A nivel mundial, se estima que más de mil millones de personas viven con alguna discapacidad física o mental, lo que representa alrededor del 15% de la población global y esta cifra sigue en aumento. Existe un grupo de enfermedades que afectan la capacidad física motriz, las cuales llegan a postrar a pacientes en cama y a necesitar asistencia de por vida ya que la lesión imposibilita el movimiento desde el cuello hacia abajo. Ante esta problemática, se están desarrollando Interfaces Cerebro Computador, las cuales son usadas como una manera alternativa de comunicación y control para pacientes con discapacidad motriz. Sin embargo, estudios demuestran que aún no se han logrado diseñar dispositivos que logren satisfacer las necesidades reales de este tipo de pacientes. En este contexto, el presente trabajo presenta el diseño de una interfaz cerebro computador, el cual se compone por un casco de adquisición de señales cerebrales, un sistema de procesamiento de señales y el control de un dispositivo robótico con forma de mano humanoide. El diseño del headset posee las siguientes características: i) Portable y basados en estándares antropométricos de medidas de cabeza; ii) Mecanismo de sujeción y reposicionamiento de electrodos basado en el sistema internacional 10-20 de posicionamiento de electrodos. La etapa de procesamiento de señales se realizó mediante una simulación usando el software OpenVibe, el cual es un software especializado para interfaces cerebro computador y permite realizar una programación mediante bloques. Asimismo, se demostró el control de una mano robot humanoide mediante un experimento, en el cual se logró comunicar el software de procesamiento de señales con un controlador Arduino, el cual comanda los servomotores que permiten mover la mano. Finalmente, la implementación del presente proyecto tiene un costo de S/.14948.92, teniendo en cuenta el costo de diseño, costo de componentes tanto mecánicos como electrónicos, costo de fabricación e imprevistos.

[ES] La obesidad es uno de los principales problemas de salud pública debido a su elevada prevalencia y a las comorbilidades asociadas, lo que se traduce en una reducción considerable de la calidad y esperanza de vida, además de un enorme gasto económico. Su origen es multifactorial y el desarrollo de terapias efectivas para combatirla resulta complejo. La microbiota intestinal ejerce un papel relevante en el mantenimiento del balance energético y salud metabólica. Por ello, las estrategias basadas en la modificación de la microbiota intestinal son consideradas potenciales alternativas para el manejo clínico de la obesidad. No obstante, se requiere un mayor conocimiento sobre cuáles son las especies bacterianas clave en el mantenimiento de la homeostasis energética del hospedador y su modo de acción. El objetivo general de la tesis ha sido identificar nuevas estrategias basadas en la manipulación de la composición y funciones de la microbiota intestinal eficaces contra la obesidad, así como sus mecanismos de interacción con el hospedador. El capítulo primero de la tesis se centra en estudiar los mecanismos de acción por los que Bacteroides uniformis CECT 7771 ejerce efectos protectores frente al desarrollo de la obesidad, tal y como nuestro grupo ha descrito en trabajos previos. A través de un estudio en ratones con obesidad inducida por la dieta hemos demostrado que esta cepa reduce la disfunción metabólica a través de la modulación de la microbiota intestinal y las alteraciones inmunológicas en el intestino y el tejido adiposo asociados a la obesidad. Todos los efectos sobre el eje intestino-tejido adiposo parecen estar mediados por la activación de TLR5. Además, hemos desarrollado una estrategia similar a un simbiótico con el fin de incrementar la eficacia de esta bacteria administrándola a dosis menores. La formulación simbiótica se diseñó en base a la preferencia de B. uniformis CECT 7771 por el salvado de trigo (WBE) como fuente de carbono en cultivos in vitro. La administración conjunta de la bacteria y WBE mostró beneficios inmuno-metabólicos al reducir el aumento de peso corporal y la adiposidad, al tiempo que mejoraron las rutas del metabolismo energético moduladas por insulina y la homeostasis inmunológica intestinal. Además, reforzó la primera línea de defensa inmunológica al aumentar los niveles de butirato y restaurar los niveles de IEL inducidos y las ILC3. En el segundo capítulo hemos llevado a cabo dos estudios preclínicos que describen los efectos de dos nuevas bacterias autóctonas del tracto gastrointestinal humano como potenciales probióticos para el tratamiento de la obesidad identificadas por el grupo. El primer estudio, la administración de Holdemanella biformis CECT 9752 a ratones con obesidad inducida por la dieta redujo los niveles de glucosa en ayuno y mejoró la tolerancia oral a la glucosa de forma independiente a la insulina. A nivel del contenido luminal del intestino grueso, la bacteria incrementó los niveles de ácidos grasos insaturados, potenciales secretagogos lipídicos de GLP-1. A nivel del intestino delgado, incrementó la sensibilidad a GLP-1 de las neuronas vagales aferentes, mecanismo implicado en la producción endógena de glucosa. A nivel hepático, la suplementación con la bacteria redujo la gluconeogénesis y mejoró la sensibilidad a insulina. En el segundo estudio hemos evaluado los efectos inmuno-metabólicos de Phascolarctobacterium faecium DSM 32890, consumidora de succinato y productora de propionato en un modelo animal de obesidad. La administración redujo el aumento de peso corporal y la ingesta de alimentos y mejoró la tolerancia oral a la glucosa. Estos beneficios se asociaron a un aumento sostenido de la hormona intestinal anorexigénica PYY en plasma y una prevención de la hipersecreción de GIP inducida por la dieta rica en grasa. Además, la bacteria normalizó la inmunidad intestinal alterada en la obesidad, y mejoró / [CA] L'obesitat és un dels principals problemas de salut pública a causa de la seua elevada prevalença i a les comorbilitats associades, la qual cosa es tradueix en una reducció considerable de la qualitat i de l'esperança de vida, a més d'una enorme despesa econòmica. El seu origen es multifactorial i el desenvolupament de teràpies efectives per combatre-les resulta complex. La microbiota intestinal exerceix un paper rellevant en el manteniment del balanç energètic i salut metabòlica. Per això, les estrategias basades en la modificació de la microbiota intestinal son considerades hui en dia potencials alternatives per al maneig clínic de l'obesitat. No obstant això, es requereix d'un major coneixement sobre quines son les espècies bacterianes claus al manteniment de l'homeòstasi energètica de l'hoste i la seua manera d'acció. L'objectiu general de la tesi ha sigut identificar noves estratègies basades en la manipulació de la composició i funcions de la microbiota intestinal eficaces contra l'obesitat, així com els seus mecanismes d'interacció amb l'hoste. El capítol primer de la tesi es centra en estudiar els mecanismes d'acció pels quals Bacteroides uniformis CECT 7771 exerceix efectes protectors enfront del desenvolupament de l'obesitat, tal com el nostre grup ha descrit previament. A través d'un estudi en ratolins amb obesitat induïda per la dieta hem demostrat que aquesta soca redueix la disfunció metabòlica a través de la modulació de la microbiota intestinal i les alteracions immunològiques en l'intestí i al teixit adipos epididimal associats a l'obesitat. Tots els efectes sobre l'eix intestí-teixit adipós semblen estar mediades per l'activació de TLR5. A més, hem desenvolupat una estrategia similar a un simbiòtic amb la finalitat d'incrementar l'eficàcia d'aquest bacteri administrant-la a dosis menors. La fomulació simbiòtica es va dissenyar basant-se en la preferència de B. uniformis CECT 7771 pel segó del blat (WBE) com a font de carboni en cultius in vitro. L'administració conjunta de la bacteria i WBE va mostrar beneficis immuno-metabòlics al reduir l'augment de pes corporal i l'adipositat, al mateix temps que van millorar les rutes del metabolisme energètic modulades per insulina i la homeòstasi immunològica intestinal. A més, va reforçar la primera línia de defensa immunològica augmentant els nivells de butirat i restaurant els nivells de IEL induïts i de ILC3. Al segon capítol de la tesi hem dut a terme dos estudis preclínics que descriuen els efectes de dos nous bacteris autòctones del tracte gastrointestinal humà com a potencials probiòtics per al tractament de l'obesitat identificades amb posterioritat pel grup. El primer estudi, l'administració de Holdemanella biformis CECT 9752 a un model animal d'obesitat va reduir els nivells de glucosa en dejú i va millorar la tolerància oral a la glucosa de manera independent a la insulina. A nivell del contingut luminal de l'intestí gros, el bacteri va incrementar els nivells d'àcids grassos insaturats, potencials secretagogos lipídics de GLP-1. A nivell de l'intestí prim, va incrementar la sensibilitat a GLP-1 de les neurones vagals aferents, mecanisme