Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3244.pdf: 1568153 bytes, checksum: ace013c6a0af80e75388b3ba5b97e8cf (MD5) Previous issue date: 2010-03-22 / The Brazilian tropical savannah occupies a large area in Brazil and includes a high variety of plant species. This diversity is an important source of endophytic microorganisms consisting mainly of bacteria and fungi that inhabit the interior of plants. Endophytes can produce bioactive metabolites that exhibit activities of biotechnological interest, such as antibacterial and antifungal action. The aim of this study was to isolate from Butia capitata var capitata (Coquinho-do-cerrado), Solanum lycocarpum (Lobeira), Stryphnodendron polyphyllu (Barbatimão), Miconia albicans (Quaresmeira-white) and Aegiphila lhotzliana (Tamanqueira), collected on Brazilian tropical savannah at São Carlos, SP, endophytic microorganisms with suggestive features of the genus Streptomyces. The samples were characterized through macroscopic, physiological, biochemical and morph-dying characteristics. The antagonistic potential was tested against Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Serratia marcensis ITB 1475, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Shigella sonnei ATCC 10231 and Candida albicans ATCC 10231. 26 samples of endophytic microorganisms were isolated and selected two, one from Butia capitata var capitata and another one from Miconia albicans. Both presented microbiological characteristics of Streptomyces. The microorganism isolated from Butia inhibited the growth of Staphylococcus aureus (13 mm) and Enterococcus faecalis (11 mm), and the one isolated from Miconia did not show bioactivity against the pathogens tested. / O Cerrado ocupa uma extensa área geográfica no Brasil comportando uma variedade de espécies de plantas. Essa diversidade é uma potencial fonte de microrganismos endofíticos constituídos principalmente por bactérias e fungos que habitam o interior das plantas. Os endofiticos podem produzir metabólitos secundários bioativos de interesse biotecnológico, como ação antibacteriana e antifúngica. Esse trabalho objetivou isolar das folhas das plantas Butia capitata var. capitata (Coquinhodo- cerrado), Solanum lycocarpum (Lobeira), Stryphnodendron polyphyllu (Barbatimão), Miconia albicans (Quaresmeira-branca) e Aegiphila lhotzliana (Tamanqueira), coletadas no cerrado de São Carlos, SP, microrganismos endofíticos produtores de substâncias bioativas com características sugestivas do gênero Streptomyces. As amostras foram identificadas através de características macroscópicas, fisiológicas, bioquímicas e morfo-tintoriais. O potencial antagônico foi testado contra Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Serratia marcensis IAL 1475, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Shigella sonnei ATCC 10231 e Candida albicans ATCC 10231. Vinte e seis amostras de endofíticos foram isoladas e duas selecionadas, provenientes de Butia capitata var capitata e de Miconia albicans. Ambas apresentaram características de Streptomyces. O endofítico isolado de Butia inibiu o crescimento de Staphylococcus aureus (13 mm) e de Enterococcus faecalis (11 mm), e o isolado de Miconia não apresentou bioatividade contra os microrganismos testados.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3884.pdf: 2350844 bytes, checksum: 87de3b488205648abd5593cffa8efec1 (MD5) Previous issue date: 2011-03-14 / Financiadora de Estudos e Projetos / Prospecting for cellulose-producing fungi is one of the possible strategies for obtaining the necessary enzymes to hydrolyze the lignocellulosic material and to contribute to the viability of cellulosic ethanol production. Among the different biomes, the Amazon represents a potential source of cellulolytic fungi due to its unique soil and climatic conditions that favor the continued degradation of the biomass of the forest undergrowth. In this context, the objective of this study was the isolation and selection of fungi producing complex cellulase present in the Amazon biome with high efficiency through the process of solid-state fermentation (SSF) of 100 soil samples collected at 50 different points of Reserve Embrapa Eastern Amazon, in Belém - PA. After isolation of fungi, a total of 110, they were transferred to plates containing crystalline cellulose (Avicel) as sole carbon source for selection. Of these 110, 10 fungi were selected that showed the highest growth. The selected strains were grown at 35 ° C for 120 hours in SSF, using as a substrate for a first selection of strains producing endoglucanases, wheat bran with 60 % humidity. The two fungi had higher enzyme production in wheat bran, Aspergillus fumigatus (P40M2) and Aspergillus niger (P47C3) were evaluated in several other substrates, with different percentage of humidity. In these other substrates, has also evaluated the production of endoglucanases, Fpase, xylanase and β- glucosidase.The fungus Aspergillus fumigatus P40M2 showed, in general, the best production of these enzymes. So, finally, the enzymes produced by Aspergillus fumigatus P40M2 were characterized optimum pH, optimum temperature and thermal stability, and their bands of activities identified by electrophoresis (zymograms). The extract obtained by the fungus is characteristic thermophilic and acidophilic being very important for hydrolysis of biomass to ethanol production. / A prospecção de fungos produtores de celulases é uma das possíveis estratégias para a obtenção das enzimas necessárias para hidrolisar o material lignocelulósico e com isso contribuir para a viabilização da produção de etanol celulósico. Dentre os diferentes biomas do país, o Amazônico representa uma fonte em potencial de fungos celulolíticos devido as suas condições edafoclimáticas peculiares que propiciam a constante degradação da biomassa rasteira da floresta. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi realizar o isolamento e a seleção de fungos produtores do complexo de celulases presentes no Bioma Amazônico com alta eficiência por meio do processo de fermentação em estado sólido (FES) de 100 amostras de solo coletados em 50 pontos diferentes da Reserva Embrapa Amazônia Oriental, na cidade de Belém PA. Após o isolamento dos fungos, um total de 110, eles foram transferidos para placas contendo celulose cristalina (Avicel) como única fonte de carbono para avaliação e seleção quanto a sua produção de celulase. Desses 110, foram selecionados os 10 fungos que apresentaram maior crescimento. As linhagens selecionadas foram cultivadas a 35°C, por 120 horas em FES, utilizando como substrato, para uma primeira seleção de linhagens produtoras de endoglucanases, o farelo de trigo com 60 % de umidade. Os dois fungos que obtiveram maior produção enzimática no farelo de trigo, o Aspergillus fumigatus P40M2 e o Aspergillus niger P47C3, foram avaliados em diversos outros substratos, com diferentes percentuais de umidade. Nestes outros substratos, além da avaliação quanto a produção de endoglucanases, essas linhagens também foram avaliadas quanto a produção de xilanase, FPase e β- glicosidase. Dessas duas linhagens, o Aspergillus fumigatus P40M2 foi o que apresentou, de maneira geral, a melhor produção dessas enzimas. Assim, por fim, as enzimas produzidas pelo Aspergillus fumigatus P40M2 foram caracterizadas quanto ao pH ótimo, temperatura ótima e estabilidade térmica, e suas bandas de atividades identificadas por eletroforese (zimograma).O extrato obtido pelo fungo apresentou características termofílicas e acidofílicas sendo muito importantes para hidrólise da biomassa visando a produção de etanol.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4583.pdf: 2193987 bytes, checksum: a9b3822b8425223d19c05e613a4895db (MD5) Previous issue date: 2012-05-29 / The biological contamination causes a great depth of concern in the polymers industry, whose materials are used for food packaging. Most of the bacteria are associated to a biofilm; complex microbial ecosystem, well structured; thus, it is essential to search for alternatives which can provide the reduction of biofilm accumulation on the surface. One of the alternatives is the usage of nanomaterial for such control. One example of such material is the silver nanoparticle. The human activities produce a lot of residue which have hard decomposition. Research and production with biodegradable plastic open space to a new market by being driven to ecological awareness. One example of such plastic is Poli (lactic acid) (PLA). The aim of such research was to evaluate the anti-bacterial, biodegradable and inhibitory action in the shaping of biofilms on the modified PLA with silver nanoparticle in concentrations of 0,3, 0,5, 1,0 and 1,5 %. Standard strain Staphylococcus aureus and Escherichia coli were used for the antibacterial activity evaluation, through the Japanese regulation JIS Z 2801:2000. For the biofilm inhibition evaluation, the samples were incubated with biofilm forming strains from S. aureus, E. coli and Pseudomonas aeruginosa in a constant shaking and evaluated in 1, 3 and 7 days. The samples were buried with a humidity air system for observation of natural degradation in organic soil, in favor of its bacterial growing for 328 days. The results show that the silver antibacterial action was around 70% for E. coli and a small inhibition of biofilm was observed on the third day for E. coli and P. aeruginosa. The PLA natural biodegradation was stable for the mass loss as well as he significantly loss of molar mass. The analysis of the compound presented good distribution and bad dispersion, which could have influenced on the antibacterial activity. New process methods for the nanoparticle incorporation must be carried out for better dispersion and availability of PLA silver surface. / A contaminação biológica causa grande preocupação na indústria de polímeros, cujos materiais são usados para embalagens de alimentos. A maior parte das bactérias se encontra associadas a um biofilme; complexo ecossistema microbiano, bem estruturado; sendo assim, é essencial buscar alternativas que proporcionem a redução do acúmulo de biofilme nas superfícies. Uma das alternativas é o uso de nanomateriais para tal controle. Um exemplo deste material é a nanopartícula de prata. As atividades humanas produzem muito resíduos de difícil decomposição. Impulsionada pela consciência ecológica, as pesquisas e produção com plásticos biodegradáveis ganham espaço. Exemplo de tal plástico é o Poli (ácido lático) (PLA). O objetivo desta pesquisa foi avaliar a ação antibacteriana, biodegradante e a inibitória na formação dos biofilmes sobre o PLA modificado com nanopartícula de prata nas concentrações de 0,3, 0,5, 1,0 e 1,5 %. Foram utilizadas cepas padrão de Staphylococcus aureus e Escherichia coli para a avaliação da atividade antibacteriana, através da norma japonesa JIS Z 2801:2000. Para a avaliação da inibição do biofilme as amostras foram incubadas com cepas formadoras de biofilme de S. aureus, E. coli e Pseudomonas aeruginosa em constante agitação e avaliadas em 1, 3 e 7 dias. Para a observação da degradação natural em solo orgânico as amostras foram enterradas com um sistema de ar e umidade, favorável ao crescimento bacteriano por 328 dias. Os resultados mostraram que a ação antibacteriana da prata foi de aproximadamente 70 % para E. coli e uma pequena inibição do biofilme foi observada no terceiro dia para E. coli e P. aeruginosa. A biodegradação natural do PLA foi estável para a perda de massa e foi observada redução significativa de massa molar. A análise do composto apresentou boa distribuição e má dispersão, que pode ter influenciado na atividade antibacteriana. Novos métodos de processamento para a incorporação das nanopartículas devem ser realizados para melhor dispersão e disponibilidade da prata na superfície do PLA.