Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-06-26T15:18:47Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AtividadeAntimicrobianaAntioxidante.pdf: 2908572 bytes, checksum: e12ae6d5a92fa7674e91793cb3fff4f9 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-06-27T16:05:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AtividadeAntimicrobianaAntioxidante.pdf: 2908572 bytes, checksum: e12ae6d5a92fa7674e91793cb3fff4f9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-27T16:05:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_AtividadeAntimicrobianaAntioxidante.pdf: 2908572 bytes, checksum: e12ae6d5a92fa7674e91793cb3fff4f9 (MD5) Previous issue date: 2016-09-15 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A sepse é uma disfunção orgânica causada por uma resposta imune desregulada a uma infecção. Na abordagem terapêutica inicial da sepse são utilizados antimicrobianos de amplo espectro, que não é suficiente para o controle da infecção, sendo necessário associações com outras terapias. Dessa forma, o Ilex paraguariensis por ser um potente antimicrobiano, antioxidante, e Agaricus brasiliensis possui propriedades imunomoduladora poderiam ser uma nova fonte de terapia. Assim, o presente estudo visou avaliar o efeito antimicrobiano, antioxidante e imunomodulador in vitro e in vivo dos extratos. Para tanto, neste estudo, foi avaliada a ação antimicrobiana in vitro dos extratos aquosos de A.brasiliensis e I. paraguariensis frente à Staphylococcus aureus e Escherichia coli pelo método da microdiluição e espectrofotmétrico para determinação de concentração inibitória Mínima e técnica de cultivo em placa de petri para a concentração bactericida mínima. Foi também avaliada a citotoxicidade em macrófagos, produção de óxido nítrico (NO), proliferação, fagocitose, capacidade antioxidante equivalente ao Trolox (TEAC) e determinação da atividade antioxidante total pela captura do radical livre e produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). In vivo, os camundongos swiss com sepse induzida foram pré-tratados com os extratos aquosos de A.brasiliensis e I. paraguariensis e após 12 e 24 horas suas amostras coletadas,e avaliado a sobrevida, migração leucocitária, hemograma, carga bacteriana, produção de NO, níveis de malonaldeído, TEAC em ex vivo avaliou-se capacidade fagocítica e liberação de EROs. O A.brasiliensis não apresentou atividade antimicrobiana in vitro, manteve as células viáveis, reduziu a capacidade fagocítica, aumentou NO, mas na presença de LPS reduziu o NO, apresentou efeito proliferativo, mas na presença do mitógeno teve efeito antiproliferativo e possui uma forte atividade antioxidante e capacidade de sequestro de radicais in vitro. O I.paraguariensis apresentou atividade antimicrobiana assim como efeito citotóxico, induziu à capacidade fagocítica dos leucócitos, aumentou NO, mas na presença de LPS reduziu, teve efeito proliferativo e atividade antioxidante com capacidade de sequestro de radicais in vitro. Em modelo de sepse in vivo, ambos aumentaram da sobrevida dos animais. O A.brasiliensis reduziu o influxo de leucócitos enquanto que o I. paraguariensis aumentou. Somente A.brasiliensis teve o hemograma semelhante ao sham, ambos extratos reduziram a carga bacteriana e diminuíram os níveis de NO, MDA e aumentaram os níveis de antioxidante nos tecidos, além disso, ambos diminuíram a produção de ERO. Apesar de ambos extratos apresentarem excelente resultados in vitro, o extrato aquoso de A.brasiliensis mostrou ser mais promissor que o extrato de I.paraguariensis como uma terapia adjuvante na sepse, devido sua elevada atividade antimicrobiana, antioxidante e anti-inflamatória in vivo. / Sepsis is an organ dysfunction caused by a dysregulated immune response to an infection, the initial therapeutic approach to sepsis are broad spectrum antimicrobials, which is not sufficient for control of infection, requiring association with other therapies. Thus, Ilex paraguariensis where to be a potent antimicrobial, antioxidant and Agaricus brasiliensis has immunomodulatory properties could be a new source of therapy. Thus, this study aimed to evaluate the antimicrobial effect, antioxidant and immunomodulatory in vitro and in vivo of the extracts. Therefore, in this study, we evaluated the in vitro antimicrobial activity of aqueous extracts from A.brasiliensis and I. paraguariensis against Staphylococcus aureus and Escherichia coli by the method of microdilution and by spectophotometry for determination of minimum inhibitory concentration and cultivation technique on petri dish for minimum bactericidal concentration, cytotoxicity in macrophages was evaluated, nitric oxide (NO) production, proliferation, phagocytosis, equivalent antioxidant capacity to Trolox (TEAC) and determination of the total antioxidant activity by capturing the free radical and reactive species production oxygen (ROS). In the swiss mice with induced sepsis were pretreated with aqueous extracts of A.brasiliensis and I. paraguariensis, after 12 and 24 hours collected their samples and evaluated the survival, leukocyte migration, hemogram, bacterial load, NO production, malondialdehyde (MDA), TEAC and ex vivo we evaluated phagocytic capacity and release of ROS. The A.brasiliensis showed no antimicrobial activity in vitro, remained viable cells reduced the phagocytic capacity, increased NO, but in the presence of LPS reduced, showed proliferative effect, but in the presence of mitogen had antiproliferative effect and has a strong antioxidant activity and capacity to sequester radicals