Acetoacetato (AA) e 2-metilacetoacetato (MAA) são compostos β-cetoácidos acumulados em diversas desordens metabólicas como no diabetes e na isoleucinemia, respectivamente. Examinamos o mecanismo de oxidação aeróbica de AA e MAA iniciada por intermediários reativos de mioglobina de coração de cavalo (Mb) gerados pela adição de H2O2. Uma rota quimioluminescente que envolve um intermediário dioxetânico cuja termólise gera espécies α-dicarbonílicas (metilglioxal e biacetilo) foi proposta e estudada. Emissão de luz ultra fraca acompanha a reação, e sua intensidade aumenta linearmente pelo aumento da concentração tanto de Mb (10-500 µM) quando AA (10-100 mM). Estudos de consumo de oxigênio mostraram que MAA é, como esperado, quase uma ordem de grandeza mais reativo que AA. Estudos de EPR com captação de spin, utilizando MNP, possibilitaram detectar adutos de MAA atribuíveis a um radical centrado no Cα (aN = 1.55 mT) e ao radical acetila (aN = 0.83 mT). O sinal do radical acetila é totalmente suprimido por sorbato, um conhecido e eficiente supressor de espécies tripletes, o que é consistente com uma rota reacional envolvendo um intermediário dioxetânico. Clivagem-α da ligação carbonila-carbonila do produto biacetilo triplete produziria, de fato, radicais acetila. Além disso, utilizando AA como substrato para Mb/H2O2, um sinal de EPR atribuível ao aduto MNP-AA• (aN = 1.46 mT e aH = 0.34 mT) foi observado e confirmado por efeito isotópico. O consumo de oxigênio e o rendimento de compostos α-dicarbonílicos foram dose-dependentes à concentração de AA ou MAA (1-50 mM) bem como à concentração de H2O2 adicionado às misturas de reação contendo Mb (até 1:10 quando medido o consumo de oxigênio, e até 1:25 quando medido o rendimento de compostos α-dicarbonílicos) e tert-butilhidroperóxido (até 1:200). Os perfis de pH (5,8-7,8) para consumo de oxigênio e rendimento de compostos α-dicarbonílicos mostraram maiores rendimentos para baixos valores de pH, indicativo de ferrilMb formada no ciclo peroxidático da proteína. Avaliando os níveis de lesão de Mb, os β-cetoácidos diminuíram o nível de desorganização protéica na estrutura secundária e terciária elicitada por H2O2. Ainda, houve maior preservação da estrutura primária da proteína, sendo que MAA protegeu mais em comparação a AA, embora quando utilizado este último composto, foi mostrado que há acetilação dose-dependente de Mb. Acetoacetato aumentou a velocidade de descoramento da hemeproteína, provavelmente por ataque de espécies tripletes geradas no sistema. Músculos de rato, plantar e sóleo, expostos ex vivo a concentrações citotóxicas de glicose oxidase (GOX, gera H2O2 em fluxo), foram protegidas pelos ésteres etílicos AAE e MAAE. Foi detectado biacetilo no meio intracelular em músculos expostos a MAAE e GOX. A concentração deste composto α-dicarbonílico é claramente relacionada à abundância de Mb em cada um dos tipos de músculos estudados. Em resumo, Mb tratada com metabólitos β-cetoácidos (AA e MAA) gera radicais centrados em carbono e produtos α-dicarbonílicos altamente reativos no estado triplete. Experimentos realizados com tecido muscular ex vivo sugerem que esta reação possivelmente ocorra in vivo. Levantamos a hipótese de que a geração de espécies carbonílicas reativas e seus adutos em condições de desbalanço metabólico possam contribuir para a compreensão das bases moleculares de desordens cetogênicas. / Acetoacetate (AA) and 2-methylacetoacetate (MAA) are β-ketoacids accumulated in several metabolic disorders such as diabetes and isoleucinemia, respectively. Here we examine the mechanism of AA and MAA aerobic oxidation initiated by the reactive enzyme intermediates formed by the reaction of muscle horse myoglobin (Mb) with H2O2. A chemiluminescent route involving a dioxetane intermediate whose thermolysis yields triplet α-dicarbonyl species (methylglyoxal and diacetyl) is envisaged. Accordingly, the ultraweak light emission that accompanies the reaction increases linearly by raising the concentration of both Mb (10-500 µM) and AA (10- 100 mM). Oxygen uptake studies revealed that MAA is, expectedly, almost one order of magnitude more reactive than AA. EPR spin-trapping studies with MNP detected spin adducts from MAA attributable to an α-carbon-centered radical (aN = 1.55 mT) and to an acetyl radical (aN = 0.83 mT). As the acetyl radical signal is totally suppressed by sorbate, a well-known efficient triplet species quencher, the dioxetane hypothesis seems to be reliable. The α-cleavage of the carbonyl-carbonyl bond of a putative excited triplet diacetyl product would, in fact, leads to an acetyl radical. Furthermore, using AA as substrate for Mb/H2O2, an EPR signal assignable to a MNP-AA• adduct (aN = 1.46 mT and aH = 0.34 mT) was observed and confirmed by isotope effect. Oxygen consumption and α-dicarbonyl yield were also dependent on AA or MAA concentrations (1-50 mM) as well as on the concentration of peroxide added to the Mb-containing reaction mixtures: H2O2 (up to 1:10 when measuring oxygen uptake and up to 1:25 when measuring the α-dicarbonyl yield) and t-butOOH (up to 1:200). The pH profiles (5.8-7.8) of oxygen consumption and α-dicarbonyl yield show higher reaction rates at lower pHs, indicative of a ferrylMb intermediate. Evaluating Mb lesion, both β-ketoacids reduced disorganization of the secondary and tertiary protein structure elicited by H2O2. Therefore, Mb primary structure was more preserved, and MAA was more protective than AA. Moreover using the later compound, it was shown that Mb acetylation is dose-dependent. Acetoacetate increased the rate of the hemeprotein bleaching, probably due to the attack of triplet products generated in the system. Plantaris and soleous rat muscles exposed to damaging concentrations of glucose oxidase (GOX, generates H2O2 in flux), was cytoprotected by AAE and MAAE. Intracellular diacetyl was detected in muscle samples exposed to MAAE and GOX. The α-dicarbonyl concentration is clearly related to the Mb abundance in the muscle types. In summary, Mb treated with peroxides reacts with β-ketoacid metabolites (AA and MAA), yielding carbon-centered radicals and highly reactive α-dicarbonyl products in the triplet state. Experiments carried out ex vivo with muscle tissue showed that this reaction possibly occurs in vivo. A new route for generation and accumulation of carbonyl reactive species and adducts is here proposed to occur in unbalanced metabolic situations, such as is the case of ketogenic disorders.

