Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017. / Submitted by Raquel Almeida (raquel.df13@gmail.com) on 2017-05-18T21:43:20Z No. of bitstreams: 1 2017_FabiánAndrésHurtadoErazo.pdf: 1577377 bytes, checksum: fbcc285d4a9db38da107507c2b9fac14 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-05-24T21:53:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_FabiánAndrésHurtadoErazo.pdf: 1577377 bytes, checksum: fbcc285d4a9db38da107507c2b9fac14 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-24T21:53:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_FabiánAndrésHurtadoErazo.pdf: 1577377 bytes, checksum: fbcc285d4a9db38da107507c2b9fac14 (MD5) Previous issue date: 2017-05-21 / O fungo patogênico Cryptococcus neoformans é um dos agentes etiológicos da criptococose, uma infecção fúngica invasiva que pode se disseminar ao sistema nervoso central e que afeta principalmente pacientes imunocomprometidos. Uma das principais células em detectar a infecção são as células dendríticas, que reconhecem e fagocitam o fungo orquestrando a resposta imune adaptativa para erradicar a infecção. A resposta imune do hospedeiro às infecções por patógenos microbianos envolve ampla reprogramação gênica, que é finamente controlada de modo a conter ou eliminar efetivamente o patógeno sem causar danos excessivos no hospedeiro. Micro-RNAs (miRNAs) são pequenos RNAs regulatórios envolvidos em mecanismos de regulação gênica e já foram detectados em diversos processos fisiológicos e patológicos controlando a estabilidade ou a taxa de tradução de RNA mensageiros (mRNA). Portanto, essas moléculas foram identificadas como um componente crucial na maquinaria da regulação gênica, afetando a produção e função das proteínas durante a homeostase ou sua perturbação. Esse estudo visou a caracterização do perfil de miRNAs expressos em células dendríticas derivadas de medula óssea de camundongos BALB/c (BMDCs) em resposta à infecção por C. neoformans. BMDCs foram co-cultivadas com a linhagem B3501 de C. neoformans por 24 h e tiveram RNA extraído para análise de expressão de miRNAs por RT-qPCR array. Os níveis de acúmulo de 29 miRNAs foram alterados nas BMDCs infectadas. Desse grupo, 22 miRNAs foram regulados positivamente e 7 miRNAs mostraram uma diminuição nos níveis de seus transcritos. Em seguida, analisou-se o papel do miR-155 nas principais funções das BMDCs em resposta à infecção por C. neoformans, por meio da abordagem de perda da função, mediante a transfecção de inibidores de miRNAs. Em tais experimentos, observou-se uma alteração na fagocitose e no controle intracelular do fungo pelas BMDCs quando miR-155-3p foi inibido. A análise da expressão, por citometria de fluxo, de MHCII nas BMDCs revelou um aumento na média da intensidade de fluorescência quando miR-155-5p foi inibido, sugerindo um papel na regulação desse complexo. Os resultados desse trabalho são pioneiros ao sugerir a participação de miRNAs na resposta de células dendríticas à infecção por C. neoformans. Estudos posteriores serão realizados visando ao aprofundamento da avaliação funcional desses miRNAs e seus respetivos mecanismos de ativação nesse modelo de infecção. / The pathogenic fungus Cryptococcus neoformans is one of the etiological agents of cryptococcosis, an invasive fungal infection that can spread to the central nervous system and mainly affects immunocompromised patients. One of the main cells in detecting the infection are dendritic cells, which recognize and phagocyte the fungus, orchestrating the adaptive immune response to eradicate the infection. The immune response to microbial pathogen infections involves extensive genetic reprogramming, which is finely controlled to contain or to effectively eliminate the pathogen without causing excessive damage to the host. Micro-RNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs involved in gene regulation mechanisms; these molecules are observed in a wide range of physiological and pathological processes controlling either messenger RNA (mRNA) stability or translation rate. Therefore, these molecules have been identified as a crucial component in the gene regulation machinery, affecting the production and function of proteins in homeostasis and its alterations. This study focused on characterizing the profile of miRNAs expressed in bone marrow-derived dendritic cells from BALB/c mice (BMDCs) in response to C. neoformans infection. BMDCs were co-cultured with the B-3501 strain of C. neoformans for 24 hours, after which the RNA was extracted for analysis of miRNA expression by RT-qPCR array. The expression levels of 29 miRNAs were altered in the infected BMDCs. Out of this group, 22 miRNAs were upregulated and 7 miRNAs showed a decrease in the levels of transcripts. Subsequently, the effect of miR-155 in the main functions of BMDCs in response to C. neoformans infection was analyzed by of a lossof-function approach: transfection of miRNA inhibitors into BMDCs. When miR-155-3p was inhibited, a change in BMDCs phagocytosis ability and in the intracellular control of the fungus was observed. Analysis of the MHCII expression in infected BMDCs by flow cytometry revealed an increase in the Mean Fluorescence Intensity when miR-155-5p was inhibited. These results are pioneering in indicating the participation of miRNAs in the dendritic cells response to C. neoformans infection.

Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 14/08/2015 / Inclui referências : f. 81-95 / Área de concentração / Resumo: Em um ramo novo da ciência como a imunologia, poucos modelos são capazes de resistir por tanto tempo quanto o modelo de sinalização dupla, proposto por Bretcher e Cohn em 1970. Atualmente, entende-se que a dupla sinalização atua de forma sinérgica para a ativação dos linfócitos T e que a via do CD28 é apenas uma parte de uma grande rede de controle incluindo diversas outras vias que atuam em conjunto para controlar a ativação de linfócitos. Tanto do ponto de vista funcional, assim como do ponto de vista estrutural, a abordagem da via de CD28-CD80/86 na maioria dos casos tem um enfoque sobre a via de ativação de linfócitos, a qual é bastante descrita enquanto as APCs aparecem apenas como coadjuvantes nessa interação. Essa perspectiva começou a mudar em 2004 quando foi descrito que células dendríticas de camundongo, quando estimuladas com LPS e CD28 sofrem uma ativação e iniciam a secreção de interleucinas. Num contexto no qual o efeito das vias de sinalização sobre os APCs começa a ser compreendido, torna-se importante o estabelecimento de modelos adequados a esse estudo. Frangos são um modelo clássico para o estudo em imunologia, desde o início do desenvolvimento desse campo de conhecimento. Não foi descrita na literatura, até o momento, a sinalização CD28-CD80/86 em macrófagos de aves, as quais podem apresentar diferenças fisiológicas e funcionais quando comparadas às de mamíferos. Desta forma, este estudo pretende estabelecer se os mecanismos de sinalização reversa presentes em mamíferos e aves foi conservado durante a evolução, avaliando ainda a hipótese de que macrófagos possam ser artífices da sinalização reversa, fato observado apenas para células dendríticas. Este trabalho tem como objetivo avaliar a ativação de macrófagos de frango frente ao estímulo com CD28 recombinante. Às células previamente estimuladas com LPS, foram adicionados meios de cultivo com LPS, CD28 e CD28 deletada (com uma deleção em seu sítio MYPPPY de ligação com CD80/86) e os estímulos mensurados através de qPCR para diversas citocinas em diferentes tempos experimentais. Para o primeiro estimulo com LPS, houve uma redução na produção de IL-4, IL-2 e IFN-? e uma alteração sugerida para a expressão reduzida de IL-6, IL-12, IL-1? e aumentada de TNF?. Na segunda estimulação apenas com LPS, pode-se concluir que o ambiente resultante é pró-inflamatório, uma vez que a expressão das interleucinas com características anti-inflamatórias, IL-4 e IL-10, está diminuída ou ausente, enquanto IL-2, IL-18 e IL-12 estão aumentadas. Sugere-se que o estimulo com CD28 produz uma ativação de macrófagos que tem característica pró-inflamatória, porém sem direcionamento M1 ou M2. Essa polarização provavelmente advém de uma interação com os outros atores do sistema imune por diversos mecanismos de troca de informação, como citocinas, quimiocinas e outras moléculas sinalizadoras. Este trabalho mostrou pela primeira vez o mecanismo de sinalização reversa mediado por células apresentadoras de antígeno profissionais em macrófagos de aves. Palavras-chave: imunologia; aves; gallus; macrófago; CD28; sinalização reversa; citocinas. / Abstract: In a new branch of science such as immunology, just a few models are able to resist for as long as the dual signaling model proposed by Bretcher and Cohn in 1970. Currently, it is known that the double signaling acts synergistically to activate T lymphocytes and that the path of CD28 is only one part of a large network control including several other ways that work together to control the activation of lymphocytes. In a functional point of view as well as from a structural point of view, the approach of CD28-CD80 / 86 in most cases has a focus on the activation pathway of lymphocytes, which is detailed described as the APCs appear only with a secondary role in this interaction. This perspective started to change in 2004 when it was reported that mouse dendritic cells when stimulated with LPS and CD28 undergoes activation and start to secrete interleukins. In a context that the effect of signaling pathways on APCs begins to be understood, it is important to establish suitable models in this study. Chickens are a classic model for the study in immunology, since the beginning of development of this field of knowledge. It has not been described in so far, CD28-CD80/86 signaling in avian macrophage, which may have physiological and functional differences compared to mammal ones. Thus, this study aims to establish if the mechanisms of reverse signaling present in mammals has been conserved during evolution and is similar in birds, also evaluating the hypothesis that macrophages can be passive of reverse signaling, which was observed only for