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 697140 bytes, checksum: a673ff7affad18149751f45b84127b29 (MD5) Previous issue date: 2009-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This work is a contribution to the studies about the role of KlRox1p in fermentative metabolism of Kluyveromyces lactis. Rox1p is known in Saccharomyces cerevisiae by repressing in aerobic conditions genes that are expressed when oxygen is limited. The kinetics growth of lineages of Kluyveromyces lactis MW270-7B and its derivative mutant K. lactis MW270- 7B rox1Δ was carry out on YNB media (Yeast Nitrogen Base) containing fermentative carbon sources (glucose and lactose) or non fermentative carbon sources (glycerol and ethanol) to determine the growth profile on this sources. Besides both yeasts had its fermentative capacity researched in the presence of an inhibitor of electron chain carrier, antimicin A on YPD (yeast extract, peptone and glucose). The results indicated that the absence of KlROX1 didn't favor the growth in fermentative carbon sources, but it favored in non fermentative carbon sources. The more fermentative capacity of K. lactis rox1Δ was confirmed for the higher ethanol yield for biomass detected in the absence and presence of antimicin A (10 and 20 µM). The lineages rox1 mutant and control were also cultivated on YNB plus glucose under aerobic continuous culture (D = 0,01 h-1) and later they were submitted to a hypoxic condition for 9 hours. Samples were collected every 3 hours for analysis of the expression of putative target genes of KlRox1p as well as analysis of ethanol and of the enzymatic activity of the alcohol desidrogenase (ADH). For the analysis of gene expression, recognition sequences for KlRox1p were researched in silico in the promoters of the genes KlAAC3, KlCOX5B, KlHEM13, KlHAP1, KlRAG1 and KlADH1 and they were found diverging of two nucleotide of the consensus sequence YYYATTGTTCTC. KlRox1p showed to have negative effect on expression of KlAAC3 and KlHEM13, but it didn't seem to act on KlCOX5B. The ethanol concentration, the activity of ADH and the expression of KlADH1 evidenced the metabolism more fermentative of K. lactis rox1Δ on aerobic and hypoxic conditions. And in a way not known, KlRox1p acts on expression of KlHAP1 and KlRAG1. The influence of KlRox1p on expression of KlADH1, KlRAG1 and KlHAP1 suggests the participation of KlRox1p in the control of key points of the fermentative metabolism: entrance of the glucose that determine the flow for the maintenance of fermentative way, as well as in the reductive reaction end that culminates with the ethanol production. The existence of genes that showed to be regulated negatively by KlRox1p in aerobic condition, like KlAAC3 and KlHEM13, indicates the existence in K. lactis of mechanism of transcriptional regulation for oxygen that intends to better use the oxygen in a limit condition, similar to the function of Rox1p in Saccharomyces cerevisiae. However that mechanism seems not just to be related with the concentrations of oxygen, but also with the carbon sources used, fermentative sources or non fermentative sources. / Esse trabalho é uma contribuição aos estudos sobre a função de KlRox1p no metabolismo fermentativo de Kluyveromyces lactis. Rox1p é conhecida em Saccharomyces cerevisiae por reprimir, em aerobiose, genes que são expressos em condição limitante de oxigênio. A cinética de crescimento de linhagens de Kluyveromyces lactis MW270-7B e sua mutante derivativa K. lactis MW270-7B rox1Δ foi realizada em meio YNB (Yeast Nitrogen Base) contendo fontes de carbono fermentáveis (glicose e lactose) ou não fermentáveis (glicerol e etanol) para determinar o perfil de crescimento nessas fontes. Além disso, ambas as linhagens tiveram sua capacidade fermentativa avaliada na presença de um inibidor da cadeia transportadora de elétrons, antimicina A, em meio YPD (extrato de levedura, peptona e glicose). Os resultados indicaram que a ausência de KlROX1 não favoreceu o crescimento em fontes de carbono fermentáveis, mas favoreceu em fontes de carbono não fermentáveis. A maior capacidade fermentativa de K. lactis rox1Δ foi confirmada pelo maior rendimento de etanol por biomassa detectada, na ausência e presença de antimicina A (10 e 20 µM). As linhagens mutante rox1 e controle também foram cultivadas em YNB e glicose em regime contínuo (D= 0,1h-1) sob aerobiose e, em seguida, submetidas à hipoxia por 9 horas. Amostras foram coletadas a cada 3 horas para análise da expressão de possíveis genes alvos de KlRox1p, bem como de etanol e da atividade da álcool desidrogenase (ADH). Para análise da expressão gênica, sequências de reconhecimento por KlRox1p foram pesquisadas in silico nos promotores dos genes KlAAC3, KlCOX5B, KlHEM13, KlHAP1, KlRAG1 e KlADH1 e foram encontradas divergindo de dois nucleotídeos da sequência consenso YYYATTGTTCTC. KlRox1p mostrou ter efeito negativo sobre as expressões de KlAAC3 e KlHEM13 em aerobiose, mas não pareceu atuar sobre KlCOX5B. A concentração de etanol, a atividade da ADH e a expressão de KlADH1 evidenciaram o metabolismo mais fermentativo de K. lactis rox1Δ tanto em aerobiose quanto em hipoxia. E, por um mecanismo ainda desconhecido, KlRox1p atuou sobre as expressões de KlHAP1 e KlRAG1. A influência de KlRox1p na expressão de KlADH1, KlRAG1 e KlHAP1, sugere a participação de KlRox1p no controle de pontos chaves do metabolismo fermentativo: entrada da glicose, que determina o fluxo para a manutenção de uma via fermentativa, bem como na reação redutiva final, que culmina com a formação de etanol. A existência de genes que mostraram ser regulados negativamente por KlRox1p em aerobiose, como KlAAC3 e KlHEM13, indica a existência em K. lactis de mecanismo de regulação transcricional por oxigênio que visa melhor utilizar o oxigênio numa condição limitante, semelhante à função de Rox1p em Saccharomyces cerevisiae. Esse mecanismo, entretanto, parece não estar relacionado apenas com as concentrações de oxigênio, mas também com metabolismo de carbono fermentável ou não fermentável.