in vitro. I.paraguariensis presented antimicrobial activity as well as cytotoxic effect induced phagocytic capacity increased NO, but in the presence of LPS reduced, had proliferative effect, antioxidant activity and capacity to sequester radicals in vitro. In vivo model of sepsis, both increased the survival of animals, A.brasiliensis reduced leukocyte influx while Ilex increased, only A.brasiliensis had hemogram similar to sham, both extracts reduced bacterial load and levels decreased NO, MDA and increased antioxidant levels in the tissues, in addition, both reduced the production of both extracts present ERO. Although excellent in vitro results, the aqueous extract from A.brasiliensis was found to be most promising as an adjuvant therapy in sepsis that I. paraguariensis due to its high antimicrobial activity, antioxidant and anti-inflammatory in vivo.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-06-26T15:15:30Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_UtilizacaoTecnicasHifenadas.pdf: 2148528 bytes, checksum: e4cf156ec901be080f61599c50e61ac5 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-06-28T12:44:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_UtilizacaoTecnicasHifenadas.pdf: 2148528 bytes, checksum: e4cf156ec901be080f61599c50e61ac5 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-28T12:44:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_UtilizacaoTecnicasHifenadas.pdf: 2148528 bytes, checksum: e4cf156ec901be080f61599c50e61ac5 (MD5) Previous issue date: 2016-08-31 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O emprego de técnicas hifenadas que permitam a separação e o isolamento de substâncias de um extrato vegetal mostra-se necessário tanto para o conhecimento da composição química, de um composto, como também para a determinação de uma substância, ou grupo de substâncias, que sirvam como marcadora de determinada espécie. A espécie Acmella oleracea (L.) R.K.Jansen, cresce na Amazônia Legal, uma região sociogeográfica no norte do Brasil, onde é conhecido como Jambu, Agrião Bravo ou Agrião do Pará. É utilizada na medicina popular na forma de chá, xaropes e tinturas e indicada para o uso como anestésico e antisséptico. O objetivo deste trabalho foi utilizar a HPLC-UV-ELSD e a UHPLC-DAD-MS para o desenvolvimento de programações que possam identificar metabólitos de interesse em Acmella oleracea. O material vegetal foi adquirido no município de Tailândia, estado do Pará, sítio Santa Inês na microrregião de Tomé-Açu as margens da rodovia PA150, posicionado a 260 km da capital Belém, nas coordenadas 02º56‘22‘‘ de latitude sul e 48º57‘03‘‘ de longitude oeste, e consistia de 10 maços de Acmella oleracea (jambu) frescos, compostos de folhas, flor, raiz e caule, após a higienização o material in natura foi triturado e em seguida macerado por 7 dias com etanol a 92,8 ºGL numa proporção de 1:10. Os extratos hidroetanólicos, de cada parte da planta, foram filtrados e concentrados a baixa pressão e em seguida liofilizados para posterior análise com técnicas hifenadas. O espilantol foi registrado nas análises por UHPLC-DAD-ESI-MS em modo Scan e Produto de íon, através da detecção do íon m/z 222 em todos os órgãos analisados. Uma substância que apresentou m/z 376.80 para análise com etoh/água e m/z 388.20 para acn/água, que apresenta perfil promissor foi encontrada através das análises por UHPLC-DAD-MS e precisa de experimentos específicos para a confirmação de flavonoides. Durante o desenvolvimento das programações, observou-se que os melhores perfis cromatográficos de EEAOFOC e EEAOR foram obtidos quando a fase móvel era composta por etanol e água. / The use of hyphenated techniques that allow the separation and isolation of substances of a herbal extracts is necessary both for the knowledge of the chemical composition of a compound, as well as for the determination of a substance or a group that serve as marker of particular species. The species Acmella oleracea (l.) R. K. Jansen, grows in Legal Amazon, a geographic region in northern Brazil, where is known as Jambu, Agrião Bravo ou Agrião do Pará. It is used in folk medicine in the form of tea, syrups and tinctures and indicated for use as anesthetic and antiseptic. The aim of this study was to use the HPLC-UV-ELSD and HPLC-DAD-MS for the development of methods that can identify metabolites of interest on Acmella oleracea. The plant material was acquired in Tailândia, State of Pará, in the Santa Inês farm, city of Tomé-Açu, PA150 highway margins, positioned the 260 km from Belém, at 02° 56 ' 22 '' south latitude and 48° 57 ' 03 '' west longitude, and consisted of 10 packs of Acmella oleracea (jambu), composed of leaves, flower, root and stem, after cleaning the material was grinded and then macerated for 7 days with 92.8° GL ethanol at a ratio of 1:10. Hydroethanolic extracts, of each part of the plant, were filtered and concentrated at a low pressure and then lyophilized for further analysis with hyphenated techniques. The Spilanthol was registered in the analysis by HPLC-DAD-ESI-MS, Scan mode and Product ion, through the detection of ion m/z 222 in all analyzed organs. A substance which showed m/z 376.80 for analysis with etoh/water and m/z 388.20 for acn/water, which has promising profile was found through the analysis by HPLC-DAD-MS and needs specific experiments for confirmation of flavonoids. During the development of methods, it was observed that the best chromatographic profiles of EEAOFOC and EEAOR were obtained when the mobile phase was composed of ethanol and water.

