iniciadores de tumors. Aquestes dues subpoblacions de càncer de pròstata poden cooperar entre elles. La subpoblació mesenquimal augmenta la seva invasió in vitro de les epitelials-TICs i in vivo promou la seva sortida del lloc de tumor primari accelerant així la colonització metastàtica. Els nostres models proveeixen nous coneixements en com la dinàmica entre programes epitelials auto-renovadors i mesenquimals, determinen la plasticitat de les cèl•lules epitelials iniciadores de tumors

El término “cáncer” agrupa un amplio grupo de enfermedades que implican proliferación celular descontrolada y que afectan a casi cualquier tejido del organismo. Es la principal causa de mortalidad a nivel mundial; 7,6 millones de personas fallecieron por cáncer en 2008 y se prevé que la cifra de defunciones alcanzará los 11 millones en 2030. El denominador común de todas estas muertes es la malignidad tumoral, definida como la capacidad para invadir tejidos sanos y formar metástasis, que aparecen incluso años después del tratamiento del tumor primario. La mayor limitación en la búsqueda de soluciones terapéuticas efectivas contra el cáncer es la heterogeneidad de los tumores. Estos se componen de distintos tipos celulares que varían en su morfología, índice de proliferación, grado de diferenciación, anomalías genéticas, capacidad metastásica y resistencia a tratamientos, hasta tal punto que un tumor llega a desarrollar características específicas en cada paciente. Conocer cuáles son los mecanismos responsables de esta heterogeneidad es un objetivo clave en el estudio de la biología del cáncer, ya que permitiría abordar la génesis de la enfermedad y desarrollar terapias dirigidas a la/s célula/s que originan el tumor. Este abordaje requiere de modelos experimentales en los que se pueda inducir la formación de un tumor desde un origen conocido, seguir su evolución en comparación con el desarrollo normal del tejido control y analizar las alteraciones que desencadenan la transformación maligna. Estudios pioneros en Drosophila identificaron el primer ejemplo de ¿gen supresor de tumores¿. Sucesivos trabajos en este sistema modelo han permitido conocer un número considerable de genes implicados en oncogénesis, muchos de los cuales son reguladores esenciales de la división de las células madre. El desarrollo de protocolos para la inducción y el crecimiento de estos tumores ha permitido recapitular en Drosophila, a partir de mutaciones génicas únicas, la formación e inmortalización de tumores malignos que comparten muchas de las características esenciales del cáncer en humanos. Sin embargo, aún queda un largo camino hasta identificar qué alteraciones son responsables de la transformación maligna. En este contexto, las técnicas de transcriptómica proporcionan una herramienta clave para analizar los perfiles de expresión génica característicos de tumores en distinto estadio de desarrollo y/o de distinto origen, y su aplicación en tumores de Drosophila es el objetivo de este trabajo.

1) Introducción Hasta el momento se han secuenciado total o parcialmente más de 100 tipos y subtipos de VPH. De todos ellos, aproximadamente 40 tipos se han aislado en lesiones de tracto genital inferior y unos 35, según diferentes estudios, en carcinomas. Según su riesgo oncogénico, se clasifican en tipos de VPH de bajo riesgo (VPH-BR), VPH de probable alto riesgo y VPH de alto riesgo (VPH-AR). Uno de los descubrimientos más importantes en la investigación etiológica del cáncer en los últimos 25 años ha sido la demostración de que el cáncer de cuello uterino está causado por la infección persistente de ciertos genotipos de VPH. En mujeres con cáncer de cuello uterino invasivo, los genotipos de VPH más frecuentes a nivel mundial son el VPH 16, el VPH 18, el VPH 31, el VPH 33, el VPH 35, el VPH 45, el VPH 52 y el VPH 58, que representan el 91% del total de casos de cáncer invasivo de cuello uterino. 2) Hipótesis de trabajo La infección por los diferentes genotipos del VPH presenta una prevalencia diferente según la población estudiada. 3) Metodología Se trata de un estudio prospectivo transversal descriptivo. La población de estudio se centra en pacientes con patología cervical controladas en el Hospital Universitario Sant Joan de Déu, de Esplugues, Barcelona (Universidad de Barcelona). El tiempo de recogida de pacientes abarca 96 meses (enero 2003-enero 2010). Hemos reunido un total de 1007 pacientes. 