Abstract In pathologies of the ascending aorta or in congenital heart defects, circulation may be temporarily halted during surgical intervention. This is achieved by operating under deep hypothermic circulatory arrest or under hypothermia combined with isolated perfusion techniques. For deep hypothermic circulatory arrest (DHCA), the patient is cooled below 18°C using an extracorporeal heart-lung machine, and circulation and breathing are stopped. The advantage of hypothermia is that it decreases oxygen and glucose consumption and provides the surgeons the time required to repair complex heart defects. However, there is still a relatively high risk of neurological complications that can affect the quality of life of patients and their families. One of the methods to mitigate ischaemia-reperfusion injury is remote ischaemic preconditioning. In this work, the neuroprotective mechanisms of remote ischaemic preconditioning (RIPC) were studied in acute and surviving chronic animal models. In study I, we used an acute model, and studied the effects of RIPC in cerebral microcirculation using an intravital microscope and samples analysed by transmission electron microscope. In study II, a chronic model was used to evaluate whether the effects of remote ischaemic preconditioning can be seen in the markers of oxidative stress or in redox-regulating enzymes. Study III was conducted to supplement the findings of study II, considering the markers of oxidative stress. Findings in all studies were consistent with one another. Study I showed the effect of remote ischaemic preconditioning on leukocyte activation and adhesion to cerebrocortical vessels in piglets after prolonged DHCA. Additionally, cellular preservation of endoplasmic reticulum was present in transmission electron microscope analysis of the central nervous system. In studies II and III, the remote ischaemic preconditioning lowered markers of ischaemia-reperfusion-related oxidative stress. In study III the remote ischemic preconditioning lowered oxidative stress already during cardiopulmonary bypass. / Tiivistelmä Hoidettaessa nousevan aortan sairauksia ja synnynnäisiä sydänvikoja verenkierto voidaan tilapäisesti pysäyttää kirurgisten toimenpiteiden ajaksi. Tämä saavutetaan jäähdyttämällä elimistö verenkierron pysäytyksen ajaksi tai jäähdytettynä isoloitujen perfuusiotekniikoiden avulla. Potilas jäähdytetään alle 18 °C lämpötilaan käyttäen kehonulkoista sydän-keuhkokonetta, minkä jälkeen verenkierto ja hengitys voidaan väliaikaisesti pysäyttää. Elimistön viilentäminen vähentää hapen ja glukoosin kulutusta ja antaa kirurgeille aikaa korjata monimutkaisia sydänsairauksia. Verenkierron pysäytyksestä ja palauttamisesta voi ilmaantua keskushermostoon iskemia-reperfuusiovaurioita, mitkä vaikuttavat potilaiden ja heidän läheistensä elämänlaatuun. Esialtistava raajaiskemia on yksi tutkituista menetelmistä lieventää iskemia-reperfuusiovauriota. Tässä työssä esialtistavan raajaiskemian hermostoa suojaavia mekanismeja tutkittiin akuutilla ja kroonisilla koe-eläinmalleilla. Tutkimuksessa I tutkimme esialtistavan raajaiskemian vaikutuksia aivojen mikroverenkiertoon kuvaamalla aivojen pintaverisuonia mikroskoopilla, ja hermosoluihin käyttäen läpäisyelektronimikroskooppia. Tutkimuksessa II kroonisella mallilla tutkittiin voiko esialtistavan raajaiskemian vaikutuksia nähdä oksidatiivisen stressin määrässä tai hapetus-pelkistys reaktioita säätelevissä entsyymeissä. Kolmas tutkimus tehtiin toisen tutkimuksen päätelmien täydentämiseksi mitaten oksidatiivista stressiä. Kaikkien osatöiden löydökset olivat keskenään johdonmukaisia. Ensimmäisessä osatyössä esialtistava raajaiskemia vaikutti leukosyyttiaktivaatioon ja leukosyyttien tarttumiseen aivojen pintaverisuoniin pidennetyn hypotermisen verenkierron seisautuksen jälkeen. Myös hermosolujen sisäisten soluelinten säilyminen näkyi läpäisyelektronimikroskoopilla raajaiskemiaryhmällä. Tutkimuksissa II ja III esialtistava raajaiskemian todettiin alentavan iskemia-reperfuusion aiheuttamaa oksidatiivista stressiä, jonka todettiin tapahtuvan/alkavan jo sydän-keuhkokoneen käytön aikana tutkimuksen III perusteella.

Accumulation of osmotically active metabolites, which create an osmotic gradient estimated at ∼60 mOsM, and cell swelling are prominent features of ischemic myocardial cell death. This study tests the hypothesis that reduction of ischemic swelling by enhanced cell volume regulation is a key mechanism in the delay of ischemic myocardial cell death by ischemic preconditioning (IPC). Experimental protocols address whether: (i) IPC triggers a cell volume regulation mechanism that reduces cardiomyocyte swelling during subsequent index ischemia; (ii) this reduction in ischemic cell swelling is sufficient in magnitude to account for the IPC protection; (iii) the molecular mechanism that mediates IPC also mediates cell volume regulation. Two experimental models with rabbit ventricular myocytes were studied: freshly isolated pelleted myocytes and 48-h cultured myocytes. Myocytes were preconditioned either by distinct short simulated ischemia (SI)/simulated reperfusion protocols (IPC), or by subjecting myocytes to a pharmacological preconditioning (PPC) protocol (1 μM calyculin A, or 1 μM N6-2-(4-aminophenyl)ethyladenosine (APNEA), prior to subjecting them to either different durations of long SI or 30 min hypo-osmotic stress. Cell death (percent blue square myocytes) was monitored by trypan blue staining. Cell swelling was determined by either the bromododecane cell flotation assay (qualitative) or video/confocal microscopy (quantitative). Simulated ischemia induced myocyte swelling in both the models. In pelleted myocytes, IPC or PPC with either calyculin A or APNEA produced a marked reduction of ischemic cell swelling as determined by the cell floatation assay. In cultured myocytes, IPC substantially reduced ischemic cell swelling (P < 0.001). This IPC effect on ischemic cell swelling was related to an IPC and PPC (with APNEA) mediated triggering of cell volume regulatory decrease (RVD). IPC and APNEA also significantly (P < 0.001) reduced hypo-osmotic cell swelling. This IPC and APNEA effect was blocked by either adenosine receptor, PKC or Cl- channel inhibition. The osmolar equivalent for IPC protection approximated 50-60 mOsM, an osmotic gradient similar to the estimated ischemic osmotic load for preconditioned and non-preconditioned myocytes. The results suggest that cell volume regulation is a key mechanism that accounts for most of the IPC protection in cardiomyocytes.