dendritic cells. This project aims to evaluate the activation of chicken macrophages front of the stimulation with recombinant CD28. The cells previously stimulated with LPS, received culture media containing LPS, CD28 and deleted CD28 (with a deletion on the MYPPY CD80/86 binding site) the stimuli was measured by qPCR for different cytokines under different experimental times. For the first stimulation with LPS, there was a reduction in the production of IL4, IL2 and IFN-? and a modification on the expression was suggested with an increase for IL6, IL12, IL-1? and decreased for TNF. In the second stimulation with LPS, one may conclude that the resulting environment was pro-inflammatory, since the expression of interleukins with anti-inflammatory characteristics, IL-4 and IL-10, is decreased or absent, while IL-2 IL-18 and IL-12 are increased. It is suggested that CD28 stimulation generate an activation of macrophages that has pro-inflammatory characteristic but without polarization M1 or M2. This bias probably comes from an interaction with other actors of the immune system through several mechanisms of signaling such as cytokines, chemokines, and other signaling molecules. This study showed for the first time the reverse signaling mechanism mediated by professional antigen presenting cells in avian macrophage. Key words: immunology; birds; gallus; macrophage; CD28; reverse signaling; cytokines.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-18Bitstream added on 2014-06-13T20:17:30Z : No. of bitstreams: 1 bachiega_tf_me_botfm.pdf: 459615 bytes, checksum: ade6efe273ffa9cabd596ec413f8732b (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Nosso grupo tem se dedicado à investigação das ações biológicas da própolis, alecrim-do-campo, capim-limão e cravo-da-Índia. A própolis tem despertado a atenção dos pesquisadores em virtude de suas inúmeras propriedades biológicas, e o alecrim-do-campo é uma das principais fontes deste apiterápico em nossa região. Já o capim-limão e o cravo-da-Índia têm sido pouco avaliados no tocante à sua ação imunomoduladora. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito imunomodulador do extrato e respectivos compostos isolados da: própolis (ácidos cumárico e cinâmico), do alecrim-do campo (ácido cafeico), do cravo-da-Índia (eugenol) e do capim-limão (citral) sobre a produção de citocinas (IL-1, IL-6 e IL-10) por macrófagos peritoneais de camundongos BALB/c. Em protocolos com LPS, macrófagos foram incubados ora com os produtos naturais supracitados em diferentes concentrações e posteriormente desafiados com LPS; ora desafiados com LPS e posteriormente incubados com os produtos naturais. A dosagem das citocinas foi realizada através da técnica de ELISA. A própolis exerceu ação moduladora sobre a resposta imune e inflamatória, e os ácidos cinâmico e cumárico podem estar envolvidos em sua ação imunomoduladora. O alecrim-do-campo e o ácido cafeico também demonstraram efeito imunomodulador quanto à produção de citocinas. O capim-limão exerceu efeito inibitório sobre a produção de citocinas, sendo este efeito mais pronunciado em ensaios com o citral. Resultados semelhantes foram observados com o cravo-da-Índia e o eugenol. Nossos resultados sugerem que o potencial imunomodulador dos produtos naturais merece ser melhor explorado em futuras investigações, avaliando sua eficiência em doenças inflamatórias / Our group has been investigating the biological action of propolis, “alecrim-do-campo”, lemongrass and clove. Propolis has attracted the researchers’ attention due to its several biological properties, and “alecrim-do-campo” is its main vegetal source in our region. However, little is known concerning lemongrass and clove immunomodulatory action. The goal of this work was to evaluate the immunomodulatory effect of the following extracts and isolated compounds: propolis (coumaric and cinnamic acids), “alecrim-do-campo” (caffeic acid), clove (eugenol) and lemongrass (citral) on cytokines production (IL-1, IL-6 and IL-10) by peritoneal macrophages of BALB/c mice. In LPS protocols, macrophages were incubated either with natural products in different concentrations and then challenged with LPS; or with LPS and then incubated with the natural products. Cytokine concentrations were measured by ELISA. Propolis exerted a modulatory action on the immune and inflammatory response and cinnamic and coumaric acids may be involved in its immunomodulatory action. “Alecrim-do-campo” and caffeic acid also exerted an immunomodulatory action on cytokines production. Lemongrass showed an inhibitory action on cytokines production, mainly in the assays with citral. Similar results were found using clove and eugenol. Our results suggest that the immunomodulatory potential of the natural products should be investigated in further studies, evaluating their efficacy in inflammatory diseases