RESUMO A morte celular programada (PCD) é um processo vital que ocorre em todos os eucariotos. Em plantas, os mecanismos básicos que governam a PCD não estão esclarecidos. Sabe-se que a PCD em plantas é ativada pelo acúmulo de ácido salicílico e influxo de íons cálcio, bem como pela geração de ERO que ocorre nos cloroplastos e nas mitocôndrias. Além disso, as plantas possuem um grupo de proteases denominadas metacaspases, que assemelham-se estruturalmente com as caspases, proteínas que executam PCD em animais. Apesar destes conhecimentos, os mecanismos que governam a ativação da PCD são desconhecidos. Nesse contexto, o presente trabalho procurou investigar alguns fatores possivelmente envolvidos em PCD vegetal. Com esse objetivo, foram isoladas e caracterizadas mitocôndrias de cultura de células em suspensão de Rubus fruticosus. Foram avaliados os efeitos do Ca2+ e do AS sobre as funções mitocondriais, dentre elas a geração de ERO, diminuída pelo AS, porém aumentada por Ca2+. Um mecanismo foi proposto para explicar a diminuição de ERO pelo AS e as respostas observadas para AS e Ca2+ sobre as mitocôndrias são discutidas com base no possível envolvimento na PCD vegetal. A segunda parte do trabalho envolveu a expressão e caracterização de metacaspases (AtMCPs) em Arabidopsis thaliana. As proteases demonstraram autoprocessamento quando superexpressas in planta, assim como ocorre com as caspases em animais. A expressão de AtMCPs nesse modelo não produziu nenhum fenótipo de morte celular, sugerindo que o fenômeno ocorra por meio da integração de duas ou mais metacaspases. Foram estudadas também as propriedades biológicas de AtMCPs recombinantes em E. coli, demonstrando-se diferentes efeitos. Nossos estudos visam contribuir para a melhor compreensão de mecanismos básicos possivelmente envolvidos na PCD em plantas superiores. / ABSTRACT Programmed cell death (PCD) is a fundamental process that occurs in all eukaryotes. In plants, such phenomenon is not well understood. It is known that PCD in plants is activated through salicylic acid (SA) accumulation, Ca2+ ion fluxes, as well as reactive oxygen species (ROS) generation, which occurs mainly in chloroplasts and mitochondria. Besides, plants have a family of proteases, named metacaspases, which are proteases structurally similar to the caspases, members of proteins involved in animal PCD execution. In despite of this knowledge, the mechanism by which plant PCD is activated remains elusive. In this context, the aim of this work was to investigate some factors potentially involved in plant PCD. To this purpose, mitochondria from cell suspension cultures of Rubus fruticosus were isolated and characterized. It was investigated the effects of SA and Ca2+ on mitochondrial functions, as well. We have focused on ROS generation, which are important signals involved in plant PCD. It was shown that Ca2+ increased ROS generation, while SA decreases such production. A mechanism was proposed to explain the SA effects on isolated mitochondria, and the responses obtained from Ca2+ and SA addition on the organelle are discussed, based on the possible involvement of these effects in plant PCD. In the second part of this work, it was investigated the expression of metacaspases (AtMCPs) in the model plant Arabidopsis thaliana. The proteases have demonstrated self-processing when expressed in planta, similar to the animal caspases. Such expression did not cause any cell death phenotype, suggesting that PCD could be activated through the integration of two or more MCPs, if they are involved. It was investigated the effects of recombinant AtMCPs in E. coli, as well, demonstrating different responses. Our work contributes to a better understanding of factors potentially involved in plant PCD.