Submitted by Nathalya Silva (nathyjf033@gmail.com) on 2017-06-28T19:48:52Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PotencialCicatrizanteExtrato.pdf: 6131191 bytes, checksum: ef566ea3cb774708d89a7c294f0111fb (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-06-29T16:02:26Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PotencialCicatrizanteExtrato.pdf: 6131191 bytes, checksum: ef566ea3cb774708d89a7c294f0111fb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T16:02:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PotencialCicatrizanteExtrato.pdf: 6131191 bytes, checksum: ef566ea3cb774708d89a7c294f0111fb (MD5) Previous issue date: 2017-05-25 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O Diabetes Mellitus (DM), uma doença que desperta o interesse de muitos profissionais da saúde, é uma patologia crônica que nos últimos anos tornou-se motivo de preocupação para a saúde pública. A doença divide-se em diabetes tipo 1 e tipo 2, a qual causa uma disfunção na fisiologia da insulina/glicose. Essa desregulação causa alterações significativas em alguns eventos biológicos, dentre eles, o processo de cicatrização. O surgimento de uma lesão em uma pessoa normal desencadeia uma cascata de reações celulares e bioquímicas com objetivo de reparar o tecido lesionado. Em pacientes portadores de diabetes o reparo é mais lento. Vários mecanismos são descritos como fatores importantes no retardo do processo de cicatrização em diabéticos, entre eles, a produção excessiva de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS), diminuição do Óxido Nítrico (NO), diminuição da reposta aos Fatores de Crescimento (GFs) e das proteínas da via de sinalização da insulina. A busca por formas terapêuticas que possam auxiliar o processo de reparo tecidual apresenta uma grande demanda, devido o índice de pessoas portadoras de diabetes estar aumentando aos longos dos anos. Sendo assim visa-se, encontrar alternativas farmacológicas para este aspecto, no presente estudo foi realizada a caracterização do efeito farmacológico da aplicação tópica do extrato cetônico da semente Pentaclethra macroloba (Pracaxi), no processo de regeneração tecidual em animais diabéticos. Para avaliação do efeito cicatrizante foi criada uma ferida cutânea excisional com punch de biopsia nos animais diabéticos e posteriormente foram tratados por aplicação tópica do extrato para avaliação do potencial cicatrizante da semente. O efeito do tratamento foi avaliado mediante alguns aspectos, tais como: a contração da ferida, reepitelização, quantidade de células inflamatórias, organização tecidual e formação de colágeno na matriz extracelular. Os resultados encontrados demonstram que o extrato de pracaxi apresentou efeito cicatrizante em camundongos diabéticos, estimulando a reestruturação tecidual após lesões cutâneas. Desta forma, o pracaxi torna-se uma possível alternativa para o tratamento de lesões teciduais em diabéticos devido estimular a cascata de cicatrização promovendo a melhor formação da matriz extracelular. / Diabetes Mellitus (DM), a disease that attracts the interest of many health professionals, is a chronic pathology that has become a public health concern in recent years. The disease is divided into diabetes type 1 and type 2 , which causes a dysfunction in insulin / glucose physiology. This deregulation causes significant alterations in some biological events, among them, the cicatrization process. The emergence of injury in to a normal person triggers a cascade of cellular and biochemical reactions Aiming to repair the injured tissue. In patients with diabetes, the repair is slower. Several mechanisms are described as important factors in the delay of the healing process in diabetics, among them, excessive production of reactive oxygen species (ROS), reduction of nitric oxide (NO), reduction of the response to growth factors (GFs) And proteins the insulin signaling pathway . The search for therapeutic forms that can help the tissue repair process is in great demand, Because the rate of people with diabetes is increasing over the years. Thus, it is aimed to find pharmacological alternatives for this aspect, in the present study the characterization of the pharmacological effect of the topical application of the ketone extract of the seed Pentaclethra macroloba (Pracaxi) on the tissue regeneration process in diabetic animals was performed. To evaluate the healing effect, an excisional cutaneous wound with biopsy punch was created in diabetic animals and were subsequently treated by topical application of the extract to evaluate the healing potential of the seed. The effect of the treatment was evaluated by some aspects, such as: wound contraction, Reepithelialization, quantity of inflammatory cells, tissue organization and formation of collagen in the extracellular matrix. The results showed that the pracaxi extract presented a healing effect in diabetic mice, stimulating the tissue reconstruction after skin lesions. In this way, the pracaxi becomes a possible alternative for the treatment of tissue lesions in diabetics because it stimulates the healing cascade promoting the best formation of the extracellular matrix.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Staphylococcus aureus is considered as a microorganism belonging to the normal flora of humans, being both a settler as an infectious pathogen Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) has emerged as a major cause of nosocomial infections and community. The large increase in resistance to antimicrobials has limited therapeutic options. Thus the proper conduct of testing the susceptibility to drugs is vital to ensure the proper treatment of these infections, and the use of methods capable of detecting resistance quickly and accurately, it is essential in clinical diagnosis . The aim of this study was to compare manual and automated phenotypic methods with genotypic based on Polymerase Chain Reaction (PCR) to detect MRSA strains. A total of 139 samples of S. aureus were analyzed using automated and manual methods phenotypic and compared with the determination of the mecA gene by PCR. A total of 139 samples, 37 (26.6 %) had the gene searched. The oxacillin had a sensitivity of 62.2% and specificity of 95.1 %, while cefoxitin disk for these parameters were 67.6% and 94.1 %, respectively. The automated method was the one that had the highest percentages of sensitivity (67,6 %) and specificity (96.1 %). Some differences were observed when comparing the phenotypic methods with PCR. A combination of methods can be considered as an efficient alternative for the diagnosis of infections caused by MRSA. / Staphylococcus aureus é considerado como um microrganismo pertencente à microbiota normal dos seres humanos, podendo ser tanto um colonizador como um patógeno infeccioso. Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) emergiu como uma das principais causas de infecções nosocomiais e comunitárias. O elevado aumento na resistência a diferentes antimicrobianos tem limitado as opções terapêuticas. Assim, a realização adequada de testes de sensibilidade a essas drogas é vital para garantir o adequado tratamento dessas infecções, e o emprego de metodologias capazes de detectar esta resistência de forma rápida e precisa, torna-se imprescindível no diagnóstico clínico. O objetivo desse estudo foi comparar métodos fenotípicos manual e automatizado com o genotípico, baseado na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), para detectar cepas MRSA. Um total de 139 amostras de S. aureus foram analisadas por meio de métodos fenotípicos manuais e automatizado e comparadas com a determinação do gene mecA por PCR. De um total de 139 amostras, 37 (26,6%) apresentaram o gene pesquisado. O disco de oxacilina apresentou sensibilidade de 62,2% e especificidade de 95,1%, enquanto que para o disco de cefoxitina estes parâmetros foram 67,6% e 94,1%, respectivamente. O método automatizado foi o que obteve as maiores percentagens de sensibilidade (67,6%) e especificidade (96,1%). Algumas divergências foram observadas quando comparamos os métodos fenotípicos com a PCR. A combinação de metodologias pode ser considerada como uma alternativa eficiente no diagnóstico de infecções causadas por MRSA.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Some forms of neuropathic pain are maintained by sympathetic fibers, but the underlying mechanisms are poorly understood. Thus, the aim of this study was to investigate the possible involvement of the TRPA1 receptor as well as the role of the sympathetic nervous system (involved in sympathetically maintained neuropathic pain) in a model of neuropathic pain induced by chronic sciatic nerve constriction injury (CCI) in mice. The systemic injection of the selective TRPA1 antagonist HC-030031 reversed both mechanical and cold allodynia induced by chronic sciatic nerve constriction injury. Nerve injury also sensitizes mice to the nociception induced by the intraplantar injection of a low dose of the TRPA1 agonist allyl isothiocyanate without changing TRPA1 immunoreactivity in the injected paw. Furthermore, the chemical sympathectomy produced by guanethidine largely prevented CCI-induced mechanical and cold allodynia. CCI also induced a norepinephrine-trigged nociception that was inhibited by α-adrenoceptor antagonism and norepinephrine transporter and monoamine oxidase inhibition. Finally, the peripheral injection of HC-030031 also largely reduced CCI-induced nociception by norepinephrine and mechanical or cold allodynia. Taken together, the present findings reveal the critical role of TRPA1 in mechanical and cold hypersensitivity as well as in hypersensitivity to norepinephrine following nerve injury. This article presents the role of TRPA1 receptor on the sympathetically-maintained nociception induced by nerve injury in mice. Our results suggest that TRPA1 antagonists may be useful to treat neuropathic patients that present sympathetically maintained pain. / Algumas formas de dor neuropática são mantidos por fibras simpáticas, contudo os mecanismos subjacentes são pouco compreendidos. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o possível envolvimento do receptor TRPA1, bem como o papel do sistema nervoso simpático num modelo de dor neuropática induzido pela constrição crônica do nervo ciático (CCI) em camundongos. A administração sistêmica do antagonista seletivo do receptor TRPA1, HC-030031, reverteu a alodinia mecânica e ao frio induzida pela CCI. A injeção de uma baixa dose do agonista do receptor TRPA1, isotiocianato de alila, induziu uma resposta nociceptiva nos animais que sofreram a lesão no nervo, sem alterar a imunorreatividade do TRPA1 na pata injetada. Além disso, a simpatectomia química produzida pela guanetidina amplamente previniu a alodínia mecânica e ao frio induzida pela CCI. Ainda, a injeção intraplantar de norepinefrina induziu nocicepção espontânea, a qual foi reduzida pelo antagonista α-adrenérgico, inibidor do transportador de norepinefrina e inibidor da enzima monoamina oxidase. Finalmente, a administração periférica do HC-030031 reduziu a nocicepção espontânea induzida pela norepinefrina e também a alodínia mecânica e térmica de animais neuropáticos. Assim, nossos resultados revelam o papel crítico do receptor TRPA1 na alodínia mecânica e ao frio, bem como na hipersensibilidade à norepinefrina após lesão do nervo em um modelo de dor neuropática mantida pelo simpático. Dessa forma, o receptor TRPA1 poderá ser um alvo para o desenvolvimento de novos tratamentos para esse tipo de dor.