Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-10-26T16:54:27Z No. of bitstreams: 2 Tese - Flávia de Castro Pereira - 2014.pdf: 7274098 bytes, checksum: 2478fc770e9bfbd8ffb6361d038b525d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-27T14:38:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Flávia de Castro Pereira - 2014.pdf: 7274098 bytes, checksum: 2478fc770e9bfbd8ffb6361d038b525d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-27T14:38:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Flávia de Castro Pereira - 2014.pdf: 7274098 bytes, checksum: 2478fc770e9bfbd8ffb6361d038b525d (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-03-19 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The resistance acquired by some tumor cell lines retricts the use of drugs made of platinum because of Ruthenium compounds have been objects of great attention for presenting antimetastatic properties and low toxicity. Ruthenium compounds form compounds with the most different chemical binders, presenting good behavior and expanding the possibilities offor biological applications. A wide variety of coordination has enabled studies on ruthenium complexes, andseveral oxidation stages (Ru (II), Ru (III), and Ru (IV)) under physiological conditions and the rate of binder substitution. This study ranges the citotoxic activity of ruthenium (III) compound cis- Tetraammine(oxalato)Ruthenium(III) Dithionate - {Cis-[Ru(C2O4)(NH3)4]2(S2O6)} to treat human erythroleukemia (K562) tumor cell lineand the complex of ruthenium (II) coordinated a phosphine ligand and nitrile front tumor lineage S180 through the techniques of assay cell viability, assay kinetics of cell cycle phases, annexin V assay/ propidium iodide, test of mitochondrial membrane potential, test comet and gene expression through real time PCR. Both antiproliferative and cytotoxic activity revealed that K562 cells cultured with ruthenium (III) compound showed meaningful decrease in proliferation. Ruthenium(III) compound induced the IC50 value was of 18.28 μM set againts the cell cycle profiles cells not treated. Flow cytometric analysis indicated a sub-G1 arresting effect of ruthenium compound on K562 cells. Through the cell viability assay through MTT reduction technique, it was found that the complex of ruthenium (II) phosphine coordinated and nitrile presented cytotoxic activity when facing the tumor strain S180 with IC50 17.02±8.21μM and IC50 de 53.73 ± 5.71 μM for lymphocyte. When analyzing the cell cycle of tumor cells S180 treated with complex of ruthenium (II) caused increase in cells in G0/G1 and in S phase decreased. We observed an increase G2 / M. In the analysis of apoptosis assays, the results pointed that the complex ruthenium (II) induced cell death via apoptosis in tumor strain S180 as proved the increase in annexin cells V positive, depolarization of the mitochondrial membrane potential, activation of caspase 3 (Casp3) and 8 (Casp8) and increased expression levels of caspase-3 (Casp3) (mRNA), Bax (mRNA) and Tp53. The results lead to the conclusion that both complexes of ruthenium (II) and (III) induce cytotoxic activity against cell models tested, and that this activity correlates with alterations in cell cycle phases and induction of cell death via apoptosis. / Fármacos à base de cisplatina ainda são os anticancerígenos mais utilizados no mundo. Os compostos de rutênio têm sido objetos de grande atenção devido as suas propriedades antimetastática, baixa toxicidade e vários estados de oxidação (Ru (II), Ru (III) e Ru (IIV)) em condições fisiológicas. O presente trabalho teve como objetivo investigar in vitro os efeitos citotóxico e mecanismo de morte do complexo Ditionato de cis-Tetraamino(oxalato)rutênio(III) na linhagem tumoral de leucemia mielóide crônica (K562) e do complexo de rutênio (II) coordenado a ligante fosfina e nitrila [RuCl(bcn)(bipy)(dppe)]PF6, em linhagem tumoral S180 a partir das técnicas de ensaio de viabilidade celular, ensaio de cinética das fases do ciclo celular, ensaio anexina V/Iodeto de Propídeo, ensaio de potencial de membrana mitocondrial e expressão gênica por PCR em tempo real. Os resultados mostraram que o complexo de rutênio (III) provoca uma significativa redução na proliferação de células K562. O complexo de rutênio (III) induziu uma IC50 =18,28 μM. A análise por citometria de fluxo indicou um efeito sub-G1 dos complexos de rutênio sobre células de K562. O composto provocou um aumento de dano significativo nas células em todas as concentrações testadas em comparação ao controle negativo, o que pode ser associado à citotoxicidade com efeito direto sobre o DNA das células de K562. A partir do ensaio de viabilidade celular pela técnica de redução do MTT, verificou-se que o complexo de rutênio (II) coordenado a fosfina e nitrila apresentou atividade citotóxica frente à linhagem tumoral S180 com IC50 17,02±8,21μM e IC50 de 53,73 ± 5,71 para linfócito. Na análise do ciclo celular de células tumorais S180 tratadas com o complexo de rutênio (II), casou indução de G0/G1, fase S e G2/M. Na análise dos ensaios de apoptose, os resultados demonstraram que o complexo de rutênio (II) induziu morte celular via apoptose na linhagem tumoral S180, como evidenciado pelo aumento no número de células anexina V positivo, despolarização do potencial de membrana mitocondrial, ativação das caspase 3 (Casp3) e 8 (Casp8) e aumento dos níveis de expressão de caspase-3 (Casp3) (mRNA), Bax (mRNA) e Tp53 . A partir dos resultados conclui-se que ambos os complexos de rutênio (II) e (III) induzem atividade citotóxica frente aos modelos de células testadas, sendo que a atividade está correlacionada às alterações nas fases do ciclo celular e indução de morte celular via apoptose.