implicat en la producció endògena de glucosa. A nivell hepàtic, la suplementació amb el bacteri va reduir la gluconeogènesi i va millorar la sensibilitat a insulina. En el segon estudi hem avaluat els efectes immuno-metabòlics de Phascolarctobacterium faecium DSM 32890, consumidora de succinat i productora de propionat a un model animal d'obesitat. L'administració va reduir l'augment de pes corporal i l'ingesta d'aliments i va millorar la tolerància oral a la glucosa. Aquests beneficis es van associar a un augment sostingut de l'hormona intestinal anorexigénica PYY en plasma i la prevenció de la hipersecreció de GIP induïda per la dieta rica en greix. A més, el bacteri va normalitzar la immunitat intestinal alterada en l'obesitat i va millorar / [EN] Obesity is one of the main public health problems due to its high prevalence and associated comorbidities, which results in a considerable reduction of the health-related quality of life and life expectancy, as well as in an overwhelming cost to global health economies. It has a multifactorial origin and the development of effective therapies is complex and has become one of the main challenges for society. The gut microbiota plays an important role in the maintenance of energy balance and metabolic health. Therefore, strategies based on gut microbiota modification to beneficially modulate energy metabolism are nowadays considered potential alternatives for the clinical management of obesity. However, the effective implementation of these strategies requires the identification of key bacterial species for the maintenance of host energy homeostasis as well as the better understanding of which mechanisms are behind of their effects. The general objective of this doctoral thesis has been to identify new and effective strategies against obesity based on the manipulation of the gut microbiota composition and function, as well as their mechanisms of interaction with the host. The first chapter of the thesis focuses on studying the mechanisms of action by which Bacteroides uniformis CECT 7771 induces protective effects against the onset of obesity, based on previous studies of our group. An intervention conducted in diet-induced obese mice, we have demonstrated that this strain reduces metabolic dysfunction through the modulation of the intestinal microbiota and immune players obesity associated in both intestine and epididymal white adipose tissue. All the effects on the gut-adipose tissue axis appear to be mediated by TLR5 activation. Moreover, we have developed a symbiotic strategy with the aim of increasing the B. uniformis anti-obesity efficacy at lower doses. The symbiotic formulation was designed based on the preference of B. uniformis CECT 7771 for wheat bran (WBE) as a carbon source in in vitro cultures. The co-administration of the bacteria and WBE showed immuno-metabolic benefits reducing body weight gain and adiposity, along with improving insulin-modulated energy metabolism pathways and intestinal immune homeostasis. In addition, It strengthened the first line of immune defence by increasing butyrate levels and restoring levels of induced IEL and ILC3. In the second chapter of the thesis we have carried out two pre-clinical studies describing the effects of two new autochthonous bacteria of the human gastrointestinal tract as potential probiotics for the treatment of obesity identified later by the group. The first study, the administration of Holdemanella biformis CECT 9752 in an animal model obesity reduced fasting glucose levels and improved oral glucose tolerance in an insulin-independent manner. In the luminal content of the large intestine, the bacteria increased the abundance of unsaturated fatty acids, potential GLP-1 secretagogues. In the small intestine, it could directly increase the GLP-1 sensitivity of vagal afferent neurons, a mechanism involved in hepatic endogenous glucose production. At the hepatic level, the supplementation with the bacteria reduced gluconeogenesis and improved insulin sensitivity. In the second study we have evaluated the immuno-metabolic effects of Phascolarctobacterium faecium DSM 32890 succinate consumer and propionate producer in an animal model of diet-induced obesity. The bacteria reduced body weight gain and food intake and improved oral glucose tolerance. These benefits were associated with a sustained increase in plasma of the anorexigenic gut hormone PYY and a prevention of high-fat diet-induced GIP hypersecretion. In addition, the bacteria normalized the impaired intestinal immunity in obesity and improved intestinal barrier integrity. / This study received funding from the European Union Horizon 2020 research and innovation program under the Marie Sklodowska-Curie grant agreement No. 797297 (M.R-P) and from the European Union 7th Framework program under the grant agreement no 613979 (MyNewGut) and grant AGL2017-88801-P from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MCIU, Spain). The Santiago Grisolía scholarship (GRISOLIAP/2014/110) to E.F from Generalitat Valenciana and the FPI scholarship (BES-2015-073930) of I López-Almela and the PTA contract (PTA2013-8836-I) of I. Campillo from MCIU are fully acknowledged. / López Almela, I. (2021). Descifrando las funciones de la microbiota intestinal en la obesidad [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/174897

[ES] El alcohol es una de las drogas más aceptadas y consumidas a nivel mundial, y su ingesta crónica causa alteraciones en el sistema nervioso central, desde desmielinización hasta muerte neural. Se ha demostrado que gran parte de estos efectos estarían mediados por la activación del sistema inmune innato, principalmente a través del receptor TLR4, que desemboca en un estado inflamatorio. Para ahondar en estos mecanismos, en esta tesis se pretende analizar si el consumo crónico de etanol puede causar modificaciones en los miARNs de la corteza cerebral, regulando la expresión de genes proinflamatorios asociados a la ruta de señalización del TLR4 y si el uso de la curcumina como terapia es capaz de disminuir estos efectos. Además, analizaremos si el consumo de alcohol a largo plazo es capaz de alterar la microbiota intestinal, y la implicación del TLR4 en estos procesos. Nuestros resultados demuestran que el etanol es capaz de alterar la expresión de diferentes microARNs que regulan la expresión de genes proinflamatorios y asociados a la vía del TLR4. La ausencia del receptor causa un perfil de expresión distinto tanto en los controles como en los animales alcohólicos crónicos. Puesto que en los últimos años nos hemos interesado en la búsqueda de una posible terapia para paliar la neuroinflamación producida por el etanol, hemos usado el BDMC, un curcuminoide con capacidad antiinflamatoria y antioxidante, para revertir los daños causados por el abuso del alcohol. Para su administración proponemos su conjugación con un polipéptido que elimina los tradicionales problemas asociados al uso de estos compuestos naturales como son su vida media corta y su baja biodisponibilidad, sin que hayamos registrado toxicidad. El uso de este polímero en animales con un consumo crónico de etanol produce una disminución de la inflamación, tanto a nivel proteico como de expresión génica. Considerando que otra de las regiones del organismo más afectadas por el alcohol es el tracto gastrointestinal, y que la población bacteriana puede ser modificada en determinadas enfermedades o por el uso de sustancias nocivas, produciendo una disbiosis, hemos comparado el efecto del alcohol sobre la población bacteriana y la participación del receptor TLR4 en estos efectos. Mediante análisis de expresión génica, confirmamos que el tejido intestinal ausente del receptor TLR4 es menos susceptible de sufrir cambios debidos al consumo de alcohol. Sin embargo, no hemos encontrado en estos animales la expresión aumentada de genes proinflamatorios característica de los tratamientos alcohólicos. Además, los ratones carentes de este receptor presentan una microbiota intestinal única y diferente a la encontrada en animales de genotipo normal, con sus propios cambios en el equilibrio bacteriano en respuesta a la ingesta de alcohol. Esta microbiota presenta menor cantidad de especies Gram - y mayor resistencia al desequilibrio ocasionado por el alcohol, que su contraparte en los ratones WT. En general, los resultados científicos que aparecen en esta tesis resaltan el papel del TLR4 en las alteraciones causadas por el consumo crónico de alcohol. Mostramos como cambios causados por el etanol a niveles tan distintos como la regulación mediante miARNs o la microbiota intestinal dependen en gran medida de la respuesta inicial que causa el alcohol en el TLR4. Dado que es un receptor necesario para el correcto funcionamiento de muchos órganos, planteamos un posible tratamiento mediante la inhibición de esta cascada inflamatoria. / [CA] L'alcohol és una de les drogues més acceptades i consumides a nivell mundial, i la seva ingesta crònica causa alteracions al sistema nerviós central, des de desmielinització fins a mort neural. S'ha