Dissertação (mestrado) - Pontifícia Universidade Católica do Paraná, Curitiba, 2007 / Bibliografia: f. 144-155 / O nascimento da Engenharia Genética constitui um marco para as Ciências, pois a partir do desenvolvimento desta técnica, também conhecida como técnica do DNA recombinante, tornou-se possível produzir os Organismos Geneticamente Modificados (OGM). Em 1996,

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-02T18:36:32Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 465320 bytes, checksum: aef535b7b9e18085d72080d249710846 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-02T18:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 465320 bytes, checksum: aef535b7b9e18085d72080d249710846 (MD5) Previous issue date: 2005-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A família Geminiviridae é caracterizada pelo aspecto geminado da partícula viral e genoma composto por DNA circular de fita simples, com aproximadamente 2.600 nucleotídeos. É dividida em quatro gêneros, de acordo com o tipo de inseto vetor, gama de hospedeiros, organização do genoma e relacionamento filogenético. Os begomovírus possuem dois componentes genômicos, são transmitidos por mosca-branca e infectam espécies dicotiledôneas. No Brasil há diversos relatos de begomovírus causando sérias perdas nas culturas do feijoeiro e tomateiro. Embora a importância econômica dos begomovírus em soja seja secundária, a ocorrência desses patógenos nesta cultura é preocupante. Duas possíveis novas espécies de begomovírus, denominadas “vírus A” e “vírus B” foram isoladas e clonadas a partir de plantas de soja. Obteve-se a seqüência completa de nucleotídeos do DNA-B do “vírus A”, e uma seqüência parcial do DNA-A do “vírus B”. A comparação de seqüências e análise filogenética indica que o DNA-B do “vírus A” possui a máxima correspondência nucleotídica com o isolado B3 do Sida micrantha mosaic virus (SimMV), e o DNA-A do “vírus B” com o isolado A2 do SimMV. Entretanto os níveis de identidade são baixos, indicando que ambos os vírus realmente devem constituir novas espécies de begomovírus. Vírus de plantas, incluindo os begomovírus, têm sido utilizados com sucesso na construção de vetores para a indução de silenciamento gênico. Entretanto, existem poucos vetores eficientes para a inoculação em plantas de tomate e não há relatos para plantas de soja. Os dois componentes genômicos do Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) encontram-se completamente seqüenciados e, o DNA-A foi utilizado para a construção do vetor viral pToR- A1.4 CP. A estratégia utilizada foi a construção de um clone infeccioso sem o gene da proteína capsidial, substituído por um sítio múltiplo de clonagem para 9 enzimas de restrição derivado do vetor pKS+. Este vetor viral baseado no ToRMV será um complemento e uma alternativa em estudos de genômica funcional de tomateiro e de soja, na análise de genes envolvidos em vários processos biológicos. / The Geminiviridae is a family of plant viruses characterized by twinned icosahedral viral particles and a circular single-stranded DNA genome, with approximately 2.600 nucleotides. It is divided into four genera according to the type of insect vector, host range, genomic organization and phylogenetic relationships. Begomoviruses have two genomic components, are transmitted by whitefly and infect dicotyledoneous species. In Brazil, begomoviruses cause serious losses in tomato and bean crops. Although the economic importance of the begomoviruses in soybean is secondary, the presence of these pathogens in this crop is cause of concern. Two possible new begomovirus species, named “virus A” and “virus B”, were isolated and cloned from soybean plants. The complete nucleotide sequence of the DNA-B from “virus A” and a partial sequence of the DNA-A from “virus B” were obtained. Sequence comparisons and phylogenetic analysis indicated that the DNA-B from “virus A” has a maximum nucleotide identity with the isolate B3 from Sida micrantha mosaic virus (SimMV), and that the DNA-A from “virus B” with the isolate A2 from SimMV. However, identity levels are low, indicating that both viruses could actually comprise novel begomovirus species. Plant viruses, including begomoviruses, have been used with success for the construction of vectors for the induction of gene silencing. However, there are few effective vectors for inoculation into tomato plants and none for soybean plants. Both genomic components of Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) have been completely sequenced and, the DNA-A was used for the construction of the viral vector pToR-A1.4 CP. The strategy used was the construction of an infectious clone without the capsid protein gene, replaced by a multiple cloning site for 9 restriction enzymes, derived from the pKS+ plasmid vector. This viral vector will be a complement and an alternative in functional genomics of tomato and soybean plants, in the analysis of genes involved in various biological processes. / Dissertação importada do Alexandria

