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Desenvolvimento de sistemas baseados em Nested-PCR convencional e em único tubo para o diagnóstico de leishmaniose visceral / Development systems based on nested-PCR and conventional single tube for the diagnosis of visceral leishmaniasis

Silva, Maria Almerice Lopes da January 2012 (has links)
Made available in DSpace on 2015-06-17T12:06:54Z (GMT). No. of bitstreams: 2 339.pdf: 1673760 bytes, checksum: b6988680884c38393a1141615afb2832 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2012 / A leishmaniose visceral ocorre em países dos cinco continentes e quando não tratada pode levar a óbito. Para se evitar esse desfecho, são essenciais o diagnóstico precoce e tratamento adequado. Com o objetivo de contribuir na pesquisa de novos diagnósticos para leishmaniose visceral, esse trabalho propôs desenvolver sistemas baseados em Nested-PCR convencional e em único tubo para o diagnóstico de leishmaniose visceral. A partir de uma revisão na literatura em busca de alvos moleculares utilizados no diagnóstico dessa parasitose, foram selecionados os alvos subunidade menor do RNA ribossômico (ssu rRNA) e espaçador transcrito interno 1 (ITS-1), que compõem o DNA do agente etiológico Leishmania infantum, para o desenvolvimento das nested-PCR. Foi também escolhido o alvo kDNA, o mais aplicado nas abordagens de PCR, para comparações com os sistemas desenvolvidos. Após otimizar todas as PCR com DNA genômico de L. infantum, esses sistemas foram avaliados em amostras de sangue, soro e urina de indivíduos com suspeita de leishmaniose visceral dos hospitais de referência da cidade do Recife - PE. Para utilização da urina, foram avaliados quatro protocolos de extração de DNA e identificou-se que a extração por fenol-clorofórmio, com modificações, foi a de melhor desempenho. Na avaliação com amostras biológicas, as PCR simples e nested-PCR com os alvos ssu rRNA e ITS-1 não tiveram boa sensibilidade ao se usar sangue, e não foram capaz de amplificar DNA do parasito em soro e urina. Esses sistemas desenvolvidos não podem ser usados para o diagnóstico da leishmaniose visceral. No entanto, a kDNAPCR apresentou bons resultados quando avaliada com urina. Mais estudos devem ser feitos para avalia-la como um diagnóstico seguro para esse tipo de amostra biológica. Esse trabalho representa um ponto de início para posteriores estudos que objetivem o aprimoramento e validação da nested-PCR único tubo para o diagnóstico da leishmaniose visceral
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Avaliação do efeito da medicação homeopática Antimonium crudum em culturas de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi / Evaluation of the effect of the homeopathic medicine Antimonium crudum in cultures of Leishmania (Leishmania) infantum chagasi

Karinne Marques da Silva 23 March 2016 (has links)
Atualmente, a busca por opções de tratamento com medicações financeiramente mais acessíveis e menos agressivas ao organismo, aliada à uma visão mais humana de tratar o paciente, fez da homeopatia uma prática mais utilizada. Em se tratando de uma das sete endemias de maior impacto mundial, a Leishmaniose é uma doença negligenciada causada pelo parasita do gênero Leishmania, com estimativas alarmantes de novos casos e óbitos por ano, se tornando um grande problema de saúde pública. No Brasil, a Leishmaniose Visceral em áreas urbanas se destaca pelo fato de ser uma zoonose que possui como principal reservatório também o cão, que sempre esteve presente e em estreito contato com grande parte das famílias brasileiras. O mesmo, quando infectado pela doença, é submetido à eutanásia como norma do Ministério da Saúde, por apresentar riscos à população. Utilizando-se a Lei da Similitude, instruída por Hahnemann, chegou-se à medicação Antimonium crudum para possível tratamento e profilaxia da Leishmaniose Visceral Canina. Portanto, no presente trabalho, visou-se o estudo da ação da medicação homeopática Antimonium crudum, in vitro, diretamente em promastigotas de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, através do teste de MTT (brometo de 3-[4.5 dimetitiazol- 2- il) 2,5 difenil- 2 H- tetrazólio), que visa mensurar a atividade metabólica e a observação da curva de crescimento do parasito na forma promastigota, bem como a ação na infecção das Leishmanias em macrófagos da linhagem J774, em sua forma amastigota. Os resultados obtidos para a forma promastigota mostram que o estímulo homeopático não teve influência direta sobre os parasitos, tanto no teste de MTT quanto na curva de crescimento, corroborando os estudos que sugerem que a homeopatia não age diretamente sobre o parasito e sim em conjunto com o sistema imune do hospedeiro. Já nos resultados dos ensaios infectivos, observa-se, em geral, maior porcentagem de macrófagos infectados, assim como maior taxa de fagocitose nos grupos tratados com Antimonium crudum, o que sugere uma maior atividade dos mesmos levando à uma resposta imune secundária mais representativa e consequentemente, à destruição do antígeno. Quando se verificou o pré e o pós-tratamento de macrófagos, observou-se que as potências mais baixas, CH6 e CH12, parecem