Introdução: O trauma é um fenômeno que cursa com lesão tecidual, sendo que o trauma cirúrgico (TC) apresenta a referida lesão como consequência de um ato cirúrgico. A isquemia seguida de reperfusão (IR) é um evento comum em várias condições patológicas, bem como em diversos procedimentos cirúrgicos, principalmente transplantes. É frequente o desenvolvimento de lesões teciduais locais e remotas após trauma e após a I/R, parte de um fenômeno conhecido como síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SRIS), frequentemente seguida pela falência de múltiplos órgãos (FMO). Estudos provaram o envolvimento do neutrófilo em tais síndromes como resultado da ação de enzimas proteolíticas secretadas a partir de grânulos citoplasmáticos, radicais livres produzidos por explosão respiratória e citocinas liberadas após a infiltração nos tecidos. Nesse contexto, foi provado que o pré-condicionamento isquêmico (PCI), definido como curtos episódios de isquemia precedendo a IR, protege contra essas lesões, com menor ativação de neutrófilos. No entanto, o conhecimento a respeito dos mecanismos operantes nos neutrófilos após o trauma cirúrgico, a isquemia seguida de reperfusão ou o pré-condicionamento isquêmico, ainda são preliminares. Objetivo: Analisar com maior profundidade o impacto dessas condições (TC, IR e PCI) no proteoma e fosfoproteoma do neutrófilo. Métodos: Foi realizada a análise de parâmetros hematológicos juntamente com a análise proteômica e fosfoproteômica de neutrófilos de ratos submetidos a TC, IR e PCI, comparados ao grupo controle. A análise proteômica foi realizada em sistema de nLC-MS/MS orbitrap de alto desempenho, usando marcação com iTRAQ, enriquecimento de fosfopeptídios e pré-fracionamento por HILIC. A análise estatística baseada em clusters utilizando scripts em R mostrou proteínas com abundância relativa diferencial em todas as condições. Resultados: A avaliação dos parâmetros hematológicos antes e depois de TC, IR e IPC demonstrou alterações no número, forma e tamanho de linfócitos, hemácias, plaquetas e, principalmente, neutrófilos (granulócitos). Observou-se um claro aumento na contagem de neutrófilos após TC e IR, sendo que tal aumento foi prevenido pelo PCI. Um total de 393 proteínas foram determinadas como reguladas para abundância relativa entre o grupo controle e o grupo TC. A maioria das proteínas encontradas como reguladas em comum nos grupos TC e IR estão relacionadas à apoptose (caspase-3), motilidade celular (PAK2), transdução de sinal (IL-5, IL-6 e TNF) e degradação pelo sistema proteassoma no neutrófilo. Maior produção de espécies reativas de oxigênio e disfunção da migração direcional de neutrófilos (PKC-delta) com aumento do tempo de vida dos neutrófilos são eventos iniciais importantes que podem resultar em mais dano tecidual e em infecção. A análise proteômica de neutrófilos de ratos após PCI levou à identificação de 2437 grupos de proteínas atribuídos a 5 clusters diferentes, contendo proteínas de abundância relativa significativamente aumentada ou diminuída em IR e PCI. O estudo de vias desses clusters baseado no KEGG revelou aumento nas vias de fagocitose mediada por Fc-gama R, sinalização por quimiocinas, adesão focal e migração transendotelial, citoesqueleto de actina, metabolismo e diminuição nas vias ribossomais, de transporte de RNA, de processamento de proteínas. A regulação da fosforilação de proteínas após IR e PCI mostrou algumas vias como quimiocinas, Fc-gama, GPCR, migração celular e vias pró e antiapoptóticas, sendo que a via de splicing alternativo foi a que apresentou regulação mais evidente (p < 0.0001). A regulação da abundância, bem como da fosforilação, presença de motivos e de domínios levou à identificação de fosfatases, como Fgr, GRK2, PKC delta, ptpn6 e ptprc reguladas por IR, bem como stk38, pkn1, syk e inpp5d reguladas por PCI. A interação mais marcante entre proteínas foi demonstrada como sendo entre os receptores de Fgr e Ptp. Conclusão: Concluímos que as alterações causadas por TC, IR e PCI levaram a intenss alterações na abundância de algumas proteínas e em eventos de fosforilação em neutrófilos, levando ao efeito destrutivo observado após a IR e ao efeito protetor consequente ao PCI / Introduction: Trauma is a phenomenon that involves tissue injury, whereas the surgical trauma (ST) has such injury as a consequence of a surgery. Ischemia reperfusion is common event in many surgical procedures, especially in transplants, as well as in many pathological conditions. Local and remote tissue injuries usually develop after trauma and ischemic reperfusion, part of a phenomenon known as systemic inflammatory response syndrome, frequently followed by multiple organ failure (MOF). Studies have proven the involvement of the neutrophil in all these injuries as a result of proteolytic enzymes secreted from cytoplasmic granules, free radicals produced by respiratory burst, cytokines released after tissue infiltration. In that context, ischemic preconditioning (IPC), that are short episodes of ischemia before ischemia reperfusion, was proved to be protective against these injuries with less activation of neutrophils. However the knowledge about the underlying mechanism operating in the neutrophil after surgical trauma, ischemia reperfusion and preconditioning is preliminary. Objective: To deeply analyze the impact of these conditions (ST, IR and IPC) on the neutrophil proteome and phosphoproteome. Methodology: We did hematological analysis along proteomics and phospho proteomics through high throughput nLC-MS/MS analysis by orbitrap using iTRAQ labeling, phospho peptide enrichments, and HILIC pre-fractionation. Neutrophils from control, ST, IR and IPC conditions after extraction were processed for proteomic analysis. Statistical package using R based on cluster analysis led to the detection of differentially regulated proteins in all conditions. Results: The evaluation of the hematological parameters before and after ST, IR or IPC on blood cells stated alteration in size, number and shape of lymphocytes, RBCs, platelets and specially neutrophils (granulocytes). In the analysis, a clear increase in neutrophil count after ST and IR with such increase prevented by IPC. A total of 393 proteins were found differentially regulated between control and trauma groups. Most of the common proteins found regulated in trauma and IR seem to be related to apoptosis (caspase-3), cell motility (PAK2) and signal transduction in IL5, IL6 and TNF and proteasomal degradation in neutrophil. Higher oxygen species production and dysfunction of directional neutrophil migration (PKC delta) with