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-01-20T13:50:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1066929 bytes, checksum: 6fba09d20e0a47560175c7acd46b586e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-20T13:50:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1066929 bytes, checksum: 6fba09d20e0a47560175c7acd46b586e (MD5) Previous issue date: 2015-07-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Nesta pesquisa, estudamos o tempo de eficiência das insulinas de DNA recombinante via modelos para os testes de vida acelerados. Para isso, foi avaliada, periodicamente, a perda de potência dessas insulinas, submetidas às condições de temperatura de 8ºC, 25ºC e 37ºC, inseridas num contexto de ensaios acelerados. Essa proposta envolveu a utilização da metodologia para os testes de vida acelerados em estudos de dados reais através dos softwares R e Minitab. Ela teve como objetivos: o estudo da influência da temperatura no tempo da perda de potência das insulinas; a aplicação de técnicas gráficas e do teste da razão de verossimilhança para escolha do modelo que melhor se ajuste aos dados; a extrapolação das estimativas obtidas em momentos de estresse para as condições normais de uso e a apresentação ao mundo acadêmico de uma aplicação desses testes aos dados reais da engenharia genética. A análise, de abordagem classica, tomou como referência os estudos de alguns pesquisadores que, para tratar a censura intervalar presente nos dados, passaram a considerar os intervalos censurados como tempos exatos de falha. Os resultados mostraram que, por meio dos testes de vida acelerados, os fabricantes não só serão capazes de produzir insulinas com mais qualidade e confiabilidade, em tempo recorde, bem como poderão ter os prejuízos minimizados por calcular o prazo de garantia e a validade desses produtos com estimativas de tempos de falha confiáveis, oferecendo, assim, produtos com mais eficiência. / Dans cette recherche, nous étudions la durée (le temps) de éfficacité de lºinsuline dºADN recombinant par les modeles de testes de vie accélérés. Raison pour laquelle a été avaliée, périodiquement, la perte de lºefficacité de ces insulines que sont sumises a des conditions de température de 8ºC, 25ºC et 37ºC, inserées dans un contexte de testes accélérés. Cette proposition a impliquée lºutilisation de la méthodologie par les testes de vie accélérés et les études de données réelles par moyen softwares R et Minitab. Ayant ainsi pour objectifs: lºétude de lºinfluence de la temperature au moment de la perte dºefficacité des insulines; lºapplication de techniques graphiques et du teste de la raison de vraissemblance pour le choix du modele que mieux sºajuste aux données; lºextrapolation des estimatives obtenues au moment du stress (tension) pour les conditions normales dºusage et la présentation au monde académique dº une application de ces testes aux données réelles de lº ingénierie génétique. Lºanalyse, de lºapproche classique, a pris pour référence les études de quelques chercheurs qui pour traiter la censure entre intervale présent dans les données, sont passés a considérer les intervales censurées comme temps exacte de faille. Les résultats ont montré que, par moyen de testes de vie accélérés, les fabricants ne seront pas seulement capables de produire des insulines de bonnes qualités et fiables, en temps record, mais aussi aurons leurs préjudices assez minimisés en ce qui concerne le délai de validité de ces produits avec les estimatives de la durée de faille confiable, tout en offrant ainsi, de produits plus efficace. / We have studied in the present research the efficiency rate of recombinant DNA insulin through models for accelerated life testing. For this purpose, we have periodically assessed the power loss for this type of insulin when it is subjected to temperature conditions of 8ºC, 25ºC, and 37ºC, and inserted in a context of accelerated life testing. This plan involved the use