O Rhipicephalus microplus é um parasita obrigatório hematófago, monoxeno, que gera grande impacto econômico a partir da ação espoliativa sobre o seu hospedeiro preferencial. A glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3), uma proteína altamente conservada e ubiquamente expressa entre diversas espécies, foi identificada no carrapato bovino sob a isoforma GSK-3β. Envolvida na modulação da atividade da proteína glicogênio sintase, como um agente regulador da síntese de glicogênio, essa proteína atua no metabolismo energético do R. microplus. A GSK-3 também está envolvida na via de sinalização Wnt, e por isso, já foi descrita como uma quinase essencial para a formação do embrião, estando diretamente envolvida no processo reprodutivo deste carrapato. Neste contexto, a GSK-3β é uma candidata para o desenvolvimento de novas alternativas de controle do carrapato bovino. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi estudar a participação da proteína GSK-3β na fisiologia do R. microplus a partir da inibição de sua atividade. Ensaios in vitro e in vivo foram realizados para testar a inibição química e imunológica da atividade dessa proteína. Anticorpos contra peptídeos sintéticos baseados na sequência da GSK-3β (anti- SRm0218 e anti-SRm86100) usados neste trabalho não foram capazes de inibir a atividade dessa proteína, no entanto, a inibição da GSK-3β foi alcançada quando células embrionárias de R. microplus foram submetidas à inibição química, por meio de um inibidor específico. Este resultado sustenta o potencial dessa proteína como alvo para o desenvolvimento de uma alternativa de controle do carrapato bovino, pois a sua inibição possivelmente atuaria negativamente na capacidade reprodutiva do carrapato R. microplus. / Rhipicephalus microplus is a monogenetic, hematophagous ectoparasite that has a large economic impact due to associated losses in the cattle industry. Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) is a highly conserved and ubiquitously expressed protein in several species. It has been identified as GSK-3β isoform in the cattle tick, and is involved in the modulation of glycogen synthase activity, as a regulator of glycogen synthesis with a role in energy metabolism of R. microplus. GSK-3β is also involved in the Wnt signaling pathway. It is a fundamental kinase for embryo development, and is directly linked with R. microplus reproductive process. Thus, the aim of this study was to investigate the role of GSK-3β in R. microplus physiology by inhibiting its activity. In vitro and in vivo assays were carried out to test its immunological and chemical inhibition. Rabbit antibodies against synthetic peptides based on GSK-3β sequence (anti-SRm0218 and anti-SRm86100) used in this work were not capable to inhibit GSK- 3β activity, but GSK-3β inhibition was reached when R. microplus embryo cells were cultivated with a specific inhibitor. This result supports the potential of this protein as a target to develop a new cattle tick control method, because its inhibition probably acts detrimentally in the reproductive capacity of the tick.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O estado nutricional perinatal tem influência persistente sobre o desenvolvimento neural e a função cognitiva. Em humanos e outros animais, a malnutrição protéica durante o período perinatal acarreta alterações permanentes, incluindo a síndrome metabólica na idade adulta. A alimentação é modulada principalmente por fatores neuronais e hormonais que chegam ao hipotálamo. As reservas de glicogênio hipotalâmicos são uma fonte de glicose em altas demandas energéticas, como durante o desenvolvimento dos circuitos neurais. Como alguns circuitos hipotalâmicos estão sendo formados durante o período de lactação, focamos o estudo nos efeitos da desnutrição protéica, durante os primeiros 10 dias de lactação, sobre as reservas de glicogênio em núcleos hipotalâmicos envolvidos no controle do metabolismo energético. Ratas grávidas foram aleatoriamente separadas individualmente em gaiolas e alimentadas ad libitum com uma dieta normoproteíca (22% proteína). Após o parto, cada mãe ficava com 6 filhotes machos. Durante os 10 primeiros o grupo experimental recebia uma dieta isenta de proteína (D) e o grupo controle uma dieta normoproteíca (C). Em P10 a marcação para as reservas de glicogênio era muito intensa nos animais C no núcleo arqueado (ARC) e eminência média (EM). Em P20 no animais C, as reservas eram menores em comparação com P10. Os animais D apresentaram uma marcação menor do que os controles. Após P45 foi difícil determinar diferença entre os grupos porque o as reservas estavam diminuídas. Nós também mostramos que os tanicitos eram as células que apresentavam reservas de glicogênio. Nossos dados reforçam que o estado nutricional materno durante a lactação é crítico para a maturação cerebral, pois a malnutrição materna resulta em menor marcação nas reservas de glicogênio no hipotálamo, o que pode ser crítico para o estabelecimento da circuitaria neural. / Perinatal nutrition has persistent influences on neural development and cognition. In humans and other animals protein malnutrition during the perinatal period causes permanent changes, inducing to adulthood metabolic syndrome. Feeding is mainly modulated by neural and hormonal inputs to the hypothalamus. Hypothalamic glycogen stores are a source of glucose in high energetic demands, as during development of neural