demostrat que gran part d'aquests efectes estarien intervinguts per l'activació del sistema immune innat, principalment a través del receptor TLR4, que desemboca en un estat inflamatori. Per aprofundir en aquests mecanismes, en aquesta tesi es pretén analitzar si el consum crònic d'etanol pot causar modificacions als miARNs de l'escorça cerebral, regulant l'expressió de gens proinflamatoris associats a la ruta de senyalització del TLR4 i si l'ús de la curcumina com a teràpia és capaç de disminuir aquests efectes. A més, analitzarem si el consum d'alcohol a llarg termini és capaç d'alterar la microbiota intestinal i la implicació del TLR4 en aquests processos. Els nostres resultats demostren que l'etanol pot alterar l'expressió de diferents microARNs que regulen l'expressió de gens proinflamatoris i associats a la via del TLR4. L'absència del receptor causa un perfil d'expressió diferent tant als controls com als animals alcohòlics crònics. Com que els darrers anys ens hem interessat en trobar una possible teràpia per pal·liar la neuroinflamació produïda per l'etanol, hem utilizat el BDMC, un curcuminoide amb capacitat antiinflamatòria i antioxidant, per revertir els danys causats per l'abús de l'alcohol. Per a la seva administració proposem la seva conjugació amb un polipèptid que elimina els problemes tradicionals associats a l'ús d'aquests compostos naturals com són la seva vida mitjana curta i la seva baixa biodisponibilitat, sense que haguem registrat toxicitat. L¿ús d¿aquest polímer en animals amb un consum crònic d¿etanol produeix una disminució de la inflamació, tant a nivell proteic com d¿expressió gènica. Considerant que una altra de les regions de l'organisme més afectades per l'alcohol és el tracte gastrointestinal, i que la població bacteriana pot ser modificada en determinades malalties o per l'ús de substàncies nocives, produint una disbiosi, hem comparat l'efecte de l'alcohol sobre la població bacteriana i la participació del receptor TLR4 en aquests efectes. Mitjançant una anàlisi d'expressió gènica, confirmem que el teixit intestinal absent del receptor TLR4 és menys susceptible de patir canvis deguts al consum d'alcohol. Tot i això, no hem trobat en aquests animals l'expressió augmentada de gens proinflamatoris característica dels tractaments alcohòlics. A més, els ratolins sense aquest receptor presenten una microbiota intestinal única i diferent de la trobada en animals de genotip normal, amb els seus propis canvis en l'equilibri bacterià en resposta a la ingesta d'alcohol. Aquesta microbiota presenta menor quantitat d'espècies Gram - i més resistència al desequilibri ocasionat per l'alcohol, que la contrapart en els ratolins WT. En general, els resultats científics que apareixen en aquesta tesi ressalten el paper del TLR4 a les alteracions causades pel consum crònic d'alcohol. Mostrem com a canvis causats per l'etanol a nivells tan diferents com la regulació mitjançant miARNs o la microbiota intestinal depenen en gran mesura de la resposta inicial que causa l'alcohol al TLR4. Atès que és un receptor necessari per al funcionament correcte de molts òrgans, plantegem un possible tractament mitjançant la inhibició d'aquesta cascada inflamatòria. / [EN] Alcohol is one of the most accepted and consumed drugs worldwide, and its chronic consumption causes alterations in the central nervous system, such as demyelination and neural death. It has been shown that these effects would be mediated by the activation of the innate immune system, mainly through the TLR4 receptor, which leads to an inflammatory response. To inquire into these mechanisms, this thesis aims to analyse whether chronic ethanol consumption can cause changes in miRNAs in the cerebral cortex, regulating the expression of proinflammatory genes associated with the TLR4 signalling pathway, and whether the use of curcumin as a therapy it is able to reduce these effects. In addition, we will analyse if long-term alcohol consumption can alter the intestinal microbiota, and the involvement of TLR4 in these processes. Our results show that ethanol can alter the expression of different microRNAs that regulate the expression of proinflammatory genes associated with the TLR4 pathway. The absence of this receptor causes a different expression profile in both controls and chronic alcoholic animals. Taking into account our interest in seeking a possible therapy to alleviate the neuroinflammation caused by ethanol, we have used BDMC, a curcuminoid with anti-inflammatory and antioxidant activity, to ameliorate the damage caused by alcohol abuse. For its administration, we propose its conjugation with a polypeptide that eliminates the traditional problems associated with the use of these natural compounds, such as their short half-life and low bioavailability, with no toxicity recorded. The use of this polymer in animals with chronic ethanol consumption produces a decrease in inflammation, at both protein level and gene expression. Considering that another of the regions of the body most affected by alcohol is the gastrointestinal tract, and that bacterial population can be modified in certain diseases or due to harmful substances, producing dysbiosis, we have compared the effect of alcohol on the bacterial population and the participation of the TLR4 receptor in these effects. Using gene expression analysis, we confirm that intestinal tissue without TLR4 receptor show less changes induced by the alcohol consumption. However, we have not found in these animals an increased expression of proinflammatory genes which are observed in alcoholic treatments. In addition, mice lacking this receptor have a unique intestinal microbiota, which is different from the normal genotype animals, with their own changes in bacterial balance in response to alcohol intake. This microbiota has less Gram - species and greater resistance to imbalance caused by alcohol than its counterpart in WT mice. In general, the results of this thesis highlight the role of TLR4 in the alterations caused by chronic alcohol consumption. We show that ethanol can cause changes at different levels, such as regulation of miRNAs or intestinal microbiota, which largely depend on the TLR4 activation induced by ethanol. Therefore, herein we demonstrate the importance of the TLR4 to the correct activity of several body organs, and we propose a possible treatment by inhibiting its inflammatory cascade. / Cuesta Díaz, CM. (2022). Papel de los receptores TLR4 y de la microbiota intestinal en los procesos inflamatorios y neuroinflamatorios causados por el consumo crónico de alcohol, y posibles terapias con curcuminoides [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/183832

ntrodução: A mielite transversa longitudinal extensa (MTLE), uma forma grave de síndrome medular (SM) inflamatória associada à lesão da medula espinhal (LME) propagada por três ou mais segmentos vertebrais (SV) à ressonância magnética (RM), é considerada um espectro da neuromielite óptica (ENMO). A neuromielite óptica (NMO), caracterizada por episódios graves e recorrentes de neurite óptica e mielite, é associada a um anticorpo específico, direcionado contra a aquaporina-4 (AQP4-IgG), presente em cerca de 80% dos casos da NMO e 40% dos casos de MTLE isolada. O uso de terapia imunossupressora de manutenção, indicada em pacientes com NMO, é indefinido naqueles com primeiro episódio de MTLE (PEMTLE), cujos casos soronegativos podem representar o evento inicial da NMO ou uma forma isolada da MTLE (MTLEI). A distinção entre estas entidades, por critérios clínicos, paraclínicos e evolutivos, ainda não foi estudada e constitui o objetivo deste estudo. Métodos: Entre 2005 e 2011, 182 pacientes consecutivos admitidos na Clinica Neurológica da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo com MTLE foram avaliados. Critérios de exclusão: doença vascular, desmielinizante, infecciosa ou sistêmica que justificasse o quadro de MTLE. Critérios de inclusão: 41 pacientes com PEMTLE, sem etiologia definida. A casuística consistiu de 27 (65,9%) mulheres, e 33 (80,5%) afrodescendentes, com idade média de 39,5 anos. Avaliados quanto à sorologia para o AQP4-IgG (imunofluorescência indireta) e quanto à recorrência, os pacientes foram classificados como ENMO ou MTLEI ao final do acompanhamento prospectivo. Os dados clinicos, laboratoriais, imagenológicos e evolutivos foram comparados, e o modelo de análise discriminante (AD) foi utilizado para diferenciar as duas condições clínicas. Resultados: Após o seguimento prospectivo médio de 3,7 anos (DP±2,2), 22 pacientes (53,%) apresentaram MTLE isolada monofásica e soronegativa e 19 (46,3%) receberam diagnóstico de ENMO, em razão da soropositividade para AQP4-IgG em 11 (26,8%) e/ou recorrência em 12 (29,3%) pacientes. O perfil demográfico não distinguiu os grupos (p>0,5), e as seguintes variáveis clínicas sugeriram o diagnóstico de MTLEI (p<0,05): SM estrita de instalação aguda, com média de 7 dias, com déficit motor moderado, menor freqüência de sinal de Lhermitte e espasmos tônicos, ausência de sintomas sistêmicos e sugestivos