increase in the life span of neutrophils are early important events that can finally result into more tissue damage and infection. The total proteomic analysis of rat neutrophils after IPC led to the identification of 2437 protein groups assigned to five different clusters with significantly up and downregulated proteins in IR and IPC. Cluster based KEGG pathways analysis revealed up-regulation of chemokine signaling, focal adhesion, leukocyte transendothelial migration, actin cytoskeleton, metabolism and Fc gamma R mediated phagocytosis, whereas downregulation in ribosome, spliceosome, RNA transport, protein processing in endoplasmic reticulum and proteasome, after intestinal ischemic preconditioning. The phosphoregulated proteins containing domains and motifs in the regulated peptides after IR and IPC led to the identification of some of important players such as chemokine, Fc gamma, GPCR, migration and pro/anti-apoptotic pathways. The phosphoproteins from alternative splicing was the pathway presenting the most remarkable regulation with a p-value of 0.0001. The regulation in expression as well as in phosphorylation, the presence of motifs and domains led to the identification of kinases and phosphatases including Fgr, GRK2, PKC delta, ptpn6 and ptprc in neutrophils after IR whereas stk38, pkn1, syk, and inpp5d in neutrophil due to IPC. The highest protein-protein interaction was shown by Fgr and Ptp receptors. Conclusion: We concluded that the changed stimulus produced after ST, IR and IPC led to the huge alteration in proteins expression and phosphorylation events in the neutrophil proteome as mentioned in our work, that leads to final destructive and protective phenotype of neutrophils respectively

Eventos isquêmicos seguidos por reperfusão levam ao dano celular e mitocondrial devido à abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (TPM). Todavia, o pré-condicionamento evita o dano celular por isquemia e reperfusão. Esse efeito protetor é semelhante ao obtido pela abertura do canal mitocondrial de potássio sensível a ATP (mitoKATP). Aqui, nós mostramos os mecanismos de sinalização que ativam o mitoKATP durante o pré-condicionamento, o papel redox destes canais e seu conseqüente mecanismo protetor. Usando células cardíacas HL-1, nós demonstramos que aumentos em espécies reativas de oxigênio (EROs) observadas durante o pré-condicionamento não foram revertidos por antagonistas do mitoKATP, que significativamente evitaram a proteção pelo pré-condicionamento. Isso sugere que essas espécies são formadas anteriormente à abertura do canal. Consistente com essa hipótese, a adição de catalase a corações perfundidos de rato e a células HL-1 promove reversão dos efeitos benéficos do pré-condicionamento, mas não do diazóxido (um agonista do mitoKATP). Por outro lado, 2-mercaptopropionil glicina preveniu a cardioproteção em ambos os casos, sugerindo que este composto deve apresentar outros efeitos além de antioxidante. De fato, verificamos que agentes redutores tiólicos interferem na ativação do mitoKATP mediada pelo diazóxido em mitocôndrias isoladas de coração de rato. Examinando como o mitoKATP pode ser ativado durante o pré-condicionamento, constatamos que EROs endógenas e exógenas fortemente ativaram o mitoKATP, sugerindo que o moderado aumento nas EROs durante o pré-condicionamento pode ativar esse canal. Uma vez ativado, o canal preveniu as condições (captação de Ca2+ e formação de EROs) que favorecem a ocorrência de TPM em situação de isquemia. A atividade deste canal também leva à diminuição de EROs gerados fisiologicamente ou durante períodos de isquemia e reperfusão, evitando o dano celular conseqüente. Este fato não envolveu nenhum aumento nos sistemas de remoção de oxidantes. Por outro lado, a inibição da TPM, usando ciclosporina A, preveniu o estresse oxidativo somente durante a reperfusão, mas protegeu as células de maneira indistinguível da abertura do mitoKATP. Juntos, nossos resultados sugerem que o mitoKATP age como um sensor para as EROs que diminui a sua geração em resposta a níveis aumentados de oxidantes. Em conseqüência, estes canais regulam o balanço redox em condições fisiológicas e previnem o estresse oxidativo em condições patológicas, inibindo com isso a ocorrência de TPM e morte celular isquêmica. / Ischemia followed by reperfusion results in impairment of cellular and mitochondrial functionality due to opening of mitochondrial permeability transition (MPT) pores. Nevertheless, preconditioning rescues cells from ischemic damage. Mitochondrial ATP-sensitive K+ channel (mitoKATP) opening also prevents cardiac ischemic cell death. Here we show the signaling mechanisms that activate mitoKATP during preconditioning, the redox role of these channels and consequent protective mechanisms. Using cardiac HL-1 cells, we found that increases in reactive oxygen species (ROS) observed during preconditioning were not inhibited by mitoKATP antagonists, although these drugs significantly avoided the protection afforded by preconditioning, suggesting their activation occurrs upstream of channel activity. Consistent with this, catalase addition to perfused rat hearts and HL-1 cells reversed the beneficial effects of preconditioning, but not of diazoxide (a mitoKATP agonist). On the other hand, 2-mercaptopropionylglycine prevented cardioprotection in both cases, suggesting this compound may present effects other than scavenging ROS. Indeed, thiol reducing agents impaired diazoxide-mediated activation of mitoKATP in isolated rat heart mitochondria. We found that endogenous or exogenous ROS strongly enhanced mitoKATP activity, suggesting that moderate increments in ROS release during preconditioning may activate mitoKATP. Furthermore, mitoKATP prevented conditions (Ca2+ uptake and ROS formation) that favor the opening of MPT pores under ischemic conditions. MitoKATP opening decreased ROS generation physiologically and during both ischemia and reperfusion, consequently avoiding cellular damage. This prevention does not involve an increase in oxidant removal systems. On the other hand, the inhibition of MPT, using cyclosporin A, prevented oxidative stress only during simulated reperfusion, but protected cells in a manner indistinguishable from mitoKATP opening. Collectively, our results suggest that mitoKATP acts as a ROS sensor that decreases mitochondrial ROS generation in response to enhanced local levels of oxidants. As a result, these channels regulate mitochondrial redox state under physiological conditions and prevent oxidative stress under pathological conditions, inhibiting MPT opening and ischemic cardiac damage.