circuits. As some hypothalamic circuits are formed during lactation, we attempt to study the effects of malnutrition, during the first 10 days of lactation, on glycogen stores in hypothalamic nuclei involved in the control of energy metabolism. Female pregnant rats were fed ad libitum with a normorprotein diet (22% protein). After delivery each dam was kept with 6 male pups. During the first 10 days of lactation dams from experimental group received a protein free diet and the control group a normoprotein diet. By P10 glycogen stores were very high in the arcuate nucleus and median eminence of control group. Glycogen stores decreased during development. In P20 control animals, glycogen stores were lower when compared to P10 control animals. Animals submitted to malnutrition presented a staining even lower than control ones. After P45 it was difficult to determine differences between control and diet groups because glycogen stores were reduced. We also showed that tanycytes were the cells presenting glycogen stores. Our data reinforce that maternal nutritional state during lactation may be critical for neurodevelopment since it resulted in a low hypothalamic glycogen store, which may be critical for establishment of neuronal circuitry.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5576.pdf: 1152832 bytes, checksum: 13ad2d45c47c55991a6ab0c41eebb5e1 (MD5) Previous issue date: 2013-09-27 / Financiadora de Estudos e Projetos / Introduction: The skeletal muscle is the largest tissue present in vertebrates and is involved in locomotion, posture and breathing movements. It is composed of elongated, cylindrical and multinucleated muscle fibers with fat droplets in the sarcoplasma, known as intramyocellular lipid (IMCL) used as energy during exercise. Another source of energy used by the muscle is the carbohydrate stored in the body as glycogen, which is stored in the liver and muscle fibers. Muscle fibers are also surrounded by an extracellular matrix (ECM) formed, among other components, by collagen, mainly types I, III, IV and V. The aging process is associated with loss of muscle mass, muscle strength and function, increase of IMCL, reduction in glycogen synthesis with consequent insulin resistance, and also fibrosis and deposition of ECM. On the other hand, strength training (TF) is considered appropriate intervention to modify, minimize or reverse some physiological changes in skeletal muscle, as a result of aging. Thus, this study aimed to assess the cross section area of skeletal muscle fibers, amount of IMCL, glycogen content and MEC properties of the gastrocnemius (GAM) and soleus (SO) of young and senile rats after TF protocol. Methods: 28 rats were randomly divided into 4 groups: Youth (J); Old(S); Youth who underwent strength training (JT); Old who underwent strength training (ST). The animals performed strength training protocol consisting in climb a vertical ladder with weight strapped in their tails of 65%, 85%, 95% and 100% of the maximum load of the animal 3x a week for 12 weeks. CSA of muscle fibers, detection of collagen and identification of adipocytes in the GAM and SO muscles, beyond determinations of glycogen in the liver and skeletal muscle were performed. Results: Senile animals had lower CSA values, greater amount of IMCL, as well as of connective tissue in both muscles, but did not change the glycogen content in liver and muscle. After TF, the CSA increased in young and old animals in both muscles, the reduced IMCL in SO muscle of old animals, connective tissue decreased in young and old animals in both muscle and, finally, the glycogen content increased in liver and muscle of young and old animals. Conclusion: The strength training protocol in old rats was able to increase the CSA, decrease IMCL, increase of stored glycogen and decrease the connective tissue present in GAM and SO muscles. These results showed that there are changes in muscle fiber size, in the quantity of IMCL, in glycogen storage and in properties of the ECM of the GAM and SO muscle after intervention, indicating that strength training minimizes some deleterious effects inherent aging. / Introdução: O músculo estriado esquelético forma o maior tecido presente nos vertebrados e está envolvido na locomoção, postura e movimentos respiratórios. É formado por fibras musculares alongadas, cilíndricas e multinucleadas cujo sarcoplasma apresenta gotículas de gordura, conhecidas como lipídeo intramiocelular (IMCL), e utilizadas como combustível durante o exercício. Outra fonte de energia utilizada pelo músculo é o carboidrato, estocado no corpo como glicogênio que, por sua vez, é armazenado no fígado e dentro das fibras musculares. Essas fibras também estão envoltas por uma matriz extracelular (MEC) formada, entre outros componentes, pelo colágeno, principalmente, dos tipos I, III, IV e V. No músculo esquelético, o processo de envelhecimento está associado com a perda de massa, força e função muscular, aumento de IMCL, diminuição na síntese de glicogênio com, conseqüente, resistência à insulina, além de fibrose e deposição de MEC. Por outro lado, o treinamento de força (TF) é considerado uma intervenção apropriada para alterar, diminuir ou reverter parcialmente algumas alterações fisiológicas que ocorrem no músculo esquelético durante o processo de envelhecimento. Desta forma, o presente trabalho objetivou avaliar o tamanho das fibras musculares, a quantidade de IMCL, o armazenamento do