of a methodology for accelerated life testing and real data study by means of the softwares R and Minitab. This research had as its objectives: the study of the influence of temperature on the rate of insulin power loss; the application of graphical techniques and of likelihood-ratio testing in choosing the best suited model for the data; the extrapolation of estimations made in moments of stress to include normal usage conditions, and the presentation to academia of an instance of application of these tests to a real data from genetic engineering. The analysis, which was made in a classical approach, had as reference the research of a number of researchers-who, in order to cope with the interval censoring in the data, started to consider the censored intervals to be exact failure times. The results show that by means of the accelerated life tests not only the manufacturers will be able to produce insulin in record time with greater quality and reliability, but they will also manage to incur minimized losses, given that they will have the ability to calculate their products” dates of expiration and warranty periods based on reliable failure times and, therefore, to provide more efficient products. / Sem lattes

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3461.pdf: 3248917 bytes, checksum: b02925f28a9fc50ea71c3af6beebca5c (MD5) Previous issue date: 2011-03-04 / Financiadora de Estudos e Projetos / The desintegrinas are cys-rich polypeptides without enzymatic activity, some found in snake venoms with an adhesive motif to integrin, unleashing distinct responses. Several research groups have been studying snake venom disintegrins with focus in pharmacological applications in tumor progression and proliferation, angiogenesis, blood clotting, and osteoporosis. This work shows the results of the construction of cDNA library of Rhinocerophis alternatus venom gland, cloning and expression of ALT-C, a disintegrina-like protein, in bacterial system. The library was comprised of 812 sequences that were classified into: (i) coding for hypothetical protein or mismatched in databases (unknown) corresponding to 20.94%; (ii) transcripts for cellular process 17.86%; and (iii) transcripts coding for toxic protein with 61.21%. Among toxic proteins the SVMPs were the most abundant transcripts 58.59%. Other toxic transcripts were C-type lectins (15.56%), bradykinin potentiating peptides (11.8%), serineproteases (5.18%), cys-rich secretory proteins (2.28%), vascular endothelial growth factors (2.28%), L-amino acid oxidases (1.86%) and phospholipases A2 (1.45%). The percentages correspond to this snake venom effects, low enzymatic activity and hemorrhagic and clotting activity as main action, derived from the SVMPs, C-type lectin and serineproteases. One of the SVMPs contigs were chosen based on the similarity with ALT-C, the defined sequence was called ALT-Ch (ALT-C homologue) since there has 4 conservative substitutions compared to the previously determined sequence. The ALT-C-h sequence was used in PCR to inclusion the restriction site for BamHI and EcoRI, cloned in pGEX4T-1 and transformed into E. coli AD494 (DE3) for expression. The cell culture was grown until the log fase and induced with IPTG for 3 hours, the expressed protein's identity was confirmed by Western Blotting using Polyclonal antibody Anti-ALT-C. The construction of the R. alternatus venom gland cDNA library provides a source of interesting active biomolecules, such as desintegrinas, to pharmacological applications in pathologies involving integrins like angiogenesis, tumor progression and metastasis. / As desintegrinas são polipeptídeos sem atividade enzimática, ricos em cisteína, geralmente encontrados no veneno de serpentes, possuidoras de um motivo adesivo reconhecedor de integrinas antagonizando ou agonizando a atividade das mesmas. Diversos grupos de pesquisa vêm estudando desintegrinas de venenos de serpentes com o foco em aplicação farmacológica nos processos de progressão e proliferação tumoral, angiogênese, coagulação sanguínea, e osteoporose. Este trabalho apresenta os resultados da construção da biblioteca de cDNA da glândula venenífera de Rinocerophis alternatus e a clonagem e expressão da ALT-C, uma tipo desintegrina, em sistema bacteriano. A biblioteca foi composta por 812 sequências que foram classificadas em: (i) codificantes para proteínas hipotéticas ou sem equivalência nos bancos de dados (unknown) correspondendo a 20,94%; (ii) transcritos para