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-24Bitstream added on 2014-06-13T20:17:33Z : No. of bitstreams: 1 moco_np_me_botfm.pdf: 454787 bytes, checksum: e1174a4016333b9ca192548a5638a090 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Acute chorioamnionitis is a response to microbial infection of the amniotic fluid. The innate immune system constitutes the host’s first line of defense against pathogens and, in this regard, Toll-like receptors (TLRs) are important regulators of such nonspecific response. However, the expression of these receptors in chorioamniotic membranes in pregnancies complicated by chorioamnionitis has not been well established. Objective:The purpose of this study was to examine the localization of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 in fetal membranes and determine whether histologic chorioamnionitis is associated with changes in gene expression of these receptors. One hundred and fifteen chorioamniotic membranes were included in the study. They were collected at the Obstetrics Service of the Botucatu Medical School, São Paulo State University, UNESP, from pregnant women with preterm delivery or term delivery with or without labor. Both groups were stratified on the basis of the presence of histologic chorioamnionitis. Fragments of the chorioamniotic membranes were sent for histopathologic analysis in order to confirm histologic chorioamnionitis. Other membranes fragments measuring 1cm2 were placed into RNA later and submitted to total RNA extraction. After RNA extraction, the samples with concentration between 0.02 and 0.2 g/L of RNA were submitted to cDNA collection for later use in quantifying the expression of TLR-1, TLR-2, TLR-4 and TLR-6 by the real-time PCR technique using the TaqMan® Gene Expression Assays System. All membranes analyzed expressed TLR-1 and TLR-4, whereas 99.1% expressed TLR-2 and 77.4% expressed TLR-6. TLR-1 and TLR-2 expression were statistically higher in the membranes of preterm pregnancies in the presence of chorioamnionitis as compared with preterm membranes in the absence of the inflammatory infiltrate. Among the membranes of term pregnancies, there was... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-24Bitstream added on 2014-06-13T19:16:08Z : No. of bitstreams: 1 koti_kcev_me_botfm.pdf: 845351 bytes, checksum: 779069fdb204c078a3ca2367469b7a84 (MD5) / Secretaria de Saúde do Estado de São Paulo / O objetivo deste estudo foi avaliar as salas de vacinas na rede básica do município de Marília quanto a suas estruturas e processos. Trata-se de um estudo exploratório, observacional, transversal, descritivo com abordagem quantitativa. Foram avaliadas 41 salas de vacinas, sendo 12 unidades básicas de saúde e 29 unidades de saúde da família. Para coleta de dados utilizou-se o instrumento de supervisão em sala de vacinação padronizado pelo Ministério da Saúde, e, foram analisados pelo Programa de Avaliação do Instrumento de Supervisão em Sala de Vacinação disponibilizado pelo Programa Nacional de Imunização (PNI). Vários pontos críticos foram apontados nesta avaliação, estando estes relacionados principalmente com os aspectos gerais da sala de vacina que recebeu conceito regular. Foi atribuído conceito bom ao sistema de rede de frio, vigilância epidemiológica e educação em saúde. O conceito ideal foi atribuído aos procedimentos técnicos, sistema de informação, eventos adversos e imunobiológicos especiais. Em relação aos dados é importante esclarecer que mesmo conceituados dessa forma, pontos críticos foram identificados e merecem atenção especial. Porém, estes não foram suficientemente relevantes para alterar o determinado conceito. Pelos resultados encontrados enfatiza-se que a supervisão proposta pelo PNI visa identificar itens necessários a serem contemplados de acordo com normas propostas. Concluiu-se, pelos dados analisados que há necessidade de se implantar de forma sistemática a atividade de supervisão, monitoramento e avaliação nas salas de vacinas. Além disso, organizar estratégias de educação permanente que provavelmente proporcionarão o desenvolvimento técnico e científico dos profissionais, facilitando assim, a implementação de atividades de promoção à saúde junto à comunidade, com... / The aim of this study was to assess the vaccination rooms in the basic healthcare units from Marília city concerning their facilities and procedures. It’s an investigative, observational, transversal and descriptive study with quantitative approach. 