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-05-19T21:30:50Z No. of bitstreams: 2 Tese - Carolina Ribeiro e Silva - 2015.pdf: 2710382 bytes, checksum: 03a38ab42eb321f4a7528fa33c9b8110 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-05-20T14:07:56Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Carolina Ribeiro e Silva - 2015.pdf: 2710382 bytes, checksum: 03a38ab42eb321f4a7528fa33c9b8110 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-20T14:07:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Carolina Ribeiro e Silva - 2015.pdf: 2710382 bytes, checksum: 03a38ab42eb321f4a7528fa33c9b8110 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-03-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Sulfonamide chalcone derivatives have shown important biological applications, including antitumor activity. In the present study, we investigated the biological effects of the sulfonamide chalcone N-{4-[3-(4-nitrophenyl)prop-2-enoyl]phenyl} benzenesulfonamide (CPN) through bioindicators of genetic damage in bacteria, animal and human. In the Ames Mutagenicity Test, CPN did not significantly increase the number of His+ revertants in Salmonella typhimurium tester strains TA98 and TA100 at all doses tested (p > 0.05). However, CPN presented a moderate mutagenic and toxic profile, due to dose-response relationship observed at all doses tested for TA98 and TA100 strains. In the antimutagenic evaluation of Ames Test, CPN presented antimutagenic activity at all doses tested in TA98 strain (p < 0.05). In the TA100 strain, CPN showed antimutagenic activity in doses over 50 μg/plate. In the Micronucleus Test, the results demonstrated that CPN increased the frequency of micronucleated polychromatic erythrocytes (MNPCE) at 24 h and 48 h, at all doses tested, demonstrating mutagenic effect of this compound. A decrease in polychromatic/normochromatic erythrocyte ratio (PCE/NCE) was observed at 24 h and 48 h, indicating the cytotoxic action of CPN. CPN co-administered with mitomycin C (MMC) significantly decreased the frequency of MNPCE at all doses tested in 24 h, demonstrating antimutagenic action (p < 0.05). Also, there was a decrease in the frequency of MNPCE at all tested doses in 48 h, but this decrease was not significant (p > 0.05). Additionally, CPN co-administered with MMC increased PCE/NCE ratio at all doses tested, in both times, demonstrating its anticytotoxic effect. In the Comet Assay, CPN significantly increased the percentage of DNA damages at all doses tested (p < 0.05), demonstrating genotoxic activity. In the analysis of cell cycle kinetics, CPN did not induce significant changes in the cell cycle phases G0/G1, S and G2/M of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) (p > 0.05). However, doses of 256 and 512 μmol/L of the CPN presented a significant increase in the percentage of cells in sub-G1 (p < 0.05), which is indicative of apoptosis, indicating cytotoxic action. For apoptosis and necrosis detection using Annexin V/Propidium Iodide stain, CPN showed a cytotoxic effect by inducing late apoptosis and necrosis. Thus, according to tests performed CPN presented genotoxic, cytotoxic, antigenotoxic, and anticytotoxic activities. / Derivados de chalcona sulfonamida tem apresentado importantes atividades biológicas, incluindo atividade antitumoral. No presente estudo, investigou-se os efeitos biológicos da chalcona sulfonamida N-{4-[3-(4-nitrofenil)prop-2-enoil]fenil}-benzenosulfonamida (CPN) mediante a análise de bioindicadores de danos genéticos em sistemas-teste bacteriano, animal e humano. No Teste de Mutagenicidade de Ames, CPN não aumentou significativamente o número de revertentes prototróficas de Salmonella typhimurium, em nenhuma das cepas testadas, TA98 e TA100, em nenhuma das doses (p > 0,05). Entretanto, CPN apresentou um perfil moderado de um composto mutagênico e tóxico, devido à relação dose-resposta observada em todas as doses testadas, para as cepas TA98 e TA100. Na avaliação antimutagênica do Teste de Ames, CPN apresentou atividade antimutagênica para todas as doses testadas na cepa TA98 (p < 0,05). Na cepa TA100, CPN mostrou atividade antimutagênica nas doses acima de 50 μg/placa (p < 0,05). Os resultados do Teste do Micronúcleo demonstraram que CPN aumentou a frequência de eritrócitos policromáticos micronucleados (EPCMN) no tempo de 24 e 48 h, em todas as doses testadas, demonstrando efeito mutagênico deste composto. Uma diminuição na razão de eritrócitos policromáticos/normocromáticos (EPC/ENC) foi observada no tempo de 24 e 48 h, indicando ação citotóxica de CPN. CPN co-administrado com mitomicina C (MMC) diminuiu significativamente a freqüência de EPCMN em todas as doses testadas no tempo de 24 