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01 - capa_abstract.pdf: 49767 bytes, checksum: e5dea3c6edf2dcdc8b5959cced3a994d (MD5) Previous issue date: 2009-02-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Mastitis is considered the main disease of dairy cows and the major cause of economic losses in dairy farms around the world. In this study, the susceptibility to nisin of different bacterial isolates that cause mastitis in cattle was determined in vitro. Furthermore, the prevalence of nisin resistance among Staphylococcus aureus isolates was analyzed and changes in the cell surface contributing to the bacteriocin resistance phenotype was characterized. Determination of minimum inhibitory concentration (MIC) to nisin indicated that most of the 250 isolates tested (87.6%), originated from cattle affected by clinic and subclinic mastitis, were susceptible to bacteriocin concentrations ranging from 3.195 &#956;mol L-1 to 100 &#956;mol L-1. Selected isolates of S. aureus that showed initial MIC values of 12.5 &#956;mol L-1 (n=7) and 50 &#956;mol L-1 (n=1), acquired resistance to nisin when grown in the presence of sublethal doses of the bacteriocin. Resistant isolates showed MIC 100 &#956;mol L-1, and maintained their phenotype even after being cultivated for approximately 120 generations in culture media without nisin. Optical microscopy images indicated that nisin induced disaggregation of the typical arrangement of S. aureus cells. Atomic force microscopy images of S. aureus showed that the surface of sensitive cells had many irregulars regions, probably caused by the extrusion of the cytoplasm. On the surface of resistant cells, no significant changes could be observed in the cell envelope. However, signs similar to scars were seen, which could have been the result of alterations in the cell envelope related to the nisin resistance phenotype. Analyses of the fatty acids profile in the cell membrane of S. aureus did not show significant differences between isolates that were nisin- sensitive and nisin-resistant. However, cultures of nisin- sensitive and nisin-resistant S. aureus showed differences (P< 0.05) in hydrophobicity and net charge of the cell membrane, indicating that the resistance phenotype is influenced by several cell wall properties. / A mastite é considerada a principal doença das vacas leiteiras, e é responsável pela maioria das perdas econômicas na pecuária de leite no mundo todo. Nesse trabalho foi determinado in vitro o perfil de sensibilidade à nisina para diferentes espécies de bactérias causadoras de mastite em bovinos. Além disso, foi analisada a ocorrência de resistência à nisina em isolados de Staphylococcus aureus e caracterizadas as alterações nas propriedades de superfície celular que contribuíram para o fenótipo de resistência à bacteriocina. A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) de nisina indicou que a maioria (87,6%) dos 250 isolados testados, originados de bovinos acometidos por mastite clínica e sub-clínica, foram sensíveis à bacteriocina dentro da faixa de concentração de 3,195 &#956;mol L-1 e 100 &#956;mol L-1. Isolados selecionados de S. aureus que apresentavam CIM inicial de 12,5 &#956;mol L-1 (n=7) e 50 &#956;mol L- 1 (n=1), adquiriram resistência à nisina quando cultivados na presença de doses sub-letais da bacteriocina. Os isolados resistentes apresentaram CIM 100 &#956;mol L-1, e mantiveram o fenótipo de resistência mesmo quando transferidos por, aproximadamente, 120 gerações em meio de cultivo sem adição de nisina. Imagens de microscopia óptica indicaram que a nisina induziu a desagregação do arranjo típico de S. aureus. Imagens de S. aureus obtidas por microscopia de força atômica mostraram que a superfície das células sensíveis apresentou várias regiões irregulares, provavelmente decorrentes da extrusão de conteúdo citoplasmático. Na superfície das células resistentes não foram observadas deformações do envelope celular. Entretanto, observaram-se marcas semelhantes a cicatrizes que podem ter sido resultantes de alterações no envelope celular relacionadas à maior resistência à nisina. A análise do perfil de ácidos graxos de membrana de S. aureus não evidenciou diferenças significativas entre os isolados sensíveis e os resistentes à nisina. No entanto, as culturas de S. aureus sensíveis e resistentes à nisina apresentaram diferenças (P < 0,05) de hidrofobicidade e carga líquida de membrana, indicando que o fenótipo de resistência é influenciado pelas propriedades do envelope celular.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 537740 bytes, checksum: d3b38c2f699b649bb58cfb43a1c86f40 (MD5) Previous issue date: 2009-01-16 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The objectives of this research had been to compare the conventional method of detention of Salmonella sp., Listeria monocytogenes and Listeria sp. with fast methods for analysis of artisanal Minas cheese and to verify the survival of Listeria innocua to the maturation. Moreover, it was objectified to evaluate the product in relation to the counting of lactic bacteria, the contamination by bacterias from the coliform group and to determine physical and physical-chemistries characteristics. Forty eight sample units of artisanal Minas cheese had been collected of the region of Serro-MG, amongst these: 12 proceeding ones from six producers whose properties were registered in Instituto Mineiro de Agropecuária-IMA, that had been matured under refrigeration in the original packing to the vacuum and evaluated with 37 and 69 days; 20 proceeding from two properties not registered in IMA and 16 proceeding ones from a registered property, that had been matured at ambient temperature and analyzed before and after 60 days. Raw milk artificially contaminated with L. innocua, in the concentration of 10 UFC/mL, was used for the manufacture of 15 sample units of artisanal Minas cheese. The survival of