41 vaccination rooms were assessed, from which 12 were basic healthcare units and 29 family healthcare units. The standardized instrument of inspection of the Health Ministry was used to collect the data and they were analysed by the Assessmennt Program of the Inspection Instrumeent in Vaccination Room dispensed by the Immunization National Program (PNI). Several weak points were pointed out at this assessment, mostly issues related to the general aspects of the vaccination rooms, which were assessed as regular. The cold chain, the epidemiologic vigilance and the education on health were assessed as good. Eventually, the technical procedures, the information system, adverse events and special imonobiologics were assessed as ideal. It’s important to clear out that these data, even assessed this way, have weak points and deserve special attention. However, the weak points were not relevant enough to alter the assessment granted. The results found emphasize that the inspection proposed by the PNI aims to identify items which require to be contemplated according to the proposed norms. From the analysed data, it was concluded that it’s necessary to systematically carry out inspection, monitoring and assessment activities in the vaccination rooms. In addition, there’s a need to organize strategies of permanent education which will probably provide the technical and scientifical development of the professionals, thus, making it easier to carry out activities to promote health inside the community with the goal of causing individual changes, aiming the maintenance of the control of imunopredictable diseases in all the society.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-21Bitstream added on 2014-06-13T19:08:43Z : No. of bitstreams: 1 bassetto_cc_me_botib.pdf: 208428 bytes, checksum: c0a49413b34832ecc2265e91d1560b39 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Neste estudo avaliou-se a eficácia de uma vacina constituída de glicoproteínas obtidas da membrana do intestino de Haemonchus contortus em bezerros desafiados com H. contortus ou H. placei. Bezerros holandeses machos, criados livres de infecções por helmintos, foram distribuídos em quatro grupos com nove animais cada. Dois grupos foram vacinados com 50 μg do imunógeno diluído no adjuvante QuilA, enquanto os outros dois grupos foram os controles, receberam apenas adjuvante. A vacina foi administrada três vezes com intervalo de 21 dias entre as aplicações. Os bezerros foram artificialmente infectados sete dias após a última imunização e sacrificados para contagem dos vermes 43 dias depois. Os bezerros de um dos grupos vacinados receberam 8000 larvas infectantes (L3) de H. contortus enquanto os do outro grupo foram infectados com o mesmo número de L3 de H. placei. Os controles foram infectados na mesma ocasião com o mesmo número de L3 de H. contortus ou H. placei. A vacinação reduziu significativamente a contagem de ovos por grama de fezes (OPG) e a carga parasitária (P<0,01). A titulação de anticorpos nos animais controle permaneceu perto de zero enquanto nos animais vacinados verificou-se elevada titulação de anticorpos no soro. Os bezerros vacinados e desafiados com H. contortus não eliminaram ovos nas amostras de fezes, enquanto os controles apresentaram média máxima (± erro padrão) de 61,1 (±42,3) OPG 31 dias após a infecção. A partir deste dia, a contagem de OPG diminuiu progressivamente neste grupo controle com apenas um animal eliminando ovos nas fezes 42 dias após a infecção. Nos controles de H. placei, o ápice na contagem de OPG ocorreu 35 dias após a infecção (61,1 ± 21,7) e permaneceu relativamente constante até o final do estudo, enquanto no grupo vacinado apenas dois animais eliminaram ovos nas fezes, na última coleta. Os animais controle... / This study evaluated the efficacy of a vaccine containing integral membrane glycoproteins from the intestine of Haemonchus contortus in calves challenged with H. contortus or Haemonchus placei. Males Holstein calves, raised worm free, were distributed into four groups with nine animals each. Two groups were vaccinated with 50 μg of antigen diluted on QuilA adjuvant, while the others two groups were the controls and received only adjuvant. The vaccine was administered three times 21 days apart. Either vaccinated or not and challenged with either 8,000 H. contortus or H. placei infective larvae. The calves were challenged 7 days after the last immunization and killed for worm counts 43 days later. Vaccination significantly reduced faecal egg counts (FEC) and worm burdens (P< 0.01). Antibody titres in the calves control stayed close to zero meanwhile in the calves vaccinated was observed high antibody titres in the serum. Calves vaccinated and challenged with H. contortus did not shed eggs in faecal samples, while the controls showed a maximum mean (± standard error) FEC of 61.1 (±42.3) at 31 days post infection. Then, FEC progressively declined in this group with only one animal shedding eggs in faeces 42 days post infection. With H. placei the controls FEC peaked at 35 days post infection (61.1 ±21.7) and remained relatively constant until the end of the study, while in the vaccinated group only two animals shed eggs and only on the last collection date. With H. placei the controls contained a mean of 551.1 (±93.7) parasites, while the vaccinates had 174.4 (±56.3) worms. The establishment rate of H. contortus was lower than that of H. placei (P< 0.01) with an average of 163.9 (±39.4) and 74.4 (±20.4) specimens in the control and vaccinated groups, respectively. It was concluded that vaccination of calves with antigens obtained from H. contortus conferred protection against both H. placei and H. contortus