4) Resultados 73.2% de las pacientes presentan infección por VPH. El 86.4% de ellas es por genotipos de VPH de alto riesgo. Los genotipos de VPH más frecuentes son el VPH 16 (31.2%), el VPH 51 (8.9%), el VPH 53 (8.3%), el VPH 31 (7.3%) y el VPH 66 (6.7%). En CIN 2-3 (87%) y carcinomas (87%), la prevalencia de pacientes con infección por VPH es significativamente mayor que en las pacientes con CIN 1 (64%), cambios asociados a VPH (42%) o atipias (28%). En CIN 1 los genotipos de VPH más frecuentes son el VPH 16 (19.8%), el VPH 51 (11.9%), el VPH 53 (9.4%), el VPH 66 (8.8%) y el VPH 42 (5.5%). En CIN 2-3 los genotipos más frecuentes son el VPH 16 (45.3%), el VPH 31 (10.9%), el VPH 51 (9.8%), el VPH 53 (9.6%) y el VPH 58 (8.1%). En las pacientes con carcinoma el VPH 16 (47.2%), el VPH 31 (11.1%) y el VPH 45, VPH 52 y VPH 18 con un 8.3% cada uno de ellos. 5) Discusión De manera global, entre todas las pacientes de nuestra muestra, con patología cervical sin diferenciar el tipo de lesión cervical, los genotipos de VPH más frecuentes que son el VPH 16 (31.2%), el VPH 51 (8.9%), el VPH 53 (8.3%), el VPH 31 (7.3%) y el VPH 66 (6.7%). En nuestra población, el VPH 18 presenta una prevalencia del 5.4%, por detrás del VPH 51, del VPH 31, del VPH 58 y del VPH 33. Otros estudios españoles confirman estos resultados, así como estudios sobre otras poblaciones europeas, americanas o asiáticas. Sin embargo, existen publicaciones en la literatura sobre poblaciones también españolas, europeas, americanas y asiáticas, que no apoyan tan claramente estos resultados. Tenemos evidencia suficiente para afirmar que el VPH 16 es el genotipo más frecuente a nivel mundial y en cada región, pero que existen variaciones en la prevalencia del resto de los diferentes genotipos de VPH según la población que estudiemos y éstas deberían ser un factor importante a considerar, especialmente la prevalencia de los genotipos de VPH-AR, para predecir cómo las medidas de cribado y de prevención pueden influir en la incidencia del cáncer cervical de cada zona geográfica en concreto. En este punto también es importante tener en cuenta que las dos vacunas disponibles actualmente presentan cierta protección cruzada frente a lesiones CIN 2-3 y superiores por tipos de VPH oncogénicos no vacunales: VPH 33, VPH 31, VPH 45 y VPH 51, con eficacias de entre 20-40% para lesiones intraepiteliales cervicales de alto grado o superiores. / 1) Introduction Human papillomavirus (HPV) is one of the main risk factors for invasive cervical cancer. The genotypes involved most frequently are related with HPV 16 and HPV 18 and are associated with approximately 70% of all cancers of the cervix. However, other HPV genotypes also play an important role in cervical pathology and cervical cancer and their distribution appears to vary depending on age and region. 2) Objective To document the prevalence of different human papillomavirus (HPV) genotypes in our population. 3) Material and Methods Prospective, cross-sectional descriptive study. A total of 1007 patients were recruited among those seen at the cervical pathology clinic of Sant Joan de Déu University Hospital in Barcelona (Spain) between January 2003 and March 2011. 4) Results Most patients (73.2%) had HPV infection, and among these women the genotype was considered high-risk in 86.4%. The most frequent genotype was HPV 16, found in 31% of the patients. Other genotypes identified, in decreasing order of frequency (all <10%), were HPV 51, HPV 53, HPV 31, HPV 66, HPV 58, HPV 33 and HPV 18. Mean age of the patients with HPV infection was 32.3 years, versus 39.8 years in women without HPV infection (p<0.05). The prevalence of HPV infection was significantly higher among women with grade 2 or 3 cervical intraepithelial neoplasia (CIN 2/3) (86%) or carcinoma (87%) than in women with grade 1 cervical intraepithelial neoplasia (CIN 1) (64%), HPV-associated changes (50%) or atypical cells (40%). 5) Discussion Knowledge about the incidence of the different HPV genotypes is needed for an appropriate focus on preventive, diagnostic and therapeutic measures. As in the present study, genotype HPV 16 was found to be the most frequent worldwide except in Eastern Africa, Japan and Taiwan, where the prevalence of HPV 52 is high. The second most frequent genotype worldwide is HPV 18, according to earlier reports. However, in our study population the incidence of HPV 18 was 5.4%, behind HPV 51 (8.9%), HPV 53 (8.3%) and HPV 31 (7.3%). These findings are consistent with other studies in Spain and Italy, and the geographical variations make it necessary to establish the true risk associated with genotypes HPV 51 and HPV 53, given that their prevalence is non-negligible.

