DNA damage is an ongoing threat to both the ability of the cell to faithfully transmit genetic information to its offspring as well as to its own survival. In order to maintain genomic integrity, eukaryotes have developed a highly conserved mechanism to detect, signal and repair damage in DNA, known as the DNA damage response (DDR). In fission yeast the two DDR pathways converge at the regulation of single transcriptional factor complex (MBF) resulting in opposite directions. We have shown that when the DNA-synthesis checkpoint is activated, Max1 is phosphorylated by Cds1 resulting in the abrogation of its binding to MBF. As a consequence, MBF-dependent transcription is maintained active until cells are able to overcome the replication challenge. In contrast, upon DNA damage, Chk1 the effector kinase of DNA damage checkpoint is activated and blocks the cell cycle progression, inducing DNA repair and repressing the MBF dependent transcription. We have revealed that Cdc10 is the target of the DNA-damage checkpoint and when cells are treated with MMS or are exposed to IR, Chk1 phosphorylates Cdc10 inducing the exit of MBF from chromatin. The consequence is that under these conditions, MBF-dependent transcription is repressed. Thus, Max1 and Cdc10 couple normal cell cycle regulation and the DNA-synthesis and DNA-damage checkpoints into MBF.

Embryonic stem cells (ESC) are derived from the inner cell mass (ICM) of the blastocyst and have the capacity for unlimited proliferation while retaining their potential to differentiate into a wide variety of cell types when cultured in vitro. These properties have made of human embryonic stem cells (hESC) an excellent model on which to study the conditions required for differentiation into specific cell lineages, and consequently the possibility of transplanting specific cell types into damaged tissues. The continued turn over of ESC while maintaining an undifferentiated state is dependent on unusual cell cycle properties. These unusual proliferative properties are responsible for the generation of tumours when these cells are injected into adult animals. Thus, the study of the unusual proliferative properties of hESC needs to be addressed if their potential is to be realized. To date, most studies of the cell cycle in hESC have been descriptive, lacking functional studies that reveal the mechanisms of how the cell cycle maintains pluripotency and self- renewal of hESC. In this thesis we sought to understand the mechanisms of cell cycle control of hESC. We asked the question if a single cell cycle gene could regulate the self-renewal or pluripotency properties of hESC using a gain and loss of gene function strategy. We have identified that the protein expression of the p27Kip1 cell cycle inhibitor was low in human pluripotent cells, but its expression increased during differentiation together with changes in the cell cycle structure of pluripotent cells. By adopting a gain and loss of function strategy we increased or reduced its expression in undifferentiating conditions to define its functional role in self-renewal and pluripotency of Hesc, using undifferentiation conditions, overexpression of p27Kip1 in hESC lead to a G1 phase arrest with an enlarged and flattened hESC morphology and consequently loss of self-renewal ability. Loss of p27Kip1 caused an increase of self-renewal while maintaining an undifferentiated phenotype. Moreover, we have shown that a change in the balance of p27Kip1 levels in undifferentiated hESC affects expression of the mesoderm markers: BRACHYURY and TWIST. We have found that expression changes of TWIST are associated with the presence of p27Kip1 protein in the TWIST1 gene promoter. The results presented in this thesis have interesting implications in stem cell biology. Firstly, these results define that the maintenance of p27Kip1 protein levels at a certain level is essential for self-renewal and pluripotency of hESC. Secondly, p27Kip1 is involved in the regulation of TWIST which is upregulated in several types of tumours and induces an epithelial-mesenchymal transition to facilitate tumor metastasis. / Las células madre embrionarias humanas (conocidas como hESC por sus siglas en inglés de human embryonic stem cells) son derivadas de la masa celular interna de los blastocistos y poseen la capacidad para auto-renovarse ilimitadamente, reteniendo su potencial para diferenciarse hace una amplia variedad de tipos celulares (pluripotencia), cuando son cultivadas in vitro. Estas propiedades permiten el estudio de las condiciones requeridas para la diferenciación hacia linajes específicos y la posibilidad de trasplantar tipos celulares específicos en tejidos dañados. El continuo recambio de las hESC al mismo tiempo que mantienen un estado de indiferenciación es dependiente de sus inusuales propiedades proliferativas. El objetivo de esta tesis doctoral fue el estudio de los mecanismos de control del ciclo celular de las hESC. Nos preguntamos si una única proteína del ciclo celular podría regular las propiedades de auto-renovación o pluripotencia de las hESC. En esta tesis doctoral identificamos que la expresión proteica del inhibidor del ciclo celular p27Kip1 era baja en diversas líneas celulares humanas pluripotentes pero aumentó durante la diferenciación, al mismo tiempo que la estructura del ciclo celular cambió. Mediante una estrategia de ganancia y pérdida de función, aumentamos o reducimos la expresión de p27Kip1 a fin de definir su función en la auto-renovación y la pluripotencia de las hESC. En condiciones de indiferenciación, la sobreexpresión de p27Kip1 en las hESC resultó en un arresto del ciclo celular en fase G1 y un cambio hacia una morfología más grande y aplanada, y consiguiente pérdida de la propiedad de auto-renovación. La pérdida de p27Kip1 causó un aumento de la auto-renovación manteniendo un fenotipo indiferenciado. También, hemos demostrado que un cambio en la expresión de p27Kip1 en hESC indiferenciadas afecta la expresión de los reguladores de mesodermo: BRACHYURY y TWIST. Además, hemos descubierto que los cambios en la expresión de TWIST están asociados con la presencia de la proteína p27Kip1 en el promotor de TWIST1. Estos resultados definen que los niveles de expresión de p27Kip1 son críticos para la auto-renovación y la pluripotencia de las hESC y sugieren una función para p27Kip1 en el control de la transición de epitelio a mesénquima.