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Alzheimer s disease (AD) is biochemically characterized by the occurrence of extracellular deposits of amyloid beta peptide (Aβ) and intracellular deposits of the hyperphosphorylated tau protein, which are causally related to the pathological hallmarks senile plaques and neurofibrillary tangles. Monoamine oxidase B (MAO-B) activity, an enzyme involved in the oxidation of biogenic monoamines, is particularly high around the senile plaques and increased in AD patients in middle to late clinical stages of the disease. Selegiline, a selective and irreversible MAO-B inhibitor, improves learning and memory in AD patients. Notwithstanding, its mechanism of action is still not completely known. The current study aimed to investigate whether selegiline improves the Aβ25-35 induced cognitive deficit in the object recognition task in mice. In addition, we investigated whether selegiline alters MAO-B and MAO-A activities in the hippocampus, perirhinal and remaining cerebral cortices of Aβ25-35-injected mice. Acute (1 and 10 mg/kg, p.o., immediately post-training) and subchronic (10 mg/kg, p.o., seven days after Aβ25-35 injection and immediately post-training) administration of selegiline reversed the cognitive impairment induced by Aβ25-35 (3 nmol, i.c.v.). Acute administration of selegiline (1 mg/kg, p.o.) in combination with Aβ25-35 (3 nmol) decreased MAO-B activity in the perirhinal and remaining cerebral cortices. Acute administration of selegiline (10 mg/kg, p.o.) decreased MAO-B activity in hippocampus, perirhinal and remaining cerebral cortices, regardless of Aβ25-35 or Aβ35-25 treatment. MAO-A activity was not altered by selegiline or Aβ25-35. In summary, the current findings further support a role for MAO-B in the cognitive deficits observed in AD. / A doença de Alzheimer (DA) é bioquimicamente caracterizada por depósitos extracelulares de peptídeo beta amiloide (Aβ) e de proteína tau hiperfosforilada, que são causalmente relacionadas com as características patológicas, placas neuríticas e emaranhados neurofibrilares. A atividade da monoamina oxidase B (MAO-B), uma enzima envolvida na oxidação de monoaminas biogênicas, é particularmente elevada ao redor das placas senis e aumenta nos pacientes com DA em estágios clínicos de moderado a grave. A selegilina, um inibidor seletivo e irreversível da MAO-B, é relatada por melhorar a memória e o aprendizado em pacientes com DA. Porém, seu mecanismo de ação ainda não é completamente conhecido. O presente estudo teve como objetivo investigar se a selegilina melhora o déficit cognitivo induzido por Aβ25-35. na tarefa de reconhecimento de objetos em camundongos. Além disso, investigou-se a atividade da MAO-A e da MAO-B no hipocampo, no córtex cerebral e no córtex perirrinal de camundongos injetados com Aβ25-35 e com selegilina. Administração aguda (1 e 10 mg/kg, p.o., imediatamente pós-treino) e subcrônica (10 mg/kg, p.o., por sete dias depois da injeção do Aβ25-35 e imediatamente pós-treino) de selegilina preveniu o prejuízo da memória induzido pelo Aβ25-35 (3 nmol, icv). A administração aguda de selegilina (1 mg/kg, p.o.) em combinação com Aβ25-35 (3 nmol) diminuiu a atividade da MAO-B no córtex perirrinal e córtex cerebral. A administração aguda de selegilina (10 mg/kg, p.o.) diminuiu a atividade da MAO-B no hipocampo, no córtex cerebral e no córtex perirrinal independentemente da presença de Aβ25-35. A atividade da MAO-A não foi alterada pelo tratamento com selegilina ou Aβ25-35 em nenhuma das estruturas estudadas. Em resumo, os dados atuais suportam um papel adicional para a MAO-B no déficit cognitivo observado na DA.

The granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) is a hematopoietic cytokine that stimulates and regulates the proliferation and differentiation of neutrophil precursor cells of the bone marrow. The recombinant hormone (rhG-CSF) non-glycosylated, filgrastim, is used to treat the neutropenia induced by chemotherapy and bone marrow transplantion. The identification and characterization was carried out by electrophoresis and western blotting, showing the typical band in the region of 18.8 kDa. The neutropenia mouse bioassay was standardized with the BALB/c strain, previously treated with ifosfamide and used for the potency assessment of pharmaceutical products. A gradient reversed-phase liquid chromatography (RP-LC) was validated for the analysis of rhG-CSF in pharmaceutical formulations. The LC method was carried out on a Jupiter C4 column 300 Å (250 mm x 4.6 mm i.d.), maintained at ambient temperature. The mobile phase A consisted of water:acetonitrila (90:10, v/v) with 0.1% trifluoroacetic acid and the mobile phase B was water:acetonitrile (20:80, v/v) with 0.1% trifluoroacetic acid, run at a flow rate of 0.5 mL/min with detection at 280 nm. The chromatographic separation was obtained with the retention time of 31.9 minutes and the method was linear in the range of 10 300 μg/mL. Validation parameters such as sensitivity, precision, accuracy, detection limit, quantitation limit and robustness were evaluated giving results in the acceptable range. The specificity was evaluated by the peak purity of the rhG-CSF biological reference preparation subjected to oxidative conditions. The proposed method was applied for the analysis of filgrastim pharmaceutical products, evaluating the sulphoxides and deamidates forms as well. Moreover, the size-exclusion chromatography (SE-LC) was performed for the potency evaluation of 7 filgrastim, dimers and high-molecular-mass forms. Samples of pharmaceutical formulations were subjected to aggregation, degradation and than each one evaluated by the neutropenia mouse bioassay giving biological activities of 14.60%, 13.47% and 15.63%, for the dimers, high-molecular-mass substances and the sulphoxides/deamidates, respectively. The pharmaceutical samples were analysed by the chromatographyc methods and compared to the bioassay showing mean difference between the estimated potencies of 2.04% lower for the RP-LC, and 4.03% lower for the SE-LC, with significant correlation (p>0.05). Due to the reduced bioactivity of the rhG-CSF-related proteins, the SE-LC is proposed in combination with the RP-LC as an alternative to the bioassay for the potency assessment of filgrastim in pharmaceutical dosage forms. The alternative established represents a contribution towards the replacement of the animals improving the quality control and assuring the safety and efficacy of the biological product. / O fator estimulador da colônia de granulócitos humanos é uma citocina hematopoiética que estimula e regula a proliferação e diferenciação de células precursoras de neutrófilos da medula óssea. O hormônio recombinante (rhG-CSF) sob a forma nãoglicosilada, filgrastima, é usado para o tratamento de neutropenias. Realizou-se a identificação de filgrastima em produtos farmacêuticos por eletroforese, transferência e detecção com anticorpos específicos, demonstrando-se banda única na região de peso molecular de, aproximadamente, 18,8 kDa. Avaliou-se a atividade pelo ensaio biológico da neutropenia