El Virus del Papil•loma Humà (VPH) està implicat en la patogènesis dels tumors del tracte genital femení i es detecta en la pràctica totalitat dels carcinomes de cèrvix, considerant-se una causa necessària per al seu desenvolupament. El VPH també sembla estar involucrat en una proporció de tumors de la vulva i de la vagina, però al contrari que en el cèrvix, els carcinomes escamosos de la vulva (CEV) i de la vagina (CEVa) es desenvolupen seguint dues vies etiopatogèniques diferents: una relacionada amb la infecció pel VPH i una independent de la infecció viral. Degut a la baixa incidència de tumors en aquestes localitzacions, hi ha molt pocs coneixements sobre la epidemiologia, les característiques histològiques i les conseqüències clíniques dels tumors relacionats amb el VPH. Per altra banda, en totes aquestes localitzacions, tant les lesions premalignes com els carcinomes relacionats amb el VPH semblen presentar una morfologia basaloide o condilomatosa, mentre que els carcinomes no relacionats amb el VPH són generalment queratinitzants. Des de fa un temps s’ha evidenciat que la sobrexpressió de p16ink4a es troba de manera uniforme en totes les lesions premalignes i malignes del cèrvix uterí i d’altres localitzacions, com l’amígdala, la vulva o la regió anorectal, associades a la infecció el VPH i s’ha proposat coma marcador d’aquesta infecció viral. L’objectiu de la tesi va ser estudiar un grup ampli de lesions de vulva i de vagina analitzant la presència o no de VPH i determinar si existeixen característiques morfològiques, immunohistoquímiques i clínico-patològiques diferencials entre els tumors positius i els negatius per al VPH. Com a metodologia es va avaluar retrospectivament els casos de CEVa i CEV diagnosticats a l’Hospital Clínic, a l’Hospital de la Vall d’Hebrón, a l’Instituto Portugués de Oncología de Lisboa i a l’Hospital de Vic, entre 1989 i el 2009. El VPH es va detectar mitjançant tècniques de PCR utilitzant primers SPF-10 i tipificat amb el mètode INNO-LIPA HPV. També es van realitzar tècniques de immunohistoquímica per la detecció de p16ink4A i p53. Es va realitzar l’anàlisi de la supervivència global (OS) i de la supervivència lliure de malaltia (DFS) mitjançant corbes de Kaplan- Meier i anàlisis multivariades utilitzant el model de Cox. Els resultats que es van obtenir van ser que tant el CEV com el CEVa presenten dues vies etiopatogèniques, una en relació a la infecció pel VPH i una independent de la infecció viral. El tipus viral més freqüent és el VPH de tipus 16. La tinció immunohistoquímica amb p16ink4 mostra una gran especificitat i sensibilitat per al diagnòstic dels carcinomes escamosos de vagina associats al VPH, i és una tècnica útil i simple per a classificar-los etiològicament. Les dones amb CEV associat al VPH presenten un pronòstic similar a les dones amb carcinomes no relacionats amb el VPH, mentre que les pacients amb CEVa relacionat amb el VPH tenen una millor supervivència global i supervivència lliure de malaltia. Aquesta supervivència està limitada als estadis I i II de la malaltia. Les lesions vulvars intraepitelials negatives per a la infecció del VPH poden adoptar, ocasionalment, una morfologia basaloide i confondre’s amb un VIN de tipus clàssic (relacionat amb el VPH), per això, la tinció immunohistoquímica amb p16(ink4a) i p53 poden ser útils en l’adequada classificació d’aquestes lesions. / HUMAM PAPILLOMA VIRUS AS A PROGNOSTIC FACTOR IN THE CARCINOMAS OF THE VULVA AND THE VAGINA Human Papilloma Virus (HPV) has been clearly implicated in the pathogenesis of maligmant and premalignant tumours of the female lower genital tract and has been detected in almost 100% of cervical carcinomas. HPV also seems to be involved in a proportion of vulva and vagina tumours, but unlike the cervix, these tumors develop following two different etiopathogenic pathways: one group is related to HPV infection whereas a second group arises via independent- HPV