glicogênio e as propriedades da MEC dos músculos gastrocnêmio (GAM) e sóleo (SO) de ratos jovens e senis após protocolo de treinamento de força. Metodologia: 28 animais foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos experimentais: Jovens (J); Senis (S); Jovens que realizaram treinamento de força (JT); Senis que realizaram treinamento de força (ST). Os animais realizaram protocolo de treinamento de força que consistia em escalarem uma escada vertical com pesos, presos em suas caudas, de 65%, 85%, 95% e 100% da capacidade máxima de carregamento do animal, durante 12 semanas e com freqüência de 3x por semana. Foram realizadas contagem e morfometria da área de secção transversa (CSA) das fibras musculares, detecção de colágeno e identificação de adipócitos nos músculos GAM e SO, além das determinações de glicogênio muscular e hepático, seguido de análise estatística. Resultados: Os animais senis apresentaram menor valor de CSA, maior quantidade de IMCL e maior quantidade de tecido conjuntivo em ambos os músculos, porém não apresentou alterações na quantidade de glicogênio armazenada nos músculo e no fígado. Após o TF, houve aumento na CSA dos animais jovens e senis em ambos os músculos, diminuição na quantidade de IMCL no músculo SO dos animais senis, redução do conteúdo de tecido conjuntivo nos animais jovens e senis em ambos os músculos e, por fim, aumento no armazenamento de glicogênio no músculo e fígado dos animais jovens e senis. Conclusão: O protocolo de treinamento de força realizado em ratos senis foi capaz de aumentar a CSA, diminuir a quantidade de IMCL, aumentar a quantidade de glicogênio armazenado e diminuir a quantidade de tecido conjuntivo presente nos músculos esqueléticos GAM e SO. Esses resultados mostram que há alterações no tamanho das fibras musculares, na quantidade de IMCL, no armazenamento de glicogênio e nas propriedades da MEC nos músculos estudados após a intervenção, comprovando que o treinamento de força minimiza os efeitos deletérios inerentes ao envelhecimento.

Submitted by THIAGO DE SOUZA CANDIDO null (thiago.s.candido@gmail.com) on 2016-09-30T14:48:19Z No. of bitstreams: 1 Tese Thiago de Souza Candido.pdf: 8667516 bytes, checksum: a5ceff1a03a2f39c134a0633e677f4df (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-10-04T14:33:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 candido_ts_dr_araiq.pdf: 8667516 bytes, checksum: a5ceff1a03a2f39c134a0633e677f4df (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-04T14:33:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 candido_ts_dr_araiq.pdf: 8667516 bytes, checksum: a5ceff1a03a2f39c134a0633e677f4df (MD5) Previous issue date: 2016-09-15 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fungo Neurospora crassa tem sido amplamente usado como um organismo modelo para os aspectos fundamentais da biologia dos eucariotos. Neste trabalho, foi investigado o papel funcional de uma ciclina de N. crassa (PCL-1), codificada pela ORF NCU08772 e ortóloga a Pcl10 de Saccharomyces cerevisiae. Na levedura, a proteína Pcl10, em conjunto com a proteína quinase dependente de ciclina Pho85, fosforila a enzima glicogênio sintase, a enzima regulatória da síntese de glicogênio. A fosforilação resulta na inativação da enzima e, portanto, em diminuição do acúmulo de glicogênio. A linhagem pcl-1 de N. crassa apresentou um atraso na germinação dos conídios e um retardo na progressão do ciclo celular quando comparado com a linhagem selvagem, sugerindo que esta ciclina pode regular o desenvolvimento e a divisão celular. Além disto, a linhagem nocauteada acumulou níveis mais elevados de glicogênio que a linhagem selvagem indicando o papel na regulação do metabolismo deste carboidrato. A fosforilação da enzima glicogênio sintase de N. crassa (GSN) foi analisada na linhagem nocaute através de análises de atividade enzimática, e os resultados mostraram que a GSN apresentou baixo índice de fosforilação, portanto alta atividade durante o crescimento, um resultado que pode explicar o alto acúmulo de glicogênio observado. Este resultado foi confirmado por análise de 2D-PAGE seguida por western blot, utilizando anticorpos anti-GSN. GSN apresentou na linhagem mutante isoformas menos fosforiladas que a enzima presente na linhagem selvagem. As proteínas recombinantes PHO85, PCL-1 foram utilizadas em ensaios de fosforilação in vitro da enzima GSN e os resultados mostraram que a enzima GSN foi fosforilada pelo complexo PHO85/PCL-1 no sítio putativo Ser636. O papel da ciclina na resposta ao cálcio foi investigado, e os resultados mostraram que a linhagem pcl-1 mostrou uma resistência ao estresse provocado por altas concentrações de cálcio quando comparada com a linhagem selvagem. Análises de expressão gênica por RT-qPCR foram realizadas e a linhagem pcl-1 mostrou estar envolvida na regulação de genes do metabolismo do cálcio. Os resultados indicam que a proteína PCL1 de N. crassa pode ser uma ciclina multifuncional e pode estar envolvida na regulação de vários processos celulares essenciais dependendo do ambiente. / The fungus Neurospora crassa has been widely used a model organism for the fundamental aspects of eukaryotes biology. This work investigated the functional role of a N. crassa cyclin (PCL-1), encoded by the ORF NCU08772, and orthologous to the Saccharomyces cerevisiae Pcl10 cyclin. In yeast, Pcl10 protein, together with the Pho85 cyclin-dependent protein kinase, phosphorylates the glycogen