h, demonstrando ação antimutagênica (p < 0,05). Houve também uma diminuição na frequência de EPCMN em todas as doses testadas, no tempo de 48 h, mas a diminuição não foi significativa (p > 0,05). Além disso, CPN co-administrado com MMC aumentou a razão de EPC/ENC em todas as doses testadas, nos tempos de 24 e 48 h, demonstrando efeito anticitotóxico. No Ensaio Cometa, CPN aumentou significativamente a porcentagem de danos no DNA em todas as doses testadas (p < 0,05), demonstrando atividade genotóxica. Na análise da Cinética do Ciclo Celular, CPN não induziu alteração significativa nas fases G0/G1, S e G2/M do ciclo celular de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) (p > 0,05). Entretanto, as doses de 256 e 512 μmol/L de CPN apresentaram um aumento significativo na porcentagem de células em sub-G1 (p < 0,05), o qual é um indicativo de apoptose, demonstrando ação citotóxica. Na detecção de apoptose e necrose por coloração com Anexina V/Iodeto de Propídeo, CPN mostrou um efeito citotóxico, pela indução de apoptose tardia e necrose. Assim, de acordo com os ensaios realizados CPN apresentou atividades genotóxica, citotóxica, antigenotóxica e anticitotóxica.

A Fosfoetanolamina sintética (Pho-s) é uma molécula análoga aos fosfolipídios de membrana celular com propriedades antitumorais, antiinflamatórias e antiproliferativas. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu diversos estudos in vitro e in vivo com a Pho-s mostrando resultados satisfatórios quanto à sua eficácia antitumoral. Neste estudo foram avaliados os efeitos antitumorais in vitro da Pho-s e da formulação lipossomal DODAC/Pho-s em linhagem de adenocarcinoma de mama humana (MCF7). Os efeitos da citotoxicidade da Pho-s na linhagem tumoral MCF7 foi avaliado pela determinação da viabilidade celular pelo teste colorimétrico MTT e os valores obtidos da IC50% foram de 37,2; 25,8; 1,8 mM nos períodos de 24, 48 e 72 horas, respectivamente. Com o tratamento de DODAC vazio nas células MCF7 a IC50% foi de 0,3 mM e com o tratamento de DODAC/Pho-s a IC50% de 1,8 mM, após 24 horas de tratamento. A produção de radicais livres lipoperoxidados foi avaliada pela formação do TBARS em células MCF7, tratadas por 24, 48 e 72 horas com Pho-s, não mostrando diferença significativa nos valores de lipoperoxidação. As alterações nas distribuições das populações celulares nas fases do ciclo celular avaliadas por citometria de fluxo mostraram um aumento do DNA fragmentado após 48 horas e parada na fase G2/M após 24 horas. As alterações nos arranjos celulares foram avaliadas por meio da marcação com os fluorocromos acridine-orange e rodamina 123 por microscopia confocal a laser, no qual foi observada a mudança na morfologia, fragmentação de membranas e perdas da projeção de prolongamentos citoplasmáticos. A indução de células em senescência foi avaliada pela atividade enzimática com a enzima beta-galactosidase, mostrando uma diminuição das células senescentes nas maiores concentrações de tratamento com a Pho-s e com o DODAC/Pho-s. Diversos marcadores de controle e progressão do ciclo celular, stress, angiogênese e receptores hormonais e o potencial mitocondrial foram avaliados por citometria de fluxo. A atividade apoptótica das células tumorais de mama foi avaliada pela Anexina V/PI, mostrando um aumento, principalmente, da apoptose tardia e seus ensaios de proliferação celular pelo teste com o CFSE-DA resultou na diminuição significativa da capacidade de proliferação celular. O tratamento das células de adenocarcinoma de mama humana MCF7 com a Pho-s mostrou ser um composto de natureza fosfolipídica com potencial promissor antitumoral / Synthetic Phosphoethanolamine (Pho-s) is a molecule analogous to cell membrane phospholipids with antitumor, anti-inflammatory and antiproliferative effects. Our research group has developed several in vitro and in vivo studies with Pho-s showing satisfactory results regarding its antitumor efficacy. In this project we evaluated the in vitro antitumor effects of Pho-s and the liposomal formulation DODAC/Pho-s in human breast adenocarcinoma line (MCF7). The effects of the Pho-s cytotoxicity on the MCF7 tumor cell line were evaluated by determining the cell viability by the MTT colorimetric test and the concentration of IC50% were 37.2; 25.8; 1.8 mM in the 24, 48 and 72 hour periods, respectively. With DODAC treatment in MCF7 cells the IC50% was 0.3 mM and the treatment of DODAC/Pho-s at IC50% of 1.8 mM after 24 hours of treatment. The production of lipoperoxides radicals was evaluated by the formation of TBARS in MCF7 cells, treated for 24, 48 and 72 hours with Pho-s, showing no significant difference in lipoperoxidation values. Changes in the cell population distributions in the cell cycle phases evaluated by flow cytometry showed an increase of the fragmented DNA after 48 hours and stop at the G2/M phase after 24 hours. Alterations in the cellular arrangements were evaluated by means of the labeling with the fluorochromes acridine-orange and rhodamine 123 using laser confocal microscopy, in which the change in morphology, membrane fragmentation and loss of the projection of cytoplasmic prolongations were observed. Senescent cell induction was evaluated by enzymatic activity with the ?-galactosidase enzyme, showing a decrease in senescent cells at the highest concentrations of treatment with Pho-s and DODAC/Pho-s. Several control markers and cell cycle progression, stress, angiogenesis and hormone receptors and mitochondrial potential were evaluated by flow cytometry. The apoptotic activity of breast tumor cells was evaluated by Annexin V/PI, showing an increase mainly of late apoptosis and cell proliferation assays by the CFSE-DA with the Pho-s by flow cytometry, resulting in significant decrease of cell proliferation. Treatment of MCF 7 human breast adenocarcinoma cells with Pho-s has been shown to be a phospholipid-type compound with promising antitumor potential