INTRODUÇÃO: Pré-condicionamento isquêmico remoto (PCIR) é o fenômeno pelo qual curtos períodos de isquemia sub-letal sobre um órgão ou tecido, intercalados com reperfusão do mesmo, conferem a outros órgãos ou tecidos distantes deste, um aumento na capacidade da resistir a episódios subsequentes de isquemia, a qual os mesmos possam ser expostos. Com base nesse fato, testamos a hipótese de que o pré-condicionamento isquêmico remoto em pacientes portadores de claudicação intermitente de membros inferiores poderia aumentar a capacidade de deambulação desses pacientes, extrapolando o conceito do PCIR de aumento da capacidade de preservação da integridade celular frente à isquemia, para a manutenção da função celular, tornando a célula mais apta ao trabalho em situações de privação de oxigênio, geradas pela restrição do fluxo sanguíneo, como ocorre nos pacientes com claudicação intermitente de membros inferiores, durante o exercício. OBJETIVOS: Avaliar se o PCIR aumenta a distância de início de claudicação e/ou a distância total de claudicação em pacientes com doença arterial obstrutiva periférica. MÉTODOS: Foram estudados 52 pacientes ambulatoriais que apresentavam queixa de claudicação intermitente dos membros inferiores, associada a um pulso arterial ausente ou reduzido no membro sintomático e/ou um índice tornozelo-braço <0,90. Estes pacientes foram randomizados em três grupos (A, B e C). Todos os pacientes foram submetidos a dois testes de caminhada em esteira de acordo com o protocolo de Gardner. O grupo A fez o primeiro teste de esteira sem o pré-condicionamento isquêmico remoto e, após 7 dias, foi submetido a um novo teste de esteira, agora precedido pelo pré-condicionamento isquêmico remoto. O grupo B foi submetido ao pré-condicionamento isquêmico remoto antes do primeiro teste de esteira e, após 7 dias, realizou novo teste de esteira, agora sem o pré-condicionamento isquêmico remoto. Já no Grupo C (grupo controle), ambos os testes de esteira foram realizados sem pré-condicionamento isquêmico remoto, também com 7 dias de intervalo. RESULTADOS: Os grupos A e C mostraram um aumento na distância de início de claudicação, no segundo teste, em comparação com o primeiro teste. O grupo A teve um aumento estatisticamente significativo, em relação ao grupo C (grupo controle). Com relação à distância total de claudicação, todos os grupos (A, B e C), mostraram um aumento estatisticamente significativo a favor do segundo teste, porém não foi observada diferença entre os grupos (A, B e C). CONCLUSÕES: O pré-condicionamento isquêmico remoto aumentou a distância inicial de claudicação em pacientes com claudicação intermitente, no entanto, ele não afetou a distância total de claudicação dos pacientes portadores de claudicação intermitente de membros inferiores / INTRODUCTION: Remote ischemic preconditioning (RIPC) is a phenomenon in which a short period of sub-lethal ischemia in one organ protects against subsequent bouts of ischemia in another organ. Extrapolating the RIPC concept of increasing the preservation of cell integrity capability against ischemia, for the maintenance of cellular function, making the cell more able to work in oxygen deprivation generated by the restriction of blood flow, as occurs in patients with intermittent claudication of the lower limbs during exercise, we hypothesized that RIPC in patients with intermittent claudication would increase muscle tissue resistance to ischemia, thereby resulting in an increased ability to walk. OBJECTIVES: To test this hypothesis, we performed gait tests in patients with claudication with and without prior RIPC and then compared the initial claudication distance (ICD) and the total walking distance (TWD). METHODS: In a claudication clinic, 52 ambulatory patients who presented with complaints of intermittent claudication in the lower limbs associated with an absent or reduced arterial pulse in the symptomatic limb and/or an ankle-brachial index < 0.90 were recruited for this study. The patients were randomly divided into three groups (A, B and C). All of the patients underwent two tests on a treadmill according to the Gardener protocol. Group A was tested first without RIPC. Group A was subjected to RIPC prior to the second treadmill test. Group B was subjected to RIPC prior to the first treadmill test and then was subjected to a treadmill test without RIPC. In Group C (control group), both treadmill tests were performed without RIPC. The first and second tests were conducted seven days apart. Brazilian Clinical Trials: RBR-7TF6TM. RESULTS: Group A and C showed an increase in the initial claudication distance in the second test compared to the first test. Group A had a statistically significant increase, compared with C group (control group). With respect to total claudication distance, all the groups (A, B and C) showed a statistically significant increase in favor of the second test, but there was no difference between groups (A, B and C). CONCLUSIONS: RIPC increased the initial claudication distance in patients with intermittent claudication; however, RIPC did not affect the total walking distance of the patients

O pré-condicionamento isquêmico (PCI) é um importante mecanismo de proteção celular, capaz de favorecer a diminuição da necrose dos cardiomiócitos durante isquemia aguda. Fármacos hipoglicemiantes orais, tais como glibenclamida e repaglinida, podem provocar a perda dessa proteção por sua propriedade bloqueadora de canais de potássio dependentes de adenosina trifosfato (K-ATP). Já a vildagliptina, pertencente à classe dos inibidores da enzima dipeptidil peptidase 4 (DPP-4), exerce seus efeitos sobre a glicemia principalmente via hormônio peptídeo-1 tipo glucagon (GLP-1). Receptores de GLP-1 estão presentes no miocárdio e seu papel nesse tecido é alvo de investigadores. Este estudo avaliou o efeito da vildagliptina sobre o pré-condicionamento isquêmico em portadores de diabetes mellitus 2 (DM2) e doença coronariana multiarterial estável (DAC). Foram admitidos 54 pacientes diabéticos com doença multiarterial coronariana estável, documentada pela angiografia e com teste ergométrico positivo para isquemia. Na fase 1, betabloqueadores