synthase enzyme, the regulatory enzyme in glycogen synthesis. Phosphorylation results in enzyme inactivation and therefore in decreased glycogen accumulation. The N. crassa pcl-1 strain showed a delay in conidia germination and in the progression of the cell cycle compared to the wild-type strain, suggesting that the cyclin may regulate development and cell division. Furthermore, the mutant strain accumulated higher glycogen levels than wild-type strain indicating its role in the regulation of the carbohydrate metabolism. The phosphorylation rate of the N. crassa glycogen synthase (GSN) was analyzed in the mutant strain by enzymatic activity assays, and the results showed that GSN was less phosphorylated during growth; therefore, high activity, and this result may explain the high glycogen accumulation observed in the mutant strain. This result was confirmed by 2D-PAGE gels followed by western blot using anti-GSN antibodies. The GSN isoforms presented in the mutant strain were less phosphorylated than the enzyme present in the wild-type strain. The recombinant proteins PHO85 and PCL-1 were used in in vitro phosphorylation assays of GSN enzyme, and the results showed that the enzyme was phosphorylated by the PHO85/PCL-1 complex at the putative site Ser636. The role of the cyclin in the response to calcium was investigated, and the results showed that the pcl-1 strain is more resistant than the wild-type strain to the stress caused by high calcium concentration. Gene expression analysis by RTqPCR was performed to analyze genes involved in calcium metabolism, and the pcl-1 strain showed to regulate the expression of some calcium metabolism genes. The results indicate that the N. crassa PCL1 cyclin may be multifunctional and may be involved in the regulation of several cellular processes depending on the environment. / FAPESP: 2012/08652-4

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O estado nutricional perinatal tem influência persistente sobre o desenvolvimento neural e a função cognitiva. Em humanos e outros animais, a malnutrição protéica durante o período perinatal acarreta alterações permanentes, incluindo a síndrome metabólica na idade adulta. A alimentação é modulada principalmente por fatores neuronais e hormonais que chegam ao hipotálamo. As reservas de glicogênio hipotalâmicos são uma fonte de glicose em altas demandas energéticas, como durante o desenvolvimento dos circuitos neurais. Como alguns circuitos hipotalâmicos estão sendo formados durante o período de lactação, focamos o estudo nos efeitos da desnutrição protéica, durante os primeiros 10 dias de lactação, sobre as reservas de glicogênio em núcleos hipotalâmicos envolvidos no controle do metabolismo energético. Ratas grávidas foram aleatoriamente separadas individualmente em gaiolas e alimentadas ad libitum com uma dieta normoproteíca (22% proteína). Após o parto, cada mãe ficava com 6 filhotes machos. Durante os 10 primeiros o grupo experimental recebia uma dieta isenta de proteína (D) e o grupo controle uma dieta normoproteíca (C). Em P10 a marcação para as reservas de glicogênio era muito intensa nos animais C no núcleo arqueado (ARC) e eminência média (EM). Em P20 no animais C, as reservas eram menores em comparação com P10. Os animais D apresentaram uma marcação menor do que os controles. Após P45 foi difícil determinar diferença entre os grupos porque o as reservas estavam diminuídas. Nós também mostramos que os tanicitos eram as células que apresentavam reservas de glicogênio. Nossos dados reforçam que o estado nutricional materno durante a lactação é crítico para a maturação cerebral, pois a malnutrição materna resulta em menor marcação nas reservas de glicogênio no hipotálamo, o que pode ser crítico para o estabelecimento da circuitaria neural. / Perinatal nutrition has persistent influences on neural development and cognition. In humans and other animals protein malnutrition during the perinatal period causes permanent changes, inducing to adulthood metabolic syndrome. Feeding is mainly modulated by neural and hormonal inputs to the hypothalamus. Hypothalamic glycogen stores are a source of glucose in high energetic demands, as during development of neural circuits. As some hypothalamic circuits are formed during lactation, we attempt to study the effects of malnutrition, during the first 10 days of lactation, on glycogen stores in hypothalamic nuclei involved in the control of energy metabolism. Female pregnant rats were fed ad libitum with a normorprotein diet (22% protein). After delivery each dam was kept with 6 male pups. During the first 10 days of lactation dams from experimental group received a protein free diet and the control group a normoprotein diet. By P10 glycogen stores were very high in the arcuate nucleus and median eminence of control group. Glycogen stores decreased during development. In P20 control animals, glycogen stores were lower when compared to P10 control animals. Animals submitted to malnutrition presented a staining even lower than control ones. After P45 it was difficult to determine differences between control and diet groups because glycogen stores were reduced. We also showed that tanycytes were the cells presenting glycogen stores. Our data reinforce that maternal nutritional state during lactation may be critical for neurodevelopment since it resulted in a low hypothalamic glycogen store, which may be critical for establishment of neuronal circuitry.