Our earlier work has shown that pre-B cells can be converted into macrophages by the transcription factor C/EBPα at very high frequencies and also that a clonal pre-B cell line with an inducible form of C/EBPα can be converted into macrophage-like cells. Using these systems we have performed a systematic analysis of the questions whether during transdifferentiation the cells retrodifferentiate to a precursor cell state and whether cell cycle is required for reprogramming. As for the first question, a transcriptome analysis of transdifferentiating cells showed that most genes are continuously up or downregulated, acquiring a macrophage phenotype within 5 days. In addition, we observed the transient reactivation of a subset of immature myeloid markers, as well as low levels of the progenitor markers Kit and Flt3 and a few lineage inappropriate genes. Importantly, we were unable to observe the re-expression of cell surface marker combinations that characterize hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), including c-Kit and Flt3. This was the case even when C/EBPα was activated in pre-B cells under culture conditions that favor HSPC growth or when the transcription factor was activated in a time limited fashion. As for the second question, using the C11-inducible pre-B cell line, time-lapse experiments showed that a subpopulation of about 8% of the pre-B cells did not divide before acquiring macrophage properties, with the majority of cells dividing once and a few percent dividing twice. In agreement with these results we found that 8% of the induced cells did not incorporate BrdU during reprogramming. Importantly, the non-dividing cell subset expressed the highest levels of C/EBPα and was the fastest in acquiring a macrophage phenotype. Inhibition of DNA synthesis by aphidicolin led to an impairment of transdifferentiation in >70% of the cells, suggesting a requirement for traversing the cell cycle. However, sorting pre-B cells into G0/G1 and G2/M fractions followed by induction showed no significant differences in the reprogramming kinetics. Finally, we showed that knocking down p53 in the inducible pre-B cells does not alter their conversion into macrophages, suggesting that an acceleration of the cell cycle has no effect. Together, our findings show that the conversion of pre-B cells to macrophages does not involve overt retrodifferentiation and that high concentrations of C/EBPα bypass the cell cycle-dependency of immune cell transdifferentiation / Recientemente, nuestro grupo ha demostrado que las células pre-B se pueden reprogramar a macrófagos mediante la sobreexpresión del factor de transcripción C/EBP, con una eficiencia elevada. Así mismo, mediante la expresión de la forma inducible de C/EBP en una línea de células pre-B (C11), éstas también se puede convertir en células similares a macrófagos. Usando este sistema hemos estudiado si durante el proceso de trans-diferenciacion las células requieren volver a un estadio de célula precursora, y si el ciclo celular es necesario para este proceso. En cuanto a la primera cuestión, el análisis del transcriptoma de células trans-diferenciadas mostró que la expresión de la mayoría de los genes están regulados durante todo el proceso bien aumentando o disminuyendo, y que adquieren el fenotipo de macrófago a los 5 días después de iniciar el proceso. Así mismo, se observó la reactivación transitoria de un grupo de genes que codifican para marcadores de células mieloides inmaduras; también cabe destacar que observamos una disminución en la expresión de los genes expresados en células progenitoras Kit y Flt3, así como de genes de linajes impropios. Es importante destacar que nunca hemos llegado a observar la expresión de combinaciones de marcadores de superficie característicos de las células madre hematopoyéticas y las células progenitoras (HSPCs), incluyendo c-Kit y Flt3, mediante el análisis por citometría de flujo. Estos resultados se reprodujeron incluso cuando C/EBP se sobreexpresó en células pre-B que fueron cultivadas en condiciones que favorecen el crecimiento de las HSPC o cuando el factor de transcripción se activó de forma limitada en el tiempo. En cuanto a la segunda pregunta, usando la línea de células inducibles pre-B C11, el análisis mediante microscopia a diferentes tiempos después de la inducción de la reprogramación mostraron que una subpoblación de aproximadamente el 8% de las células pre-B no se dividen antes de adquirir las propiedades de macrófago, mientras que la mayoría de las células se dividen sólo una vez y un pequeño porcentaje dos veces antes de que se reprogramen totalmente a macrófagos. De acuerdo con estos resultados se encontró que un 8% de las células inducidas no incorporan BrdU durante la reprogramación. Es importante destacar que el subconjunto de células que no se dividen expresan los niveles más altos de C/EBP, con lo que cabe pensar que la adquisición del fenotipo de macrófago es más rápida en estas células. La inhibición de la síntesis de ADN por afidicolina bloqueó la transdiferenciación en mas de un 70% de las células, lo que sugiere que la correcta progresión del ciclo celular es un requisito para la transdiferenciación. Sin embargo, al separar la linea de células pre-B C11 en fracciones G0/G1 y G2/M seguido de la inducción, la cinética de la reprogramación no mostró diferencias significativas. Por último, también demostramos que la reducción en la expresión de p53 en las células pre-B inducibles no altera el proceso de conversión a macrófago, lo que sugiere que la aceleración del ciclo celular no tiene ningún efecto. En conjunto, nuestros resultados muestran que la conversión de células pre-B a macrófagos no requiere retro-diferenciación y que las células con una expresión mayor de C/EBP pueden llegar a prescindir de la dependencia del ciclo celular para la trans-diferenciación de las células inmunitarias.