em camundongos da linhagem BALB/c, pré-tratados com ifosfamida. Desenvolveu-se e validou-se o método por cromatografia líquida em fase reversa (CL-FR), utilizando coluna Júpiter C4 300 Å (250 mm x 4,6 mm, i.d.), mantida a temperatura ambiente. A fase móvel A foi constituída de água/acetonitrila (90:10, V/V)/ 0,1% ácido trifluoroacético e a fase móvel B de água/acetonitrila (20:80, V/V)/ 0,1% ácido trifluoroacético, eluída em gradiente na vazão de 0,5 mL/min com detecção no ultravioleta a 280 nm. A análise cromatográfica viabilizou a separação da filgrastima no tempo de retenção de 31,9 min, sendo linear na faixa de concentração de 10 300 μg/mL. Avaliaram-se os parâmetros de precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez. Estudou-se também a especificidade, através da determinação da pureza do pico da Substância biológica de referência de rhG-CSF, submetida à degradação sob condições oxidativas. O método proposto foi utilizado para análise de filgrastima em produtos farmacêuticos, determinando-se as formas de sulfóxidos e desamidados. Paralelamente, efetuaram-se avaliações de potência por cromatografia líquida por exclusão molecular (CL-EM), determinando as formas diméricas e de alta massa molecular. Amostras de produtos farmacêuticos foram submetidas a condições de agregação e degradação e, então, avaliadas pelo bioensaio da neutropenia em 5 camundongos, obtendo-se atividades biológicas de 14,60%, 13,47% e 15,63%, para os dímeros, substâncias de alta massa molecular e sulfóxidos/desamidados, respectivamente. Estudou-se a correlação entre métodos e demonstrou-se que as análises dos produtos farmacêuticos forneceram diferenças médias 2,04% menor por CL-FR, e significativa de 4,03% menor por CL-EM, em relação ao ensaio biológico. Devido à reduzida bioatividade das formas alteradas, conclui-se sugerindo a adoção do método por CL-EM para a avaliação de potência de filgrastima, em combinação com CL-FR. Desse modo, estabeleceu-se alternativa no contexto da substituição do uso de animais, contribuindo para aprimorar o controle da qualidade, garantindo a segurança e eficácia terapêutica do produto biológico.

Species belonging to the Asteraceae family are an important source of terpenoids with biological activity. Senecio bonariensis Hook. et Arn., popularly known as margarida-do-banhado-de-Buenos Aires is native from South America and can be found in south Brazil, blooming from October to December. This plant is known for contain furanoeremophylanes, steroids and pyrrolizidines alkaloids (PAs) with toxic activities. This work describes the isolation and identification of three compounds present in the CH2Cl2 extract of the aerial parts of Senecio bonariensis Hook at Arn. Leaves of this plant were collected in Eldorado do Sul, RS, Brazil, in April 2004 and identified by Prof. Dr. Nelson Ivo Matzenbacher. Voucher specimen Nº SMDB 9519 is preserved in the Herbarium of the Departamento de Botânica, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, RS, Brazil. The fresh leaves of S. bonariensis (2.3 kg) were extracted by maceration with CH2Cl2. The CH2Cl2 extract was evaporated under vacuum to yield an viscous residue (13.5 g), which gave a yield of 0.64%. The crude extract was fractionated by flash chromatography over silica-gel, using CH2Cl2, and CH2Cl2: EtOH mixture of increasing polarity, (stepwise, 99:1 to 80:20) to yield 15 fractions. The fraction 1 col. 1 (1 g) was chromatographed over silica-gel impregnated with AgNO3 (10%) eluting with hexane-acetone (99:1), to yield 13 news fractions. Fraction 10 col. 2 (253 mg) was chromatographed on silica-gel impregnated with AgNO3 (10%), eluting with hexane: ethyl ether (95:5) and purified to afford 104 mg of CS1 (caryophyllene) and 16 mg of CS2 (caryophyllene oxide). Fraction 11 col. 2 (83.5 mg) was also chromatographed on silica-gel impregnated with AgNO3 (10%), eluting with hexane: ethyl ether (98:2) and purified to afford 5 mg of CS3 (germacrene-D). The compounds obtained were analyzed by GC-EI-MS, IR, 1H and 13C NMR. The antimicrobial activity of CS1 and CS2 were evaluated by the microdilution method based on M27-A2 and M7-A4 (NCCLS). Both compounds sowed no antimicrobial activity at the tested concentrations. / Espécies pertencentes à família Asteraceae, são uma importante fonte de terpenóides com várias atividades biológicas já descritas. Senecio bonariensis Hook. et Arn., popularmente conhecida como margarida-do-banhado-de-Buenos Aires é um arbusto nativo da América do Sul, que pode ser encontrado no sul do Brasil e floresce de outubro a dezembro. Esta planta é conhecida por apresentar furanoeremofilanos, esteróides e alcalóides pirrolizidínicos, com atividades tóxicas. Este trabalho descreve o isolamento e identificação de três constituintes químicos presentes no extrato CH2Cl2 das partes aéreas de Senecio bonariensis Hook. et Arn. As folhas de S. bonariensis foram coletadas em abril de 2004, no município de Eldorado do Sul-RS. A espécie foi localizada e identificada pelo Prof. Dr. Nelson Ivo Matzenbacher, do Programa de Pós Graduação em Botânica da UFRGS. Material testemunha encontra-se depositado no Herbário do Departamento de Biologia da UFSM sob o registro n° SMDB 9519. As folhas frescas de S. bonariensis (2,3 kg) foram extraídas por maceração com CH2Cl2. O extrato bruto foi evaporado sob pressão reduzida, resultando num resíduo pastoso (13,5 g), com rendimento de 0,64%. O extrato bruto foi fracionado por cromatografia em coluna do tipo flash sobre gel de sílica, usando CH2Cl2 e misturas de CH2Cl2 : EtOH, em gradiente, nas proporções de 99:1 até 80:20, sendo obtidas 15 frações (1 a 15 col. 1). A fração 1 col. 1 (1g) foi cromatografada sobre gel de sílica impregnado com AgNO3 (10%), eluída com hexano: acetona (99:1), obtendo-se 13 novas frações (1 a 13 col. 2). A fração 10 col. 2 (253 mg) foi cromatografada sobre gel de sílica impregnado com AgNO3 (10%), eluída com hexano:éter etílico (95:5), obtendo-se 104 mg de CS1(cariofileno) e 16 mg de CS2 (óxido de cariofileno). A fração 11 col. 2 (83,5 mg) também foi cromatografada sobre gel de sílica impregnado com AgNO3 (10%), eluída com hexano:éter etílico (98:2) e forneceu 5 mg de CS (germacreno-D). Os compostos isolados foram analisados por CG-EM-IE, IV, RMN 1H e RMN 13C e seus dados espectroscópicos foram comparados com os obtidos da literatura. Além disso, foi determinada a atividade antimicrobiana do cariofileno e do óxido de cariofileno, através do método de microdiluição em caldo, baseado nos documentos M27-A2/NCCLS para fungos e M7-A4/NCCLS para bactérias. Os compostos não apresentaram atividade antimicrobiana nas concentrações testadas.