e fármacos hipoglicemiantes orais foram suspensos por 7 dias, e todos paciente foram submetidos a 2 testes ergométricos (TE) seguenciais, com intervalo de descanso de 30 minutos entre eles (TE1 e TE2). Para a fase 2, os pacientes receberam vildagliptina 100mg/dia por 7 dias consecutivos e foram submetidos a mais 2 TE seguenciais (TE3 e TE4). Na fase 1, todos os pacientes desenvolveram isquemia esforço induzida (depressão de ST>=1 mm) no TE1. O tempo para alcançar 1,0mm de depressão do segmento ST (T-1,0mm) em TE2 foi maior que em TE1, caracterizando a presença do PCI em todos os pacientes. Na fase 2, todos desenvolveram isquemia em TE3, e 76% apresentaram isquemia mais tardia em TE4, isto é, aumentaram a tolerância miocárdica em TE4 em comparação a TE3, caracterizando PCI preservado (p<0,001). Somente 24% dos pacientes revelaram bloqueio do PCI (p=0,006). A vildagliptina preservou o pré-condicionamento isquêmico em pacientes com DM2 e DAC. / Ischemic preconditioning (IPC) refers to the phenomenon in which short periods of myocardial ischemia and reperfusion promote resistance to a subsequent prolonged ischemic insult. Some hypoglycemic drugs, such as glibenclamide and repaglinide, are able to inhibit this protective phenomenon probably by its effects as blockers of adenosine triphosphate-dependent potassium (K-ATP) channels. Moreover, vildagliptin, belonging to the class of dipeptidyl peptidase-4 enzyme (DPP-4) inhibitor, performs its action by incretin system, mainly by hormone glucagon-like peptide 1 (GLP-1). GLP-1 receptors are present in various body tissues, including myocardium. Multiple actions of GLP-1 and structurally related GLP-1 agonists have been reported in heart. We aimed to evaluate the effect of vildagliptin on IPC in patients with type 2 diabetes and symptomatic coronary artery disease. We evaluated 54 patients with DM2 and a positive exercise test that also had with multivessel coronary disease confirmed by coronary angiography. In phase I, without drug, all patients underwent 2 consecutive treadmill exercise tests (ET1 and ET2). After that, all patients received vildagliptin 100 mg per day for one week and underwent more 2 more sequential tests (ET3 and ET4). The time interval between the exercises tests was 30 minutes. In phase 1, all patients demonstrated IPC that was observed by the improvement in time to 1mm of ST segment depression (T-1.0mm) in ET2 compared with T1 In phase 2, with vildagliptin, all patients (54) developed ischemia in ET3, however, 76 % (41) of patients showed experienced later ischemia in ET4 compared with ET3 (p<0.001), characterizing IPC preserved. Only 24% (13) patients demonstrated T-1.0mm earlier in ET4 compared with ET3, indicating the cessation of IPC (p=0.006). Vildagliptin did not affect this protective mechanism in a relevant way in patients with type 2 diabetes and symptomatic coronary artery disease.

As doenças isquêmicas representam a principal causa de mortalidade e morbidade no mundo. Dessa forma, o melhor entendimento dos sinais intracelulares envolvidos no estabelecimento e propagação do dano induzido pela isquemia-reperfusão (I/R) é essencial para o desenvolvimento de novas estratégias, futuramente utilizadas na prevenção e no tratamento do infarto agudo do miocárdio, acidente vascular cerebral e isquemia renal. O processo de isquemia-reperfusão gera danos irreparáveis aos tecidos acometidos. A reperfusão do tecido afetado, que ficara temporariamente mantido em hipóxia (com baixa tensão de oxigênio), resulta em um brusco aporte de oxigênio (alta tensão de oxigênio) e consequente colapso metabólico, caracterizado pela disfunção mitocondrial associada à elevada produção de radicais livres. Recentemente demonstramos que estímulos cardioprotetores (ex. pré-condicionamento isquêmico e etanol) são acompanhados pela ativação da proteína quinase C isoforma épsilon (PKC&#949;), aumento de sua translocação para a mitocôndria e consequente fosforilação/ativação da enzima mitocondrial aldeído desidrogenase 2 (ALDH2). A ALDH2 é uma enzima chave na proteção contra danos isquêmicos devido a sua capacidade de oxidar aldeídos, como 4-hidroxi-2-nonenal e acetaldeído, produzidos durante estresse oxidativo. Semelhante ao pré-condicionamento isquêmico, o exercício físico (EF) também promove um aumento da tolerância do miocárdio à lesão de isquemia-reperfusão, entretanto os mecanismos celulares envolvidos nessa cardioproteção ainda são pouco compreendidos. No presente projeto de pesquisa buscamos validar o eixo intracelular PKC&#949;-ALDH2 como possível mecanismo cardioprotetor induzido pelo EF frente estresse de isquemia-reperfusão. Inicialmente, utilizando camundongos selvagens, avaliamos se o exercício físico (7 dias consecutivos) modula a PKC&#949; e a ALDH2, e se essa resposta é transiente ou sustentada. Em seguida, por meio da técnica de isquemia-reperfusão ex vivo (Langendorff), avaliamos a participação individual da PKC&#949; e ALDH2 na cardioproteção mediada pelo exercício físico. Nossos resultados mostram que o exercício físico aumenta a expressão da PKC&#949; no cardiomiócito de forma transiente, visto que 24h após a última sessão de exercício físico esse valor foi restabelecido, e a ALDH2 mostrou aumento sustentado em sua atividade, mantida até mesmo 24h após a última sessão de exercício físico. Além disso, sete dias de exercício físico é capaz de proteger o coração da lesão de isquemia e reperfusão. Entretanto, quando foram utilizados inibidores específicos ou animais geneticamente modificados, essa cardioproteção foi perdida. Assim, nossos resultados sugerem um papel importante do eixo PKC&#949;-ALDH2 na cardioproteção induzida pelo exercício físico frente a uma lesão por isquemia/reperfusão. / Ischemic diseases are the leading cause of mortality and morbidity worldwide. Thus, a better understanding of the intracellular signals involved in the establishment and propagation of damage induced by ischemia-reperfusion is essential to the development of new strategies that can be used in the prevention and treatment of myocardial infarction, stroke and renal ischemia. The process known as ischemia-reperfusion (I/R) causes irreparable