this bacteria during the maturation for 5, 15, 30, 45 and 60 days was verified. The sample units artificially contaminated or not (n = 63) had been analyzed by the conventional method, immunoanalytical VIDAS®-SLM and molecular PCR-BAX® in relation to the presence of Salmonella sp. Sample units not contaminated (n = 48) had been evaluated by the conventional method and immunoanalytical VIDAS®-LMO in relation to the presence of L. monocytogenes, while sample units artificially contaminated (n = 15) had been analyzed by the conventional method and immunoanalytical Lateral Flow SystemTM in relation to the presence of Listeria sp. The performance of the fast methods was determined based on the Kappa agreement index and in the values of sensitivity, specificity, accuracy, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV). The results of lactic microbiota, total and thermotolerant coliform population and physical and physical-chemistries analyses of the 63 sample units had been submitted to the analysis of variance or linear regression with 5 % of significance. It was not evidenced Salmonella sp. by the conventional method and the method of PCR-BAX®, but it was verified in 3,17 % of the sample units evaluated by VIDAS®-SLM. The Kappa agreement index zero and the sensitivity were not determined, the specificity and accuracy of 96,83 %, the PPV of 0 % and NPV equal 100 % when comparing VIDAS®-SLM method with the conventional method. The presence of L. monocytogenes was not detected by the evaluated methods. L. innocua was detected in 13 of the 15 sample units analyzed in the evaluated times of maturation. The Lateral Flow SystemTM method presented Kappa of 0,30, sensitivity of 61,54 %, specificity of 100 %, accuracy of 66,67 %, PPV of 100 % and NPV of 28.57 % compared with the conventional method. Reduction of the population of total and thermotolerant coliforms was observed at acceptable values for the legislation and average reduction of 2 cycles log in the counting of lactic bacteria to the end of 60 days of maturation under ambient temperature. The physical and physical-chemistries characteristics of matured cheeses in vacuum packages and under refrigeration, in general, had been kept what it was not observed in the matured cheeses out of the packages and to the ambient temperature. The PCR-BAX® method for the research of Salmonella sp. e VIDAS®-LMO for the research of L. monocytogenes had presented similar results to the presented ones for the conventional methodology. Salmonella sp. e L. monocytogenes had not been recovered in the sample units evaluated. The minimum period of maturation of 60 days for the artisanal Minas cheese, demanded for State Law 14,185, was not enough to guarantee microbiological security when cheeses had been produced with raw milk artificially contaminated with L. innocua. / Os objetivos desta pesquisa foram comparar o método convencional de detecção de Salmonella sp., Listeria monocytogenes e Listeria sp. com métodos rápidos para análise de queijo Minas artesanal e verificar a sobrevivência de Listeria innocua à maturação. Além disso, objetivou-se avaliar o produto quanto à contagem de bactérias láticas, a contaminação por bactérias do grupo coliformes e determinar características físicas e físico-químicas. Foram coletadas 48 unidades amostrais de queijo Minas artesanal da região do Serro-M.G., dentre estas: 12 provenientes de seis produtores cujas propriedades eram cadastradas no Instituto Mineiro de Agropecuária - IMA, que foram maturadas sob refrigeração na embalagem original à vácuo e avaliadas com 37 dias e 69 dias; 20 provenientes de duas propriedades não cadastradas no IMA e 16 provenientes de uma propriedade cadastrada, que foram maturadas à temperatura ambiente e analisadas antes e após 60 dias. Leite cru artificialmente contaminado com L. innocua, na concentração de 10 UFC/mL, foi utilizado para a fabricação de 15 unidades amostrais de queijo Minas artesanal. A sobrevivência dessa bactéria durante a maturação por 5, 15, 30, 45 e 60 dias foi verificada. As unidades amostrais artificialmente contaminadas ou não (n = 63) foram analisadas pelo método convencional, imunoanalítico VIDAS®-SLM e molecular PCR-BAX® quanto à presença de Salmonella sp. Unidades amostrais não contaminadas (n = 48) foram avaliadas pelo método convencional e imunoanalítico VIDAS®-LMO quanto à presença de L. monocytogenes, enquanto unidades amostrais artificialmente contaminadas (n = 15) foram analisadas pelo método convencional e imunoanalítco Lateral Flow SystemTM quanto à presença de Listeria sp. O desempenho dos métodos rápidos foi determinado com base no índice de concordância kappa e nos valores de sensibilidade, especificidade, acurácia, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN). Os resultados da microbiota lática, população de coliformes totais e termotolerantes e análises físicas e físico-químicas das 63 unidades amostrais foram submetidos à análise de variância ou regressão linear com 5 % de significância. Salmonella sp. não foi constatada pelo método convencional e pelo método de PCRBAX ®, mas foi verificada em 3,17 % das unidades amostrais avaliadas pelo VIDAS®- SLM. O coeficiente de concordância kappa e a sensibilidade não foram determinados, a especificidade e acurácia de 96,83 %, o VPP de 0 % e o VPN igual a 100 % ao comparar o método VIDAS®-SLM com o método convencional. A presença de L. monocytogenes não foi detectada pelos métodos avaliados. L. innocua foi detectada em 13 das 15 unidades amostrais analisadas nos tempos de maturação avaliados. O método Lateral Flow SystemTM apresentou kappa de 0,30, sensibilidade de 61,54 %, especificidade de 100 %, acurácia de 66,67 %, VPP de 100 % e VPN igual a 28,57 % comparado ao método convencional. Observou-se redução da população de coliformes totais e termotolerantes a valores aceitáveis pela legislação e redução média de 2 ciclos log na contagem de bactérias láticas ao final de 60 dias de maturação sob temperatura ambiente. As características físicas e físico- químicas de queijos maturados em embalagens à vácuo e sob refrigeração, em geral, foram mantidas o que não foi observado nos queijos maturados fora da embalagem e à temperatura ambiente. O método de PCR-BAX® para a pesquisa de Salmonella sp. e VIDAS®-LMO para a pesquisa de L. monocytogenes apresentaram resultados semelhantes aos apresentados pela metodologia convencional. Salmonella sp. e L. monocytogenes não foram recuperados nas unidades amostrais avaliadas. O período de maturação mínimo de 60 dias para maturação do queijo Minas artesanal, exigido pela Lei Estadual 14.185, não foi suficiente para garantir segurança microbiológica quando queijos foram produzidos com leite cru artificialmente contaminado com L. innocua.