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The assessment of biomarkers of reactions involving reactive oxygen species have the potential not only to determine the extent of oxidative damage, but also to predict the effectiveness of therapeutic strategies aimed at reducing or preventing the damage promoted by oxidative stress. Recently, it has been described and characterized a new class of compounds formed in consequence of oxidative stress, designated as advanced oxidation protein products (AOPP). The accumulation of AOPP was first described in patients with chronic renal failure undergoing hemodialysis and was subsequently found in diabetes, atherosclerosis, obesity and acute renal failure. Previous studies have identified AOPP as a new marker of oxidative damage to proteins and a new class of inflammatory mediators, providing arange of effects at both the cellular and systemic levels. Although the mechanism of action by which AOPP act is not fully understood, it is known that these products activate respiratory burst in phagocytes, including neutrophils and monocytes, through the activation of enzymes present in these cells. Furthermore, it has been demonstrated that AOPP may promot these effects (pro-oxidants and pro-inflammatory) at several cell types such as endothelial and kidney cells via activation of a signaling cascade, and in some aspects of this cascade AOPP effects is very similar to effects caused by advanced glycation end products (AGEs). In this context, the evaluation of the antioxidant activity of compounds in vitro models involving the formation of AOPP may present special interest. Among these compounds, N-acetylcysteine (NAC) and Fructose-1 ,6-bisphosphate (FBP) may be promising substances for this purpose. The NAC is a sulfhydryl donor group very similar to the amino acid cysteine and FBP is a highly energetic intermediate metabolite of glycolysis. Thus, the aim of this study was to determine the effects of FBP and NAC, as well as the synergistic effect of both treatments on the formation of AOPP in vitro. For this purpose, purified human albumin was incubated with various concentrations of hypochlorous acid (HOCl) (1, 2 and 4 mM) to produce AOPP in vitro, which was named albumin-advanced oxidation protein products (albumin-AOPP). In this context, both FBP as NAC were able to inhibit the formation of AOPP concentration-dependent manner, with FBP 20mg/mL and NAC 1mg/mL were responsible for the inhibition of 64% and 85% respectively. Furthermore, the synergistic effect promoted by the association of both compounds was more effective ininhibiting the formation of AOPP. Therefore, FBP and NAC may be promising candidates to mitigate or neutralize the pro-inflammatory and pro-oxidant triggered by AOPP. / A avaliação de biomarcadores das reações que envolvem as espécies reativas de oxigênio têm potencial não apenas de determinar a extensão do dano oxidativo, mas também de predizer a eficiência das estratégias terapêuticas destinadas a reduzir ou prevenir os danos promovidos pelo estresse oxidativo. Recentemente, foi descrita e caracterizada uma nova classe de compostos formados em consequência do estresse oxidativo, designada como produtos proteicos de oxidação avançada (AOPP). O acúmulo de AOPP foi primeiramente descrito em pacientes com insuficiência renal crônica submetidos à hemodiálise e, posteriormente, verificou-se que este marcador está envolvido em várias condições patológicas, incluindo diabetes, aterosclerose, obesidade e insuficiência renal aguda. Estudos prévios têm identificado AOPP como um novo marcador de dano oxidativo a proteínas e uma nova classe de mediadores inflamatórios, promovendo uma série de efeitos tanto a nível celular quanto a nível sistêmico. Embora o mecanismo de ação pelo qual os AOPP agem não está totalmente esclarecido, sabe-se que estes produtos ativam o burst respiratório em fagócitos, incluindo neutrófilos e monócitos, através da ativação de complexos enzimáticos presentes nestas células. Além disso, tem sido demonstrado que os AOPP também podem promover efeitos deletéreis (pró-oxidantes e pró-inflamatórios) a vários tipos celulares, como células renais e endoteliais, através da ativação de uma cascata de sinalização, sendo em alguns aspectos desta cascata muito semelhante aos efeitos promovidos pelos produtos finais de glicação avançada (AGEs). Neste contexto, a avaliação da atividade antioxidante e antiinflamaória de compostos em modelos in vitro envolvendo a formação de AOPP pode apresentar especial interesse. Dentre esses compostos, a N-acetilcisteína (NAC) e a Frutose- 1,6-bisfosfato (FBP) podem ser substâncias promissoras para esta finalidade. A NAC é um doador de grupo sulfidrila muito semelhante ao aminoácido cisteína e a FBP é um açúcar bifosforilado e um metabólito intermediário altamente energético da glicólise. Assim, o principal objetivo deste estudo foi determinar o efeito da FBP e da NAC, bem como o efeito sinérgico de ambas, sobre a formação de AOPP in vitro. Para isso, a albumina purificada humana foi incubada com várias concentrações de ácido hipocloroso (HOCl) (1, 2 e 4 mM) para produzir AOPP in vitro, a qual foi denominada de albumina-produtos proteicos de oxidação avançada (albumina-AOPP). Neste contexto, tanto FBP quanto NAC foram capazes de inibir a formação de AOPP de maneira concentração-dependente, sendo que FBP 20 mg/mL e NAC 1mg/mL foram responsáveis pela inibição de 64% e 85% respectivamente. Além disso, o efeito sinérgico promovido pela associação de ambos os compostos foi maisefetivo em inibir a formação de AOPP quando comparado com o efetio promovido pelos compostos isoladamente. Portanto, FBP e NAC podem ser candidatos promissores para amenizar ou neutralizar os efeitos pró-inflamatórios e pró-oxidantes desencadeados pelos AOPP.