damage to the affected tissues due to the wide variation in tissue oxygen tension. Reperfusion of the affected tissue, which had been temporarily maintained at hypoxia (low oxygen tension), results in abrupt oxygen supply (high oxygen tension) and consequent metabolic collapse, characterized by mitochondrial dysfunction associated with high production of free radicals. We recently demonstrated that cardioprotective stimuli (i.e. ischemic preconditioning and ethanol) are accompanied by increased translocation of protein kinase C isoform epsilon (PKC&#949;) to the mitochondria and subsequent phosphorylation-activation of mitochondrial aldehyde dehydrogenase enzyme 2 (ALDH2), which has an inverse correlation with myocardial injury. ALDH2 is a key enzyme in the protection against ischemic damage due to its capacity to oxidize aldehydes (i.e. acetaldehyde and 4-hydroxynonenal) produced during oxidative stress. Similar to ischemic preconditioning, exercise promotes increased myocardial tolerance to ischemia-reperfusion injury; however, the cellular mechanisms involved in this process are still poorly understood. We proposed to validate the intracellular PKC&#949;-ALDH2 axis as a possible exercise-mediated cardioprotective mechanism upon ischemia-reperfusion. Firstly, using wild-type mice, we evaluated whether exercise (7 consecutive days) modulates the activity of PKC&#949; and ALDH2 (transient vs. sustained). Then, through the ex vivo ischemia-reperfusion technique (Langendorff), we evaluated the individual participation of PKC&#949; and ALDH2 in exercise-mediated cardioprotection. Our results show that physical exercise increases the cardiomyocyte PKC&#949; levels in a transient way, since this response was reestablished 24h after the last physical exercise session. Moreover, ALDH2 showed a sustained increase in its activity, which was maintained even 24h after the last session. In addition, seven days of physical exercise was able to protect the heart from ischemia and reperfusion injury, whereas this cardioprotection was lost when specific inhibitors or genetically modified animals (PKC&#949; knockout mice and ALDH2 knock-in mice) were used. Thus, our results suggest an important role of the PKC&#949;-ALDH2 axis in the cardioprotection induced by exercise against ischemia/reperfusion injury.

Fundamentos: A Síndrome da Resposta Inflamatória Sistêmica (SRIS) permanece como uma das principais causas de disfunção de órgãos associada à circulação extracorpórea (CEC) na maioria dos pacientes submetidos à cirurgia cardíaca, especialmente em neonatos submetidos à correção de cardiopatias congênitas com auxílio de CEC. A circulação extracorpórea (CEC) neonatal é uma ferramenta essencial para a correção cirúrgica de grande parte das cardiopatias congênitas. Apesar dos avanços importantes na técnica, a CEC geralmente promove uma lesão multi-órgãos, cujo mecanismo inclui a lesão de isquemia-reperfusão (IR) e a resposta inflamatória sistêmica. Na arena clínica, a complicação mais importante pós-CEC neonatal consiste na lesão pulmonar e a disfunção respiratória, com consequente congestão vascular pulmonar e aumento do liquido intersticial. No cenário fetal, a disfunção placentária representa a principal causa de morbi-mortalidade durante e após a CEC fetal. O pré-condicionamento isquêmico remoto (PCIR) tem sido aplicado como alternativa terapêutica capaz de mitigar os danos teciduais consequentes ao processo inflamatório desencadeado pela lesão de IR e proteger tecidos à distância da isquemia subsequente. No entanto, o impacto desta estratégia não foi ainda demonstrado na CEC fetal, para determinar se esta forma de intervenção terapêutica não-invasiva poderia oferecer uma proteção multi-órgãos fetais, como os pulmões e a placenta. Objetivo: Testar a hipótese de que o PCIR em fetos de ovinos submetidos a CEC reduz a inflamação sistêmica fetal e a disfunção placentária. Método: Foram estudados 18 fetos de ovinos com pesos comparáveis (p > 0,87), divididos em 3 grupos: Controle Negativo (2,68kg ± 0,2kg), CEC simples, isto é, fetos submetidos à CEC sem PCIR (2,98kg ± 0,4kg) e Grupo PCIR, que contempla fetos submetidos ao PCIR antes de serem submetidos à CEC (2,96kg ± 0,4kg). O PCIR foi realizado antes da manipulação cirúrgica fetal, com quatro ciclos de isquemia intermitente de um dos membros traseiros (cinco minutos de garroteamento do membro, alternados com dois minutos de reperfusão). Ambos os grupos de estudo foram submetidos à CEC normotérmica durante 30 minutos. O perfusato foi composto de Ringer simples (61,33 ml ± 6,57 ml) aquecido (38º C). Os fetos foram monitorizados durante 120 minutos após a CEC. Foram analisados os marcadores inflamatórios sistêmicos fetais, trocas gasosas através da placenta e alterações morfológicas da placenta e dos pulmões fetais. Resultados: Foi observada uma queda progressiva da pressão arterial sistêmica dos animais do grupo CEC simples ao longo do protocolo em relação ao grupo Controle Negativo (p=0,006). O grupo PCIR não diferiu dos demais grupos (p < 0,53). O maior fluxo sanguíneo da CEC fetal foi atingido no grupo PCIR (191,4 ± 36 ml.min-1.Kg-1), quando comparado ao grupo CEC simples (137,0 ± 16,3 ml.min-1.Kg-1; p=0,0002). Quanto à função placentária, a partir do estabelecimento da CEC, ambos os grupos de estudo (Controle Positivo e PCIR) evoluíram com uma queda significativa da saturação de oxigênio arterial em relação ao grupo Controle Negativo (p < 0,04), sendo pior no grupo CEC simples em relação ao grupo PCIR (p=0,02). Em relação à avaliação metabólica, os animais submetidos a CEC, com ou sem PCIR, desenvolveram acidose mista progressiva (p < 0,0001), níveis inferiores de bicarbonato de Sódio (p < 0,0001) e hiperlactatemia (p < 0,0003), quando comparados ao grupo Controle Negativo. A avaliação histológica dos pulmões não evidenciou diferenças significativas em relação ao edema interlobular (p=0,589), porém foi observado maior espessamento de parede das arteríolas bronquiolares no grupo da CEC simples, quando comparadas aos demais grupos (p=0,009). A avaliação imuno-histoquímica do receptor Toll-Like-4 (TLR-4) e das moléculas de adesão intercelular-1 (ICAM-1) e