Espécies carbonílicas tripletes formadas quimicamente no escuro, por exemplo, durante a peroxidação de lipídios, têm reatividade química análoga à de radicais alcoxilas. Aventou-se que tais espécies possam estar implicadas na fisiopatologia de doenças degenerativas (\"estresse carbonílico\"). A pesquisa dos efeitos de espécies tripletes sobre algumas biomoléculas e consequentes respostas biológicas, propostas e pesquisadas no período 1970 - 1990 (hipótese de \"fotoquímica sem luz\" dos Profs. G. Cilento, IQUSP, e Emil H. White, Johns Hopkins University), encontrou empecilhos instrumentais e relativamente poucas propostas foram confirmadas. Com o uso de técnicas de alta resolução, tais como EPR, HPLC e MS, este trabalho teve como objetivo analisar intermediários e produtos de tais processos e estudar mecanismos de reação de acetona triplete, produzida quimicamente pela decomposição térmica de 3,3,4,4-tetrametildioxetano (TMD) ou, enzimaticamente, pela oxidação aeróbica de isobutanal (IBAL), catalisada por peroxidase de raiz forte (HRP), na presença de aminoácidos e proteínas. Este trabalho demonstra a formação de um radical acetila, presumidamente formado da clivagem α de acetona triplete, e um radical terciário centrado em carbono, formado pela abstração de hidrogênio do IBAL. Resultados de espectrometria de massas demonstraram a formação de três diferentes adutos entre o radical terciário de IBAL, com L-Trp. Aventou-se que um dos produtos era resultante de alteração no nitrogênio e os outros no carbono 3, ambos no anel indólico. Observou-se também a formação de produto correspondente ao radical hidroxipropionil com L-Trp. Também se observaram dois produtos de L-Trp típicos de sua oxidação por oxigênio singlete, a formilquinurenina, e um aduto de função álcool. A formação de base de Schiff entre o L-Trp estudado e o IBAL também é apresentada. A formação de oxigênio singlete foi evidenciada indiretamente via EPR utilizando o spin trap TEMP e através de um captador de adição-9,10 (tipo Diels-Alder) em derivado de antraceno. Foram realizados, também, experimentos com precursores de melanina e demonstrou-se a formação de espécies excitadas do ácido 5,6-dihidroxi-indol-2-carboxílico (DHICA) que poderiam explicar a formação de produtos de DNA tipicamente resultantes de reação fotoquímica, mas na ausência de luz. Tais resultados corroboram a reação de espécies tripletes com biomoléculas, possibilitando a compreensão de número significativo de eventos biológicos conhecidos, mas teoricamente \"proibidos\" de ocorrer no estado fundamental, em tecidos não expostos à luz / Electronically excited triplet carbonyl species formed as products of some biochemical reactions, such as lipid peroxidation, behave similarly as alcoxyl radicals. It has long been hypothesized that such excited species could have a role in some diseases (\"carbonyl stress\"). Research of chemical lesions of triplet carbonyls over biomolecules and their biological response took place principally from 1970 to 1990 (the \"photochemistry without light\" hypothesis proposed by Profs. G. Cilento, IQUSP, and Emil H. White, Johns Hopkins University), but it suffered from the lack of required instrumentation, and just few cases of photo(bio)chemistry without light were confirmed. The aim of this work, using high resolution techniques (EPR, HPLC, and MS), is to analyze the reaction products of excited triplet acetone with aminoacid and protein targets. Triplet acetone was produced from the thermal decomposition of 3,3,4,4-tetramethyldioxetane (TMD) or from the aerobic oxidation of isobutanal (IBAL) catalyzed by horseradish peroxidase (HRP). We revealed the generation of acetyl radical, putatively originated from α-cleavage of triplet acetone, and a carbon-centered tertiary radical, proposed as an IBAL radical formed by hydrogen abstraction from IBAL. Mass spectrometry showed production of three adducts from the reaction of IBAL radical with L-Trp, one of them at the nitrogen 1 and the other two at carbon 3 from the amino acid indole ring. Two adducts with m/z correspondent to the reaction between L-Trp (at carbon 3) and a hydroxypropionyl radical, and two products typically formed from singlet oxygen (formylkynurenine and an alcohol L-Trp adduct) were also observed. A Schiff base between L-Trp and IBAL was also observed. Singlet oxygen production from triplet-triplet energy transfer from excited acetone to ground state molecular oxygen was indirectly showed by EPR spin trapping with TEMP, and by MS using the anthracene derivative EAS to trap (9,10-cycloaddition) of 18O2 (1Δg). Other data reported here include the demonstration of excited species formed when DHICA, a melanin precursor, was oxidized. These results might explain the generation of DNA photochemical products (thymine dimers) in the absence of light. Altogether, we collect strong and significant evidence in this thesis that corroborate the reactivity of triplet excited species with a couple of biomolecules, providing insights over some reportedly known molecular events that are theoretically forbidden to occur in the ground state but happen in tissues non-exposed to light

A atividade biológica de aldeídos α,Β-insaturados tem sido associada a diversos processos incluindo regulação gênica, envelhecimento Alzheimer e disfunções mitocondriais. Neste trabalho investigamos a formação de adutos do trans,trans-2,4-decadienal (DDE), um aldeído produzido endogenamente e presente como contaminante em alimentos e água, em lisina, histidina e citocromo c. Avaliamos também alterações na função de mitocôndrias de fígado de rato expostas ao aldeído. As análises por espectrometria de massas, LC-ESI/MS, indicaram a formação de diversos tipos de adutos de DDE nos aminoácidos lisina e histidina, entre eles bases de Schiff e enaminas. Os resultados obtidos por espectrometria de massas, MALDI-Tof, indicaram a formação de adutos de DDE formados via base de Schiff de maneira concentração do aldeído, tempo e pH dependentes. As análises da proteína digerida por ESI-Q-ToF, indicaram que os adutos foram formados nos resíduos H-33, K-39, 72 e 100, localizados em regiões ricas em resíduos básicos, cuja interação com membranas e citocromo e oxidase tem sido postulada. Observamos também o deslocamento da banda Soret (λ = 409 nm) e o desaparecimento da banda em λ = 695 nm, relativa a coordenação do sexto ligante do grupo heme (M-80). Este fenômeno está associado a abertura da cavidade