Orientador: Robson Francisco Carvalho / Resumo: A irradiação pelo laser de baixa intensidade (LBI) tem sido utilizada como um método nãoinvasivo para promover ou acelerar a capacidade de regeneração muscular. No entanto, os mecanismos moleculares regulatórios pelos quais o LBI exerce esses efeitos, permanecem em grande parte desconhecidos. Nosso objetivo foi realizar uma análise de sequenciamento de RNA (RNA-Seq) em mioblastos C2C12 após LBI. Foram realizadas as taxas de viabilidade, migração, proliferação e os dados de RNA-Seq dos mioblastos C2C12, identificando 514 genes diferencialmente expressos após LBI. Em seguida, uma análise de ontologia genética e das vias dos genes diferencialmente expressos revelaram transcritos relacionadas ao ciclo celular, biogênese ribossômica, resposta ao estresse, migração celular, estrutura morfológica e proliferação de células musculares. Após, cruzamos nossos dados de RNA-Seq com dados de transcriptomas disponíveis em base de dados públicas, com dados de diferenciação miogênica que mostraram um total de 42 transcritos sobrepostos (mioblastos vs miotubos). Este conjunto de transcritos compartilhados mostrou que os mioblastos irradiados pelo LBI, possuem um perfil transcricional semelhante ao de miotubo, agrupando-se distante do perfil transcricional dos mioblastos. Concluíndo, revelamos pela primeira vez que LBI, induz a uma expressão de um grande conjunto de RNAm, que codificam proteínas reguladoras do ciclo celular que podem controlar a proliferação e diferenciação de mioblastos em mio... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Low-level laser irradiation (LLLT) has been used as a non-invasive method to promote or accelerate muscular regeneration capability. However, the regulatory molecular mechanisms by which LLLT exerts these effects remain largely unknown. Our goal was to perform a RNAsequencing (RNA-Seq) analysis in C2C12 myoblasts after LLLT. C2C12 myoblasts viability, migration, proliferation and RNA-Seq were performed, identifying 514 differentially expressed genes after LLLT. Next, gene ontology and pathway analysis of the differentially expressed genes revealed transcripts among categories related to cell cycle, ribosome biogenesis, response to stress, cell migration, morphological structure and muscle cell proliferation. After, we intersected our RNA-Seq data with transcriptomes publicly available myogenic differentiation data that showed a total of 42 overlapping transcripts (myoblasts vs myotube). This set of shared transcripts showed that the LLLT-myoblasts have a myotube-like profile, clustering away from the myoblast profile. In conclusion, we revealed for the first time that LLLT induces the expression a large set of mRNAs encoding for cell cycle regulatory proteins that may control myoblasts proliferation and differentiation into myotubes. Importantly, these set of mRNA revealed a myotube-like transcriptional profile and provided new insights to the understanding of the specific molecular changes underlying the effects of LLLT irradiation on skeletal muscle cells. / Doutor

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2703.pdf: 887815 bytes, checksum: ffe15f73632c174ed03a17b4e76bcee7 (MD5) / Universidade Federal de Sao Carlos / Androgenic-anabolic steroids (AAS) are spread among athletes and no athletes in order to improve performance or physical appearance. AAS targets the satellite cells in skeletal muscles, which are the major precursors of the skeletal muscle, and are essential for muscle growth and repair. When activated, in the presence of several factors, including myogenic differentiation factor D (MyoD), they proliferate and differentiate into new myofibers or myonuclei, resulting in increased protein synthesis. On the other hand, myostatin is able to inhibit cell cycle progression. Up-regulation of the expression of ubiquitin ligases, Atrogin-1 and muscle ring finger protein 1 (MuRF-1), results in increased muscle degradation. The understanding of AAS mechanism of action in skeletal muscle is critical for a better comprehension of muscular physiology under AAS use and abuse. The aim of this study was to investigate the effects of resistance training associated to AAS supraphysiological dose on the expression of modulators of skeletal muscle pathways of atrophy and hypertrophy. Wistar rats were grouped into: sedentary (S); trained (T); S with AAS (A); and T with AAS (TA). Exercised groups performed jumps in water: 4 sets of 10 jumps each and 30-second of rest interval between series, for 7 weeks with a progressive overload of 50 to 80% of body weight. Nandrolone decanoate (5 mg/kg) was injected sc twice a week. After last exercise session animals were killed. Myostatin, MyoD, Atrogin-1 and Murf mRNA expression were determined in the gastrocnemius muscle extracts by real-time reverse transcriptase-polimerase chain reaction (RT-PCR). The exercise did not change RNAm expression of any studied genes while AAS or its association with training increased atrogina-1 and reduced myostatin RNAm. The expression of MyoD and MuRF-1 was not altered by AAS. These results showed that both myostatin and atrogin-1, important genes of skeletal muscle related to cell cycle progression and protein degradation, are sensitive to supraphysiological doses of AAS. / O uso de esteróides anabólicos androgênicos (EAA) é disseminado entre atletas e não atletas que desejam melhorar o desempenho ou a aparência física. Os EAA agem sobre as células satélites no músculo esquelético, que são as