produtos celulares 17,86%; e (iii) transcritos codificantes para proteínas tóxicas 61,21%. Dentre as proteínas tóxicas as SVMPs foram os transcritos mais abundantes com 58,59% dos compostos tóxicos do tecido. Os demais transcritos tóxicos encontrados foram as lectinas do tipo-C (15,56%), peptídeos potenciadores de bradicinina (11,8%), serinoproteases (5,18%), proteínas secretórias ricas em cisteína (2,28%), fatores de crescimento endotelial vascular (2,28%), L-aminoácido oxidases (1,86%) e fosfolipases A2 (1,45%). As percentagens encontradas correspondem aos efeitos do veneno dessa serpente, que possui baixa atividade enzimática e predominate ação hemorrágica e de alteração na coagulação sanguínea derivada da ação das SVMPs, lectinas do tipo-C e serinoproteases. Um dos contigs para SVMPs foi eleito pela similaridade com a ALT-C. A sequência determinada por esse contig foi denominada ALT-C-h (homóloga da ALT-C) por apresentar 4 substituições conservativas da sequência determinada anteriormente. A sequência foi utilizada em PCR para inclusão de sítio de restrição para BamHI e EcoRI, clonado em pGEX4T-1 e transformados em E. coli AD494(DE3) para ensaios de expressão. O cultivo foi crescido até a fase log e a indução expressão realizada com IPTG por 3 horas, a identidade da proteína expressa foi confirmada por western blotting utilizando anticorpo policlonal anti-ALT-C. A construção da biblioteca de cDNA da glândula venenífera de R. alternatus fornece uma fonte de estudo interessante de biomoléculas ativas nos venenos como, por exemplo, as desintegrinas visando aplicações farmacológicas para patologias envolvendo integrinas como angiogênese, progressão e metástase tumoral.

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-06-25Bitstream added on 2015-01-26T13:30:39Z : No. of bitstreams: 1 000793411.pdf: 2869881 bytes, checksum: dde8b87e326aaccf874b6b62350ca99d (MD5) / O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) é um gammaherpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (SK). A proteína K1 do KSHV é conhecida por aumentar a sobrevivência e proliferação celular em células infectadas. A ORF-K1 viral apresenta elevada variabilidade, de modo a discriminar diferentes genótipos do KSHV. Até o momento não se sabe se diferentes genótipos virais apresentam características biológicas próprias. Assim, vetores recombinantes contendo a ORF-K1 de genótipos virais A e B foram gerados. A ORF-K1 foi obtida a partir do DNA de linhagens de linfoma de efusão primária (PEL) constitutivamente infectadas pelo KSHV. O amplicon da ORF-K1 e vetor comercial foram digeridos, ligados e clonados em bactéria E. coli DH5α. Clones selecionados foram então submetidos à sequenciamento automatizado de DNA. As sequências geradas dos vetores recombinantes foram alinhadas e comparadas com sequências-protótipo de ORF-K1 do KSHV. Sequência de aminoácidos dos vetores recombinantes foram geradas e analisadas quanto a região codificadora do ITAM de K1. Um clone validado de cada vetor recombinante foi transfectado estavelmente em células HEK293 e a expressão de K1 foi avaliada por Western blot (WB) O sequenciamento de DNA demonstrou que a ORF-K1 dos vetores recombinantes de genótipo A, B e C corresponde a de sequências-protótipo depositadas de linhagens de PEL. A presença de K1 no lisado de células HEK293 transfectadas foi demonstrada por WB. A análise da sequência de aminoácidos de K1 codificada nos vetores recombinantes revelou que o domínio ITAM de K1 do genótipo B apresenta aminoácidos distintos em relação ao ITAM de K1 de genótipos A e C. Portanto, vetores recombinantes de ORF-K1 foram produzidos e validados, e serão úteis para se estabelecer modelo experimental para análises das propriedades biológicas da proteína K1 do KSHV / Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is a gammaherpesvirus associated with the development of Kaposi's sarcoma. The K1 protein of KSHV has been shown to induce increases the survival and proliferation of infected cells. The viral ORF-K1 shows high variability, so it is possible to distinguish different KSHV genotypes (genotypes A, B, C, D). So far, it is unclear whether different viral genotypes have their own biological characteristics. To this intent, recombinant vectors were generated containing the ORFK1 genotypes A and B. ORF-K1 was obtained from the DNA of primary effusion lymphoma (PEL) cell lines. The amplicon generated and the commercial vector were digested, bonded and cloned in E.coli DH5α. Selected