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 243475 bytes, checksum: 08375cc332ea6491435cc3b67f4a34e9 (MD5) Previous issue date: 2010-03-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Programs of control and management of the quality in laboratories, the necessity of standardization of the analysis methods and repeatability of the experimental data have stimulated the increase of the use of Reference Material (RM) in the microbiological analyses. Considering that the stages of preparation and storage of the MR are stress processes that causes to injuries to the microorganism test the preparation of the cells becomes necessary to tolerate the variation of temperature and humidity the one that is submitted during the frezze- drying and storage. It was objectified, in this work, to get resistant cells of Salmonella enterica the frezze-drying for the RM preparation and to evaluate the stability of these cells throughout the stockage. The growth of enteric Salmonella sorotipo Enteritidis PT4 578 was folloied in broth brain heart infusion (BHI) and mineral salts medium (MMS) increased of 0,5 M sodium chloride (NaCl), 3 mM of trehalose e, or 0,05 mM of glucose. The survival after the frezze-drying was determined by the counting of the number of form units of colonies (UFC.g-1). The effect of the thermal shock in the cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 was evaluated the 50 °C in the increase of the resistance to the frezze- drying. Also the influence of substrata of dehydration in the resistance of cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 and the stability of the RM was evaluated during 90 days of stockage in the 4 °C the - 20 °C. The way of culture that guaranteed the biggest survival of the cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 to the frezze-drying was the MMS, added of the evaluated solutos indicating it nutricional stress confers resistance crossed to the frezze-drying. The thermal shock diminishes the cellular viability, after the frezze-drying. The addition of 100 mM of trealose e, or sacarose to skimmed milk reconstituted (LDR) the 10%, increased the stability of the cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 in the storaged MR the 4 °C and - 20 °C. The temperature of stockage of 4 °C resulted in loss of the cellular viability in about 2 logarithmic cycles after 90 days stockage while the -20 °C the loss in the cellular viability was ten times lesser. The results detach that, for the attainment of MR with bigger stability, it has the necessity of the preparation of the cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 to present greater resistance the frezze-drying, considering conditions of nutricional stress and osmotic during the culture and the inclusion of osmoprotectant in the dehydration substratum. / Programas de controle e gestão da qualidade em laboratórios, a necessidade de padronização dos métodos de análise e repetibilidade dos dados experimentais têm impulsionado o aumento da utilização de Material de Referência (MR) nas análises microbiológicas. Considerando que as etapas de preparo e armazenamento do MR são processos estressantes que ocasionam injúrias ao micro-organismo teste faz-se necessário a preparação das células para tolerar a variação de temperatura e umidade a que são submetidas durante a liofilização e o armazenamento. Objetivouse, neste trabalho, obter células de Salmonella enterica resistentes a liofilização para o preparo de MR e avaliar a estabilidade destas células ao longo da estocagem. O crescimento de Salmonella enterica sorotipo Enteritidis PT4 578 foi acompanhado em caldo infusão cérebro coração (BHI) e meio mínimo de sais (MMS) acrescido dos solutos 0,5 M de cloreto de sódio (NaCl), 3 mM de trealose e, ou 0,05 mM de glicose. A sobrevivência após a liofilização foi determinada pela contagem do número de unidades formadoras de colônias (UFC.g-1). Avaliou-se o efeito do choque térmico nas células de Salmonella Enteritidis PT4 578 a 50 °C por 30 min no aumento da resistência à liofilização. Foi também avaliada a influência dos substratos de desidratação na resistência de células de Salmonella Enteritidis PT4 578 e a estabilidade do MR preparado durante 90 dias de estocagem a -20 °C e 4 °C. O meio de cultivo que garantiu a maior sobrevivência das células de Salmonella Enteritidis PT4 578 à liofilização foi o MMS, adicionado de NaCl, trealose e sacarose indicando que o estresse nutricional confere resistência cruzada à liofilização. O choque térmico diminui a viabilidade celular, após a liofilização. A adição de 100 mM de trealose e, ou sacarose ao leite desnatado reconstituído (LDR 10 %) como substrato de desidratação, aumentou a estabilidade das células de Salmonella Enteritidis PT4 578 no MR estocado a 4 °C e - 20 °C. A temperatura de estocagem de 4 °C resultou em perda da viabilidade celular em cerca de 2 ciclos logarítmicos após 90 dias de estocagem enquanto a -20 °C não houve perda na viabilidade celular significativa. Os resultados indicam que, para a obtenção de MR com maior estabilidade, há a necessidade do preparo da células de Salmonella Enteritidis PT4 578 para apresentar maior resistência a liofilização, submetendo estas células a condições de estresses nutricional e osmótico durante o cultivo e a inclusão de osmoprotetores (trealose ou sacarose) no substrato de desidratação.