principais precursoras do músculo esquelético, sendo essenciais tanto para crescimento quanto para reparo muscular. Quando são ativadas, na presença de diversos fatores, incluindo o fator D de diferenciação miogênica (MyoD), elas podem se proliferar e diferenciar-se em novas miofibrilas ou mionúcleos, resultando em maior síntese proteica. Por outro lado, a miostatina é capaz de inibir essa progressão do ciclo celular. Uma maior expressão de ubiquitinas de ligação, Atrogina-1 e muscle ring finger protein 1(MuRF-1), resulta em aumentada degradação muscular. Entender os mecanismos de ação dos EAA no músculo esquelético é essencial para uma melhor compreensão da fisiologia muscular sob a ação dos EAA. O objetivo desse estudo foi investigar os efeitos do treinamento pliométrico aquático com sobrecarga associado a doses suprafisiológicas de EAA sobre a expressão de moduladores de vias de hipertrofia e atrofia do músculo esquelético. Ratos Wistar foram agrupados em não treinados (S), treinados (T), S tratados com EAA (E), e T tratados com EAA (TE). Os grupos que treinaram realizaram saltos na água: quatro séries de 10 saltos com 30 segundos de intervalo entre as séries, 5 vezes por semana durante 7 semanas, com uma sobrecarga progressiva de 50 a 80% do peso corporal. Decanoato de nandrolona (5 mg/kg) foi injetado subcutaneamente duas vezes por semana. Imediatamente após a última sessão os animais foram mortos. A expressão gênica de miostatina, MyoD, Atrogina-1 e MuRF-1 do músculo gastrocnêmio foi determinada por transcriptase reversa-reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) em tempo real. O treinamento não alterou a expressão de nenhum dos genes estudados, enquanto sua associação com o EAA aumentou a expressão gênica de atrogina-1 e reduziu de miostatina. A expressão de MyoD e MuRF-1 não foi alterada pelo EAA. Os resultados mostraram que tanto a miostatina quando a atrogina-1, importantes genes relacionados tanto a progressão do ciclo celular quanto a degradação de proteínas no músculo esquelético, são sensíveis ao EAA.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:23:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6668.pdf: 2073017 bytes, checksum: 8ec4f9ade1f9ee1c27b9d53f7a52d371 (MD5) Previous issue date: 2015-03-30 / Financiadora de Estudos e Projetos / Cancer is among the leading causes of death in the world and breast cancer is the type of cancer that affects more women. The treatment of this disorder requires a careful selection of one or more methods of intervention. The majority of drugs currently used in chemotherapy causes DNA damage in tumor cells and also in normal cells, therefore the development of new chemotherapeutic agents is challenging, since these chemotherapeutic agents should be able to kill or inhibit the growth only of tumor cells. From ancient times until today plants and their products have been used for the treatment of diseases, thus the natural compounds may provide new opportunities for the development of cancer drugs. Cedrelone is an isolated limonoid from methanol extract of Trichilia catigua aryl, a native Brazilian plant that grows abundantly in various regions of the country and is popularly known as "cedrinho", "catuaba" or "catiguá". Studies have shown that cedrelone has insecticidal and antifungal activity and previous studies performed by our research group have demonstrated that cedrelone is able to inhibit proliferation, colony formation, cell adhesion, migration, invasion and moreover, to induce apoptosis in triple negative breast cancer cells from the line MDAMB- 231. Therefore, the aim of this study was to identify the mechanism of action of cedrelone in triple negative breast tumor cells, MDA-MB-231, through cedrelone analysis, and through cell morphology assay, colony formation, apoptosis assays such as DNA fragmentation and nuclear fragmentation, cell cycle, qRT-PCR and western blotting. The results demonstrate that cedrelone has an affinity for biological membranes and no antioxidant activity. Furthermore, cedrelone is capable of inducing morphological changes, reduce the number and size of colonies and induce apoptosis by increasing the gene expression of pro-apoptotic protein Bax and decreasing gene expression of anti-apoptotic Bcl-2 in MDA-MB-231. These results indicate that cedrelone has immense potential in cancer therapy based on their antiproliferative and apoptosis inducing effects. / O câncer está entre as maiores causas de morte do mundo, sendo que o câncer de mama é o tipo de câncer que mais acomete mulheres. O tratamento dessa doença requer uma cuidadosa seleção de um ou mais métodos de intervenção. A maioria das drogas usadas em quimioterapia atualmente provoca danos no DNA, tanto das células tumorais, como também das células normais, portanto o desenvolvimento de novos quimioterápicos é um desafio, uma vez que esses quimioterápicos devem ser capazes de agir seletivamente para matar ou inibir o crescimento apenas de células tumorais. Desde a antiguidade até hoje as plantas e seus produtos vêm sendo utilizados para o tratamento das doenças, sendo assim os compostos naturais podem proporcionar novas oportunidades para o desenvolvimento de medicamentos contra o câncer. A cedrelona é um limonóide isolado do extrato metanólico do arilo de Trichilia catigua, uma planta nativa da flora brasileira que cresce abundantemente em várias regiões do país e que é popularmente conhecida como cedrinho , catuaba ou catiguá . Estudos demonstram que a cedrelona apresenta atividade inseticida