do grupo heme e o deslocamento do ligante, indicando alterações nas estruturas secundária e terciária da proteína. Os experimentos realizados com mitocôndrias isoladas indicaram que DDE promove danos à membrana interna mitocondrial, demonstrando i pelo aumento no consumo de O2 em mitocôndrias em estado 4. Em decorrência destas lesões observamos também o intenso inchamento mitocondrial, indicado por experimentos de espalhamento de luz e microscopia eletrônica de transmissão. O inchamento não foi bloqueado por ciclosporina A, um inibidor do poro de transição mitocondrial. DDE também induziu a perda do potencial de membrana da organela, demonstrado pelo monitoramento do indicador fluorescente safranina O e aumento da peroxidação lipídica atestado pela quantificação de malondialdeido (MDA). Estes resultados indicam que DDE promove alterações estruturais no citocromo e podendo levar ao comprometimento da atividade da proteína, além de promover alterações em parâmetros mitocondriais, indicando um possível envolvimento na disfunção mitocondrial promovida por estresse oxidativo. / Lipid hydroperoxide-derived α,β-unsaturated aldehydes are involved in several cellular processes such as gene expression, aging, Alzheimer disease and mitochondrial dysfunction. In this work we have investigated adduct formation in lysine, histidine and cytochrome c by trans,trans-2,4-decadienal (DDE), an endogenously lipoperoxidation product. DDE is also a widespread environment aldehyde found, for example, in food and as a contaminant in water. Alterations in rat liver mitochondrial parameters such as oxygen consumption, membrane potentials, swelling and lipoperoxidation were also investigated. LC-ESI/MS experiments indicated that DDE react with aminoacids lysine and histidine producing adducts. In addition, MALDI-TOF experiments indicated increases in the molecular weight of cytochrome c consistent with the formation of DDE adducts via the Schiff base mechanism. Our data shows that the protein modification was time, pH and DDE-concentration dependent, leading to the formation of at least six adducts after 2 h incubation at pH 7.4. ESI-Q-TOF MS analysis of tryptic digests indicated that H-33, K-39, K-72 and K-100 were modified by DDE. These adducts are present in clusters of basic amino acid residues, which are believed to participate in the interaction of cytochrome c with mitochondrial membrane and cytochrome c oxidase. A blue shift in the Soret band from 409 to 406 nm was also observed, indicating heme crevice opening and displacement of heme sixth ligand (Met-80) coordination in modified protein. DDE (180 µM) treatment increases the rate of mitochondrial oxygen consumption, suggesting a partial mitochondrial uncoupling. Moreover, extensive mitochondrial swelling upon treatment with DDE (900 nM-162 &#181M) was observed by light scattering and transmission electron microscopy experiments. These effects were not prevented by the mitochondrial permeability transition inhibitor cyclosporin A. A DDE concentration-dependent loss in the inner mitocondrial membrane potential, monitored by safranin O fluorescence and an increase in lipoperoxidation were also observed. All together, these results suggest that reactive aldehydes can induce inner mitochondrial membrane damage playing a role in mitochondrial dysfunction associated with oxidative stress.

Nesta tese investigamos o comportamento eletroquímico da matriz lamelar de xerogel de pentóxido de vanádio(V) hidratado (VXG), visando desenvolver interfaces moleculares e eletrodos modificados. A partir da suspensão do gel de V2O5.nH2O, geramos os filmes lamelares de VXG sobre a superfície do eletrodo de trabalho. Inicialmente, os filmes de VXG consistem de regiões heterogêneas, que podem ser diferenciadas espectroeletroquimicamente. Após tratamento eletroquímico, esses filmes atingem uma condição eletroquímica estacionária, sofrendo um colapso e formando uma estrutura tipo banda uniforme. Esses filmes de VXG condicionados, foram utilizados como interfaces de espécies moleculares eletroativas. Em paralelo, interagimos o VXG com a argila bentonita, e obtivemos um xerogel floculento verde em solução aquosa, denotado BV, cuja evidência mais forte dessa interação foi obtido pelo espectro de FTIR, em função do surgimento de um forte pico em 835 cm-1, atribuído ao estiramento V-O-Si. A interação com a zeólita13X, resultou num sólido amarelo devido à troca de íons Na+ pelo grupo VO3+, denotado ZV. A troca iônica foi evidenciada pela análise de ICP-AES, que determinou uma quantidade grande de íons Na+ na solução sobrenadante, aproximadamente 225 mg/L contra 28 e 25,4 mg/L das soluções originais de VXG e zeólita13X, respectivamente. Eletroquimicamente, os compósito BV e ZV, despontam como materiais modificadores de eletrodos muito atraentes, combinando a boa condutividade dos filmes de VXG com as propriedades de troca iônica e de intercalação das argilas e das zeólitas. / The electrochemical behavior of hydrated vanadium(V)-oxide xerogels (denoted VXG), has been investigated, aiming the development of molecular interfaces and modified electrodes. Layered vanadium(V)- oxide xerogel films have been generated, in a controlled way, by the direct deposition de precise amounts of the polyvanadic acid solution onto the electrode surface. Initially, the layered VGX films consist of heterogeneous regions, which can be differentiated spectroelectrochemically. However, after the electrochemical treatment, those films reach a stationary electrochemical condition, collapsing into a uniform band type structure. The conditioned layered VXG films have been utilized as interfaces of electroactive molecular species. In parallel, the VXG suspension has been combined with a montmorillonite clay, yielding a green flocculent xerogel in suspension, here denoted BV. Strong evidence of polyvanadate-bentonite interaction has been provided by the FTIR spectra, from the appearance of a strong peak in 835 cm-1, ascribed to the a new V-O.-Si stretching vibration. The VXG suspension has also been combined with zeolite 13X, resulting a yellow solid, envolving ionic exchange of Na+ ions by VO3+; this solid has been denoted ZV. Ionic exchange has been evidenced by ICP-AES analyses. A promissing use of the new materiaIs as molecular interfaces has been demonstated, exploiting the good conductivity and intercalation properties of VXG and BV, as well as, the ion exchange properties of ZV.