O Rhipicephalus microplus é um parasita obrigatório hematófago, monoxeno, que gera grande impacto econômico a partir da ação espoliativa sobre o seu hospedeiro preferencial. A glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3), uma proteína altamente conservada e ubiquamente expressa entre diversas espécies, foi identificada no carrapato bovino sob a isoforma GSK-3β. Envolvida na modulação da atividade da proteína glicogênio sintase, como um agente regulador da síntese de glicogênio, essa proteína atua no metabolismo energético do R. microplus. A GSK-3 também está envolvida na via de sinalização Wnt, e por isso, já foi descrita como uma quinase essencial para a formação do embrião, estando diretamente envolvida no processo reprodutivo deste carrapato. Neste contexto, a GSK-3β é uma candidata para o desenvolvimento de novas alternativas de controle do carrapato bovino. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi estudar a participação da proteína GSK-3β na fisiologia do R. microplus a partir da inibição de sua atividade. Ensaios in vitro e in vivo foram realizados para testar a inibição química e imunológica da atividade dessa proteína. Anticorpos contra peptídeos sintéticos baseados na sequência da GSK-3β (anti- SRm0218 e anti-SRm86100) usados neste trabalho não foram capazes de inibir a atividade dessa proteína, no entanto, a inibição da GSK-3β foi alcançada quando células embrionárias de R. microplus foram submetidas à inibição química, por meio de um inibidor específico. Este resultado sustenta o potencial dessa proteína como alvo para o desenvolvimento de uma alternativa de controle do carrapato bovino, pois a sua inibição possivelmente atuaria negativamente na capacidade reprodutiva do carrapato R. microplus. / Rhipicephalus microplus is a monogenetic, hematophagous ectoparasite that has a large economic impact due to associated losses in the cattle industry. Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) is a highly conserved and ubiquitously expressed protein in several species. It has been identified as GSK-3β isoform in the cattle tick, and is involved in the modulation of glycogen synthase activity, as a regulator of glycogen synthesis with a role in energy metabolism of R. microplus. GSK-3β is also involved in the Wnt signaling pathway. It is a fundamental kinase for embryo development, and is directly linked with R. microplus reproductive process. Thus, the aim of this study was to investigate the role of GSK-3β in R. microplus physiology by inhibiting its activity. In vitro and in vivo assays were carried out to test its immunological and chemical inhibition. Rabbit antibodies against synthetic peptides based on GSK-3β sequence (anti-SRm0218 and anti-SRm86100) used in this work were not capable to inhibit GSK- 3β activity, but GSK-3β inhibition was reached when R. microplus embryo cells were cultivated with a specific inhibitor. This result supports the potential of this protein as a target to develop a new cattle tick control method, because its inhibition probably acts detrimentally in the reproductive capacity of the tick.

O Rhipicephalus microplus é um parasita obrigatório hematófago, monoxeno, que gera grande impacto econômico a partir da ação espoliativa sobre o seu hospedeiro preferencial. A glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3), uma proteína altamente conservada e ubiquamente expressa entre diversas espécies, foi identificada no carrapato bovino sob a isoforma GSK-3β. Envolvida na modulação da atividade da proteína glicogênio sintase, como um agente regulador da síntese de glicogênio, essa proteína atua no metabolismo energético do R. microplus. A GSK-3 também está envolvida na via de sinalização Wnt, e por isso, já foi descrita como uma quinase essencial para a formação do embrião, estando diretamente envolvida no processo reprodutivo deste carrapato. Neste contexto, a GSK-3β é uma candidata para o desenvolvimento de novas alternativas de controle do carrapato bovino. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi estudar a participação da proteína GSK-3β na fisiologia do R. microplus a partir da inibição de sua atividade. Ensaios in vitro e in vivo foram realizados para testar a inibição química e imunológica da atividade dessa proteína. Anticorpos contra peptídeos sintéticos baseados na sequência da GSK-3β (anti- SRm0218 e anti-SRm86100) usados neste trabalho não foram capazes de inibir a atividade dessa proteína, no entanto, a inibição da GSK-3β foi alcançada quando células embrionárias de R. microplus foram submetidas à inibição química, por meio de um inibidor específico. Este resultado sustenta o potencial dessa proteína como alvo para o desenvolvimento de uma alternativa de controle do carrapato bovino, pois a sua inibição possivelmente atuaria negativamente na capacidade reprodutiva do carrapato R. microplus. / Rhipicephalus microplus is a monogenetic, hematophagous ectoparasite that has a large economic impact due to associated losses in the cattle industry. Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) is a highly conserved and ubiquitously expressed protein in several species. It has been identified as GSK-3β isoform in the cattle tick, and is involved in the modulation of glycogen synthase activity, as a regulator of glycogen synthesis with a role in energy metabolism of R. microplus. GSK-3β is also involved in the Wnt signaling pathway. It is a fundamental kinase for embryo development, and is directly linked with R. microplus reproductive process. Thus, the aim of this study was to investigate the role of GSK-3β in R. microplus physiology by inhibiting its activity. In vitro and in vivo assays were carried out to test its immunological and chemical inhibition. Rabbit antibodies against synthetic peptides based on GSK-3β sequence (anti-SRm0218 and anti-SRm86100) used in this work were not capable to inhibit GSK- 3β activity, but GSK-3β inhibition was reached when R. microplus embryo cells were cultivated with a specific inhibitor. This result supports the potential of this protein as a target to develop a new cattle tick control method, because its inhibition probably acts detrimentally in the reproductive capacity of the tick.