clones underwent automated DNA sequencing. The generated sequences were compared with prototype sequences of ORF-K1. The amino acid sequences from vectors were generated and analyzed in the K1 ITAM-coding region. Validated clones were stably transfected into HEK293 cells and K1 expression was evaluated using Western blot (WB). DNA sequencing showed that the ORF-K1 recombinant vectors corresponds to the prototype sequences deposited from PEL cell lines. WB demonstrated the presence of K1 in the lysate of HEK293 transfected cells. Analysis of the K1 amino acid sequence encoded in the vectors revealed that ITAM domain of K1 (genotype B) has distinct amino acids from the ones in the ITAM domain of K1 (genotypes A and C). Therefore ORF-K1 recombinant vectors were produced and validated, and will be useful to establish an experimental model for analysis of the biological properties of the K1 protein

Orientador: Deilson Elgui de Oliveira / Banca: Claudia Esther Alicia Rocio Hassan / Banca: João Pessoa Araújo Junior / Resumo: O herpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) é um gammaherpesvírus associado ao sarcoma de Kaposi (SK). A proteína K1 do KSHV é conhecida por aumentar a sobrevivência e proliferação celular em células infectadas. A ORF-K1 viral apresenta elevada variabilidade, de modo a discriminar diferentes genótipos do KSHV. Até o momento não se sabe se diferentes genótipos virais apresentam características biológicas próprias. Assim, vetores recombinantes contendo a ORF-K1 de genótipos virais A e B foram gerados. A ORF-K1 foi obtida a partir do DNA de linhagens de linfoma de efusão primária (PEL) constitutivamente infectadas pelo KSHV. O amplicon da ORF-K1 e vetor comercial foram digeridos, ligados e clonados em bactéria E. coli DH5α. Clones selecionados foram então submetidos à sequenciamento automatizado de DNA. As sequências geradas dos vetores recombinantes foram alinhadas e comparadas com sequências-protótipo de ORF-K1 do KSHV. Sequência de aminoácidos dos vetores recombinantes foram geradas e analisadas quanto a região codificadora do ITAM de K1. Um clone validado de cada vetor recombinante foi transfectado estavelmente em células HEK293 e a expressão de K1 foi avaliada por Western blot (WB) O sequenciamento de DNA demonstrou que a ORF-K1 dos vetores recombinantes de genótipo A, B e C corresponde a de sequências-protótipo depositadas de linhagens de PEL. A presença de K1 no lisado de células HEK293 transfectadas foi demonstrada por WB. A análise da sequência de aminoácidos de K1 codificada nos vetores recombinantes revelou que o domínio ITAM de K1 do genótipo B apresenta aminoácidos distintos em relação ao ITAM de K1 de genótipos A e C. Portanto, vetores recombinantes de ORF-K1 foram produzidos e validados, e serão úteis para se estabelecer modelo experimental para análises das propriedades biológicas da proteína K1 do KSHV / Abstract: Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) is a gammaherpesvirus associated with the development of Kaposi's sarcoma. The K1 protein of KSHV has been shown to induce increases the survival and proliferation of infected cells. The viral ORF-K1 shows high variability, so it is possible to distinguish different KSHV genotypes (genotypes A, B, C, D). So far, it is unclear whether different viral genotypes have their own biological characteristics. To this intent, recombinant vectors were generated containing the ORFK1 genotypes A and B. ORF-K1 was obtained from the DNA of primary effusion lymphoma (PEL) cell lines. The amplicon generated and the commercial vector were digested, bonded and cloned in E.coli DH5α. Selected clones underwent automated DNA sequencing. The generated sequences were compared with prototype sequences of ORF-K1. The amino acid sequences from vectors were generated and analyzed in the K1 ITAM-coding region. Validated clones were stably transfected into HEK293 cells and K1 expression was evaluated using Western blot (WB). DNA sequencing showed that the ORF-K1 recombinant vectors corresponds to the prototype sequences deposited from PEL cell lines. WB demonstrated the presence of K1 in the lysate of HEK293 transfected cells. Analysis of the K1 amino acid sequence encoded in the vectors revealed that ITAM domain of K1 (genotype B) has distinct amino acids from the ones in the ITAM domain of K1 (genotypes A and C). Therefore ORF-K1 recombinant vectors were produced and validated, and will be useful to establish an experimental model for analysis of the biological properties of the K1 protein / Mestre