Fundação de Amparo a Pesquisa no Estado do Rio Grande do Sul / Resveratrol (RES) is an anti-aging molecule that provides both anti-inflammatory and antioxidant properties. However, it is unclear whether the basal oxidative state of the cell has any influence on the effects of this compound. In humans, a single nucleotide polymorphism (SNP) is present in the enzyme manganese superoxide dismutase (SOD2), localized in codon 16 (rs4880), which can either be an alanine (A) or valine (V). This SNP causes an imbalance in the cellular levels of SOD2, where AA- and VV-genotypes result in higher or lower enzy-matic activity, respectively. Furthermore, the VV-genotype has been associated with high levels of inflammatory cytokines. Here, we examined the effects of a range of RES concentra-tions on the in vitro activation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) carry-ing different Ala16Val-SOD2 genotypes. Cell proliferation (at 24 and 72 h) was analyzed using an MTT assay and several oxidative biomarkers and cytokines (IL-1β, IL-6, TNF-α, IFT-γ and IL-10) were also quantified. In addition, the effects of RES on the expression of the SIRT 1 gene were evaluated by qRT-PCR. We show that after 24 h exposure to RES, A-genotype PBMCs displayed a decrease in cell proliferation, whilst VV-cells contrasted this; although after 72 h, cell proliferation was similar in homozygous cells when compared to con-trol groups. At 10 μM RES, there was a significant decrease in the production of inflammato-ry cytokines in A-allele cells; however, VV-cells generally displayed a subtle decrease in the-se, except for TNF-α, which was not affected. In all SOD2 genotypes cells exposed to RES resulted in an upregulation of SIRT 1 levels. Together, these results suggest that the effect of RES on human PBMC activation is not universal and is dependent on the Ala16Val-SOD2 SNP. / O resveratrol (RES) é uma molécula com propriedades na saúde humana incluindo ações anti-inflamatórias e antioxidantes, e no retardo do envelhecimento celular. Entretanto, não está claro se o estado oxidativo basal da célula tem alguma influência sobre os efeitos desta molécula. Em seres humanos, um polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) está presente na enzima superóxido dismutase dependente de manganês (SOD2), localizada no códon 16 (rs4880), que pode ser tanto uma alanina (A) ou valina (V). Este SNP provoca um desequilíbrio nos níveis celulares de SOD2, onde os genótipos AA e VV resultam em maior ou menor atividade enzimática, respectivamente. Além disso, o genótipo VV tem sido associ-ado com elevados níveis de citocinas inflamatórias. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo investigar a influência do polimorfismo Ala16Val-SOD2 no efeito anti-inflamatório in vitro do RES em células monucleares do sangue periférico (CMSPs), através da análise da viabilidade, proliferação celular, parâmetros oxidativos, inflamatórios e na mo-dulação da expressão do mrNA e proteína da enzima Sirtuína 1 que está relacionado com o retardo da senescência celular. A proliferação celular (em 24 e 72 horas), foi analisada utili-zando ensaio de MTT, e alguns biomarcadores oxidativos e citocinas (IL-1β, IL-6, TNF-α, IFT-γ e IL-10) também foram quantificados. Além disso, os efeitos do RES sobre a expressão do gene da SIRT1 foram avaliados por qRT-PCR. Nós observamos que, após 24 horas de ex-posição ao RES, as CMSP-AA apresentaram uma redução na proliferação celular, enquanto as CMSP-VV apresentaram o contrário disto, embora, depois de 72 horas, a proliferação celu-lar foi semelhante em células homozigóticas quando comparado ao grupo controle. Na con-centração de 10 μM de RES, houve uma diminuição significativa na produção de citocinas inflamatórias em CMSP-AA. No entanto, as CMSP-VV geralmente apresentam uma redução sutil destas citocinas, exceto para TNF-α, que não foi afetado. Em todos os genótipos SOD2, as células expostas ao RES resultaram em uma regulação positiva dos níveis de SIRT1. Em conjunto, estes resultados sugerem que o efeito do RES na ativação de CMSPs não é universal e é dependente do polimorfismo Ala16Val-SOD2.