Macrófagos recuperados de peritôneo de camundongos 48 horas após administração de concanavalina A (Con A) são ativados e possuem um conteúdo maior de mieloperoxidase (MPO) do que macrófagos residentes. Este aumento pode ser observado por immunobloting e pelo aumento da atividade peroxidásica. Esta atividade foi avaliada pela quimiluminescência desencadeada por homogenato de macrófagos e peróxido de hidrogênio, durante a oxidação de luminol e melatonina. Os macrófagos contendo MPO são capazes de gerar ácido hipocloroso quando estimulados com acetato de forbol miristato (PMA). O aumento do conteúdo de MPO em macrófagos é um processo que independe de interferon-γ (IFN-γ), uma vez que camundongos IFN-γ-\"knockout\" têm uma atividade ainda maior que camundongos \"wild type\". O contato entre macrófagos e neutrófilos in vivo, não é necessário para o incremento observado, visto que macrófagos de camundongos tratados com anticorpo anti-granulócitos preservam a atividade peroxidásica. Este achado é uma evidência de que em algumas condições a ativação de macrófagos é acompanhada por um aumento da atividade peroxidásica. Dentre o amplo espectro de ação da MPO, este processo pode ter um papel especial na inflamação. Também é de especial interesse o fato de macrófagos serem capazes de oxidar melatonina, um hormônio com vários efeitos imunomodulatórios. / Macrophages recovered from mice peritoneum 48 after concanavalin-A (Con A) administration are primed and have a higher content of myeloperoxidase (MPO) than resident cells. The increase of MPO is accompanied by an increment in peroxidase activity, evaluated by the chemiluminescence during the oxidation of luminol and melatonin triggered by macrophages homogenates plus hydrogen peroxide. MPO present in macrophages are able to generate hypochlorous acid when macrophages are stimulated with phorbol myristate acetate. Interferon-γ (IFN-γ) does not participate in the process that lead macrophages to become enriched in MPO, since IFN-γ knockout mice have an even higher peroxidase activity compared to the wild type. The contact of macrophages with neutrophil in vivo seems to be not necessary for the observed increment in peroxidase since macrophages recovered from mice treated with antigranulocyte antibody preserves the peroxidase activity. These finding provides evidences that, at least in some conditions, macrophage activation is accompanied by an increment in peroxidase activity. Given the broad spectrum of action of MPO, this process might play a special role in inflammation. Also of special interest is the finding that macrophages are able to oxidize melatonin, a hormone with several immunomodulatory effects.

Atualmente estamos presenciando mudanças climáticas ao nível global sem precedentes, as quais se tornarão mais severas no decorrer dos anos, podendo causar danos irreversíveis à biodiversidade. Como as espécies irão reagir a essas mudanças e quais ações de conservações devem ser tomadas estão entre os tópicos mais significantes na ecologia atualmente. As mudanças climáticas têm sido apontadas como uma das principais causas de reduções (e alterações) na distribuição geográfica e abundância de muitas espécies, e até mesmo a extinção. Os modelos de nicho ecológico têm sido uma ferramenta muito utilizada a fim de compreender como a distribuição das espécies pode ser afetada pelas mudanças climáticas. Os modelos fornecem valiosas informações sobre o potencial efeito das mudanças climáticas na distribuição futura das espécies, podendo assim ser usado para a compreensão de como e quais espécies podem ser mais afetadas, além dos locais adequados para sua conservação. Uma vez que informações importantes sobre os organismos não são incorporadas nos modelos, é fundamental o conhecimento sobre a biologia e história natural das espécies para a interpretação dos resultados. No presente estudo é aprestada uma revisão sobre o atual estado de conhecimento das quatro espécies do gênero Eunectes em relação à distribuição geográfica, uso do habitat e microhabitat, atividade diária e sazonal, reprodução, tamanho corporal, dieta e status de conservação. Adicionalmente aspectos da história natural de uma população da sucuri verde, Eunectes murinus, foram estudados em locais florestados, na cidade de Bonito, MS, e aqui são apresentados dados sobre movimentação, uso do microhabitat, reprodução e dieta. Ainda, foram desenvolvidos modelos de nicho climático para cada uma das quatro espécies a fim de entender os possíveis impactos das mudanças climáticas nessas espécies em dois cenários futuros. Foram assumidas duas abordagens de dispersão, com livre dispersão e sem dispersão. A partir dos resultados foi possível reconhecer padrões na biologia das espécies de Eunectes, identificar as principais lacunas de conhecimento e sugerir onde esforços em pesquisa devem ser focados. Além disso, importantes dados sobre a história natural da sucuri verde (E. murinus) foram registrados. Foi observado que, em relação à movimentação, dieta e reprodução, aparentemente a espécie mantém o padrão já registrado em estudos anteriores. Entretanto, o uso do microhabitat diferiu substancialmente, tendo sido encontrado um número muito elevado de indivíduos utilizando árvores. As projeções futuras indicam que, para o intervalo entre os anos de 2061-2080, todas as espécies, menos E. notaeus, perderão grande quantidade de hábitat climaticamente adequado, sendo E. deschauenseei a mais afetada (100% de perda com e sem dispersão no pior cenário). Ainda, as análises apontam que haverá uma mudança de local adequado para a potencial ocorrência de três espécies. Sem dispersão, todas as espécies perderão área, sendo que E. beniensis perderá 100% de habitat adequado em ambos os cenários de alterações climáticas. As informações geradas por este estudo ajudam a melhorar a compreensão da ecologia, história natural e distribuição das espécies do gênero, bem como indica quais as espécies poderão ser mais prejudicadas pelas mudanças climáticas em curso. Finalmente, os resultados fornecem subsídios para a formulação de planos de conservação, indicando importantes áreas que poderão servir de refúgio climático para as espécies / We are currently witnessing unprecedented global climate change, which will become more severe over the years and can cause irreversible damage to biodiversity. How species will react to these changes and what conservation actions should be taken are among the most significant topics in ecology today. Climate change has been identified as a major cause of reductions (and changes) in geographic distribution and abundance of many species, and even extinction. Ecological niche models have been widely used in order to understand how the distribution of species can be affected by climate change. The models provide valuable information on the potential effect of climate change on the future distribution of species and can be used to assess how and which species may be most affected, as well as the appropriate sites for their conservation. Since important information about the species is not incorporated into the models, the knowledge about their biology and natural history is crucial for interpretating the results. In the present study a review is presented on the current state of knowledge about the four species of the genus Eunectes in relation to geographic distribution, habitat and microhabitat use, daily and seasonal activity, reproduction, body size, diet and conservation status. In addition, natural history aspects of a green anaconda (E. murinus) population were studied