Orientador: Denise Vaz de Macedo / Tese (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T02:09:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Stancanelli_Mirtes_M.pdf: 527727 bytes, checksum: 8ebada11e8ef5688039bd52cf92a6a14 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Os objetivos desse trabalho foram: i) analisar as concentrações plasmáticas de uréia e creatina quinase (CK) de jogadores de futebol que consumiram caldo de cana imediatamente pós-treinos ou jogos durante todo o Campeonato Brasileiro ii) analisar o efeito da gavagem estomacal com caldo de cana em ratos submetidos a um protocolo de exercício exaustivo agudo na reposição dos estoques de glicogênio muscular e hepático. A sessão de exercício agudo consistiu em natação com carga de 10% do peso corporal até a exaustão após jejum de 30 horas. Imediatamente após o exercício, os animais suplementados receberam água ou caldo de cana por gavagem estomacal. Os dados com os jogadores mostraram uma concentração plasmática de uréia, aliada a uma concentração estável da CK plasmática ao longo de todo o campeonato, sugerindo uma possível ação ergogênica do caldo de cana. O exercício agudo diminuiu significativamente os estoques de glicogênio somente nos músculos gastrocnêmio branco e vermelho dos ratos. A suplementação com caldo de cana (0,7g/kg de peso corporal) aumentou significativamente os estoques de glicogênio desses músculos, sem alterar a concentração de glicogênio hepático. Os ratos suplementados também exibiram maior resistência muscular pós-exercício. Esses dados comprovam o efeito ergogênico do caldo de cana na reposição dos estoques de glicogênio muscular. Entre outras vantagens, o caldo de cana é um produto de fácil obtenção e principalmente de baixo custo, ideal para as condições socio-econômicas dos atletas nacionais / Abstract: The goal of this work were i) monitoring soccer players (n=29) submitted to sugar cane juice consumption immediately after training or games through plasma urea and CK analyses along the Brazilian Championship, and ii) investigate the effect of sugar cane juice ingestion in the restoration of muscular and liver glycogen stores after high intense exercise in rats. The rats swam with 10% body weight load until exhaustion after 30 hours fasting. Immediately after exercise the supplemented animals got water or sugar cane juice from stomach gavages. We have used 56 male Wistar rats weighting from 280 to 310 g, which were divided in 7 groups; control (C); fasting (F); fasting and exercise (FE); water supplemented (WS); and sugar cane juice supplemented (SCS). Liver, white and red gastrocnemius and soleus muscles samples were removed after 40 and 60 min to glycogen concentration determinations. The players exhibited a decrease in plasma urea together with stable levels of plasma CK activity along all the championship, suggesting a recovery action. The exhaustive exercise decreased significantly only the red and white gastrocnemius muscle glycogen stores. Sugar cane juice supplementation (0,7 g/kg body weight) increased significantly glycogen stores of these muscles, but practically didn¿t change liver glycogen concentration after 1 h. These data strongly suggest that sugar cane juice is efficient to maximize the rate of glycogen storage in the early hour¿s post- exercise / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Denise Vaz de Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Educação Fisica / Made available in DSpace on 2018-08-14T02:22:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_EduardaFariaAbrahao_M.pdf: 1361714 bytes, checksum: 992f3e29c70608cd5aeadd76efd36059 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O exercício físico pode induzir traumas na musculatura, sinalizando uma resposta inflamatória. O reparo e regeneração das estruturas danificadas dependem do período adequado de descanso para recuperação. Esse período regenerativo é necessário após uma única sessão ou diversas sessões de exercícios. A restauração do glicogênio muscular pós-treino tem sido proposto como um dos fatores mais importantes para a recuperação pós-esforço. Normalmente, no esporte, são utilizados monossacarídeos ou amidos em diluições apropriadas para repor o glicogênio pós-treino. O caldo-de-cana é uma bebida comum no Brasil. Possui 65%-75% de água em sua composição média e alta concentração de sacarose, correspondente a 70%-91% de seus sólidos solúveis, além de antioxidantes, vitaminas, minerais e aminoácidos. O objetivo desse trabalho foi analisar o efeito do caldo-de-cana comparado a soluções carboidratadas ministradas imediatamente após um protocolo de exercício exaustivo na reposição de glicogênio; e na cinética de biomarcadores. No entanto, durante a revisão literária encontramos a utilização de diversos tipos anestésicos como principal variação metodológica nos estudos que quantificavam a concentração de glicogênio em animais. Foi necessário, portanto, definir qual anestésico utilizar permitindo interpretação de dados teciduais com análises concomitantes em sangue. Os agentes anestésicos podem afetar estrutura, função de órgãos e sistemas biológicos diferentemente, importando saber se o anestésico a ser utilizado poderia causar hemólise e/ou glicogenólise tecidual, interferentes na interpretação dos resultados. O capítulo 1 apresenta dados