e antifúngica, e em um estudo preliminar verificamos que a cedrelona inibe a proliferação de células tumorais da linhagem MDA-MB-231 com mais seletividade do que inibe a proliferação de fibroblastos humanos, inibe significativamente a adesão das células MDA-MB-231 ao colágeno tipo I, e também possui um potencial excelente contra a migração e a invasão das células MDA-MB-231. A cedrelona também é capaz de induzir a apoptose em células da linhagem MDA-MB- 231. Portanto, o objetivo do presente trabalho foi identificar o mecanismo de ação da cedrelona em células tumorais de mama triplo negativas, da linhagem MDA-MB-231, por meio de análises da cedrelona, por meio do coeficiente de partição e do ensaio de atividade antioxidante e de ensaios de morfologia celular, formação de colônia, apoptose, como o de fragmentação de DNA e o de fragmentação nuclear, ciclo celular, pcr em tem real e western blotting. Os resultados demonstram que a cedrelona possui afinidade com membranas biológicas e não apresenta atividade antioxidante. Ainda, a cedrelona é capaz de induzir modificações morfológicas, diminuir o número e tamanho de colônias e induzir a apoptose aumentando a expressão gênica da proteína próapoptótica Bax e diminuindo a expressão gênica da proteína anti-apoptótica Bcl-2 nas células tumorais de mama triplo negativas, da linhagem MDA-MB-231. Esses resultados indicam que a cedrelona tem potencial na terapia contra o câncer com base em sua ação antiproliferativa e efeitos de indução da apoptose.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA09MA118.pdf: 160083 bytes, checksum: 25c9450a31e59d2364610c952a970219 (MD5) Previous issue date: 2009-09-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / In somatic cell nuclear transfer (SCNT), the type of the recipient cytoplast plays a key role on nuclear reprogramming. Distinct cytoplasts and karyoplasts and different activation protocols were used for bovine embryo cloning aiming to evaluate the effect of the type of cytoplast (oocyte and/or zygote) and the activation protocol (chemical, AQ, or spermatic, AE) on development of cloned blastocysts produced by handmade cloning (HMC). After 17 h of in vitro maturation (MIV), 2,946 oocytes were enucleated by manual bisection resulting in either MII cytoplasts (enucleated) or MII karyoplasts (non-enucleated). An additional group of 2,368 oocytes, in vitro-fertilized (FIV) for 6 h, were manually bisected and segregated in either FIV cytoplasts (enucleated) or FIV karyoplasts (non-enucleated). Cells from a primary culture previously established from a skin biopsy from an adult female bovine were used as nuclei donors (karyoplast CS). Structures were allocated to (a) control groups: FIV; parthenogenesis using zona-intact (PG c/) or zona-free oocytes (PG s/); and clones by SCNT; or (b) experimental groups: G1, FIV cytoplast + MII cytoplast + CS karyoplast; G2, MII cytoplast + FIV karyoplast; G3, FIV cytoplast + FIV karyoplast; G4, FIV cytoplast + FIV cytoplast + CS karyoplast; and G5, MII cytoplast + MII karyoplast. Following electrofusion, experimental groups G1 to G5 were allocated to sub-groups of either sperm-mediated (AE) or additional chemical (AQ) activation. The in vitro culture was carried out in the WOW (wellof- the-well) system. After 20 replications, cleavage (D2) and blastocyst (D7) rates were compared by the &#967;2 test, with values for total cell number and cell allocation in the blastocyst, determined by differential staining, being evaluated by ANOVA, with pairwise comparisons by the Tukey test, for P<0.05 (P<0.05). The only experimental group that yielded a blastocyst development similar to the FIV (27.0%) and SCNT (31.4%) control groups was the subgroup G1 AE (28.2%). This fact may be attributed to a more proper synchrony between the karyoplast and cytoplasts and/or to a more suitable activation process. Embryo development in subgroups G1 AQ (13.7%), G4 AQ (6.4%) and G4 AE (8.7%) was lower than in G1 AE, possibly due to a higher degree of asynchrony in the activation process or cell cycle. The lack of development in groups G2 and G3, irrespective of the activation protocol, was possibly due to the manipulation process during a highly sensible biological period. Likewise, the low cleavage (57.0%) and the lack of development in group G5 (spontaneous activation) in fact showed that the manipulation induced weak spontaneous oocyte activation. In general, total cell number and cell allocation were similar between groups with development to the blastocyst stage. In conclusion, the activation process appeared to be as important to embryo development as the type of cytoplast or karyoplast used for embryo reconstruction. The production of cloned bovine embryos using a more physiological activation process (AE) was proven as a viable procedure, with efficiency rates observed in subgroup G1 AE being similar to groups FIV or TNCS / Na clonagem por transferência nuclear com célula somática (TNCS), o tipo de citoplasto receptor desempenha papel chave na reprogramação nuclear. Distintos citoplastos e carioplastos e condições de ativação foram utilizadas na reconstrução de embriões bovinos com o objetivo de avaliar o efeito do tipo de citoplasto (oócito e/ou zigoto) e do método de ativação (química, AQ, ou espermática, AE) no desenvolvimento de blastocistos clonados produzidos pela técnica de clonagem manual (Handmade Cloning, HMC). Após 17 h de maturação in vitro (MIV), 2.946 oócitos foram enucleados por bissecção manual, resultando em hemi-oócitos enucleados (citoplastos MII) e não enucleados (carioplastos MII). Outros 2.368 oócitos submetidos a 6 h de fecundação in vitro (FIV) foram bisseccionados manualmente e segregados em hemi-zigotos enucleados (citoplastos FIV) e não enucleados (carioplastos FIV). Células de um cultivo celular estabelecido a partir da biópsia auricular de uma fêmea bovina adulta foram utilizadas como núcleos doadores (carioplasto CS). As estruturas foram dispostas em (a) grupos controle: FIV; partenogênese com oócitos com (PG c/) ou sem zona pelúcida (PG s/); e clone por TNCS; ou (b) grupos experimentais: G1, citoplasto FIV + citoplasto MII + carioplasto CS; G2, citoplasto MII + carioplasto FIV; G3, citoplasto FIV + carioplasto FIV; G4, citoplasto FIV + citoplasto FIV + carioplasto CS; e G5, citoplasto MII + carioplasto MII. Após a eletrofusão das estruturas, os grupos experimentais G1 a G45 foram divididos em subgrupos de AQ ou AE. O cultivo in vitro foi realizado pelo sistema WOW (well-of-the-well). Após 20 repetições, as taxas de clivagem (D2) e blastocisto (D7) foram comparadas pelos testes de &#967;2 e os valores para o número total de células e a alocação das linhagens celulares nos blastocistos, determinados por coloração diferencial, foram avaliados por análise de variância, com pareamento comparativo pelo teste de Tukey, para P<0,05. O único grupo experimental que apresentou desenvolvimento embrionário no D7 semelhante aos controles FIV (27,0%) e TNCS (31,4%) foi o subgrupo G1 AE (28,2%). Isso pode ser atribuído a uma melhor sincronia do ciclo celular entre citoplastos e/ou carioplasto e um mais adequado processo de ativação. O desenvolvimento embrionário nos grupos G1 AQ (13,7%), G4 AQ (6,4%) e G4 AE (8,7%) foi menor do que o G1 AE, possivelmente devido à assincronia do processo de ativação ou ciclo celular. O desenvolvimento embrionário nulo dos grupos G2 e G3, independente da ativação, possivelmente foi decorrente da manipulação das estruturas em um momento biologicamente sensível. Da mesma forma, a baixa clivagem (57,0%) e o desenvolvimento nulo no grupo G5 de ativação espontânea demonstraram de fato que a manipulação estimulou o processo de ativação embrionária de forma sub-limiar. Em geral, não houve diferença no número de células e alocação celular nos grupos onde houve desenvolvimento até o estádio de blastocisto. Conclui-se que o processo de ativação foi tão significativo para o desenvolvimento embrionário que o tipo de citoplasto e carioplasto usados na reconstrução embrionária. A produção de embriões clones com um método mais fisiológico de ativaçao (AE) mostrou-se como um procedimento viável, obtendo-se no grupo G1 AE a mesma eficiência observada na FIV ou na TNCS

INTRODUÇÃO: O sucesso a longo prazo da intervenção coronária percutânea, inicialmente realizada apenas com balão, era limitado pelo recolhimento elástico da artéria e pela hiperplasia neointimal. Com o advento dos stents convencionais (BMS) houve melhora nesse cenário e diminuição da reestenose, que é resultante de uma complexa cadeia de eventos iniciada após a injúria causada na parede vascular pela insuflação de balões e da aposição das hastes do stent. A proliferação excessiva de células musculares lisas (VSMC) tem papel fundamental na formação da neoíntima no contexto da reestenose intra-stent com a consequente redução da luz arterial. Com o advento dos stents farmacológicos (DES) houve diminuição importante da hiperplasia neointimal e um dos fármacos que se mostrou efetivo nesse papel é o sirolimo, que atua se ligando à proteína de ligação 12 e o heterodímero resultante se liga à mTOR impedindo sua ativação e causando parada do ciclo celular entre as fases G1 e S, desse modo inibindo a proliferação e migração de VSMC e das células endoteliais (HUVEC). Portanto a intervenção coronária acaba interferindo diretamente no endotélio, interferindo na produção das HUVEC não apenas no aspecto quantitativo, mas também na função das mesmas, e a qualidade funcional do endotélio é tão fundamental quanto à sua presença. Após o implante dos DES, principalmente os de primeira geração, ocorre disfunção endotelial cujo principal marcador é a perda da capacidade do relaxamento do vaso. Há correlação também entre cobertura das hastes incompleta e ocorrência de trombose dos stents. Consequentemente há espaço para o aprimoramento dos DES, para que se tornem dispositivos com eficácia já alcançada na prevenção da reestenose porém com um perfil de segurança maior. O presente trabalho tem como objetivo avaliar as alterações causadas pelos DES nas HUVEC e nas VSMC em cocultura na presença e na ausência do soro rico em plaquetas. MATERIAIS E MÉTODOS: Utilizamos células HUVEC e VSMC em modelos de monocultura e cocultura, na presença e na ausência de soro rico em plaquetas, tratadas com BMS ou DES. Realizamos a determinação da IC50 do inibidor da mTOR, avaliação da citotoxicidade pelo método colorimétrico do MTT, determinação da formação de peróxidos lipídicos, avaliação das fases do ciclo celular e da expressão de marcadores de controle de proliferação e inflamação. RESULTADOS: Na avaliação da citotoxicidade pelo método colorimétrico do MTT e determinação da IC50 as VSMC foram menos sensíveis ao sirolimo que as HUVEC (IC50 em 24/48 horas 14,85/10,47uM e 9,48/22,24 uM, respectivamente para HUVEC e VSMC). As plaquetas e fatores solúveis potencializam o estresse oxidativo gerado pela presença dos stents possivelmente por ampliar o ambiente inflamatório. Houve parada do ciclo celular na fase G0/G1 causada pelos DES somente com