in forested sites in the Bonito municipality, Mato Grosso do Sul state, Brazil, where data on movement, microhabitat use, reproduction and diet are presented. Furthermore, climate niche models were developed for each of the four species in order to understand the possible impacts of climate change under two future scenarios.Two dispersion approaches were performed, with \"free dispersion\" and \"no dispersion\". It was possible to recognize patterns in the biology of Eunectes species, identify the main knowledge gaps and to suggest where research efforts should be focused. Moreover, important data on the natural history of the green anaconda (E. murinus) were recorded. It was observed that, in relation to movement, diet and reproduction, the species apparently maintains the pattern recorded in previous studies. However, the use of the microhabitat differed substantially, with a very high number of individuals being found on trees. Future projections indicate that, for the interval between the years 2061-2080, all species, but E. notaeus, will lose a large amount of climatically suitable habitat, with E. deschauenseei being the most affected (100% loss with and without dispersion in the worst scenario). Future projections also indicate that there will be a shift in the distribution of suitable habitat for the potential occurrence of three species. Without dispersion, all species will lose area, and E. beniensis will lose 100% of suitable habitat in both climate change scenarios. The information generated by this study helps to improve the knowledge about the ecology, natural history and distribution of the species of Eunectes, as well as indicates which species may be most affected by ongoing climate change. Finally, the results provide subsidies for the formulation of conservation plans, indicating important areas that could serve as a climate refuge for the species

Através da semeadura de espécies nativas de diferentes grupos ecológicos, será possível levantar dados sobre a constituição, o adensamento e o enriquecimento do banco de sementes como uma possível prática de recuperação de áreas degradadas, principalmente visando: 1) o primeiro recobrimento do solo; 2) o possível enriquecimento da área (aumento do número de espécies) com a semeadura direta. O objetivo geral desse trabalho foi analisar a viabilidade metodológica da constituição artificial de banco de sementes de espécies florestais nativas, como estratégia de recuperação de áreas degradadas. Este trabalho teve como objetivos específicos: i) Estudar espécies potenciais para uso de semeadura direta de espécies nativas em áreas degradadas, quanto à emergência de plântulas e se, o número de indivíduos estabelecidos após um ano da semeadura é suficiente para ocupação florestal de uma área degradada; ii) Avaliar diferentes condições (tratamentos) da semeadura a lanço de espécies florestais nativas para potencializar a emergência de plântulas. Foram realizados neste trabalho dois experimentos em períodos diferentes. O experimento “A" foi instalado em fevereiro de 2003, em delineamento de blocos casualizados (DBC) e 36 tratamentos com 3 repetições, resultando em 108 parcelas em esquema fatorial (3x2x3x2) objetivando testar 20 espécies florestais, sendo 10 pertencentes ao grupo de preenchimento e 10 pertencentes ao grupo de diversidade. O experimento “B" foi instalado em janeiro de 2004, em blocos casualizados (DBC) e 4 tratamentos com oito repetições, resultando em 32 parcelas em esquema fatorial (2x2) objetivando testar 20 espécies florestais do grupo de preenchimento. Neste experimento as sementes das espécies florestais nativas (20 espécies) além de semeadas no campo tiveram também sua germinação testada em sementeiras no viveiro para posterior comparação com a germinação das espécies em condições de campo. De acordo com os resultados obtidos a método mostrouse viável conseguindo nesse experimento, aos 360 dias após a semeadura até 874 indivíduos ha -1 no grupo de preenchimento (4 espécies) e 1902 indivíduos ha -1 no grupo de diversidade (7 espécies) no experimento “A". As espécies do grupo de preenchimento Platypodium elegans e Pterogyne nitens e a do grupo de diversidade Jacaranda cuspidifolia foram as que mais se destacaram no experimento “A" com 292, 318, 574 indivíduos ha -1 respectivamente. Embora as espécies no experimento “B" não tenham germinado em condições de campo, seus dados de germinação em sementeiras no viveiro demonstraram que as sementes estavam viáveis, exceto Cecropia pachystachya. Os fatores ambientais em condições de campo contribuíram para a não germinação de sementes das espécies florestais estudadas neste experimento (“B"), principalmente a competição com Brachiaria decumbens. Isso demonstra que o manejo desta gramínea pós-semeadura é fundamental para o sucesso deste método. / Through the sowing of native species of different ecological groups, it will be possible to raise information on the constitution, the growing and enrichment of the bank of seeds as possible practical of recovery of degraded areas, mainly aiming at: 1) the first covering of the ground; 2) the possible enrichment of the area (increase of the species number) with the direct sowing. The general objective of this work was to analyze the methodological viability of the artificial constitution of bank of seeds of native forest species, as strategy of recovery of degraded areas. This work had as objective specific: A) To study the potential species for use of direct sowing of native species in degraded areas, how much to the emergency of seedlings and if the number of individuals established after one year of the sowing is enough for forest occupation of a degraded area; B) to determine different conditions (treatments) of the throwing sowing of native forest species to increase the emergency of seedlings. Two experiments in different periods had been carried through in this work. The experiment "A" was installed in February of 2003, in a randomized blocks design with 36 treatments and 3 repetitions, resulting in 108 parcels in factorial project (3x2x3x2) objectifying to test 20 species forest, being 10 fulfillment groups and 10 diversity groups. The experiment “B" was installed in February of 2003 with a randomized blocks design and 4 treatments with eight repetitions, resulting in 32 parcels in factorial project (2x2) objectifying to test 20 forest pioneer species. In this experiment the seeds of the native forest species (20 species) beyond sown in the field had also its germination tested in nursery, for posterior comparison with the germination of the species in field conditions. In accordance with the gotten results the methodology revealed viable obtaining in the “A" experiment, to the 360 days after the sowing up to 874 individuals ha -1 of fulfillment groups (4 species) and 1.902 individuals ha -1 of diversity groups (7 species). The Platypodium elegans and Pterogyne nitens of fulfillment groups and of the diversity groups Jacaranda cuspidifolia had been the more distinguished in the experiment "A" with 292, 318, 574 individuals ha -1 respectively. Although the species in experiment "B" have not germinated in field conditions, its germination data in nursery had demonstrated that the seeds were viable, except Cecropia pachystachya. The ambient factors in field conditions had been the causers of this ungermination seeds of the studied forest species, mainly competition with Brachiaria decumbens. This results demonstrates that the handling of this grassy after-sowing is basic for the success of this methodology.