infection. Premalignant and malignant tumours related to to HPV are histologicaly squamous cell carcinoma of non-keratinizing, basaloid or warty types, whereas most HPV-negative tumors are commonly of keratinizing type. However some overlap exists between the histological types and the association with HPV and immunohistochemical studies with p16ink4a has been proposed as a marker of this viral infection in the neoplasms. As a methodology, cases of carcinoma of the vulva and the vagina diagnosed in Hospital Clinic, Hospital de la Vall d'Hebron, Portuguese Institute of Oncology and Hospital de Vic, were analyzed between 1989 and 2009. HPV was detected by PCR. Immunohistochemical techniques were carried out for the detection of p p16ink4a and p53. The analysis of the overall survival (OS) and disease-free survival (DFS) was made through Kaplan Meier analysis and multivariate curves using the Cox model. The results show that in vagina, as in vulva, there are two independent pathways in the development of tha carcinomas, one related an another independant of the HPV infection.The most common HPV viral type is the 16 . Immunohistochemical p16ink4 staining shows a great sensitivity and specificity for HPV related neoplasms, and is a useful technique to classify them. In vulva, women with HPV-tumours present a similar prognosis that women with non-HPV related tumours, while in vagina patients with HPV-related tumours stand a better overall survival and disease-free survival. This survival is limited to stages I and II of the disease. Vulvars negative intraepitelials neoplasms for HPV infection can adopt an basaloide morphology and p16ink4a staining with may be helpful in the proper classification.

DE LA TESI:El diagrama complet de les pertorbacions genètiques i epigenètiques que afecten el càncer colorectal (CCR) està lluny de ser totalment conegut. L'LOH és una de les alteracions més recurrents en CCR així com en d'altres neoplàsies. Acostuma a ser un bon indicador de la presència de gens rellevants per a la carcinogènesi. L'estudi de les alteracions somàtiques en gens situats en aquestes regions recurrents de desequilibri al·lèlic ha estat fonamental en el passat per la identificació d'alguns dels gens supressors tumorals més coneguts, com és el cas de p53, Smad4, p16, APC o Rb. Els desequilibris al·lèlics a 4p s'han associat amb una major agressivitat i un pitjor pronòstic en pacients de CCR, malgrat que els gens diana d'aquests alteracions resten encara per ser identificats. En aquesta tesi s'ha dut a terme un treball d'anàlisi genètica integral per a una regió crítica situada a 4p15 am la intenció de localitzar-hi els gens que més probablement estiguin contribuint a la progressió tumoral. Hem realitzat un exhaustiu treball d'al·lotipat mitjançant la utilització de marcadors microsatèl·lit, sobre un model de tumors xenoempeltats en ratolins atímics. Hem identificat una regió crítica en al que els gens candidats han estat analitzats d'acord a les seves possibles alteracions somàtiques genètiques i/o epigenètiques. També hem analitzat els patrons d'expressió dels gens candidats per tal d'identificar possibles alteracions transcripcionals. Mitjançant prediccions de regulació transcripcional bioinformàtiques hem trobat que PI4K2B i STIM2 són dos gens regulats per TCF4/B-catenina. Això ha estat confirmat mitjançant immunoprecipitació de cromatines. Hem avaluat el valor pronòstic de les alteracions en aquests dos gens i el seu valor com predictors de la resposta al tractament basat en el 5-FU de pacients de CCR. A més, hem realitzat experiments de depleció mitjançada per siRNA sobre línies cel·lulars de CCR, alhora que hem transfectat de forma estable aquests dos gens. Finalment hem realitzat assajos de formació de tumors en ratolins immunodeprimits per comprovar si la sobreexpressió dels nostres gens candidats té o no un efecte en la formació dels tumors generats a partir de línies cel·lulars. Els patrons de