da comparação de 3 anestésicos injetáveis em relação ao grau de hemólise e concentrações de glicogênio. Os animais foram divididos em 3 grupos cada qual com um anestésico: Hidrato de Cloral (CH), Ketamina + Xilazina (KX), Zoletil 50® (zolazepam e tiletamina) + Xilazina (ZTX). Os grupos CH e KX exibiram hemólise em graus variados. Já o soro do grupo ZTX não apresentou hemólise. Não houve diferenças significativas nas concentrações de glicogênio entre os grupos CH e ZTX. Já o KX apresentou glicogenólise acentuada em todos tecidos. Os dados apresentados no capítulo 1 mostraram que o anestésico ZTX era o mais apropriado. O Capítulo 2 apresenta dados do efeito do caldo-de-cana comparativamente a soluções carboidratadas ministradas pós-exercício exaustivo, na reposição de glicogênio muscular e hepático, e na cinética de marcadores de proteólise, lesão muscular e inflamação durante 48h de recuperação. Esse estudo foi dividido em 2 experimentos. Os resultados do experimento 1 mostraram que a suplementação com caldo de cana foi tão eficiente quanto à maltodextrina para restaurar o glicogênio muscular. Nenhum dos suplementos foi capaz de repor significativamente o glicogênio hepático. Nos parâmetros bioquímicos e contagem do número de leucócitos totais, analisados no experimento 2, os dados mostraram instalação de quadro inflamatório e dano muscular pós-exercício perdurando pelas 48h de descanso. As amostras dos grupos suplementados com caldo-de-cana e maltodextrina não alteraram o padrão de resposta nas 48h pós-exaustão. Uma provável explicação seria a suplementação aguda, e após uma sessão de exercício, não ter sido suficiente para desencadear alterações nas análises. As potencialidades dos constituintes do caldo-de-cana e a escassez de estudos científicos com objetivo de utilizá-lo como recurso ergogênico no esporte reforçam a continuidade dessas investigações. / Abstract: Physical exercise induces traumas to biological structures which signal inflammatory process activation. The repair and regeneration of the damaged structures depend on an appropriate rest period for the recovery. This regenerative period is necessary after a single session or after several sessions of exercises. The muscle glycogen repletion after physical exercise seems to influence the recovery time. Usually in practices the carbohydrate rich compounds like maltodextrine, fructose or dextrin are normally used to maximize the rate of glycogen storage in the early hour's post-exercise. Sugar cane juice is an appreciate product and easily to find in Brazil. It possesses 65%-75% of water and a high sucrose concentration that corresponds 70%-91% of their soluble solids, phenolics compounds, vitamins, minerals and amino acids. The goal of this master's degree dissertation was to analyze the effect of sugar cane juice comparatively to other carbohydrates solutions supplied immediately after a bout of exhausting exercise in rats in the replacement of the glycogen stores; and in the kinetics of some biomarkers in 48h post-effort. However, the literature revision found the use of several anesthetics as the main methodological variation in the studies that quantified glycogen concentration in animals. It was necessary, therefore, initially to define the anesthetic that could allow the association of the data obtained in tissues with concomitant analyses in blood. It was important to know if the anesthetic used for samples collection could cause haemolysis and/or glycogenolysis in the animals. The studies accomplished during the master's degree are contained in two chapters. In chapter 1 we presented the comparison data of three injectable anesthetics used in experiments with animals, concerning the degree of haemolysis and glycogenolysis after anesthesia. The animals were divided into three groups: Cloral Hydrate (CH), Ketamine + Xylazine (KX), Zoletil 50® (zolazepam and tiletamine) + Xylazine (ZTX). The CH and KX presented serum haemolysis. Only ZTX presents no detectable values. The average value of the hepatic and muscular glycogen concentrations exhibited no significant difference between CH and ZTX. However, the KX presented accentuated glycogenolysis in all tissues. Our data suggest that the anesthetic ZTX seems to be the most appropriate for studies that need simultaneously to quantify the concentration of glycogen and blood markers without interferences. Chapter 2 presented the data of the effect of sugar cane juice comparatively to other carbohydrates solutions supplied after the exhaustion in rats, in the replacement of muscular and hepatic glycogen stores, and in the kinetics of some markers of proteolyses, muscular lesion and inflammation in 48hs of recovery. For that, we divided this study in two experiments. The results presented in the experiment 1 showed that the supplementation with sugar cane was as efficient as maltodextrine to restore the gastrocnemium red and white portions glycogen after 1 h of the exhaustion. The fructose exhibited less pronounced effect. None of the supplements were able to restore the hepatic glycogen significantly. The biochemical parameters and WBC number data analyzed in experiment 2 showed an persistent inflammatory picture associated to muscular damage even after 48h of rest. The supplemented groups with sugar cane and maltodextrine didn't alter the 48h post-exercise response pattern. Their representatives' potentialities reinforce the continuity of the investigations. / Mestrado / Biodinamica do Movimento Humano / Mestre em Educação Física