A biologia da reprodução sexual de plantas é um campo de pesquisa de grande importância, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes), oriundas do desenvolvimento de partes do pistilo fertilizado. Em Nicotiana tabacum, identificou-se um gene específico de estigma/estilete, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), que atua na inibição da proliferação celular (DePaoli et al., 2011). Através de ensaios de pull-down, verificou-se a interação da proteína SCI1 com uma proteína quinase dependente de ciclina (CDK) (Strini, dados não publicados). Este trabalho visou à caracterização dessa nova CDK, ortóloga da CDKG;2 de Arabidopsis. A sequência correspondente de N. tabacum (NtCDKG;2) foi amplificada por PCR, a partir de cDNAs de estigmas/estiletes, clonada e sequenciada, o que permitiu a confirmação de sua identidade. A expressão de NtCDKG;2 foi analisada nos diferentes órgãos vegetativos e reprodutivos, por qRT-PCR, o que evidenciou um perfil de expressão ubíqua. Ao estudar o perfil de expressão desse gene nos estigmas/estiletes dos doze estádios de desenvolvimento floral de N. tabacum, observa-se que NtCDKG;2 é mais expresso nos estádios tardios do desenvolvimento em direção à antese, indicando uma função importante de sua proteína ao final do desenvolvimento do pistilo. Análises de expressão de NtCDKG;2 em estigmas/estiletes, de plantas de N. tabacum com produção aumentada do hormônio auxina no pistilo, sugerem que NtCDKG;2 é regulado transcricionalmente por esse hormônio. A expressão transiente da proteína de fusão NtCDKG;2-GFP, em folhas de N. tabacum, evidenciou a localização nuclear da proteína em estudo. Também foram geradas plantas transgênicas estáveis com superexpressão e com silenciamento por RNAi de NtCDKG;2. Apesar dos altos níveis de transcritos de NtCDKG;2 nas plantas de superexpressão e dos baixos níveis nas plantas silenciadas, não foram observadas alterações fenotípicas macroscópicas nessas plantas. Adicionalmente, obteve-se a expressão da proteína NtCDKG;2, fusionada a uma tag de histidina em sua porção N-terminal, em células de Escherichia coliBL21(DE3)CodonPlusRP. Através dos estudos realizados neste trabalho e análises conjuntas da literatura, é possível propor que NtCDKG;2 codifique uma proteína que está envolvida no controle do ciclo celular nos estigmas/estiletes de N. tabacum. / The biology of plant sexual reproduction is a research field of great importance, since most of the food consumed by humans is composed of plant reproductive parts (fruits and seeds), originated by the development of fertilized pistil parts. In Nicotiana tabacum, it was identified a stigma/style-specific gene, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), which acts in the inhibition of cell proliferation (DePaoli et al., 2011). Through pull down assays, the interaction of the SCI1 protein with a cyclin-dependent protein kinase (CDK) was verified (Strini, unpublished). This work aimed the characterization of this new CDK, orthologous to the Arabidopsis CDKG;2. The N. tabacum corresponding sequence (NtCDKG;2) was PCR amplified, from stigmas/styles cDNAs, cloned and sequenced, which allowed the confirmation of its identity. The NtCDKG;2 expression was analyzed in the different vegetative and reproductive organs, by qRT-PCR, evidentiating an ubiquitous expression pattern. Studying the expression pattern of this gene in stigmas/styles of the twelve stages of N. tabacum flower development, it was observed that NtCDKG;2 is more expressed at the later developmental stages towards anthesis, indicating an important function of its protein in the end of pistil development. NtCDKG;2 expression analyses in stigmas/styles of N. tabacum plants with an enhanced auxin production in the pistil suggest that NtCDKG;2 is transcriptionally regulated by this hormone. The transient expression of the fusion protein NtCDKG;2-GFP, in N. tabacum leaves, evidentiated the nuclear localization of the studied protein. Stable transgenic plants overexpressing and silencing NtCDKG;2 by RNAi were also generated. Despite the high transcript levels in the plants overexpressing NtCDKG;2 and the low transcript levels in the silencing plants, macroscopic phenotypic alterations were not observed on these plants. Additionally, the expression of the NtCDKG;2 protein, with a histidine tag fused in its N-terminal, was obtained in Escherichia coli BL21(DE3)CodonPlusRP cells. Through studies performed on this work and literature analyses, it is possible to propose that NtCDKG;2 encodes a protein that is involved in the control of cell cycle at the N. tabacum stigmas/styles.