Orientador: Adilson Leite / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-21T19:39:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Turcinelli_SilviaRegina_M.pdf: 5122448 bytes, checksum: f181f23e777e96ab7baab2729be3de58 (MD5) Previous issue date: 1996 / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-09T09:20:33Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1613973 bytes, checksum: 68e6cb9b2db2276aab154d130130c331 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-09T09:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1613973 bytes, checksum: 68e6cb9b2db2276aab154d130130c331 (MD5) Previous issue date: 2011-04-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O Ácido L-ascórbico (L-AA), popularmente conhecido como vitamina C é naturalmente sintetizado pelas plantas a partir de D-glicose por uma via de 10 etapas. L- galactose é o intermediário chave para a biossíntese de L-ascórbico, cuja via de biossíntese foi recentemente elucidada. As leveduras produzem um composto análogo ao L-AA, o ácido D-eritroascórbico, mas em presença de um de seus precursors tais como L-galactose, L galactono-1,4-lactona, ou L-gulono-1 ,4-lactona, as leveduras são capazes de sintetizar o L-AA. Para evitar alimentar a cultura de levedura com o "L" enantiômero, a levedura Kluyveromyces lactis CBS2359 foi engenheirada com genes da via de biossíntese de L-galactose: GDP-manose-3 ,5-epimerase (GME), GDP-L- galactose fosforilase (VTC2) e L-galactose-1-fosfato fosfatase (VTC4) isolados de Arabidopsis thaliana. Com este objetivo plasmídeos foram construídos visando a integração por recombinação homóloga dos cassetes de expressão no Locus LAC4 (beta- galactosidase) Após o processo de transformação, o promotor do gene LAC4 promove a transcrição do gene GME, enquanto que genes VTC2 e VTC4 estão sob o controle dos promotores GPD1 e ADH1 respectivamente provenientes da levedura S. cerevisiae. A expressão dos genes da via de biossíntese de L-galactose em K. lactis foi determinada por RT-PCR e western blot. As leveduras recombinantes foram capazes de produzir cerca de 23 mg.L-1 de ácido L-ascórbico após 48 horas de cultivo, quando cultivados em meio YP suplementado com 2% (p/v) de D-galactose. A biossíntese de L-AA foi também realizada quando as linhagens recombinantes foram cultivadas em meio de soro de queijo, fonte alternativa rica em lactose proveniente da indústria de laticínios. Este trabalho é um dos primeiros relatos de engenharia metabólica na levedura K. lactis visando a biossíntese de ácido L-ascórbico por um processo fermentativo sem a adição de intermediários precursores no meio de cultura. / L-ascorbic acid is naturally synthesized in plants from D-glucose via a ten-step pathway. The branch pathway to synthesize L-galactose, the key intermediate for L- ascorbic biosynthesis, has been recently elucidated. Budding yeast is only able to synthesize L-ascorbic acid if it is cultivated in the presence of one of its precursors: L- galactose, L-galactono-1,4-lactone, or L-gulono-1,4-lactone extracted from plants or animals. To avoid feeding the yeast culture with this “L” enantiomer, we engineered Kluyveromyces lactis with L-galactose biosynthesis pathway genes: GDP-mannose-3,5- epimerase (GME), GDP-L-galactose phosphorylase (VTC2) and L-galactose-1- phosphate phosphatase (VTC4) isolated from Arabidopsis thaliana. Plasmids were constructed to target the cloned plant genes to the K. lactis LAC4 Locus by homologous recombination and the expression was associated to the growth of the cells on D- galactose or lactose. Upon K. lactis transformation, GME was under the control of the native LAC4 promoter while VTC2 and VTC4 genes were transcribed by the S. cerevisiae promoters GPD1 and ADH1 respectively. The expression in K. lactis of the endogenous L-galactose biosynthesis plant genes was determined by RT-PCR and western blotting. The recombinant yeasts were able to produce about 23 mg.L-1 of L- ascorbic acid in 48 hours of cultivation when cultured on rich medium with 2% (w/v) D-galactose. We have also successfully evaluated the L-AA production culturing recombinant strains in cheese whey as an alternative source of lactose and which is a waste product during cheese production. This work is the first attempt to engineering K. lactis cells for L-ascorbic acid biosynthesis through a fermentation process without any trace of “L” isomers precursors in the culture medium.