de comprometimento do tronco, tais como mialgia, astenia, anorexia, soluços, náuseas ou vômitos. As seguintes variáveis paraclínicas suportaram o diagnóstico de MTLEI (p<0,05): discreta pleocitose no líquido cefalorraquidiano, sobretudo com menos de 50 células/mm3, e LME à RM com extensão menor que 6 SV, associado à ausência de lesões bulbares e alterações encefálicas inespecíficas. A distinção entre a MTLE isolada e o ENMO foi validada pelo modelo de AD (p=0,005). Na fase aguda, a redução na incapacidade funcional ocorreu em todos os pacientes tratados (p<0,05). Na fase crônica, o uso de tratamento imunossupressor associou-se à menor chance de recorrência quando comparada à historicamente estimada, em pacientes soropositivos, e não implicou em menor chance de recorrência no grupo de soronegativos (p=1,0). Conclusão: O primeiro episódio de MTLEI apresenta características clinicas, laboratoriais e radiológicas distintas do ENMO. O perfil clínico, a soronegatividade ao AQP4-IgG e a evolução monofásica no período de 3 anos, permitem delinear uma entidade clínica restrita à medula espinhal / Background: Longitudinally extensive transverse myelitis (LETM), refers to severe inflammatory spinal cord syndrome associated with propagate lesion spanning over three or more vertebral segments (VS) on spinal cord Magnetic Resonance Image (MRI), and is regarded a spectrum of NMO (NMOSD). NMO, characterized by recurrent course of severe optic neuritis and myelitis, is associated with serum antibody that target aquaporin-4 (AQP4-IgG) in 80% of NMO and around 40% of LETM. Chronic immunosupression is suggested in NMO, while is uncertain in first-ever LETM (FELETM). In this context, seronegative cases may represent a limited form of NMO or an isolated LETM (ILETM). Discriminate between this clinical conditions, through significant therapeutic implications, are not clear. The aim of present study is distinguish ILETM from NMOSD by clinical, paraclincal and evolution parameters. Methods: We evaluated all 182 consecutive patients admitted with LETM at Neurologic Clinic of Sao Paulo University School of Medicine between 2005 until 2011. Exclusion criteria were vascular, demyelinating, infectious or systemic disease associated with LETM. The sample consists of 41 FELETM patients, 27 (65.9%) female, e 33 (80.5%) afro-brazilian, with mean age of onset of 39.5 (±15.5 of standard deviation (SD). Patients, evaluated to AQP4-IgG serologic status and recurrence, were classified as ILETM or NMOSD at end of follow-up. Clinical, serological, neuroimaging and evolutive data were compared and discriminant analysis model were done to distinguish between both conditions. Results: Over the mean time of follow-up of 3.7 years (±2.2SD), 22 patients presents as monophasic seronegative ILETM, while 19 (46.3%) were diagnosed as NMOSD due AQP4-IgG seropositivity in 11 (26.8%) or recurrent evolution in 12 (29.3%) patients. Demographic data did not discern groups (p>0.5), while following clinical features suggested ILETM (p<0.05): acute installation, over seven days mean, of strict spinal cord syndrome, characterized by moderate motor impairment, and lower frequency of Lhermitte sign and tonic spasms, associated without systemic and brainstem symptoms such as myalgia, anorexia, asthenia, nausea, hiccups or vomiting. Subsequent paraclinical findings discern both conditions and endured ILETM (p<0.05): mild pleocitosis, typically under 30 cels/mm3, and SCL propagate over lesser then six VS on MRI beside absence of bulbar and nonspecific brains abnormalities. AD model validate distinction between ILETM and NMOSD (p=0.005). Reduction in disability occurred in all patients treated with immunesuppressors at acute stage (p<0.001). Seropositive LETM patients developed lower recurrence rate when compared with hystoric controls. In seronegative LETM patients, relapse rate did not correlate with chronic imunossupression (p=1.0). Conclusion: First-ever LETM presents clinical and paraclinical features distinctive from NMOSD. Thus, clinical pattern, AQP4-IgG negative serologic status and monophasic evolution over three years follow-up, allowed us delineate a spinal cord-restrict clinical entity

ntrodução: A mielite transversa longitudinal extensa (MTLE), uma forma grave de síndrome medular (SM) inflamatória associada à lesão da medula espinhal (LME) propagada por três ou mais segmentos vertebrais (SV) à ressonância magnética (RM), é considerada um espectro da neuromielite óptica (ENMO). A neuromielite óptica (NMO), caracterizada por episódios graves e recorrentes de neurite óptica e mielite, é associada a um anticorpo específico, direcionado contra a aquaporina-4 (AQP4-IgG), presente em cerca de 80% dos casos da NMO e 40% dos casos de MTLE isolada. O uso de terapia imunossupressora de manutenção, indicada em pacientes com NMO, é indefinido naqueles com primeiro episódio de MTLE (PEMTLE), cujos casos soronegativos podem representar o evento inicial da NMO ou uma forma isolada da MTLE (MTLEI). A distinção entre estas entidades, por critérios clínicos, paraclínicos e evolutivos, ainda não foi estudada e constitui o objetivo deste estudo. Métodos: Entre 2005 e 2011, 182 pacientes consecutivos admitidos na Clinica Neurológica da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo com MTLE foram avaliados. Critérios de exclusão: doença vascular, desmielinizante, infecciosa ou sistêmica que justificasse o quadro de MTLE. Critérios de inclusão: 41 pacientes com PEMTLE, sem etiologia definida. A casuística consistiu de 27 (65,9%) mulheres, e 33 (80,5%) afrodescendentes, com idade média de 39,5 anos. Avaliados quanto à sorologia para o AQP4-IgG (imunofluorescência indireta) e quanto à recorrência, os pacientes foram classificados como ENMO ou MTLEI ao final do acompanhamento prospectivo. Os dados clinicos, laboratoriais, imagenológicos e evolutivos foram comparados, e o modelo de análise discriminante (AD) foi utilizado para diferenciar as duas condições clínicas. Resultados: Após o seguimento prospectivo médio de 3,7 anos (DP±2,2), 22 pacientes (53,%) apresentaram MTLE isolada monofásica e soronegativa e 19 (46,3%) receberam diagnóstico de ENMO, em razão da soropositividade para AQP4-IgG em 11 (26,8%) e/ou recorrência em 12 (29,3%) pacientes. O perfil demográfico não distinguiu os grupos (p>0,5), e as seguintes variáveis clínicas sugeriram o diagnóstico de MTLEI (p<0,05): SM estrita de instalação aguda, com média de 7 dias, com déficit motor moderado, menor freqüência de sinal de Lhermitte e espasmos tônicos, ausência de sintomas sistêmicos e sugestivos de comprometimento do tronco, tais como mialgia, astenia, anorexia, soluços, náuseas ou vômitos. As seguintes variáveis paraclínicas suportaram o diagnóstico de MTLEI (p<0,05): discreta pleocitose no líquido cefalorraquidiano, sobretudo com menos de 50 células/mm3, e LME à RM com extensão menor que 6 SV, associado à ausência de lesões bulbares e alterações encefálicas inespecíficas. A distinção entre a MTLE isolada e o ENMO foi validada pelo modelo de AD (p=0,005). Na fase aguda, a redução na incapacidade funcional ocorreu em todos os pacientes tratados (p<0,05). Na fase crônica, o uso de tratamento imunossupressor associou-se à menor chance de recorrência quando comparada à historicamente estimada, em pacientes soropositivos, e não implicou em menor chance de recorrência no grupo de soronegativos (p=1,0). Conclusão: O primeiro episódio de MTLEI apresenta características clinicas, laboratoriais e radiológicas distintas do ENMO. O perfil clínico, a soronegatividade ao AQP4-IgG e a evolução monofásica no período de 3 anos, permitem delinear uma entidade clínica restrita à medula espinhal / Background: Longitudinally extensive transverse myelitis (LETM), refers to severe inflammatory spinal cord syndrome associated with propagate lesion spanning over three or more vertebral segments (VS) on spinal cord Magnetic Resonance Image (MRI), and is regarded a spectrum of NMO (NMOSD). NMO, characterized by recurrent course of severe optic neuritis and myelitis, is associated with serum antibody that target aquaporin-4 (AQP4-IgG) in 80% of NMO and around 40% of LETM. Chronic immunosupression is suggested in NMO, while is uncertain in first-ever LETM (FELETM). In this context, seronegative cases may represent a limited form of NMO or an isolated LETM (ILETM). Discriminate between this clinical conditions, through significant therapeutic implications, are not clear. The aim of present study is distinguish ILETM from NMOSD by clinical, paraclincal and evolution parameters. Methods: We evaluated all 182 consecutive patients admitted with LETM at Neurologic Clinic of Sao Paulo University School of Medicine between 2005 until 2011. Exclusion criteria were vascular, demyelinating, infectious or systemic disease associated with LETM. The sample consists of 41 FELETM patients, 27 (65.9%) female, e 33 (80.5%) afro-brazilian, with mean age of onset of 39.5 (±15.5 of standard deviation (SD). Patients, evaluated to AQP4-IgG serologic status and recurrence, were classified as ILETM