Apesar da elevada prevalência dos transtornos depressivos em idosos, os mecanismos fisiopatológicos subjacentes a estes quadros são pouco conhecidos. Atualmente, o principal foco dos estudos sobre a fisiopatologia da depressão geriátrica são as alterações cerebrovasculares associadas a estes quadros. Outros mecanismos fisiopatológicos têm sido estudados, como as alterações em cascatas neurotróficas e inflamatórias. A enzima glicogênio sintase quinase 3 beta (GSK-3B) tem sido implicada na patogênese de diversos transtornos mentais, em especial os transtornos afetivos (i.e. depressão maior e o transtorno afetivo bipolar) e doenças neurodegenerativas (i.e. doença de Alzheimer). Entretanto, não há estudos que avaliam o papel desta enzima nos pacientes idosos com depressão maior. Desta maneira, o objetivo principal deste trabalho é avaliar a atividade da GSK-3B em pacientes idosos com depressão maior. A hipótese deste estudo é que a atividade enzimática está aumentada nos pacientes idosos deprimidos em relação a idosos saudáveis. Para este estudo, recrutamos 40 idosos com depressão maior (de acordo com os critérios diagnósticos do DSM-IV) e que não estavam em uso de antidepressivos. O grupo comparativo foi constituído por 13 idosos saudáveis, sem evidências de transtornos cognitivos ou do humor. A gravidade da sintomatologia depressiva foi avaliada pela escala de depressão de Hamilton de 21 itens (HAM-D); o desempenho cognitivo dos pacientes e controles foi avaliado pelo teste cognitivo de Cambridge (CAMCOG) e pelo mini-exame do estado mental (MEEM). A expressão da GSK-3B foi determinada em plaquetas através de ensaio imunoenzimático (EIA), sendo estabelecido os níveis totais da GSK-3B (T-GSK-3B) e de sua forma fosforilada (P-GSK-3B), inativa. A atividade enzimática foi inferida indiretamente pela razão P-GSK- 3B / T-GSK-3B. Nos pacientes idosos com depressão maior, observou-se uma redução significante dos níveis P-GSK-3B (p=0,03) e da razão da GSK- 3B (p=0,03). Os pacientes com sintomatologia depressiva mais grave (HAMD > 21) e déficits cognitivos mais intensos (CAMCOG < 86) apresentaram maior atividade enzimática (p=0,03 e teste, p=0,01, respectivamente). Os resultados deste trabalho sugerem que a atividade da GSK-3B está significantemente aumentada em pacientes idosos com depressão maior e que está alteração é mais pronunciada nos pacientes com sintomatologia depressiva e déficits cognitivos mais graves. Neste contexto, a atividade da GSK-3B pode ser considerada um marcador de estado em pacientes idosos com episódios depressivos mais graves e ser um importante alvo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para estes quadros / Despite the high prevalence of depressive disorders in the elderly, its main physiopathological mechanisms are largely unknown. In the recent years, most of the research efforts focused on the association between cerebrovascular changes and geriatric depression. Nonetheless, other mechanisms have been studied, such as changes in neurotrophic and inflammatory cascades. The enzyme glycogen synthase kinase 3 beta (GSK- 3B) has been implicated in many mental disorders, in particular affective disorders (i.e. major depression and bipolar disorder) and neurodegenerative disorders (i.e. Alzheimers disease). However, there is no study so far that addressed the role of this enzyme in elderly patients with major depression. Therefore, the main objective of this study was to evaluate if GSK-3B activity is changed in elderly patients with major. The working hypothesis is that enzyme activity is significantly increased in elderly patients with major depression as compared to elderly controls. We recruited 40 elderly patients with current major depressive episode (according to the DSM-IV criteria) that was not under antidepressant treatment. The comparison group included 13 healthy elderly subjects with no evidence of cognitive impairment or major psychiatric disorder. The severity of depressive symptoms was assessed by the Hamilton Depression Scale 21 items; cognitive performance was assessed by the Cambridge Cognitive test (CAMCOG) and the Mini-mental State Examination (MMSE). The levels of total and phosphorylated GSK-3B (T-GSK-3B and P-GSK-3B, respectively) levels were determined in platelets by immunoenzymatic assay (EIA). Enzyme activity was indirectly inferred by the ratio P-GSK-3B / T-GSK-3B. Elderly patients with major depression had a significant reduction in the P-GSK-3B levels (p = 0.03) and GSK-3B ratio (p= 0.03). The patients with severe depressive episode (HAM-D scores above 21 points) and cognitive impairment (CAMCOG scores below 86 points) presented the more significant reduction of GSK-3B ratio (p = 0.03 and p = 0.01, respectively). These data altogether suggest that GSK-3B activity is significantly increased in elderly patients with major depression, in particular in those with more severe depressive episode and worse cognitive performance. In this context, the increased enzyme activity may be regarded as a state marker of severe depressive episodes and may an important target to the development of therapeutic strategies to this disorder