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3209236 bytes, checksum: 730f245d59f62f2daccf53d9d6fb9b93 (MD5) Previous issue date: 2010-07-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Lactic acid bacteria (LAB) can be infected and lysed by an extensive range of bacteriophages, which is recognized as the main cause of failure or slow fermentation in the modern dairy industry. Contaminated fermentation processes affect product quality or even cause its complete loss. Although technological advances have reduced the incidence of these infections, they certainly do not eliminated it. The objective of this work was the isolation, identification and molecular characterization of lytic bacteriophages of Lactococcus lactis from sera from lactic fermentation. For this, serum samples were collected from three different dairies facilities. From one of them, were isolated 17 bacteriophages, which were propagated in L. lactis grown in GM17 medium and molecularly characterized using the techniques of multiplex PCR, DNA restriction profile, protein profile, transmission electron microscopy, cloning and sequencing. The extraction of the genome of bacteriophages isolated and its analysis revealed a strand of DNA of 48 kb for phage LIMG1 and 42 kb for phage LIMG4, while phage protein profile allowed the distinction of four groups, and the differentiation between them was consistent with the sample from which they were isolated. The PCR, coupled to microscopic analysis, confirmed the presence of members of the group 936-type phages, Siphoviridae family, the most abundant in dairy products worldwide. Phages contain isometric heads with 50 nm in diameter and a 180 nm long tail, without basal plate. The amplified sequence of isolate LIMG1 revealed high identity with other members of 936-type phages, although two punctual mutations had differed LIMG1 from the others. / Bactérias do Ácido Láctico (BAL) podem ser infectadas e lisadas por uma extensa faixa de bacteriófagos, o que constitui reconhecidamente a principal causa de fermentação falha ou lenta na indústria de laticínios moderna. Processos fermentativos contaminados prejudicam a qualidade do produto ou causam até mesmo sua perda completa. Embora avanços tecnológicos tenham reduzido a incidência destas infecções, eles certamente não as eliminaram. Assim, o objetivo deste trabalho foi o isolamento, identificação e caracterização molecular de bacteriófagos líticos de Lactococcus lactis a partir de soros provenientes de fermentações lácticas. Para isto, amostras de soro foram coletadas em três diferentes laticínios e, a partir deles, foram isolados 17 bacteriófagos, os quais foram propagados em L. lactis cultivado em meio GM17 e caracterizados molecularmente utilizando-se as técnicas de multiplex PCR, perfil de restrição enzimática de DNA, perfil proteico, microscopia eletrônica de transmissão, clonagem e sequenciamento. A extração do genoma dos bacteriófagos isolados e sua análise revelaram uma fita de DNA de 48 kb para o isolado LIMG1 e 42 kb para o isolado LIMG4, enquanto o perfil de proteínas dos fagos permitiu a distinção de quatro grupos, sendo que a diferenciação entre eles foi condizente com a amostra da qual foram isolados. A técnica de PCR, associada à análise microscópica, confirmou a presença de fagos do grupo 936, família Siphoviridae, o mais abundante em laticínios em todo o mundo. Foram encontrados fagos de cabeça isométrica de 50 nm de diâmetro e caudas longas de cerca de 180 nm de comprimento, sem placa basal. O sequenciamento do genoma do isolado LIMG1 revelou alta identidade com outros representantes do grupo 936, embora tenham sido encontradas duas mutações pontuais que o diferenciaram dos demais.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 270809 bytes, checksum: 2ca0830f4e6318653c848e9cda88dae8 (MD5) Previous issue date: 2002-11-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Penicillium expansum is a filamentous fungus that produces extracelular xylanase. An extracellular xylanase was found to be the major protein in the filtrated culture of P. expansum when grown on 0,3 % wheat bran. In contrast to other microorganism no xilanase multiplicity was found in P. expansum under the conditions used. The used partial purification estrategy was ammonium sulfate fractioning, molecular exclusion cromatography, ultrafiltration and anion exchange chromatography. The proteins eluation profile showed only one form of xylanase that was partially characterized. The optimum pH and temperature were 5,5 and 40 0C, respectively. The enzyme kept stable when preincubed for 1 h under pH between 5.5 and 6.5. It also kept stable when preincubed for 1h under temperature between 20-40 0C. The enzime showed km of 3,03 mg mL-1 and Vmax of 0,027 mmol min-1 &#956;g &#8211;1 of protein. The enzymatic activity was increased by 34 % by Mg3(PO4)2 (1 mM); 31 % by MgSO4 (1 mM).and 28 % by Al2(SO4)3 (1 mM). / O Penicillium expansum é um fungo filamentoso produtor de xilanase extracelular. Uma xilanase extracelular foi encontrada como a principal proteína na cultura filtrada de P. expansum quando cultivado em farelo de trigo 0,3 %. Em contraste com outros microrganismos, não foi encontrada multiplicidade de xilanase de P. expansum sob as condições usadas. Como estratégia de purificação parcial da enzima, foram realizados fracionamento com sulfato de amônia, cromatografia de exclusão molecular, ultrafiltração e cromatografia de troca iônica. O perfil de eluição das proteínas mostrou uma única forma de xilanase, sendo esta parcialmente caracterizada. O pH ótimo e a temperatura ótima foram 5,5 e 40 0C, respectivamente. A enzima se manteve estável quando pré-incubada por 1 h em pH entre 5,5 e 6,5. Também manteve a estabilidade quando pré-incubada por 1 h em temperatura entre 20-40 0C. A enzima apresentou Km de 3,03 mg mL-1 e Vmax de 0,027 mmol min-1 &#956;g-1 de proteína. A atividade enzimática foi aumentada 34 % por Mg3(PO4)2 (1 mM); 31 % por MgSO4 (1 mM) e 28 % por Al2(SO4)3 (1 mM).