or NMOSD at end of follow-up. Clinical, serological, neuroimaging and evolutive data were compared and discriminant analysis model were done to distinguish between both conditions. Results: Over the mean time of follow-up of 3.7 years (±2.2SD), 22 patients presents as monophasic seronegative ILETM, while 19 (46.3%) were diagnosed as NMOSD due AQP4-IgG seropositivity in 11 (26.8%) or recurrent evolution in 12 (29.3%) patients. Demographic data did not discern groups (p>0.5), while following clinical features suggested ILETM (p<0.05): acute installation, over seven days mean, of strict spinal cord syndrome, characterized by moderate motor impairment, and lower frequency of Lhermitte sign and tonic spasms, associated without systemic and brainstem symptoms such as myalgia, anorexia, asthenia, nausea, hiccups or vomiting. Subsequent paraclinical findings discern both conditions and endured ILETM (p<0.05): mild pleocitosis, typically under 30 cels/mm3, and SCL propagate over lesser then six VS on MRI beside absence of bulbar and nonspecific brains abnormalities. AD model validate distinction between ILETM and NMOSD (p=0.005). Reduction in disability occurred in all patients treated with immunesuppressors at acute stage (p<0.001). Seropositive LETM patients developed lower recurrence rate when compared with hystoric controls. In seronegative LETM patients, relapse rate did not correlate with chronic imunossupression (p=1.0). Conclusion: First-ever LETM presents clinical and paraclinical features distinctive from NMOSD. Thus, clinical pattern, AQP4-IgG negative serologic status and monophasic evolution over three years follow-up, allowed us delineate a spinal cord-restrict clinical entity

Hintergrund: Das Baraitser-Winter-Zerebro-Fronto-Faziale-Syndrom (BWCFF-S) gehört mit einer Prävalenz von 1:1.000.000 zu den sehr seltenen genetischen Krankheiten und wird durch Missense-Mutationen in den Genen ACTB und ACTG1, die die zytoplasmatischen Aktin-Isoformen βCYA und γCYA kodieren, verursacht. Neben multiplen fazialen Dysmorphien und Skelettfehlbildungen weisen bis zu 70 % der Patient*innen kortikale Malformationen wie Mikrozephalie und Lissenzephalie auf, deren ursächlichen Pathomechanismen bisher noch nicht erforscht wurden. Ebenso wenig ist über das Expressionsmuster von βCYA und γCYA im humanen Gehirn während der embryonalen Entwicklung bekannt. Die Generierung von zerebralen Organoiden durch Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen (induced pluripotent stem cells, iPS-Zellen), die aus primären Zellen von Patient*innen reprogrammiert werden können, eröffnet neue Möglichkeiten, die Neurogenese und Kortikogenese zu studieren sowie zelluläre Krankheitsmodelle zu entwickeln. Material und Methoden: Das Expressionsmuster von βCYA und γCYA wurde mittels Immunfluoreszenz in humanem fetalem Gehirngewebe sowie zerebralen Organoiden charakterisiert. Aus den iPS-Zelllinien der BWCFF-S-Patientinnen mit Mutationen in jeweils einem Aktin-Gen (ACTB p.Thr120Ile und ACTG1 p.Thr203Met) sowie gesunden Kontrollen wurden unter der Verwendung von zwei Protokollen nach gerichteter und ungerichteter Differenzierung zerebrale Organoide generiert und diese charakterisiert. Mithilfe des CRISPR/Cas9-Systems wurden die gleichen Mutationen in ACTB und ACTG1 in iPS-Zellen der Kontroll-Zelllinien CRTDi011-A und SC102A-1 editiert. Zerebrale Organoide, die nach dem ungerichteten Protokoll differenziert wurden, wurden durch Immunfluoreszenz- und TEM-Analysen hinsichtlich ihrer Zytoarchitektur, Zelltypen und Aktin-Verteilung untersucht. Außerdem wurden Apoptose, Proliferation und Ausrichtung der Zellteilungsebenen der apikalen Progenitorzellen analysiert. Unter Verwendung der RNA-Einzelzell-Sequenzierung wurden die Zellpopulationen von zerebralen BWCFF-S- und Kontroll-Organoiden an zwei unterschiedlichen Kultivierungs-Zeitpunkten analysiert. Zudem wurden Kontroll-iPS-Zellen in neurale Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) differenziert, um die intrazelluläre Lokalisierung der Aktin-Isoformen mit Immunfluoreszenz-Analysen zu bestimmen. Unter Durchführung von Migrationsassays mit Neurospäroiden und zerebralen Organoiden wurden die Migrationseigenschaften der neuralen BWCFF-S-Zellen untersucht. Ergebnisse: In dieser Arbeit wurde das Expressionsmuster der Aktin-Isoformen βCYA und γCYA im humanen fetalen Gewebe, in zerebralen Organoiden sowie in NPCs und Neuronen analysiert. Im humanen fetalen Gewebe und in den zerebralen Organoiden zeigte sich ein überlappendes Expressionsmuster von beiden Isoformen in allen Schichten des Neokortex. Im Gegensatz dazu wiesen Immunfluoreszenz-Färbungen in kultivierten NPCs und Neuronen eine Isoform-spezifische Lokalisierung von βCYA und γCYA auf, mit einer Anreicherung von βCYA im Zellkortex und in den Zellfortsätzen der NPCs, wohingegen γCYA im Zytosol angereichert war. In Neuronen wurde eine stärkere Lokalisierung von βCYA im Wachstumskegel und von γCYA in den Neuriten festgestellt. Zudem wurde die Kultur zerebraler Organoide für die Modellierung des BWCFF-S erfolgreich etabliert. BWCFF-S-Organoide waren im Vergleich zur Kontrolle in ihrer Gesamtgröße signifikant reduziert und zeigten auch kleinere ventrikulären Zonen (VZs) in den Ventrikel-ähnlichen Strukturen. Als Ursache für diese Größenunterschiede konnte die veränderte Ausrichtung der Teilungsebene der apikalen Progenitorzellen (APs) in der Anaphase von vertikal zu horizontal und damit der Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Teilung festgestellt werden, im Zusammenspiel mit einer abnormalen Anreicherung von Mikrotubuli an der ventrikulären Oberfläche in den Ventrikel-ähnlichen Strukturen. Die RNA-Einzelzell-Sequenzierung der zerebralen Kontroll- und BWCFF-S-Organoide zeigte eine Veränderung der Zellpopulation mit einer reduzierten Anzahl von radialen Gliazellen (RGs) und Neuronen in den BWCFF-S-Organoiden. Die BWCFF-S-ähnlichen Organoide mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile, die durch Gen-Editierung der Kontroll-Zelllinie CRTDi011-A generiert wurden, zeigten nahezu in allen Analysen vergleichbare Ergebnisse wie die Patientinnen-eigenen BWCFF-S-Organoide mit derselben Mutation und belegten somit, dass sich durch Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems isogene Kontrollen herstellen lassen. Durch Migrationsassays mit Neurosphäroiden und Organoiden konnte eine gravierend veränderte Migration der neuralen BWCFF-S-Zellen mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile festgestellt werden. Schlussfolgerung: Die Modellierung des BWCFF-S in den zerebralen Organoiden entschlüsselte den zellulären Pathomechanismus der mikrozephalen kortikalen Malformation. Die Veränderung der Ausrichtung der mitotischen Spindel in den APs und dem dadurch entstehenden Wechsel von symmetrischer zu asymmetrischer Teilung führt zu einer Reduktion des Progenitorzellpools und einer verfrühten Neurogenese. Die verringerte Anzahl der Progenitorzellen in der VZ der zerebralen Organoide spiegelt sich in der verminderten Größe der VZs wider. Beide BWCFF-S-assoziierten Mutationen in den Genen ACTB und ACTG1 führten zu einer veränderten Ausrichtung der Teilungsebene in den APs. Die deutliche Einschränkung der neuralen Migration wurde jedoch nur bei Zellen mit der Mutation ACTB p.Thr120Ile festgestellt, was einen ersten Hinweis auf die Isoform-spezifische Funktion der beiden Aktinproteine liefert.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis V Abbildungsverzeichnis X Tabellenverzeichnis XIII 1. Einleitung 1 1.1. Baraitser-Winter-Zerebro-Fronto-Faziales-Syndrom 1 1.1.1. Das klinische Bild und genetische Ursachen 1 1.1.2. Neurologische Symptome und kortikale Malformationen beim BWCFF-S 3 1.2. Aktin 5 1.2.1. Die sechs Aktin-Isoformen 5 1.2.2. Das Aktin-Zytoskelett 5 1.2.3. Die Funktionen des Aktin-Zytoskeletts 8 1.2.4. Das Aktin-Zytoskelett im zentralen Nervensystem (ZNS) 10 1.3. Neuro- und Kortikogenese des humanen Gehirns 12 1.4. Zerebrale Organoide als Modellsysteme für neurologische Entwicklungsstörungen 15 1.5. Ziele dieser Arbeit 20 2. Material 21 2.1. Geräte und Verbrauchsmaterialien 21 2.2. Chemikalien und Kits 23 2.3. Lösungen für die Molekularbiologie 25 2.4. Medien für die Zellkultur 25 2.5. Puffer und Lösungen für Immunfluoreszenz-Analysen 27 2.6. Primer 28 2.7. Guide RNAs (gRNAs), Templates und Cas9 28 2.8. Primäre Antikörper 29 2.9. Sekundäre Antikörper und DNA-Fluoreszenzfarbstoff 30 2.10. Zelllinien 30 2.11. Humanes fetales Gehirngewebe 32 2.12. Software 33 3. Methoden 34 3.1. Molekularbiologische Methoden 34 3.1.1. DNA-Isolierung 34 3.1.2. Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) 34 3.1.3. Gelelektrophorese 35 3.1.4. Aufreinigung der PCR-Produkte 35 3.1.5. Sanger-Sequenzierung 36 3.2. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) 36 3.2.1. Reprogrammierung von dermalen Fibroblasten in iPS-Zellen 36 3.2.2. Kultivierung der iPS-Zellen 37 3.2.3. Gen-Editierung der iPS-Zellen mit CRISPR/Cas9 37 3.3. Differenzierung von iPS-Zellen in neurale Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) und Neurone 39 3.3.1. Kultivierung von Neuronen im XonaChip® 39 3.4. Differenzierung von iPS-Zellen in Vorderhirn-Organoide (forebrain organoids) 40 3.5. Differenzierung von iPS-Zellen in zerebrale Organoide (whole brain organoids) 42 3.6. Migrationsassay mit Neurosphäroiden 43 3.7. Migrationsassay mit zerebralen Organoiden (radiale Migration) 44 3.8. Immunfluoreszenz-Analysen 44 3.8.1. Färbeprotokoll für βCYA und γCYA in Einzelzellen, Organoiden und humanem fetalem Gewebe 45 3.8.2. Protokoll für Immunfluoreszenz-Färbungen mit Antigen-Demaskierung durch Sieden 45 3.9. Mikroskopie 46 3.10. Bildanalyse und Datenerhebung 46 3.10.1. Bildbearbeitung der Immunfluoreszenz-Aufnahmen für die Analyse der Verteilung von βCYA und γCYA in Einzelzellen, zerebralen Organoiden und humanem fetalen Gehirngewebe 46 3.10.2. Bildbearbeitung der Immunfluoreszenz-Aufnahmen von Einzelzellen und zerebralen Organoide 47 3.10.3. Quantifizierungen verschiedener Größen der zerebralen Organoide 47 3.10.4. Bildbearbeitung der Aufnahmen der zerebralen Organoide nach dem Migrationsassay 49 3.11. Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM) 49 3.12. RNA-Einzelzell-Sequenzierung von zerebralen Organoiden 50 3.13. Analyse der RNA-Einzelzell-Sequenzierdaten der zerebralen Organoide 50 3.14. Statistik 51 4. Ergebnisse 53 4.1. Bestätigung der pathogenen Aktin-Varianten in den Patientinnen-spezifischen iPS- und editierten iPS-Zelllinien 53 4.2. Die beiden Aktin-Isoformen βCYA und γCYA zeigen ein überlappendes Expressionsmuster im humanen fetalen Gewebe des Neokortex 55 4.3. Isoform-spezifische intrazelluläre Anreicherung von βCYA und γCYA in neuralen Progenitorzellen (neural progenitor cells, NPCs) und Neuronen 58 4.4. Gehirn-Organoide als Krankheitsmodell für die BWCFF-S-assoziierten kortikalen Malformationen 62 4.4.1. Das Vorderhirn-Protokoll konnte nicht reproduziert werden 62 4.4.2. Differenzierung von Kontroll- und BWCFF-S-iPS-Zelllinien in zerebrale Organoide nach dem Lancaster-Protokoll und erfolgreiche Etablierung des Organoidmodells für Analysen des zellulären Pathomechanismus des BWCFF-S 63 4.5. Zerebrale BWCFF-S-Organoide rekapitulieren die mit dem BWCFF-S-assoziierte Mikrozephalie 64 4.5.1. Die Analyse der Lokalisierung von βCYA und γCYA zeigt keine Unterschiede zwischen zerebralen Kontroll- und BWCFF-S-Organoiden und ist ähnlich der Verteilung im humanen fetalen Neokortex 67 4.5.2. Zerebrale BWCFF-S-Organoide sind signifikant kleiner im Vergleich zu Kontroll-Organoiden 70 4.5.3. BWCFF-S-Organoide zeigen eine signifikant verminderte Größe der Ventrikel-ähnlichen Strukturen mit reduzierter Anzahl der Progenitorzellen 75 4.5.4. BWCFF-S-Organoide zeigen keine Unterschiede in Proliferation und Apoptose im Vergleich zu Kontroll-Organoiden 78 4.5.5. Apikale Progenitorzellen (APs) von BWCFF-S-Organoiden teilen sich vermehrt horizontal statt vertikal 81 4.5.6. Geneditierte BWCFF-S-ähnliche Organoide zeigen ebenfalls eine Veränderung in der Ausrichtung der Zellteilungsebene im Vergleich zur Kontrolle 82 4.5.7. BWCFF-S-Organoide zeigen eine veränderte Morphologie des Adhäsions-Verbindungsgürtels mit apikaler Anreicherung von Mikrotubuli in Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM)- und Immunfluoreszenz-Analysen 85 4.5.8. Geneditierte BWCFF-S-ähnliche Organoide zeigen ebenfalls eine abnormale Morphologie des Adhäsions-Verbindungsgürtels mit einer Anreicherung von Mikrotubuli an der apikalen Oberfläche der VZ 89 4.6. BWCFF-S-NPCs zeigen ein abnormales Migrationsver-halten im Neurosphäroid-Migrationsassay 91 4.7. Zerebrale BWCFF-S-Organoide mit ACTB p.Thr120Ile zeigen kaum Migration von neuralen Zellen 93 4.8. Die RNA-Einzelzell-Sequenzierung zeigt Veränderungen in den Zellpopulationen von BWCFF-S-Organoiden und eine reduzierte Anzahl der RGs und Neurone 96 5. Diskussion 106 5.1. βCYA und γCYA zeigen in Gewebeschnitten des humanen fetalen Neokortex sowie zerebralen Organoiden ein überlappendes Expressionsprofil, weisen aber intrazellulär eine Isoform-spezifische Anreicherung auf 107 5.2. Zerebrale Organoide eignen sich für die Modellierung der mit dem BWCFF-S-assoziierten kortikalen Malformationen 108 5.3. Die asymmetrische, horizontale Zellteilung von APs in BWCFF-S-Organoiden führt zu einer vorzeitigen Neurogenese und erklärt die mit dem BWCFF-S-assoziierte Mikrozephalie 110 5.4. Die Änderung der Orientierung der mitotischen Spindel in den apikalen Progenitorzellen weist auf eine gestörte Interaktion zwischen Mikrotubuli und dem Aktin-Zytoskelett hin 113 5.5. Die BWCFF-S-Organoide zeigen keine grundlegenden strukturellen Veränderungen der AJ 114 5.6. Editierte BWCFF-S-ähnliche Organoide mit cr. ACTB p.Thr120Ile zeigen eine ähnliche Pathologie wie BWCFF-S-Organoide mit ACTB p.Thr120Ile 115 5.7. Limitationen des zerebralen Organoidmodells müssen bei der Krankheitsmodellierung berücksichtig werden 117 5.8. Die BWCFF-S-Mutation ACTB p.Thr120Ile führt zu Migrationsstörungen von neuralen Zellen 119 5.9. BWCFF-S-Organoide haben eine reduzierte Anzahl von RGs und Neuronen 120 6. Ausblick 123 7. Zusammenfassung 125 8. Summary 128 9. Literaturverzeichnis 130 10. Anhang 142 10.1. Charakterisierung der reprogrammierten und editierten iPS-Zellklone 142 10.2. Auswertungsstrategie für die intrazelluläre Verteilung von βCYA und γCYA in NPCs und Neuronen 146 10.3. Werte der Winkel der Zellteilungsebenen der APs in der Anaphase 146 10.4. Immunfluoreszenz-Analysen des Adhäsions-Verbindungs-gürtels 148 10.5. Zusätzliche Daten der RNA-Einzelzell-Sequenzierung 149 11. Danksagung i 12. Veröffentlichungen iv 13. Erklärung zum Antrag auf Eröffnung des Promotionsverfahrens vi 14. Eidesstattliche Versicherung vii

[pt] Interfaces Cérebro Computador (BCIs) são sistemas artificiais que permitem a interação entre a pessoa e seu ambiente empregando a tradução de sinais elétricos cerebrais como controle para qualquer dispositivo externo. Um Sistema de neuroreabilitação baseado em EEG pode combinar portabilidade e baixo custo com boa resolução temporal e nenhum risco para a vida do usuário. Este sistema pode estimular a plasticidade cerebral, desde que ofereça confiabilidade no reconhecimento das tarefas de imaginação motora realizadas pelo usuário. Portanto, o objetivo deste trabalho é o projeto de um sistema de aprendizado de máquinas que, baseado no sinal de EEG de somente dois eletrodos, C3 e C4, consiga classificar tarefas de imaginação motora com alta acurácia, robustez às variações do sinal entre experimentos e entre sujeitos, e tempo de processamento razoável. O sistema de aprendizado de máquina proposto é composto de quatro etapas principais: pré-processamento, extração de atributos, seleção de atributos, e classificação. O pré-processamento e extração de atributos são implementados mediante a extração de atributos estatísticos, de potência e de fase das sub-bandas de frequência obtidas utilizando a Wavelet Packet Decomposition. Já a seleção de atributos é efetuada por um Algoritmo Genético e o modelo de classificação é constituído por um Sistema de Múltiplos Classificadores, composto por diferentes classificadores, e combinados por uma rede neural Multi-Layer Perceptron. O sistema foi testado em seis sujeitos de bases de dados obtidas das Competições de BCIs e comparados com trabalhos benchmark da literatura, superando os resultados dos outros métodos. Adicionalmente, um sistema real de BCI para neurorehabilitação foi projetado, desenvolvido e testado, produzindo também bons resultados. / [en] Brain Computer Interfaces (BCIs) are artificial systems that allow the interaction between a person and their environment using the translated brain electrical signals to control any external device. An EEG neurorehabilitation system can combine portability and affordability with good temporal resolution and no health risks to the user. This system can stimulate the brain plasticity, provided that the system offers reliability on the recognition of the motor imagery (MI) tasks performed by the user. Therefore, the aim of this work is the design of a machine learning system that, based on the EEG signal from only C3 and C4 electrodes, can classify MI tasks with high accuracy, robustness to trial and inter-subject signal variations, and reasonable processing time. The proposed machine learning system has four main stages: preprocessing, feature extraction, feature selection, and classification. The preprocessing and feature extraction are implemented by the extraction of statistical, power and phase features of the frequency sub-bands obtained by the Wavelet Packet Decomposition. The feature selection process is effectuated by a Genetic Algorithm and the classifier model is constituted by a Multiple Classifier System composed by different classifiers and combined by a Multilayer Perceptron Neural Network as meta-classifier. The system is tested on six subjects from datasets offered by the BCIs Competitions and compared with benchmark works founded in the literature, outperforming the other methods. In addition, a real BCI system for neurorehabilitation is designed and tested, producing good results as well.