No estado de São Paulo são produzidas uvas de mesa de origem europeia (Vitis vinifera) e de origem americana (Vitis labrusca). Devido as condições climáticas, doenças fúngicas foliares são recorrentes e causam danos e prejuízos aos viticultores paulistas. Entre essas doenças se destaca a ferrugem da videira (Phakopsora euvitis), por causar desfolha intensa, depreciar cachos e reduzir a produção. Entretanto, pouco se sabe sobre a interação desse patógeno e espécies de videiras. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a severidade e eficiência de doença da ferrugem em V. labrusca; e comparar a resistência à ferrugem entre as espécies de videira V. vinifera cv. Moscato Giallo e V. labrusca cv. Niágara Rosada, por meio de componentes epidemiológicos da doença e alterações anatômicas, sintomatológicas e fisiológicas dos hospedeiros. O período de molhamento foliar e a temperatura no processo de infecção, assim como a concentração de inóculo de P. euvitis influenciam na eficiência de doença e consequentemente na severidade de ferrugem em Vitis labrusca. A maioria dos componentes epidemiológicos avaliados mostrou que a V. labrusca é mais suscetível à ferrugem do que a V. vinifera. O período de latência e período infeccioso da ferrugem da videira são similares entre as espécies de videiras e folhas mais velhas (com 60 dias após a brotação) são mais suscetíveis à ferrugem que folhas mais jovens (34 e 24 dias após a brotação). As folhas mais velhas tem maior capacidade de esporulação. Em V. labrusca foi observado maior severidade da doença durante o período infeccioso. Em folhas de V. labrusca são observadas urédias satélites oriundas da primeira infecção que caracterizam o crescimento da pústula. Em folhas de V. vinifera há a presença de um halo encharcado ao redor da lesão, onde há acúmulo de substâncias pécticas e celulose que funcionam como mecanismos de defesa do hospedeiro para a ferrugem da videira. Em folhas de V. vinifera assim como de V. labrusca a ferrugem da videira reduz a fotossíntese tanto na região da lesão quanto na região assintomática ao redor da pústula. A ferrugem da videira causa danos no processo fotoquímico, pela redução do transporte aparente de elétrons. Em ambas as espécies também pode ser observada o acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) no sítio de infecção horas após a inoculação, relacionando a resposta de hipersensibilidade a uma reação pós-formada do hospedeiro como estratégia de reduzir a área lesionada. / Grapevines cultivar of Vitis vinifera and Vitis labrusca are cultivated in Sao Paulo state for producing table grapes. Foliar fungal diseases are recurrent and cause yield losses when climatic conditions are favourable to disease development. Grapevine rust (Phakopsora euvitis) causes intense defoliation, fruit depreciation and yield losses. However, little is known about the interaction between P. euvitis and Vitis spp. Therefore, the objective of this work was to evaluate the severity and disease efficiency of rust in V. labrusca; and compare the resistance of the species V. vinifera cv. Moscato Giallo and V. labrusca cv. Niagara Rosada measuring of epidemiological components of the disease and anatomical, symptomatological and physiological alterations in the hosts. The leaf wetness period and the temperature during the infection process, as well as the inoculum concentration of P. euvitis influence the disease efficiency and, consequently the rust severity in V. labrusca. Most of the evaluated epidemiological components showed that V. labrusca is more susceptible to rust than V. vinifera. The latent period and the infectious period of rust are similar between the species and older leaves (60 days after bud break) are more susceptible to rust than younger leaves (34 and 24 days after bud break). Older leaves have greater sporulation capacity. During infectious period of rust in V. labrusca was observed a higher severity of disease than in V. vinifera. Satellite uredias originary from the first infection are observed in V. labrusca leaves which characterize the pustule growth. V. vinifera leaves showed a soaked halo surround the lesion, and accumulation of pectic substances and cellulose was observed in this region. These substances accumulation may are defense mechanisms of the host against the rust. Rust reduces photosynthesis in the region of lesion, and also in the asymptomatic region around the pustule in both grapevine species. Rust causes damage in photochemical process as a result of reduction from apparent transport of electrons. In both species, one day after inoculation it was observed accumulation of reactive oxygen species (ROS). Therefore, hypersensitivity response is related to a post-formed host reaction such as a strategy to reduce the injured area.