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-24Bitstream added on 2014-06-13T19:29:04Z : No. of bitstreams: 1 guilherme_grb_me_botfm.pdf: 2588332 bytes, checksum: 8ef4f30634a7a7abfb353bf08791a95c (MD5) / Fundação para o Desenvolvimento Médico e Hospitalar (Famesp) / Secretaria do Estado da Saúde de São Paulo / O sistema imunológico é dividido em imunidade natural e adquirido (humoral e celular). Os linfócitos B são os principais efetores da resposta humoral. Junto aos linfócitos T, mediam diversas reações imunológicas. Todos os leucócitos possuem antígenos de superfície (clusters of differentiation – CD) determinados que possuem as mais diferentes funções. As expressões destes CDs podem variar na maturação e na presença de patologias, sendo as de maior prevalência e gravidade as leucemias e linfomas, tornando-se marcadores importantes que podem ser avaliados por citometria de fluxo ou imunoquímica através do uso de anticorpos monoclonais murinos (AcMm). Após produção dos AcMm é necessário caracterizar e validá-los. Utilizou-se 11 clones que apresentaram especificidade somente contra linfócitos B. Pela técnica de Western Blotting, 5 anticorpos (3 do tipo IgM e 2 do tipo IgG) foram escolhidos de acordo com sua possível especificidade e importância clínica. A validação dos anticorpos tipo IgM foi realizada por citometria de fluxo utilizando anticorpo comercial para comparação de quantidade de células marcadas, sendo testados em 20 amostras de indivíduos normais e 20 de indivíduos portadores de neoplasias hematológicas diversas. O LINB B, que foi comparado com o anti-CD171 e anti-CD45RA, apresentando diferença estatística somente em relação ao anti-CD45RA, e identidade com o anti-CD171. O LINB C, que foi comparado com o anti-CD20 e anti-CD19, não apresentou diferença estatística significante quando frente a ambos anticorpos comerciais. No teste de regressão linear, houve maior correlação dos resultados com o anti-CD19. O LINB E foi comparado somente contra o anti-CD107b, havendo grande identidade entre os dois. Dos resultados apresentados, conclui-se que o LINBs B e E apresentam grandes chances de serem específicos contra... / The immunological system is divided into: natural immunity and acquired immunity (celular and humoral responses). The B lymphocytes are the main effectors of the humoral response. Together with the T lymphocytes, they make several immunological reactions. All leucocytes have antigens on the surface (clusters of differentiation – CD) that possess lot of functions. The expressions of these CDs may be altered during maturation and pathologies, like leukemia and lymphomas, becoming important markers that can be evaluated by flow cytometry or immunochemistry thought murine monoclonals antibodies (Mab). After production of Mabs it´s necessary characterize and validated them. We used 11 clones that presented Mab against B lymphocytes only. By Western Blotting method 5 Mab (3 IgM and 2 IgG) were chosen according you possible especifity and clinical importance. The validation of IgM Mabs were made by flow cytometry using commercial antibody to compare the quantity of marked cells, being used 20 samples from normal people and 20 samples from person with hematological cancer. The LINB B, compared to anti-CD171 and anti-CD45RA, presented statistical difference from anti-CD45RA and identity to anti-CD171. The LINB C, compared to anti-CD19 and anti-CD20, didn´t presented any statistical difference from both commercial antibodies, although it correlates better with anti-CD19. The LINB E was compared to anti-CD107b, where it appears great identity between then. By the present results, we conclude that LINB B and E need multicentre studies to expand validation, and LINB C, needs to increase the samples to have a statistical validation. The two IgGs LINB, possible anti-CD138, weren´t test yet.