ter maior eficiência e quando a infecção já está instalada, a potência CH30 parece ter uma maior significância na profilaxia da infecção. Apesar disso, a resolução da doença dependerá da ação imunológica de cada hospedeiro, que irá controlar o crescimento e manutenção do parasito ou não / Currently, the search for treatments with medicines that are financially affordable, less aggressive to the host, and more humane in treating the patient, homeopathy is the most practical course. When it comes to one of the seven largest worldwide impact endemics, Leishmaniasis is a neglected public health complex with alarming estimates of new cases and deaths per year. In Brazil, urban Visceral Leishmaniasis also stands out because the reproductive cycle of this zoonotic disease can include the dog, which has always been present and in close contact with most Brazilian families. Dogs, when infected by the disease are euthanized as a rule from the Ministry of Health to prevent risks to the population. Using the Law of Similars, developed by Hahnemann, the medication Antimonium crudum was identified as possible treatment and prophylaxis for Canine Visceral Leishmaniasis. Therefore, the present work was to study the direct action of the homeopathic medicine Antimonium Crudum in vitro against the promastigotes of Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, through the MTT test (3- [4.5 - dimetitiazol- 2-yl) - 2.5 diphenyl tetrazolium H 2), which aims to measure the metabolic activity; the promastigote growth curve; as well as the performance of promastigote infectivity in J774 macrophages. The results from both the MTT assay as well as the growth curve show that the homeopathic stimulus did not directly influence the promastigote form of the parasites, corroborating studies that suggest that homeopathy has no direct action on the parasite, but may function together with the host\'s immune system. Treatment with Antimonium crudum led to a higher percentage of infected macrophages in the infectivity assays and a higher rate of phagocytosis, which suggests increased activity leading to a stronger secondary immune response and as a result, antigen destruction. Assays in which macrophages were treated before or after infection suggest that lower concentrations (CH6 and CH12) seem most effective when the cells are already infected, however a higher concentration (CH30) appears to have greater activity in preventing infection. Ultimately, the resolution of the disease depends on the immunological action of each host, which may control the growth and maintenance of parasite
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Leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica causada pela Leishmania infantum chagasi no município de Amapala, Valle, Honduras: caracterização imuno-histopatológica das lesões de pele / Non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania (L.) infantum chagasi in the municipality of Amapala, Valle, Honduras: immunohistotopathological characterization of skin lesions

Carmen Maria Sandoval Pacheco 01 September 2017 (has links)
Nas Américas, em especial na América do Sul, a infecção por Leishmania (L.) infantum chagasi causa manifestações subclínicas e leishmaniose visceral (LV), a qual quando não tratada é potencialmente fatal. Na América Central, especialmente em Honduras, a leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica e a leishmaniose visceral são causadas pelo mesmo agente etiológico Leishmania (L.) infantum chagasi e ocorrem na mesma região geográfica. Pouco se conhece sobre o perfil da infecção humana por Leishmania (L.) infantum chagasi em Honduras, especialmente sobre a forma não ulcerada ou atípica, sendo assim, no sentido de compreender melhor a patogênese da infecção causada por esta espécie de parasito no município de Amapala (Valle) e Orocuina (Choluteca), Honduras, o presente estudo visou a caracterização histopatológica e da resposta imune celular in situ em lesões de pacientes com leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica. Foram utilizadas 20 biópsias de pele de pacientes com diagnóstico parasitológico confirmado por raspado de lesão corado por Giemsa e observado em microscópio ótico. A histopatologia foi avaliada em cortes histológicos corados por hematoxilina-eosina (HE) e a resposta imune por meio da reação de imunoistoquímica utilizando anticorpos primários para macrófagos (CD68), linfócitos T (CD4, CD8), células natural killer - NK (CD56), linfócitos B (CD20), óxido nítrico sintetase (NOS2) e interferon-gama (IFN-y. Microscopicamente as alterações histopatológicas mais significativas foram observadas na derme superficial e profunda caracterizando-se por um infiltrado inflamatório predominantemente linfohistiocitário de intensidades variável com arranjo difuso e, por vezes, associado à formação de granulomas epitelioides. A observação de formas sugestivas do parasito ocorreu em apenas 55 % dos casos. A análise imunoistoquímica das lesões confirmou a presença de células mononucleares no infiltrado inflamatório caracterizada principalmente pela presença de linfócitos TCD8+, seguido por TCD4+, macrófagos, linfócitos B e