Helicoverpa armigera (Hübner) was officially reported in Brazil in 2013. This species is closely related to Helicoverpa zea (Boddie) and has caused significant crop damage in Brazil. The use of genetically modified crops expressing insecticidal protein from Bacillus thuringiensis (Berliner) has been one of the control tactics for managing these pests. Genetically modified maize expressing Vip3Aa20 was approved to commercial use in Brazil in 2009. Understanding the genetic diversity and the susceptibility to B. thuringiensis proteins in H. armigera and H. zea populations in Brazil are crucial for establishing Insect Resistance Management (IRM) programs in Brazil. Therefore, the objectives of this study were: (a) to infer demographic parameters and genetic structure of H. armigera and H. zea Brazil; (b) to assess the intra and interspecific gene flow and genetic diversity of H. armigera and H. zea; and (c) to evaluate the susceptibility to Vip3Aa20 protein in H. armigera and H. zea populations of Brazil. A phylogeographic analysis of field H. armigera and H. zea populations was performed using a partial sequence data from the cytochrome c oxidase I (COI) gene. H. armigera individuals were most prevalent on dicotyledonous hosts and H. zea individuals were most prevalent on maize crops. Both species showed signs of demographic expansion and no genetic structure. High genetic diversity and wide distribution were observed for H. armigera. A joint analysis indicated the presence of Chinese, Indian, and European lineages within the Brazilian populations of H. armigera. In the cross-species amplification study, seven microsatellite loci were amplified; and showed a potential hybrid offspring in natural conditions. Interespecific analyses using the same microsatellite loci with Brazilian H. armigera and H. zea in compare to the USA H. zea were also conducted. When analyses were performed within each species, 10 microsatellites were used for H. armigera, and eight for H. zea. We detected high intraspecific gene flow in populations of H. armigera and H. zea from Brazil and H. zea from the USA. Genetic diversity was similar for both species. However, H. armigera was more similar to H. zea from Brazil than H. zea from the USA and some putative hybrid individuals were found in Brazilian populations.Tthere was low gene flow between Brazilian and USA H. zea. The baseline susceptibility to Vip3Aa20 resulted in low interpopulation variation for H. zea (3-fold) and for H. armigera (5-fold), based on LC50. H. armigera was more tolerant to Vip3Aa20 than H. zea (≈ 40 to 75-fold, based on CL50). The diagnostic concentration for susceptibility monitoring, based on CL99, was fairly high (6,400 ng Vip3Aa20/cm2) for H. zea and not validated for H. armigera due to the high amount of protein needed for bioassays. Implementing IRM strategies to Vip3Aa20 in H. armigera and H. zea will be of a great challenge in Brazil, mainly due to the low susceptibility to Vip3Aa20 and high genetic diversity and gene flow in both species, besides a potential of hybrid individuals between H. armigera and H. zea under field conditions. / Helicoverpa armigera (Hübner) foi oficialmente reportada no Brasil em 2013. Esta espécie é estreitamente relacionada a Helicoverpa zea (Boddie) e tem causado danos significativos nas culturas no Brasil. O uso de plantas geneticamente modificadas, que expressam proteínas inseticidas de Bacillus thuringiensis (Berliner), tem sido uma das táticas de controle para o manejo dessas pragas. O milho geneticamente modificado que expressa Vip3Aa20 foi aprovado para comercialização no Brasil em 2009. O entendimento da diversidade genética e da suscetibilidade às proteínas de B. thuringiensis em populações de H. armigera e H. zea no Brasil são cruciais para o estabelecimento de programas de Manejo da Resistência de Insetos (MRI). Assim, os objetivos desse estudo foram: (a) inferir parâmetros demográficos e estrutura genética de H. armigera e H. zea no Brasil; (b) avaliar o fluxo gênico intra e interespecífico e a diversidade genética em H. armigera e H. zea; e (c) aferir a suscetibilidade de populações brasileiras de H. armigera e H. zea a proteína Vip3Aa20. Uma análise filogeográfica de populações de campo de H. armigera e H. zea foi realizada com o uso de sequências do gene citocromo c oxidase I (COI). Indivíduos de H. armigera foram mais prevalentes em dicotiledôneas e H. zea na cultura do milho. Ambas as espécies mostraram sinais de expansão demográfica e ausência de estrutura genética. Alta diversidade genética e ampla distribuição foram observadas em H. armigera. Análises conjuntas indicaram a presença de linhagens da China, Índia e Europa em populações brasileiras de H. armigera. A partir de um estudo de amplificação cruzada de microssatélites, sete locos amplificaram em ambas as espécies e evidenciaram a possibilidade de hibridização no campo. Estes mesmos locos foram usados para análises interespecíficas de H. armigera e H. zea do Brasil em comparação a H. zea dos EUA. Nas análises para cada espécie, 10 microssatélites foram usados para H. armigera e oito para H. zea. Alto fluxo gênico intraespecífico foi detectado em populações de H. armigera e H. zea. A diversidade genética foi similar em ambas as espécies. H. armigera foi mais similar a H. zea do Brasil que dos EUA e possíveis híbridos foram encontrados nas populações brasileiras. Houve um baixo fluxo gênico entre populações brasileiras e americanas de H. zea. A linha-básica de suscetibilidade a Vip3Aa20 resultou numa variação interpopulacional baixa em H. zea (3 vezes) e em H. armigera (5 vezes), baseada na CL50. H. armigera foi mais tolerante a Vip3Aa20 que H. zea (≈ 40 to 75 vezes, baseado na CL50). A concentração diagnóstica, baseada na CL99, foi bastante alta (6.400 ng Vip3Aa20/cm2) para H. zea e não validada para H. armigera devido à alta quantidade de proteína necessária para os bioensaios. A implementação de estratégias de MRI a Vip3Aa20 em H. armigera e H. zea serão um grande desafio no Brasil, principalmente devido à baixa suscetibilidade a Vip3Aa20 e alta diversidade genética e fluxo gênico em ambas as espécies, além da possibilidade de indivíduos híbridos entre H. armigera e H. zea nas condições de campo.