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-27Bitstream added on 2014-06-13T19:08:59Z : No. of bitstreams: 1 sodre_lp_me_botfm.pdf: 1339623 bytes, checksum: ed335773fb6c0b581fc33a31e3612a6e (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Anticorpos monoclonais (AcMm) são imunoglobulinas produzidas por engenharia celular através da fusão de células tumorais com linfócitos B provenientes de organismos previamente imunizados contra o antígeno de interesse. As células recém criadas recebem a denominação de hibridomas, crescem indefinidamente em cultura por agregar características de imortalidade das células tumorais. A tecnologia de monoclonais compreende etapas seriadas, incluindo imunização, fusão, screening, clonagem, caracterização de especificidade dentre outras. O CD45 é um marcador expresso na superfície de todos os leucócitos humanos: linfócitos, eosinófilos, monócitos, basófilos e neutrófilos sendo, o maior componente da membrana de linfócitos, o que aumenta a probabilidade de obtenção de AcMm com este perfil em protocolos de imunização com linfócitos. Este marcador é amplamente utilizado em diagnóstico por citometria de fluxo, no acompanhamento de pacientes HIV+, na classificação de leucemias e linfomas, quantificação de células CD34+ para transplantes de medula óssea e, também em imunohistoqu ímica auxiliando na subtipagem das neoplasias, principalmente linfomas (Hodgkin, não Hodgkin e outras categorias) e leucemias de células B e T. Assim, este trabalho teve por objetivo a caracterização de anticorpo monoclonal anti-CD45 desenvolvido in house e validação deste em aplicações diagnósticas envolvendo citometria de fluxo e imunohistoqu ímica, comparando-o com anticorpos monoclonais comerciais, visando minimização dos custos dessas técnicas. Foram utilizadas 50 amostras de sangue excedente de doadores para o grupo controle e 48 amostras de sangue de pacientes HIV+ para validação do AcMm em citometria de fluxo e analisados 114 fragmentos em lâmina de Tissue Microarray - TMA provenientes de 38 amostras de amígdalas para validação do AcMm em imunohistoqu ímica... / Monoclonal antibodies (mAb) are immunoglobulins produced by cell engineering through fusion of tumor cells and B lymphocytes from organisms previously immunized against the antigen of interest, generating thus hybridomas that indefinitely grow in culture since they aggregate immortality characteristics of tumor cells capable of secreting antibodies. The production of such antibodies consists of sequential steps, including immunization, fusion, screening, cloning, and specificity characterization. CD45 is a marker expressed in the surface of all human leukocytes: lymphocytes, eosinophils, monocytes, basophils, and neutrophils. Besides, CD45 is the major component of lymphocyte membranes, which increases the probability of obtaining mAb presenting such profile in immunization procedures using lymphocytes. This marker has been widely used in diagnosis through flow cytometry, besides monitoring of HIV+ patients, classification of leukemia and lymphomas, quantification of CD34+ cells for bone marrow transplantation, and also in immunohistochemistry, helping in subtyping of neoplasms, mainly lymphomas (Hodgkin s, non-Hodgkin and other categories) and B- and T-cell leukemia. Thus, this work aimed to characterize the in-house-developed anti-CD45 monoclonal antibody besides its validation in diagnostic applications involving flow cytometry and immunohistochemistry through comparison with commercial monoclonal antibodies in order to reduce the costs of such techniques. Fifty samples of extra blood from donors were used in the control group, and 48 blood samples from HIV+ patients were used for mAb validation in flow cytometry. For mAb immunohistochemical validation, 114 fragments from 38 amygdala samples were analyzed in a Tissue Microarray - TMA slide. In flow cytometry, the commercial anti-CD45 and the likely in-house-obtained anti-CD45 (LINB5 clone) did not significantly differ concerning cell... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-02-21Bitstream added on 2014-06-13T19:51:38Z : No. of bitstreams: 1 cezario_gag_me_botfm.pdf: 488938 bytes, checksum: 0f674e5f7e12d7ce0a1eabedb5c6a4bb (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Toll-like receptors (TLRs) present in innate immune cells recognize pathogen molecules and influence on immunity to control the host-parasite interaction. Our objective was to evaluate the mRNA expression of TLR-2 and 4, expression and production of IL-12, IFN-γ, TNF-α, IL-17, IL-10 and TGF-β and NO production during infection with Leishmania chagasi and correlate TLR2 and 4 expressions with cytokines production and NO. Infection resulted in increased TLR2, TLR4, IL-17, TNF-α and TGF-β expression at the beginning of infection, with a decrease at the final phase in according the parasitic load; IFN- γ and IL-12 decreased at the peak of parasitemia and increased at the final phase; IL-10 increased during the whole period under analysis. With respect to cytokines and NO production, TGF-β, TNF-α and IL-17 showed high rates at the initial phase, and IFN-γ and IL-12 showed high rates at the final phase; IL-10 and NO showed increasing production during the infection period evaluated. There was a positive correlation of TLR2 and 4 with TNF-α, IL-17, NO, IL-10 and TGF-β at the beginning of infection, and with TNF-α, IL-17 and TGF-β at the end. Our data suggest that L. chagasi was in contact with host’s cells via TLR2 and 4, which resulted in cytokine modulation. This interaction could be considered as pathogenic mechanism in visceral leishmaniasis