LOH identificats a 4p descarten que, com s'havia proposat, es doni en l'estadi metastàtic una acumulació d'aquestes alteracions. L'LOH detectat no correlaciona amb la dosi gènica, és a dir que les pèrdues d'heterozigositat no comporten una pèrdua de material genètic i probablement són la conseqüència de processos de recombinació mitòtica i/o pèrdua i duplicació associats a un escenari d'inestabilitat cromosòmica. Els gens d'aquesta regió crítica no són portadors de mutacions, microdelecions ni delecions en homozigosi, ni tampoc presenten alteracions en els patrons de metilació de les seves regions promotores. Per contra, vam trobar que PI4K2B i STIM2 estaven significativament sobreexpressats en pacients afectes de CCR i metàstasi hepàtiques (MH) independentment de la presència o no d'LOH, i que, a més, la seva transcripció estava sot control del complex TCF4/B-catenina. Els nivells elevats de PI4K2B, tant de proteïna com d'mRNA estan assocats a un millor pronòstic i una millor resposta al tractament quimioteràpic dels pacients de CCR. Finalment, els estudis de depleció amb siRNA han demostrat que el silenciament d'aquests dos gens comporta un increment significatiu de la proliferació cel·lular i que la sobreexpressió en línies cel·lulars de STIM2 resulta en una disminució del volum tumoral i per tant té un efecte de supressió de la proliferació. Conclusions: Hem identificat PI4K2B i STIM2 com a gens diana de les alteracions recurrents a 4p15 i hem demostrat que són dianes transcripcional de la via de B-catenina. La sobreexpressió d'aquests dos gens té un efecte supressor de la proliferació cel·lular, que alhora, té un impacte en el pronòstic i el tractament dels pacients de càncer colorectal.

El càncer de pàncreas és la quarta causa de mortalitat en el món industrialitzat. Per tant cal avançar cap a la recerca de noves aproximacions terapèutiques que ens permetin millorar aquest pronòstic. Actualment la gemcitabina és el fàrmac d'elecció, tot i que els resultats són clarament insuficients. En aquest marc s'ha desenvolupat aquest treball amb l'objectiu de millorar els efectes de la gemcitabina emprant estratègies de teràpia gènica en models in vitro i in vivo de càncer de pàncreas humà.La primera aproximació ha consistit en la reintroducció dels transportadors de nucleòsids hCNT1 i hENT1 mitjançant vectors adenovirals defectius. Els resultats obtinguts ha posat de manifest que la sobrexpressió del transportador de nucleòsids equilibratiu hENT1 mitjançada per adenovirus permet assolir un augment significatiu del transport sensible a NBTI en línies cel·lulars amb un transport basal baix, alhora que indueix un arrest a la fase G2 del cicle cel·lular i redueix l'expressió d'enzims implicats en el metabolisme dels àcids nuclèics. Per altra banda, la combinació terapèutica de la introducció del transportador hENT1 i el fàrmac gemcitabina indueix, sorprenentment, quimioresistència en un model in vitro. Tanmateix, la transferència del transportador in vivo combinada amb el fàrmac afavoreix la inhibició del creixement tumoral. La introducció per infecció adenoviral del transportador hCNT1 provoca un augment del transport sodi-dependent i indueix un arrest a la fase S del cicle cel·lular en cèl·lules tumorals. La sobrexpressió de hCNT1 indueix mort cel·lular per necrosi i inhibeix eficientment el creixement de tumors al teixit subcutani de ratolins atímics. Al mateix temps, la combinació terapèutica amb la gemcitabina provoca una major inhibició del creixement tumoral.La segona aproximació s'ha basat en la determinació de la implicació de la comunicació intercel·lular en els efectes citotòxics de la gemcitabina. Així com, la modulació d'aquesta citotoxicitat per sobrexpressió de connexina 26 tant in vitro com in vivo. Els resultats obtinguts han mostrat que els nivells de comunicació intercel·lular mitjançats per unions gap determinen l'eficàcia citotòxica de la gemcitabina. Aquesta correlació posa de