[pt] As lesões da substância branca são lesões cerebrais não estáticas que têm uma taxa de prevalência de até 98 por cento na população idosa, embora também esteja presente na população jovem. Uma vez que elas podem estar associadas a várias doenças cerebrais, é importante detectá-las o mais cedo possível. A ressonância magnética fornece dados tridimensionais para visualização e análise de tecidos moles, pois contém informações ricas sobre sua anatomia. No entanto, a quantidade de dados adquiridos para essas imagens pode ser excessiva para análise / interpretação manual, representando uma tarefa difícil e demorada para especialistas. Portanto, esta tese de doutorado apresenta quatro novos métodos computacionais para detectar automaticamente lesões de substância branca em imagens de ressonância magnética, baseadas principalmente nos algoritmos SLIC0 e Convolutional Neural Networks. Nosso principal objetivo é fornecer as ferramentas necessárias para que os especialistas acelerem seus trabalhos e sugiram uma segunda opinião. Dos quatro métodos propostos, o que obteve melhores resultados foi aplicado em 91 imagens de ressonância magnética, e obteve uma precisão de 97,93 por cento, especificidade de 98,02 por cento e sensibilidade de 90,12 por cento, sem utilizar nenhuma técnica de redução de candidatos. / [en] White matter lesions are non-static brain lesions that have a prevalence rate up to 98 percent in the elder population, although it is also present in the young population. Because it may be associated with several brain diseases, it is important to detect them as early as possible. Magnetic resonance imaging provides threedimensional data for visualization and analysis of soft tissues as it contains rich information about their anatomy. However, the amount of data acquired for these images may be too much for manual analysis/interpretation alone, representing a difficult and time-consuming task for specialists. Therefore, this doctoral thesis presents four new computational methods to automatically detect white matter lesions in magnetic resonance images, based mainly on algorithms SLIC0 and Convolutional Neural Networks. Our primary objective is to provide the necessary tools for specialists to accelerate their works and suggest a second opinion. From the four proposed methods, the one that achieved best results was applied on 91 magnetic resonance images, and achieved an accuracy of 97.93 percent, specificity of 98,02 percent and sensitivity of 90,12 percent, without using any candidate reduction techniques.

Los trastornos emocionales de tipo depresivo y la ansiedad son las formas más prevalentes de enfermedad mental y suponen un serio problema de salud en la sociedad occidental. Recientemente, se ha postulado que el sistema endocannabinoide pueda ser un importante sustrato en el desarrollo de estos trastornos dada su participación en el control de las emociones. Nuestros resultados demuestran que los animales carentes del receptor cannabinoide CB1 manifiestan un fenotipo de tipo depresivo asociado a una deficiencia del factor neurotrófico BDNF en el hipocampo, que podría estar causada por los elevados niveles de glucocorticoides liberados en respuesta al estrés en estos mutantes. Por otra parte, el sistema endocannabinoide participa en los efectos inducidos por la nicotina sobre la ansiedad y en la expresión del síndrome de abstinencia de esta droga. Así, la actividad del receptor CB1 alivia los efectos ansiogénicos de dosis elevadas de nicotina y facilita los efectos ansiolíticos de dosis bajas. Además, la administración del agonista cannabinoide &#61508;9-THC atenúa las manifestaciones somáticas y emocionales negativas de la abstinencia de nicotina. En general, considerando los resultados presentados en esta Tesis Doctoral, podemos afirmar que el receptor CB1 participa de forma determinante en la recuperación del balance homeostático del organismo tras la exposición a un estímulo emocional negativo, bien sea una situación estresante aguda o sostenida, o bien una droga que incrementa los niveles de ansiedad o cuya retirada produce abstinencia. / Mood disorders such as depression and anxiety are the most common mental diseases and they suppose a serious health problem in our society. Recently, endocannabinoid system has been postulated to be an important substrate in the development of such disorders taking into account the role exerted by this neuromodulatory system in mood and emotions. Our results demonstrate that CB1 knockout mice exhibit a depressive-like phenotype associated to a deficiency in the neurotrophic factor BDNF in the hippocampus, which could be a consequence of the increased glucocorticoid release in response to stress exposure. On the other hand, the endocannabinoid system participates in nicotine induced effects on anxiety and in the expression of nicotine withdrawal. Thus, CB1 receptor activity attenuates anxiogenic-like effects and facilitates anxiolytic-like responses induced by high or low doses of nicotine, respectively. Moreover, &#61508;9-THC administration ameliorates somatic and negative motivational signs of nicotine withdrawal. In summary, the results presented in this Doctoral Thesis indicate that CB1 receptor participates in the recovery of the homeostatic balance after the exposure to negative emotional stimuli, either acute or sustained stress or a drug which induced anxiety-like effects or withdrawal signs after the end of the exposure.