Made available in DSpace on 2016-01-15T01:06:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000477038-Texto+Parcial-0.pdf: 6357992 bytes, checksum: 7d2cbe20d0b95a3897695c3c5ed15c28 (MD5) Previous issue date: 2015 / Background: Invariant natural killer T (iNKT) cells play complex functions in the immune system, releasing both Th1 and Th2 cytokines. The role of iNKT cells in human asthma is still controversy and never described in severe therapy asthmatic children (STRA).Objective: To analyse iNKT frequency in peripheral blood of children with severe therapy-resistant asthma (STRA), comparing with children with milder asthma and healthy controls. Methods: This is a case-control study where blood was collected from asthmatic children (n=136) (milder and STRA) and healthy controls (n=40). Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated, stained with anti-CD3 and anti-iNKT (Vα24Jα18), and analysed through flow cytometry. Atopic status was defined by measuring specific IgE in serum. Airway inflammation was assessed through induced sputum. Results: Children with asthma (n = 136) presented an increased frequency of CD3+iNKT+ cells (mean 2. 31% SD 4. 41), compared to healthy controls (n = 40) (mean 0. 48% SD 0. 79) (p = 0. 02). Mild-asthmatic children (n = 99) showed an increased frequency of iNKT cells (2. 65% SD 4. 91; p = 0. 002) compared to STRA (n = 11) (2. 05% SD 1. 62). STRA children have shown an increase frequency of iNKT cells (2. 05% SD 1. 62) than controls (0. 48% SD 0. 79; p = 0. 002). The number of iNKT cells was not different between atopic (n = 127) and non-atopic (n = 45) children. In addition, iNKT cells were not associated with any inflammatory pattern of induced sputum studied classified as eosinophilic (n = 18), neutrophilic (n = 23), mixed (n = 31) (eosinophilic and neutrophilic) and paucigranulocytic (n = 5). However, iNKT cell numbers were not associated with any airway inflammatory pattern (p=0. 09)Conclusion and Clinical Relevance: Our data suggested a role to iNKT in paediatric asthma since it increased in asthmatic children; however these cells are not associated with atopic status or with the more severe spectrum of the disease. / Introdução: Células invariante de células NK (iNKT) desempenham funções complexas no sistema imune, liberando citocinas do tipo Th1 e Th2. O papel das células invariante de células NK (iNKT) na asma em humanos ainda é controverso e nunca foi descrito em crianças com asma grave resistente à terapia (AGRT).Objetivo: Analisar a frequência de células iNKT no sangue periférico de crianças com asma grave resistente à terapia (AGRT), comparando com crianças com asma leve e controles saudáveis.Métodos: Este é um estudo de caso-controle onde foi coletado sangue de crianças asmáticas com asma leve e AGRT (n=136) com idade entre 11. 01±1. 69 e controles saudáveis (n=40) com idade entre 11. 21±1. 16 anos. A fração mononuclear do sangue periférico (PBMC) foi isolada, marcada com anti-CD3+ e anti-iNKT (Vα24Jα18) e analisada no citômetro de fluxo. A atopia foi definida através da medição dos níveis plasmáticos de IgE. A inflamação das vias aéreas foi avaliada através da expectoração induzida. Resultados: As crianças com asma (n = 136) apresentaram um aumento da frequência de células iNKT+CD3+ (média: 2. 31%±4. 41), quando comparadas com os controles saudáveis (n=40) (média: 0. 48%±0. 79 p=0. 02). Crianças com asma leve (n = 99) apresentaram um aumento da frequência de células iNKT (2. 65%±4. 91; p = 0. 002) quando comparadas com as crianças com AGRT (n = 11) (2. 05%±1. 62). Crianças com AGRT mostraram uma aumento da frequência das células iNKT (2. 05%±1. 62) quando comparadas com os controles saudáveis (0. 48%±0. 79; p = 0. 002). O número de células iNKT não foi diferente entre atópicos (n = 127) e não-atópicos (n = 45), com média de 2. 25% ± 4. 55 e 1. 01% ± 1. 46 respectivamente. Além disso, as células iNKT não foram associadas com nenhum padrão inflamatório (eosinofílico n = 18; neutrofílico n = 23; misto n = 31; paucicelular n = 5) estudado no escarro induzido (p=0. 09).Conclusão e Relevância Clíncia: Nossos dados sugerem que as células iNKT desempenham um papel na asma pediátrica, uma vez que estava aumentada nas crianças asmáticas; entretanto, essas células não estão associadas com a atopia ou com o espectro mais severo da doença.