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-05-31T15:25:44Z No. of bitstreams: 1 alessandracristinagomesmagno.pdf: 3807060 bytes, checksum: a3775aee860af7ea06cde6b9d587ab80 (MD5) / Rejected by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br), reason: on 2017-06-01T11:41:14Z (GMT) / Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-06-01T11:44:40Z No. of bitstreams: 1 alessandracristinagomesmagno.pdf: 3807060 bytes, checksum: a3775aee860af7ea06cde6b9d587ab80 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-06-01T11:47:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 alessandracristinagomesmagno.pdf: 3807060 bytes, checksum: a3775aee860af7ea06cde6b9d587ab80 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-01T11:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 alessandracristinagomesmagno.pdf: 3807060 bytes, checksum: a3775aee860af7ea06cde6b9d587ab80 (MD5) Previous issue date: 2016-03-22 / O objetivo principal deste trabalho é adicionar e analisar uma equação que repre senta o volume no modelo dinâmico do ciclo celular de mamíferos proposto por Gérard e Goldbeter (2011). A divisão celular ocorre quando o complexo ciclinaB/Cdk1(quínase dependente de ciclina) é totalmente degradado atingindo um valor mínimo. Neste ponto, a célula é divida em duas novas células filhas e cada uma irá conter a metade do conteúdo citoplasmático da célula mãe. As equações do modelo de base são válidas apenas se o volume celular, onde as reações ocorrem, é constante. Quando o volume celular não é constante, isto é, a taxa de variação do volume em relação ao tempo é explicitamente levada em consideração no modelo matemático, então as equações do modelo original não são mais válidas. Portanto, todas as equações foram modificadas a partir do princípio de conservação das massas para considerar um volume que varia ao longo do tempo. Por meio desta abordagem, o volume celular afeta todas as variáveis do modelo. Dois méto dos diferentes de simulação foram efetuados: determinista e estocástico. Na simulação estocástica, o volume afeta todos os parâmetros do modelo que possuem de alguma forma unidade molar, enquanto que no determinista, ele é incorporado nas equações diferen ciais. Na simulação determinista, as espécies bioquímicas podem estar em unidades de concentração, enquanto na simulação estocástica tais espécies devem ser convertidas para número de moléculas que são diretamente proporcional ao volume celular. Em um esforço para entender a influência da nova equação sobre o modelo uma análise de estabilidade foi feita. Isso esclarece como o novo parâmetro µ, fator de crescimento do volume celular, impacta na estabilidade do ciclo limite do modelo. Para encontrar a solução aproximada do modelo determinista, o método Runge Kutta de quarta ordem foi implementado. Já para o modelo estocástico, o método direto de Gillespie foi usado. Para concluir, um modelo mais preciso, em comparação ao modelo de base, foi desenvolvido ao levar em consideração a influência da taxa de variação do volume celular sobre o ciclo celular. / The main goal of this work is to add and analyse an equation that represents the volume in a dynamical model of the mammalian cell cycle proposed by Gérard and Gold beter (2011). The cell division occurs when the cyclinB/Cdk1 (cyclin-dependent kinase) complex is totally degraded and it reaches a minimum value. At this point, the cell is divided into two newborn daughter cells and each one will contain the half of the cyto plasmic content of the mother cell. The equations of our base model are valid only if the cell volume, where the reactions occur, is constant. Whether the cell volume is not constant, that is, the rate of change of its volume with respect to time is explicitly taken into account in the mathematical model, then the equations of the original model are no longer valid. Therefore, every equations were modified from the mass conservation prin ciple for considering a volume that changes with time. Through this approach, the cell volume affects all model variables. Two different dynamic simulation methods were ac complished: deterministic and stochastic. In the stochastic simulation, the volume affects every model’s parameters which have molar unit, whereas in the deterministic one, it is incorporated into the differential equations. In deterministic simulation, the biochemical species may be in concentration units, while in stochastic simulation such species must be converted to number of molecules which are directly proportional to the cell volume. In an effort to understand the influence of the new equation over the model an stability analysis was performed. This elucidates how the new parameter µ, cell volume growth factor, impacts the stability of the model’s limit cycle. In order to find the approximated solution of the deterministic model, the fourth order Runge Kutta method was implemen ted. As for the stochastic model, the Gillespie’s Direct Method was used. In conclusion, a more precise model, in comparison to the base model, was created for the cell cycle as it now takes into consideration the rate of change of the cell volume.

Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T15:15:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souza_EdmarciaElisa_D.pdf: 15682912 bytes, checksum: e58bfe67bbf5f3bc0979ec28db650292 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As proteínas Neks (NIMA-related kinases) representam uma família de 11 quinases humanas nomeadas Nek1 a 11 que compartilham 40 a 45% de identidade de sequência com o regulador mitótico NIMA identificado em Aspergillus nidulans. O sinergismo entre os mecanismos que dirigem a mitose é essencial para a adequada divisão celular e sua desregulação é correlacionada ao aparecimento de cânceres humanos. As Neks são essenciais para progressão do ciclo celular e por isso têm recebido especial atenção como alvos para terapia do câncer. A Nek7 humana, por sua vez, contribui para formação do fuso mitótico e biogênese dos centrossomos. Neste trabalho, nós revelamos a Nek7 como uma quinase multifuncional. Nossos estudos demonstraram um amplo espectro de proteínas de interações com a Nek7 humana, classificadas dentro de múltiplas categorias funcionais, sobretudo, da divisão celular. Alguns novos parceiros de interação também são seus potencias substratos e, ainda, localizam com a Nek7 em estruturas essenciais para a mitose e citocinese. Nós evidenciamos ainda, que através de mecanismos distintos, os domínios N- e C-terminal de Nek6 e Nek7 podem contribuir diferencialmente para a regulação e catálise e podem proporcionar a base estrutural para a independência funcional dessas quinases na sinalização celular. Além disso, usando estudos baseados microscopia confocal e RNAi (RNA interference), nós mostramos que o interactor de Nek7, a proteína RGS2, é necessária para organização e orientação do fuso mitótico. Células em metáfase suprimidas de RGS2 apresentaram fenótipos tais como: prisão na mitose; defeitos na tensão dos cinetocóros e alinhamento dos cromossomos; desorganização do fuso mitótico; perturbação na redistribuição de proteínas do polo do fuso envolvidas em nucleação; mal-orientação do fuso mitótico; e redução de microtúbulos dos ásteres e de dinâmica. Além disso, tanto a supressão quanto a superexpressão das formas selvagem e quinase dead de Nek7 prejudicaram o recutamento de ?-tubulina para o polo do fuso. Esses achados introduz a participação de RGS2 na mitose e indicam que esta pode atuar cooperativamente com Nek7 para a precisa organização e formação do fuso mitótico. Por fim, empregando biologia de sistemas, nós mostramos um compreensivo interactoma das Neks, destacando para um possível crosstalking de todos os membros da família nos processos de regulação de centríolos e mitose; função ciliar e ciliopatias; e resposta a dano de DNA / Abstract: The Neks (NIMA-related kinases) proteins represent a human kinases family named Nek1 to 11 that share 40 to 45% of sequence identity with the established NIMA mitotic regulator, identified in Aspergillus nidulans. The synergism of the mechanisms that drive mitosis is essential for proper cell division and its dysregulation is correlated with the occurrence of human cancers. The Neks are essential for cell cycle progression and therefore have received attention as targets for cancer therapy and other diseases. Human Nek7 contributes to mitotic spindle formation and centrosome biogenesis. Herein, we reveal Nek7 as a multifunctional kinase. Our proteomic studies have demonstrated a broad spectrum of interaction proteins of human Nek7 classified into multiple functional categories, especially, cell division. Some new interaction partners are also potential Nek7 substrates and localize in key structure during mitosis and cytokinesis. We also evidenced that, through different mechanisms, the N- and C- terminal domains of Nek7 and Nek6 can differentially contribute to the regulation and catalysis and provide the basis for a functional independence of Nek6 and Nek7 in cell signaling. Furthermore, using studies based in confocal microscopy and RNAi we showed the Nek7 interactor, RGS2 protein, is required for organization and orientation of the mitotic spindle. Metaphase cells RGS2-depleted showed phenotypes such as: arrest in mitosis; defects in tension kinetochores and alignment chromosomes; disruption of the mitotic spindle; disturbance in the proteins redistribution of the spindle pole involved in nucleation and microtubule dynamics; mitotic spindle misorientation; and astral microtubules reduction. Furthermore, the suppression or both overexpression of Nek7 wild type or kinase dead impaired the recruitment of ?-tubulin to the spindle pole. These findings introduce the involvement of RGS2 in mitosis and indicate that it may act cooperatively with Nek7 for proper mitotic spindle organization and formation. Finally, employing systems biology, we showed a comprehensive Neks interactome, highlighting for a possible crosstalking of all family members in centrioles and mitosis regulation; ciliary and ciliopathies function; and response to DNA damage / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular

O ciclo de divisão celular compreende uma seqüência de fenômenos controlados por una complexa rede de regulação gênica muito estável e robusta. Aplicamos as Redes Genéticas Probabilísticas (PGNs) para construir um modelo cuja dinâmica e robustez se assemelham às observadas no ciclo celular biológico. A estrutura de nosso modelo PGN foi inspirada em fatos biológicos bem estabelecidos tais como a existência de subsistemas integradores, realimentação negativa e positiva e caminhos de sinalização redundantes. Nosso modelo representa as interações entre genes como processos estocásticos e apresenta uma forte robustez na presença de ruido e variações moderadas dos parâmetros. Um modelo determinístico recentemente publicado do ciclo celular da levedura não resiste a condições de ruido que nosso modelo suporta bem. A adição de mecanismos de auto excitação, permite a nosso modelo apresentar uma atividade oscilatória similar à observada no ciclo celular embrionário. Nossa abordagem de modelar e simular o comportamento observado usando mecanismos de controle biológico conhecidos fornece hipóteses plausíveis de como a regulação subjacente pode ser realizada na célula. A pesquisa atualmente em curso procura identificar tais mecanismos de regulação no ciclo celular da levedura, usando dados de expressão gênica provenientes de medições seqüenciais de microarray. / The cell division cycle comprises a sequence of phenomena controlled by a stable and robust genetic network. We applied a Probabilistic Genetic Network (PGN) to construct an hypothetical model with dynamical behaviour and robustness typical of the biological cell-cycle. The structure of our PGN model was inspired in well established biological facts such as the existence of integrator subsystems, negative and positive feedback loops and redundant signaling pathways. Our model represents genes\' interactions as stochastic processes and presents strong robustness in the presence of moderate noise and parameters fluctuations. A recently published deterministic yeast cell-cycle model collapses upon noise conditions that our PGN model supports well. In addition, self stimulatory mechanisms can give our PGN model the possibility of having a pacemaker activity similar to the observed in the oscillatory embryonic cell cycle. Our approach of modeling and simulating the observed behavior by known biological control mechanisms provides plausible hypotheses of how the underlying regulation may be performed in the cell. The ongoing research is lead to identify such regulation mechanisms in the yeast cell-cycle from time-series microarray gene expression data.

O estado nutricional influencia o crescimento gástrico, e enquanto a proliferação celular é estimulada pelo jejum em filhotes, ela é inibida em ratos adultos. A corticosterona também age no desenvolvimento, e seus efeitos são regulados pela corticosterone binding globulin (CBG) e receptores de glicocorticóides (GR). Para investigar se a atividade da corticosterona responde ao jejum e como possíveis mudanças poderiam controlar o ciclo celular epitelial gástrico, nós avaliamos diferentes parâmetros durante a progressão do jejum em ratos de 18 e 40 dias de vida pós-natal. A restrição alimentar induziu um aumento de corticosterona no plasma em ambas as idades, mas apenas em filhotes o binding da CBG se elevou após o jejum curto, permanecendo alto até o final do tratamento. O jejum aumentou a atividade transcricional do GR na mucosa gástrica e os níveis protéicos, porém o efeito foi mais pronunciado em adultos. Além disso, observamos que nos filhotes, o GR é principalmente citoplasmático, enquanto em animais adultos, o receptor é acumulado no núcleo durante o jejum. As proteínas HSP 70 e HSP 90 foram diferencialmente reguladas, e podem contribuir para a estabilidade do GR no citoplasma em filhotes, e para o trânsito de GR para o núcleo em animais adultos. Quanto ao ciclo celular epitelial, observamos que em filhotes, ciclina D1 e p21 aumentaram durante o jejum, enquanto em ratos adultos, a ciclina E diminuiu e a p27 aumentou muito. Assim, nós demonstramos que a atividade da corticosterona é diferencialmente regulada pelo jejum em filhotes e ratos adultos, e que as variaçõe observadas poderiam atenuar um possível efeito supressor durante o desenvolvimento pós-natal. Sugerimos que este mecanismo pode estimular a proliferação celular e possibilitar o crescimento da mucosa gástrica durante condições nutricionais adversas. / The nutritional status influences gastric growth, and interestingly, whereas cell proliferation is stimulated by fasting in suckling rats, it is inhibited in adult animals. Corticosterone takes part in the mechanisms that govern development, and its effects are regulated in particular by corticosterone binding globulin (CBG) and glucocorticoid receptor (GR). To investigate whether corticosterone activity responds to fasting and how possible changes might control gastric epithelial cell cycle, we evaluated different parameters during the progression of fasting in 18- and 40-d-old rats. Food restriction induced higher corticosterone plasma concentration at both ages, but only in pups did CBG binding increase after short and long-term treatments. Fasting also increased gastric GR at transcriptional and protein levels, but the effect was more pronounced in 40-d-old animals. Moreover, in pups, GR was observed in the cytoplasm, whereas in adults, it accumulated in the nucleus after the onset of fasting. HSP 70 and HSP 90 were differentially regulated, and might contribute to the stability of GR and to the high cytoplasmic levels in pups and elevated shuttling in adult rats. As for gastric epithelial cell cycle, whereas cyclin D1 and p21 increased during fasting in pups, in adults, cyclin E slowly decreased concomitant with higher p27. In summary, we demonstrated that corticosterone function is differentially regulated by fasting in 18- and 40-d-old rats, and such variation might attenuate any possible suppressive effects during postnatal development. We suggest that this mechanism could ultimately increase cell proliferation and allow regular gastric growth during adverse nutritional conditions.