manifest que la resposta citotòxica a aquest fàrmac pot amplificar-se per efecte adjacent. L'augment de comunicació cel·lular per sobrexpressió de connexina 26 corrobora l'existència d'efecte adjacent in vitro i millora la resposta antitumoral in vivo.En la tercera aproximació hem unit la teràpia gènica amb p53 amb la replicació viral en el que s'anomena viroteràpia gènica amb la finalitat de potenciar els resultats previs descrits amb aquestes dues estratègies per separat. Per això, s'han generat adenovirus replicatius armats amb el transgèn de p53 i tatp53 sota el control del promotor de fase tardana (MLP) del virus i s'han caracteritzat els seus efectes en models in vitro i in vivo de càncer de pàncreas humà. El conjunt de resultats ha posat de manifest que l'expressió de p53 en la fase tardana de la replicació adenoviral millora l'acció antitumoral de l'adenovirus quan aquest és injectat intratumoralment.En l'últim bloc s'ha dut a terme l'establiment i estandarització de xenoimplants ortotòpics a partir de tumors subcutanis de cèl·lules tumorals i de nous models ortotòpics procedents directament de fragments quirúrgics d'adenocarcinomes pancreàtics humans amb la finalitat de poder validar diferents combinacions terapèutiques. L'estandarització i caracterització d'aquests models ortotòpics ha evidenciat que les característiques histològiques i genètiques, així com el patró de disseminació metastàtica dels tumors d'origen es mantenen estables al llarg de, com a mínim, 3 generacions. / Pancreatic cancer is the fourth leading cause of mortality in the industrialized world. Therefore, the research of new therapeutic approaches is essential to improve this negative prognosis. Nowadays, gemcitabine is the standard first line treatment drug, even though results are clearly insufficient. In this framework, the aim of this work has been to improve the effects of gemcitabine by means of gene therapy strategies in in vitro and in vivo models of human pancreatic cancer.The first approach consists of overexpressing nucleoside transporters hCNT1 and hENT1 through defective adenoviral vectors. Overexpression of hENT1 allows a moderate increase on nucleoside transport activity NBTI-sensitive and is associated with cell cycle arrest. Furthermore, therapeutic combination of hENT1 introduction and gemcitabine enhances the inhibition of tumour growth. Introduction of hCNT1 provokes an increase in sodium-dependent transport activity and induces an S-phase cell cycle arrest. hCNT1 overexpression induces necrosis and efficiently inhibit tumour growth. Besides, combination of hCNT1 with gemcitabine enhances the inhibition of tumour growth.The second approach is based on the analysis of intercellular comunication involvement on gemcitabine cytotoxicity and the modulation by connexin 26 overexpression. Results show that gap junctions determine gemcitabine cytotoxicity. This correlation reveals that cytotoxic response to this drug could be magnified by bystander effect. The increase in cellular comunication by connexin 26 overexpression confirms the existence of bystander effect in vitro and improves antitumoral response in vivo.In the third approach, p53 gene therapy and viral replication have been joined to perform gene virotherapy. Replicative adenoviruses armed with p53 or tatp53 under the adenoviral major late promoter (MLP) control have been generated. Their effects have been characterized in vitro and in vivo. The results show that later p53 expression in replicative adenovirus improves antitumoral action of adenovirus when is intratumourally injected.The last point consists of the establishment and characterization of orthotopic xenografts developed from tumour cells and new orthotopic models obtained directly from surgical human pancreatic adenocarcinoma fragments. These orthotopic models retain histologic and genetic characteristics. Dissemination patterns are stable for at least three generations as well.