adição das plaquetas ao meio de cultura. Nos modelos de cultura celular sem as plaquetas a parada do ciclo celular foi em G2/M. Não houveaumento das células na fase DNA fragmentado (sub-G0) evidenciando que não houve indução de morte celular. CONCLUSÃO: As VSMC foram menos sensíveis ao sirolimo que as HUVEC. Nos modelos de cocultura com adição das plaquetas os DES eluídores de sirolimo causaram parada do ciclo celular na fase G0/G1 sem indução de morte celular, sugerindo que o sirolimo exerce seus efeitos anti-inflamatórios nessas populações celulares e consequentemente reduz a hiperplasia neointimal por um mecanismo citostático / INTRODUCTION: The long-term success of percutaneous coronary intervention, initially performed only with a balloon, was limited by the elastic recoil of the artery and by neointimal hyperplasia. There was improvement in this scenario with the advent of bare metal stents (BMS), because they decrease in restenosis, that resulting from a complex network of events initiated after the injury caused in the vascular wall by insufflation of balloons and apposition of the stent struts. Excessive proliferation of smooth muscle cells (VSMC) plays a key role in neointimal hyperplasia in the context of intrastent restenosis with consequent reduction of arterial lumen. With the advent of drug-eluting stents (DES) there was a significant decrease in neointimal hyperplasia and one of the drugs that proved effective in this role is sirolimus, which acts by binding to the binding protein 12 and the resulting heterodimer binds to mTOR preventing its activation and causing cell cycle arrest between G1 and S phases and thereby inhibiting the proliferation and migration of VSMC and also inhibiting endothelial cells (HUVEC). Therefore, coronary intervention interferes directly in the endothelium, interfering in the production of endothelial cells, not only in the quantitative aspect, but also in their function, and the functional quality of the endothelium is as fundamental as its presence. After the implantation of DES, especially those of the first generation, endothelial dysfunction occurs, whose main marker is the loss of the capacity of the vessel relaxation. There is also correlation between incomplete stem coverage and stent thrombosis. Consequently, it is possible to improve of the DES, so that they become devices with already achieved effectiveness in the prevention of restenosis but with a greater safety profile. The present study aims to evaluate the changes caused by DES in human HUVEC and VSMC in co-culture in the presence and absence of platelet-rich serum. MATERIALS AND METHODS: We used HUVEC and VSMC in monoculture and co-culture models in the presence and absence of platelet rich serum treated with BMS or DES. We performed the determination of IC50 for mTOR inhibitor, cytotoxicity evaluation by the colorimetric method of MTT, determination of lipid peroxide formation, cell cycle and expression of necrosis and inflammation markers. RESULTS: In the assessment of cytotoxicity by the MTT colorimetric method and determination of the IC50, VSMC were less sensitive to sirolimus than HUVEC (IC50 in 24/48 hours 14.85 uM/10.47uM and 9.48 uM/ 22.24 uM, respectively for HUVEC and VSMC). Platelets potentiate the oxidative stress generated by the presence of stents, possibly by increasing the inflammatory environment. Drug-eluting stents arrested VSMC and HUVEC in the G0/G1 phase of the cell cycle only with the addition of platelets to the culture medium. In cell culture models without platelets the cell cycle arrest was in G2/M. There was no increase of the cells in the fragmented DNA phase (sub-G0) evidencing that there was no induction of apoptosis. CONCLUSION: Human aorta smooth muscle cells of the were less sensitive to sirolimus than HUVEC. In coculture models with platelet addition, DES with sirolimus caused cell cycle arrest in the G0/G1 phase without induction of apoptosis, suggesting that sirolimus exerts its antiinflammatory effects in these cellular populations and consequently reduces neointimal hyperplasia via a cytostatic mechanism

A Fosfoetanolamina sintética (FOS) é uma molécula análoga aos fosfolipídios de membrana celular com propriedades antitumorais, antiinflamatórias e antiproliferativas. Nosso grupo de pesquisa desenvolveu diversos estudos com a FOS mostrando resultados satisfatórios quanto à sua eficácia antitumoral. Neste estudo foram avaliados os efeitos antitumorais in vitro da Fostoetanolamina e da formulação lipossomal DODAC/FOS em linhagem de carcinoma de mama murino (4T1). Os efeitos da citotoxicidade da FOS na linhagem tumoral 4T1 foi avaliado pela determinação da viabilidade celular pelo teste colorimétrico MTT e os valores obtidos da IC50% foram de 40mM e 20mM nos períodos de 24 e 48 horas, respectivamente. Com o tratamento com o lipossoma DODAC vazio nas células 4T1 a IC50% foi de 0,5 mM e 0,09 nos períodos de 6 e 12 horas, respectivamente e com o tratamento com a formulação lipossomal DODAC/Pho-s a IC50% de 0,78mM em 6 horas e 0,17mM em 12 horas de tratamento. A produção de radicais livres lipoperoxidados foi avaliada pela formação do TBARS em células 4T1, tratadas por 24 horas com Pho-s, mostrando diferença significativa a partir de 30mM e 1,6mM com o lipossoma DODAC vazio, não havendo diferença estatística no grupo DODAC/FOS. As alterações nas distribuições das populações celulares nas fases do ciclo celular avaliadas por citometria de fluxo mostraram um aumento do DNA fragmentado após 12 e 24 horas e diminuição nas outras fases do ciclo. As alterações nos arranjos celulares foram avaliadas por meio da marcação com os fluorocromos acridine-orange e rodamina 123 por microscopia confocal a laser, no qual foi observada a mudança na morfologia, fragmentação de membranas e perdas da projeção de prolongamentos citoplasmáticos. A indução de células em senescência foi avaliada pela atividade enzimática com a enzima ?