vascular-1 (VCAM-1) nos pulmões fetais não evidenciou diferenças significativas entre os grupos. Em relação à placenta, houve um adensamento da fração de área dos núcleos das células similar entre os três grupos (p=0,91). Entretanto, foi observado um menor percentual de área de vasculatura intersticial no grupo CEC simples, sinal indireto de maior edema placentário neste grupo (p < 0,04). A análise imunohistoquímica dos marcadores inflamatórios ICAM-1, VCAM-1 e TLR-4 no interstício placentário também não evidenciou diferenças significativas entre os grupos no momento final do protocolo, embora tenha sido observada maior expressão da molécula ICAM-1 na vasculatura placentária de ambos os grupos de estudo. Os níveis séricos dos marcadores pró-inflamatórios tromboxana A2 e Interleucina-1 do grupo PCIR foram significativamente menores que aqueles do grupo CEC simples, uma hora após a CEC (p < 0.01). Os valores séricos da Prostaglandina E2 e Interleucina-6 do grupo PCIR foram significativamente maiores que os valores do grupo CEC simples, também uma hora após a CEC (p=0,02). Os marcadores pró-inflamatórios Interleucina-10 e Fator de Necrose Tumoral Alfa não apresentaram variações significativas entre os grupos ou durante os diversos tempos do protocolo (p > 0,08). Conclusão: O PCIR preservou melhor a hemodinâmica fetal, permitindo maior fluxo sanguíneo durante a CEC fetal. A expressão dos marcadores inflamatórios nos tecidos pulmonar e placentário, após a CEC fetal, não foi modificada pelo PCIR, embora o grupo PCIR tenha apresentado menores valores séricos de marcadores próinflamatórios tromboxana A2 (TXA2) e interleucina-1 (IL-1Beta). Paradoxalmente, o PCIR não impediu a elevação dos marcadores pró-inflamatórios Interleucina-6 e Prostaglandina E2. Esta forma de terapia não invasiva, PCIR, não impediu a disfunção placentária nem a hipoperfusão tecidual em fetos de ovinos submetidos à circulação extracorpórea, embora o edema placentário e a saturação de oxigênio tenham sido melhor preservados nos fetos submetidos ao PCIR / Background: Systemic inflammatory response Syndrome (SIRS) remains one of the major causes of cardiopulmonary bypass (CPB) associated organ injury in the majority of patients undergoing cardiovascular surgery, especially in neonates submitted to surgical correction of congenital heart lesions with CPB support. Despite significant advances in the technique, CPB is still complicated by multisystem injury, the mechanisms of which include ischemia-reperfusion (IR) injury and a detrimental systemic inflammatory response. In the clinical arena, pulmonary injury and dysfunction remain important complication after CPB, with consequent pulmonary vascular congestion and increase in interstitial fluid. In the fetal scenario, placental dysfunction remains the major cause of mortality during and after fetal CPB. Remote ischemic preconditioning (RIPC) has been applied as an alternative therapy to attenuate tissue injury related to the effects of inflammatory mediators triggered by IR injury. The preconditioning stimulus has systemic effects to protect distant tissues from subsequent ischemia. At the present, the impact of this strategy has not been yet demonstrated on fetal CPB, to determine whether this non-invasive therapeutic intervention can offer fetal multi-organ protection, such as the lungs and placenta. Objective: To test the hypothesis that RIPC applied to fetal lambs under CPB reduces fetal systemic inflammation and placental dysfunction. Method: 18 fetal lambs with comparable weights (p > 0.87) were divided into 3 groups: Negative Control (2.68kg ± 0.2kg), Sham (CPB without RIPC; 2.98kg ± 0.4kg) and RIPC Group (CPB plus RIPC; 2.96kg ± 0.4kg). RIPC stimulus was applied prior to fetal surgical manipulation, with tourniquet occlusion of blood flow to one hind limb with four cycles of 5-minute occlusion followed by 2-minute reperfusion. Animals from both study groups underwent 30 minutes of normothermic CPB. Blood-free priming solution consisted of only warm Ringer Solution (61.33 ml ± 6.57 ml; 38° C). Fetuses were monitored for 120 minutes after CPB. Fetal systemic inflammatory markers, fetal gas exchange, and morphological changes of the placenta and fetal lungs were assessed. Results: There was a progressive decrease of the systemic blood pressure in the Sham group throughout the protocol, as compared to Negative Control group (p= 0.006). The RIPC group did not differ from the other groups (p < 0.53). Animals from the RIPC group reached highest blood flow during CPB (191.4 ± 36.0 ml.min-1.Kg-1), when compared to Sham group (137.0 ± 16.3 ml.min-1.Kg-1; p = 0.0002). Regarding placental function, both groups (Sham and RIPC) developed a significant decrease in arterial oxygen saturation since the very beginning of CPB, as compared to the Negative Control group (P < 0.04). That change was even worse in the Sham group, when compared to PCIR group (p=0.02). Concerning metabolic assessment, the animals from both study groups developed progressive mixed acidosis (p < 0.0001), lower levels of sodium bicarbonate (p < 0.0001) and hyperlactatemia (p < 0.0003), when compared to Negative Control group. Histological assessment of fetal lungs did not show significant differences of interlobular inflammatory edema among the three groups (p > 0,05), although the animals from Sham group presented increased thickness of the bronchiolar arterioles, when compared to the other groups (p=0.009). Fetal lung immunohistochemical assessment of Toll-Like Receptor-4 (TLR-4), as well as the intercellular adhesion molecule ICAM-1 and the vascular adhesion molecule VCAM-1 did not show significant differences among the three groups. Regarding the area fraction of the placental cellular nuclei, there was no significant differences among the three groups (p=0.91). However, Sham group presented with a smaller area fraction of interstitial vasculature, an indirect signal of increased placental edema (p < 0.04). The analysis of placental interstitial inflammatory markers ICAM-1, VCAM-1 and TLR-4 did not show significant differences among the three groups at the end of the protocol, although an increased expression