Orientador: Roberto da Silva / Coorientador: Mario Tyago Murakami / Banca: Gabriela Salvador de Amo / Banca: Roberto Ruller / Resumo: Proteases são enzimas cuja função é a hidrólise de proteínas e peptídeos, gerando produtos de variados tamanhos. São produzidas pelos mais diversos organismos vivos e possuem um amplo espectro de aplicações. O objetivo desse trabalho foi promover a expressão heteróloga de uma protease coagulante produzida por Thermomucor indicae-seudaticae em Escherichia coli e Pichia pastoris, através da identificação do gene codificador da enzima. Para isso, foi realizada a comparação entre o genoma de T. indicae-seudaticae e Rhizomucor pusillus utilizado como referência. Os vetores pET 28ª (+) e pPICZαA foram sintetizados contendo o gene de interesse para a transformação em E. coli e P. pastoris respectivamente. Células competentes de cinco diferentes linhagens de E. coli foram transformadas e submetidas a teste de expressão em 20 °C e 37 °C por 24 horas, analisadas tanto a fração solúvel, quanto insolúvel, onde apresentaram, aparentemente, a expressão com maior quantidade em fração insolúvel. Células de P. pastoris foram transformadas e submetidas a expressão por 72 horas. O extrato enzimático bruto do produto gerado da expressão foi caracterizado bioquimicamente. A enzima recombinante produzida por E. coli apresentou máxima atividade de 250,89 U mL-1 utilizando caseína como substrato nas condições de pH 5,0 e temperatura de 50 °C, porém com estabilidade após 24 horas apenas nos pH 6,0 e 6,5, demonstrando assim ser sensível em pH alcalino. Enquanto que a enzima recombinante produzida por... / Abstract: Proteases are enzymes whose function is the hydrolysis of proteins and peptides, generating products of various sizes. They are produced by the most diverse living organisms and have a wide spectrum of applications. The objective of this work was to promote the heterologous expression of a coagulant protease produced by Thermomucor indicae-seudaticae in Escherichia coli and Pichia pastoris through the identification of the gene encoding the enzyme. For this, a comparison was made between the genome of T. indicae-seudaticae and Rhizomucor pusillus used as reference. The vectors pET 28a (+) and pPICZαA were synthesized containing the gene of interest for transformation in E. coli and P. pastoris respectively. Competent cells from five different strains of E. coli were transformed and submitted to the expression test at 20 ° C and 37 ° C for 24 hours, analyzed both the soluble and the insoluble fraction, where they apparently presented the expression with the highest amount in insoluble fraction. P. pastoris cells were transformed and submitted to expression for 72 hours. The crude enzyme extract of the expression product generated was biochemically characterized. The recombinant enzyme produced by E. coli presented maximum activity of 250.89 U mL-1 using caseine as substrate under conditions of pH 5.0 and temperature of 50 ° C, but with stability after 24 hours only at pH 6.0 and 6.5, thus demonstrating to be sensitive at alkaline pH. While the recombinant enzyme produced by ... / Mestre

Passiflora (Passifloraceae) é um grande gênero de espécies vegetais encontradas, principalmente, na flora tropical. Algumas passifloras são cultivadas como plantas ornamentais, frutíferas ou exploradas pelas suas propriedades medicinais. A principal espécie comercial brasileira, o maracujá-azedo (Passiflora edulis f. flavicarpa, 2n = 18), ocupa 95% da área plantada. Os frutos são consumidos in natura ou processados pela indústria de suco. Estudos genéticos e cromossômicos têm sido gerados para esta espécie. Entretanto, devido ao pequeno tamanho e a similaridade morfológica dos seus cromossomos, as medições do cariótipo convencional do maracujá-azedo têm