-galactosidase, mostrando células senescente apenas na concentração de 20mM. A atividade apoptótica das células tumorais de mama foi avaliada pela Anexina V/PI, mostrando um aumento, principalmente, da apoptose tardia em todos os tratamentos. Diversos marcadores de controle e progressão do ciclo celular, stress, angiogênese e receptores hormonais e o potencial mitocondrial foram avaliados por citometria de fluxo. Os resultados mostraram um aumento na expressão das proteínas ligadas com a apoptose e morte celular e diminuição geral das proteínas que participam dos processos de progressão do ciclo celular e proliferação celular, além das proteínas anti-apoptóticas, o que demonstra o seu potencial antitumoral / Synthetic Phosphoethanolamine (FOS) is a analogous molecule to cell membrane phospholipids with antitumoral, anti-inflammatory and antiproliferative properties. Our research group has developed several studies with FOS showing satisfactory results regarding its antitumor efficacy. In this study we evaluated the in vitro antitumor effects of Fostoethanolamine and the DODAC/FOS liposomal formulation in murine breast carcinoma (4T1) line. The effects of the FOS cytotoxicity on the 4T1 tumor line were evaluated by the cell viability test MTT, and the IC 50% values were 40mM and 20mM in the 24 and 48 hour, respectively. With the empty DODAC treatment in the 4T1 cells the IC 50% was 0.5 mM and 0.09 at the 6 and 12 hour respectively and with the treatment of DODAC/FOS at IC50% of 0.78 mM at 6 hours and 0.17 mM in 12 hours of treatment. The production of lipoperoxidized free radicals was evaluated by the formation of TBARS in 4T1 cells, treated for 24 hours with Pho-s, showing a significant difference from 30mM and 1.6mM with empty DODAC, with no statistical difference in the DODAC/FOS group . Changes in the cell population distributions in the cell cycle phases evaluated by flow cytometry showed an increase in fragmented DNA after 12 and 24 hours and decrease in the other phases of the cycle. Alterations in the cellular arrangements were evaluated by means of the labeling with the fluorochromes acridine-orange and rhodamine 123 by laser confocal microscopy, in which the change in morphology, membrane fragmentation and loss of the projection of cytoplasmic prolongations were observed. The induction of senescence cells was evaluated by enzymatic activity with beta-galactosidase enzyme, showing senescent cells only at the concentration of 20 mM. The apoptotic activity of breast tumor cells was evaluated by Annexin V / PI, showing an increase, mainly, of late apoptosis in all treatments. Several control markers and cell cycle progression, stress, angiogenesis and hormone receptors and mitochondrial potential were evaluated by flow cytometry. The results showed an increase in the expression of the proteins bound with apoptosis and cell death and general decrease of the proteins that participate in the processes of cell cycle progression and cell proliferation, in addition to the anti-apoptotic proteins, which demonstrates its antitumoral potential

A proliferação das células do córtex adrenal é um fenômeno que envolve genes e proteínas relacionados com o controle do ciclo celular. Um dos principais fatores envolvidos na proliferação do córtex adrenal é o ACTH (hormônio corticotrófico), mas outros fatores, como o peptídeo N-terminal da POMC, parece estar envolvido. Para contribuir com o entendimento dos mecanismos envolvidos na resposta proliferativa do córtex adrenal analisamos os efeitos desencadeados por ambos os peptídeos em ratos cujo eixo HPA foi inibido pela dexametasona. Foram utilizados os métodos de incorporação de BrdU; de análise da expressão proteica das ciclinas D, E e p27 através de imunistoquímica e immunoblotting e da expressão de genes relacionados ao controle do ciclo celular utilizando placas de qRT-PCR. Nossos resultados sugerem que ambos os peptídeos induzem efeito proliferativo mas zona-específico no córtex adrenal, e que esse efeito pode ser mediado pelo controle da expressão das ciclinas D2, D3 e E, e pelo inibidor de ciclo celular, a proteína p27kip1. / The proliferation of adrenal cortical cells involves genes and proteins related with the control of the cell cycle. The main factor involved in the proliferation of the adrenal cortex is the ACTH (corticotrophin), but other factor, such as the peptide N-terminal of POMC, seems to be involved. To contribute to the understanding of the mechanisms involved in the proliferative response of the adrenal cortex, we analyzed the effects triggered by both peptides in rats with the HPA axis inhibited by dexamethasone. The methods used were the incorporation of BrdU; analysis of protein cyclins D, E and p27 expression through immunohistochemistry and immunoblotting and expression of genes involved in cell cycle regulation by using qRT-PCR arrays. The results suggest that both peptides induced proliferative effect in adrenal cortex in a zone-specific manner. This effect may be mediated by the control of cyclins D2, D3 and E expression, and also by the cell cycle inhibitor, protein p27KIP1.