[ES] La electrofisiología extracelular es una técnica ampliamente usada en investigación neurocientífica, la cual estudia el funcionamiento del cerebro mediante la medición de campos eléctricos generados por la actividad neuronal. Esto se realiza a través de electrodos implantados en el cerebro y conectados a dispositivos electrónicos para amplificación y digitalización de las señales. De los muchos modelos animales usados en experimentación, las ratas y los ratones se encuentran entre las especies más comúnmente utilizadas. Actualmente, la experimentación electrofisiológica busca condiciones cada vez más complejas, limitadas por la tecnología de los dispositivos de adquisición. Dos aspectos son de particular interés: Realimentación de lazo cerrado y comportamiento en condiciones naturales. En esta tesis se presentan desarrollos con el objetivo de mejorar diferentes facetas de estos dos problemas. La realimentación en lazo cerrado se refiere a todas las técnicas en las que los estímulos son producidos en respuesta a un evento generado por el animal. La latencia debe ajustarse a las escalas temporales bajo estudio. Los sistemas modernos de adquisición presentan latencias en el orden de los 10ms. Sin embargo, para responder a eventos rápidos, como pueden ser los potenciales de acción, se requieren latencias por debajo de 1ms. Además, los algoritmos para detectar los eventos o generar los estímulos pueden ser complejos, integrando varias entradas de datos en tiempo real. Integrar el desarrollo de dichos algoritmos en las herramientas de adquisición forma parte del diseño experimental. Para estudiar comportamientos naturales, los animales deben ser capaces de moverse libremente en entornos emulando condiciones naturales. Experimentos de este tipo se ven dificultados por la naturaleza cableada de los sistemas de adquisición. Otras restricciones físicas, como el peso de los implantes o limitaciones en el consumo de energía, pueden también afectar a la duración de los experimentos, limitándola. La experimentación puede verse enriquecida cuando los datos electrofisiológicos se ven complementados con múltiples fuentes distintas. Por ejemplo, seguimiento de los animales o miscroscopía. Herramientas capaces de integrar datos independientemente de su origen abren la puerta a nuevas posibilidades. Los avances tecnológicos presentados abordan estas limitaciones. Se han diseñado dispositivos con latencias de lazo cerrado inferiores a 200us que permiten combinar cientos de canales electrofisiológicos con otras fuentes de datos, como vídeo o seguimiento. El software de control para estos dispositivos se ha diseñado manteniendo la flexibilidad como objetivo. Se han desarrollado interfaces y estándares de naturaleza abierta para incentivar el desarrollo de herramientas compatibles entre ellas. Para resolver los problemas de cableado se siguieron dos métodos distintos. Uno fue el desarrollo de headstages ligeros combinados con cables coaxiales ultra finos y conmutadores activos, gracias al seguimiento de animales. Este desarrollo permite reducir el esfuerzo impuesto a los animales, permitiendo espacios amplios y experimentos de larga duración, al tiempo que permite el uso de headstages con características avanzadas. Paralelamente se desarrolló un tipo diferente de headstage, con tecnología inalámbrica. Se creó un algoritmo de compresión digital especializado capaz de reducir el ancho de banda a menos del 65% de su tamaño original, ahorrando energía. Esta reducción permite baterías más ligeras y mayores tiempos de operación. El algoritmo fue diseñado para ser capaz de ser implementado en una gran variedad de dispositivos. Los desarrollos presentados abren la puerta a nuevas posibilidades experimentales para la neurociencia, combinando adquisición elextrofisiológica con estudios conductuales en condiciones naturales y estímulos complejos en tiempo real. / [CA] L'electrofisiologia extracel·lular és una tècnica àmpliament utilitzada en la investigació neurocientífica, la qual permet estudiar el funcionament del cervell mitjançant el mesurament de camps elèctrics generats per l'activitat neuronal. Això es realitza a través d'elèctrodes implantats al cervell, connectats a dispositius electrònics per a l'amplificació i digitalització dels senyals. Dels molts models animals utilitzats en experimentació electrofisiològica, les rates i els ratolins es troben entre les espècies més utilitzades. Actualment, l'experimentació electrofisiològica busca condicions cada vegada més complexes, limitades per la tecnologia dels dispositius d'adquisició. Dos aspectes són d'especial interès: La realimentació de sistemes de llaç tancat i el comportament en condicions naturals. En aquesta tesi es presenten desenvolupaments amb l'objectiu de millorar diferents aspectes d'aquestos dos problemes. La realimentació de sistemes de llaç tancat es refereix a totes aquestes tècniques on els estímuls es produeixen en resposta a un esdeveniment generat per l'animal. La latència ha d'ajustar-se a les escales temporals sota estudi. Els sistemes moderns d'adquisició presenten latències en l'ordre dels 10ms. No obstant això, per a respondre a esdeveniments ràpids, com poden ser els potencials d'acció, es requereixen latències per davall de 1ms. A més a més, els algoritmes per a detectar els esdeveniments o generar els estímuls poden ser complexos, integrant varies entrades de dades a temps real. Integrar el desenvolupament d'aquests algoritmes en les eines d'adquisició forma part del disseny dels experiments. Per a estudiar comportaments naturals, els animals han de ser capaços de moure's lliurement en ambients emulant condicions naturals. Aquestos experiments es veuen limitats per la natura cablejada dels sistemes d'adquisició. Altres restriccions físiques, com el pes dels implants o el consum d'energia, poden també limitar la duració dels experiments. L'experimentació es pot enriquir quan les dades electrofisiològiques es complementen amb dades de múltiples fonts. Per exemple, el seguiment d'animals o microscòpia. Eines capaces d'integrar dades independentment del seu origen obrin la porta a noves possibilitats. Els avanços tecnològics presentats tracten aquestes limitacions. S'han dissenyat dispositius amb latències de llaç tancat inferiors a 200us que permeten combinar centenars de canals electrofisiològics amb altres fonts de dades, com vídeo o seguiment. El software de control per a aquests dispositius s'ha dissenyat mantenint la flexibilitat com a objectiu. S'han desenvolupat interfícies i estàndards de naturalesa oberta per a incentivar el desenvolupament d'eines compatibles entre elles. Per a resoldre els problemes de cablejat es van seguir dos mètodes diferents. Un va ser el desenvolupament de headstages lleugers combinats amb cables coaxials ultra fins i commutadors actius, gràcies al seguiment d'animals. Aquest desenvolupament permet reduir al mínim l'esforç imposat als animals, permetent espais amplis i experiments de llarga durada, al mateix temps que permet l'ús de headstages amb característiques avançades. Paral·lelament es va desenvolupar un tipus diferent de headstage, amb tecnologia sense fil. Es va crear un algorisme de compressió digital especialitzat capaç de reduir l'amplada de banda a menys del 65% de la seua grandària original, estalviant energia. Aquesta reducció permet bateries més lleugeres i majors temps d'operació. L'algorisme va ser dissenyat per a ser capaç de ser implementat a una gran varietat de dispositius. Els desenvolupaments presentats obrin la porta a noves possibilitats experimentals per a la neurociència, combinant l'adquisició electrofisiològica amb estudis conductuals en condicions naturals i estímuls complexos en temps real. / [EN] Extracellular electrophysiology is a technique widely used in neuroscience research. It can offer insights on how the brain works by measuring the electrical fields generated by neural activity. This is done through electrodes implanted in the brain and connected to amplification and digitization electronic circuitry. Of the many animal models used in electrophysiology experimentation, rodents such as rats and mice are among the most popular species. Modern electrophysiology experiments seek increasingly complex conditions that are limited by acquisition hardware technology. Two particular aspects are of special interest: Closed-loop feedback and naturalistic behavior. In this thesis, we present developments aiming to improve on different facets of these two problems. Closed-loop feedback encompasses all techniques in which stimuli is produced in response of an event generated by the animal. Latency, the time between trigger event and stimuli generation, must adjust to the biological timescale being studied. While modern acquisition systems feature latencies in the order of 10ms, response to fast events such as high-frequency electrical transients created by neuronal activity require latencies under $1ms$. In addition, algorithms for triggering or generating closed-loop stimuli can be complex, integrating multiple inputs in real-time. Integration of algorithm development into acquisition tools becomes an important part of experiment design. For electrophysiology experiments featuring naturalistic behavior, animals must be able to move freely in ecologically meaningful environments, mimicking natural conditions. Experiments featuring elements such as large arenaa, environmental objects or the presence of another animals are, however, hindered by the wired nature of acquisition systems. Other physical constraints, such as implant weight or power restrictions can also affect experiment time, limiting their duration. Beyond the technical limits, complex experiments are enriched when electrophysiology data is integrated with multiple sources, for example animal tracking or brain microscopy. Tools allowing mixing data independently of the source open new experimental possibilities. The technological advances presented on this thesis addresses these topics. We have designed devices with closed-loop latencies under 200us while featuring high-bandwidth interfaces. These allow the simultaneous acquisition of hundreds of electrophysiological channels combined with other heterogeneous data sources, such as video or tracking. The control software for these devices was designed with flexibility in mind, allowing easy implementation of closed-loop algorithms. Open interface standards were created to encourage the development of interoperable tools for experimental data integration. To solve wiring issues in behavioral experiments, we followed two different approaches. One was the design of light headstages, coupled with ultra-thin coaxial cables and active commutator technology, making use of animal tracking. This allowed to reduce animal strain to a minimum allowing large arenas and prolonged experiments with advanced headstages. A different, wireless headstage was also developed. We created a digital compression algorithm specialized for neural electrophysiological signals able to reduce data bandwidth to less than 65.5% its original size without introducing distortions. Bandwidth has a large effect on power requirements. Thus, this reduction allows for lighter batteries and extended operational time. The algorithm is designed to be able to be implemented in a wide variety of devices, requiring low hardware resources and adding negligible power requirements to a system. Combined, the developments we present open new possibilities for neuroscience experiments combining electrophysiology acquisition with natural behaviors and complex, real-time, stimuli. / The research described in this thesis was carried out at the Polytechnic University of Valencia (Universitat Politècnica de València), Valencia, Spain in an extremely close collaboration with the Neuroscience Institute - Spanish National Research Council - Miguel Hernández University (Instituto de Neurociencias - Consejo Superior de Investigaciones Cientí cas - Universidad Miguel Hernández), San Juan de Alicante, Spain. The projects described in chapters 3 and 4 were developed in collabo- ration with, and funded by, Open Ephys, Cambridge, MA, USA and OEPS - Eléctronica e produção, unipessoal lda, Algés, Portugal. / Cuevas López, A. (2021). Development of Advanced Closed-Loop Brain Electrophysiology Systems for Freely Behaving Rodents [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/179718