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 01 - capa_abstract.pdf: 19961 bytes, checksum: e3e176ff7f15c76d6e02eb7f83656fdd (MD5) Previous issue date: 2007-03-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Propionic acid is an organic acid of three carbons that has been mainly used to preserve rations, grains and foods. Alternative strategies for application of propionic acid have been proposed, including their utilization in animal feeds. In this work, 38 bacteria were isolated from the bovine rumen and showed to produce organic acids using lactose from cheese whey. Only six isolates produced propionic acid, and the isolate named 22A showed the highest propionic acid production, and was selected for further study. The isolate 22A was a Gramnegative rod that utilized several carbon sources, including carbohydrates (glucose, lactose, maltose, sacarose, celobiose and mannose ), organic acids (lactate, piruvate, malate, fumarate and succinate) and glycerol. Regardless of the carbon source used, propionic acid was always the major fermentation end-product. Our results indicated that glycerol and succinate were the carbon sources that provided highest product yield and carbon recovery. Biomass production and product yield in mineral media were both affected by yeast extract concentration. When yeast extract (2 g/L) was added to the culture medium, the concentration of biomass and product formation increased about 270 % and 260 % respectively, compared to control treatments without yeast extract. The cultivation of the isolate 22A in diluted cheese whey (14 mM lactose) showed that the carbon source was being completely consumed after 16 hours of incubation and that the propionic acid yield and the acetate:propionato ratio were 2,37 mol/mol and 0,51, respectively. When increasing concentrations of lactose were added to the basal medium without pH contro1, a decrease in propionic acid yield and the appearance of other end-products was observed. Under these conditions, the pH of the culture medium decreased rapidly, reaching values of approximately 4,3 after 24 hours of incubation, for all the lactose concentrations tested. The control of pH in 6,8 using NaOH did not stimulate the production of propionic acid by isolate 22A, but lactose consumption increased to approximately 80 % in concentrations up to 338,70 mM. When isolate 22A was cultivated in basal medium with initial pH of 8,0 the specific growth rate and yield of propionic acid were 0,317 h-1 and 2,01 mol/mol, respectively. These results were better than those obtained at pH 7,0. These results indicated that isolated 22A has potential for propionic acid production in cheese whey. However, further work is needed to improve the cultivation system and to optimize the propionic acid yield. / O ácido propiônico é um ácido orgânico de três carbonos, e sua principal aplicação é como conservante de rações, grãos e alimentos. Estratégias alternativas de aplicação do ácido propiônico têm sido propostas, entre elas sua utilização na alimentação animal. Dentre as principais limitações para a produção fermentativa deste ácido orgânico estão o baixo rendimento e a baixa produtividade. Neste trabalho, foram isoladas 38 bactérias do rúmen bovino capazes de produzir ácidos orgânicos a partir da lactose do soro de queijo. Dentre estas, apenas o isolado 22A produziu ácido propiônico como principal produto da fermentação, sendo este selecionado para os experimentos Posteriores. O isolado 22A apresentou-se como bacilo Gram-negativo, capaz de metabolizar diversos açucares (glicose, lactose, maltose, sacarose, celobiose e manose ), ácidos orgânicos (lactato, piruvato, malato, fumarato e succinato) e glicerol, produzindo ácido propiônico como principal produto final da fermentação. Os resultados indicaram que glicerol e succinato foram às fontes de carbono que propiciaram maior rendimento os produto e recuperação de carbono. A produção de biomassa e o rendimento de produto em meio mineral foram afetados pela concentração de extrato de levedura no meio de cultivo. Quando 2 g/L de extrato de levedura foram utilizadas, a concentração de biomassa e o rendimento de produto aumentaram cerca de 270 % e 260 %, respectivamente, em relação ao controle sem extrato de levedura. O cultivo do isolado 22A em soro de queijo diluído (14 mM de lactose) indicou que a lactose foi completamente consumida após 16 horas de incubação e que o coeficiente de rendimento de produto para o ácido propiônico e a relação acetato/propionato foram 2,37 mol/mol e 0,51, respectivamente. Quando concentrações crescentes de lactose foram adicionadas ao meio basal sem controle de pH, observou-se a redução no rendimento de ácido propiônico e o aparecimento de outros produtos fmais na fermentação. Nestas condições, o pH do meio de cultura decresceu rapidamente, atingindo valores de aproximadamente 4,3 após 24 horas de incubação, para todas as concentrações de lactose testadas. O controle do pH do meio em 6,8 pela adição de NaOH não estimulou a produção de ácido propiônico pelo isolado 22A, mas observou-se consumo de aproximadamente 80% do substrato em concentrações de até 338,70 mM. O isolado 22A cresceu em meio basal com pH inicial de 8,0 e apresentou velocidade específica de crescimento de 0,317 h-1 e rendimento de ácido propiônico de 2,01 mol/mol. Esses resultados foram superiores aos obtidos com o isolado 22A quando cultivado em pH 7,0. Os resultados deste trabalho indicam que o isolado 22A possui potencial para produção de ácido propiônico em soro de queijo. Entretanto, outros estudos deverão ser realizados para a adequação do sistema de cultivo e a otimização do rendimento de produto.