Poucos tratamentos têm efeito sobre melanomas metastáticos, mas novas drogas vêm sendo estudadas para combater esta doença. Este trabalho avaliou efeito de ácido cinâmico (AC) em melanócitos (NGM) e células de melanoma (HT144) sobre alterações no ciclo, morte, comunicação e mobilidade celular e morfologia nuclear e investigou efeito de proteção à radiação ultravioleta (UV). AC inibiu crescimento de HT144 em relação a NGM. Essa inibição deve ocorrer devido a dano no DNA que levou à inibição da fase S, formação de aberrações nucleares e indução de morte. AC induziu formação de micronúcleos nas células NGM. O citoesqueleto foi reorganizado após AC o que diminuiu a mobilidade celular. Apesar de não induzir comunicação entre as células HT144 o AC aumentou níveis citoplasmáticos de cx43 em células de hepatocarcinoma, o que contribui para a morte celular. Isto sugere maior citotoxicidade de AC em células HT144 em comparação com NGM. Porém, AC não protegeu as células dos efeitos de UV e sua genotoxicidade em células NGM indica que sua atividade depende de mais estudos. / Consumption of vegetables could decrease the risk of malignancies. Cinnamic acid (CA), commonly found in plants have been studied because their antitumor activitie. The present work aimed to evaluate effect of CA in melanocytes (NGM) and melanoma cells (HT-144) by focusing the cell cycle, death, mobility and communication and formation of nuclear aberration and to investigate potential of protection against UV radiation. CA inhibited cell growth of melanoma cells compared to melanocytes, probably due to DNA damage leading to DNA synthesis inhibition, induction of nuclear aberrations and apoptosis. High concentration of CA induced micronuclei in NGM cells. We observed cytoskeleton reorganization that decreased cell mobility in both cells. We have not observed communication in HT144 after treatment, but CA increased expression of cx43 in hepatocarcinoma cells, probably leading to apoptosis. CA did not showed protection effects against ultraviolet radiation and its genotoxic effects in NGM cells indicates that its mechanism of action must be further investigated.

É proposto que vias de sinalização controlem a sobrevivência e adaptação do Plasmodium, nos diferentes hospedeiros. No presente trabalho buscamos por diferentes abordagens estudar a via de sinalização de melatonina em P. falciparum. Para isso, avaliamos os níveis de RNA mensageiro de genes do sistema-ubiquitina proteossomo (UPS) bem como o perfil de ubiquitinação resultante do tratamento de parasitas com melatonina. Mostramos que a proteína quinase 7 de P. falciparum (PfPK7) atua na modulação dos genes do UPS em resposta a melatonina. Avaliamos também se o parasita é responsivo ao ácido indol-3-acético (AIA). Sabendo-se da importância de receptores de membrana na regulação de diversas funções celulares incluindo a percepção do meio externo, buscamos caracterizar um receptor serpentino putativo identificado previamente pelo grupo. Pudemos concluir que a via de sinalização por melatonina em P. falciparum envolve a participação da PfPK7, uma vez que em parasitas nocautes para pfpk7 são irresponsivos à melatonina quando comparados ao parental. / It is proposed that signaling pathways can control the parasite survival and adaptation into the hosts. In the present work we inquire about to study the melatonin signaling pathway trhough different metodologies. For this purpose we have analized post-translational modification of melatonin signaling, through ubiquitin-proteasome system (UPS) mRNA levels as well as the profile of ubiquitination resulted of melatonin treatment when compared with control. Moreover, we have found here that the P. falciparum protein kinase 7 (PfPK7) plays a major role in ubiquitin-proteasome system mRNA modulation in response to melatonin since parasites knockout to pfpk7 gene do not upregulate the UPS genes in response to melatonin. As for melatonin we have evaluated if P. falciparum parasites were responsive to indoleacetic acid. Last but not least, we made an effort to characterize a putative serpentine receptor previously identified by our group. We conclude that melatonin signaling pathway involves PK7 participation since pfpk- parasites are irresponsives to melatonin.