levado a resultados inconsistentes, sendo necessário o desenvolvimento de marcadores cromossomos-específicos. Estes marcadores são produzidos a partir da identificação de sequências de cópia-única em clones de bibliotecas de BACs (Bacterial Artificial Chromosome), que são utilizadas como sondas em ensaios de FISH (Hibridização in situ Fluorescente). Neste trabalho, foi construída uma biblioteca genômica de maracujá-azedo em BACs contendo 82.944 clones, com tamanho médio dos insertos de 108 kb, e provendo uma cobertura de seis vezes o genoma. A biblioteca apresentou baixa contaminação com cpDNA e mtDNA (~0,04% e 0%, respectivamente), e foi possível o isolamento de oito clones contendo genes putativos de P. edulis f. flavicarpa. Estes clones foram marcados e utilizados como sondas em ensaios de FISH. Destas sondas, quatro apresentaram sinal único de hibridização, e foram mapeadas nos cromossomos 1 (gene ERS), 3 (gene ACCO) e 4 (genes G3PD e CYCD1). As demais sondas (genes LOX, NDID e MIPS) apresentaram sinais de hibridização subteloméricos ou pericentroméricos, indicando a presença de DNA repetitivo nos clones; a sonda contendo o gene EMB não revelou sinal fluorescente. Com base em análises de FISH, definiu-se, no presente trabalho, um novo cariótipo para o maracujá-azedo, com marcadores específicos para os cromossomos 1, 3 e 4, localizando, também, sítios de DNAr 45S nos cromossomos 7 e 8, e um sítio de DNAr 5S no cromossomo 5. A exploração da biblioteca de BAC, bem como o mapa físico aqui estabelecido, representa importantes avanços para guiar pesquisas futuras sobre o gênero Passiflora. / Passiflora (Passifloraceae) is a large genus of plant species essentially found in the tropical flora. Some passiflora are grown as ornamentals, cultivated for their edible fruits, or exploited due to their medicinal properties. The main Brazilian commercial species, the yellow passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa, 2n = 18) occupies 95% of all planted orchards. The fruits are eaten fresh or used for industrial juice production. Genetic and chromosomal studies have been carried out on the species. However, due to the small size and morphological similarity of their chromosomes, the conventional measures of the karyotype have produced some inconsistent results, being imperative the development of chromosome-specific markers. These markers are produced by identifying BAC (Bacterial Artificial Chromosome) library clones that harbor single copy sequences, which are used as probes in FISH (Fluorescent in situ Hybridization) assays. In the present work, a yellow passion fruit genomic BAC library of 82.944 clones was constructed, with average insert sizes of 108 kb, and covering six times the genome equivalent. The library has shown a low level of cpDNA and mtDNA contamination (~0.04% and 0%, respectively), and it was possible the isolation of eight clones harboring putative genes of P. edulis f. flavicarpa. These clones were labeled and used as probes in FISH assays. Of these probes, four have shown single hybridization signals, and they were mapped on chromosome 1 (ERS gene), 3 (ACCO gene), and 4 (G3PD and CYCD1 genes). The other probes (LOX, NDID and MIPS gene) revealed subtelomeric or pericentromeric signals, suggesting the presence of repetitive DNA sequences in the clones; the probe harboring the EMB gene did not reveal any hybridization signal. Based on FISH analyses, a new karyotype for the passion fruit was established in the present work, with specific markers in chromosomes 1, 3 and 4; we also mapped 45S rDNA sites in chromosomes 7 and 8, and one 5S rDNA site in chromosome 5. The exploitation of the BAC library, as well as the physical map here established, represents novel and essential advances to guide future researches on the Passilfora genus.