of ICAM-1 was observed in the placental perivascular area of both study groups. The pro-inflammatory thromboxane A2 and interleukin-1 levels were significantly lower in the RIPC group than in Sham group, at 60-minute post-CPB (p < 0.01). Prostaglandin E2 and interleukin-6 levels were significantly higher in the RIPC group than in the Sham group at 60-minute post-CPB (p=0.02). Tumor necrosis factor-alpha and interleukin-10 did not show significant differences among the three groups nor throughout the protocol (p > 0.08). Conclusion: RIPC better preserved fetal hemodynamics, allowing for increased blood flow during fetal CPB. The expression of inflammatory markers on placenta and fetal lungs were not modified by RIPC after CPB, although the RIPC group presented with lower values of pro-inflammatory markers thromboxane A2 and Interleukin-1. Paradoxically, the RIPC did not prevent the increase of the pro-inflammatory markers interleukin-6 and Prostaglandin E2. The RIPC non-invasive therapy did not prevent placental dysfunction or tissue hypoperfusion in fetal lambs under CPB, although placental edema and oxygen saturation were better preserved in fetuses submitted to RIPC

A interrupção do fluxo sanguíneo, ou isquemia, representa um dos problemas mais importantes de doenças cardiovasculares e cerebrovasculares enfrentados pelos médicos na sua rotina. Em relação ao miocárdio muitos estudos têm sido realizados nessa área e sabe-se que os anestésicos inalatórios e os opiódes podem protege as células cardíacas contra a lesão de isquemia e reperfusão. O propofol por sua parece não ter efeito de précondicionamento, porém apresenta características similares as ações antioxidantes da vitamina E, neutralizando os efeitos nocivos da produção de radicais livres. A associação de sevoflurano, sufentanil e propofol não está descrita na literatura. O objetivo deste estudo foi examinar a potencialização de cardioproteção entre sevoflurano, propofol e sufentanil por meio de análise do tamanho da área de infarto e inibição de apoptose em células miocárdicas. Ratos foram submetidos a 5 protocolos de pré-condicionamento diferentes e divididos em grupos agudos e crônicos. Os resultados indicaram que a associação destes anestésicos não conferiu proteção maior do que quando administrados isoladamente. Além disso, o sevoflurano conferiu proteção ao miocárdio no pós-infarto agudo e crônico. Já o propofol conferiu cardioproteção no pós-infarto crônico / The interruption of blood flow, or ischemia, represents one of the major problems of cardiovascular and cerebrovascular diseases seen by physicians in their routine. With respect to the myocardium, many studies have been conducted in this area and it is a known fact that inhaled anesthetics and opiates may protect cardiac cells against the ischemia and reperfusion injury. Propofol, in turn, seems to have no preconditioning effect, but it has similar characteristics to the antioxidant actions of vitamin E by neutralizing the harmful effects of free radical production. The combination of sevoflurane, sufentanil and propofol has not been described in literature. The aim of this study was to survey cardioprotection potentiation among sevoflurane, propofol and sufentanil by analyzing the size of infarct area and the inhibition of apoptosis in cardiac cells. Rats were subjected to five different preconditioning protocols and divided into acute and chronic groups. Results indicated that the combination of these anesthetics did not confer greater protection than when they were administered alone. Furthermore, sevoflurane conferred myocardial protection in the postacute and chronic infarction stage. Propofol, in turn, conferred cardioprotection in the chronic post-infarction stage

Anoxia is an environmental stress that few air-breathing vertebrates can tolerate for more than a few minutes before extensive neurodegeneration occurs. Some facultative anaerobes, including the freshwater western painted turtle Chrysemys picta bellii, are able to coordinately reduce ATP demand to match reduced ATP availability during anoxia, and thus tolerate prolonged insults without apparent detriment. To reduce metabolic rate, turtle neurons undergo channel arrest and spike arrest to decrease membrane ion permeability and neuronal electrical excitability, respectively. However, although these adaptations have been documented in turtle brain, the mechanisms underlying channel and spike arrest are poorly understood. The aim of my research was to elucidate the cellular mechanisms that underlie channel and spike arrest and the neuroprotection they confer on the anoxic turtle brain. Using electrophysiological and fluorescent imaging techniques, I demonstrate for the first time that: 1) the α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid receptor (AMPAR) undergoes anoxia-mediated channel arrest; 2) delta opioid receptors (DORs), and 3) mild mitochondrial uncoupling via mitochondrial ATP-sensitive K+ channels result in an increase in cytosolic calcium concentration and subsequent channel arrest of the N-methyl-D-aspartate receptor, preventing excitotoxic calcium entry, and 4) reducing nitric oxide (NO) production; 5) the cellular concentration of reactive oxygen species (ROS) decreases with anoxia and ROS bursts do not occur during reoxygenation; and 6) spike arrest occurs in the anoxic turtle cortex, and that this is regulated by increased neuronal conductance to chloride and potassium ions due to activation of γ–amino-butyric acid receptors (GABAA and GABAB respectively), which create an inhibitory electrical shunt to dampen neuronal excitation during anoxia. These mechanisms are individually critical since blockade of DORs or GABA receptors induce excitotoxic cell death in anoxic turtle neurons. Together, spike and channel arrest significantly reduce neuronal excitability and individually provide key contributions to the turtle’s long-term neuronal survival during anoxia. Since the turtle is the most anoxia-tolerant air-breathing vertebrate identified, these results suggest that multiple mechanisms of metabolic suppression acting in concert are essential to maximizing anoxia-tolerance.