células NK. A grande densidade de células INF-y+ e a presença da enzima iNOS, responsável pela produção de óxido nítrico, molécula com atividade leishmanicida, em quase a totalidade dos macrófagos do infiltrado inflamatório, sugere uma resposta imune local bastante efetiva, que colabora para o controle do número de parasitos e consequentemente a evolução do tamanho da lesão / In America, especially in South America, infection by Leishmania (L.) infantum chagasi causes subclinical manifestations and visceral leishmaniasis (VL), which when untreated is potentially fatal. In Central America, especially in Honduras, non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis are caused by the same etiologic agent Leishmania (L.) infantum chagasi and occur in the same geographic region. Little is known about the profile of human infection by Leishmania (L.) infantum chagasi in Honduras, especially on the non-ulcerated or atypical form. In order to better understand the pathogenesis of the infection caused by this species of parasite in the municipality of Amapala (Valle) and Orocuina (Choluteca), Honduras, the present study aim the characterization of histopathological changes and cellular immune response in situ in lesions of patients with non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis. Twenty skin biopsies from patients with parasitological diagnosis confirmed by scraping of Giemsa-stained lesion and observed using an optical microscope. Histopathology, was evaluated by hematoxylin-eosin (HE) and the immunohistochemistry using the primary antibodies to macrophages (CD68), T lymphocytes (CD4, CD8), natural killer cells - NK (CD56), B lymphocytes CD20), nitric oxide synthase (NOS2) and interferon-gamma (IFN-y). Microscopically, the most significant histopathological changes were observed in the superficial and deep dermis, characterized by a predominantly lymphohistiocytic inflammatory infiltrate of variable intensities with diffuse arrangement and sometimes associated with the formation of epithelioid granulomas; the observation of suggestive forms of the parasite occurred in only 55 % of the cases. The immunohistochemical analysis of the lesions confirmed the presence of mononuclear cells in the inflammatory infiltrate characterized mainly by the presence of T-CD8+ lymphocytes, followed by T-CD4+, macrophages, B lymphocytes and NK cells. The high density of INF-y+ cells and the presence of iNOS, enzyme responsible for the production of nitric oxide, molecule with activity leishmanicide, in almost all of the macrophages in the inflammatory infiltrate, suggest an effective local immune response that collaborate to the control in the number of parasites and consequently the evolution of the lesion
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Algoritmo para o diagnóstico molecular da leishmaniose visceral / Algorithm for molecular diagnosis of visceral leishmaniasis

Natalia Souza de Godoy 10 November 2016 (has links)
A definição de caso confirmado de leishmaniose visceral é baseada em aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. As técnicas padrão-ouro para o diagnóstico laboratorial da leishmaniose visceral são as parasitológicas esfregaço e cultura de aspirado de medula óssea, que permitem a identificação do gênero Leishmania por visualização microscópica do parasito em lâmina, e os testes sorológicos, como o imunocromatográfico, que apresenta baixa sensibilidade em indivíduos imunodeprimidos. Em determinadas situações, como na coinfecção Leishmania/HIV, para o tratamento específico ou nos inquéritos epidemiológicos, faz-se necessária a identificação do agente etiológico da leishmaniose visceral, que comumente é a L. (L.) infantum. Desse modo, propusemos um algoritmo para o diagnóstico molecular da leishmaniose visceral, com o emprego da kDNA PCR (K20-K22 E RV1-RV2) do ITS1 PCR (LITSR e L5. 8S), tendo como referência os resultados obtidos nos exames parasitológicos e sorológicos, além de dados clínicos e epidemiológicos dos pacientes. Complementando nossa proposta, a realização da técnica de análise dos polimorfismos dos fragmentos da ITS1 PCR por RFLP, para identificação do agente etiológico, foi avaliada como alternativa à laboriosa técnica de eletroforese de isoenzimas, padrão-ouro para definição de espécies no diagnóstico das leishmanioses. As técnicas moleculares empregadas foram validadas em 82 amostras (ITS 1 PCR e kDNA PCR RV1-RV2) e 48 amostras (kDNA PCR K20-K22) de pacientes com leishmaniose visceral confirmada e em 30 amostras de pacientes saudáveis. Os ensaios obtiveram as seguintes sensibilidades: 97,5% (80/82) na ITS1 PCR, 98% (47/48) na kDNA PCR K20-K22, e 92,7% (76/82) na kDNA PCR RV1-RV2, e 100% de especificidade em todos os testes. Quando comparados os resultados obtidos nos testes moleculares ITS1 PCR, kDNA PCR K20-K22 e kDNA PCR RV1-RV2 ao padrão ouro observou-se uma concordância quase perfeita, com um índice kappa maior que 0,80, e um valor de p < 0,001. No que concerne à realização da ITS1 PCR RFLP nas 80 amostras positivas, 52,5% (42/80) demonstraram perfil semelhante ao de L. (L.) infantum. Três das amostras que não demonstraram perfil na RFLP da ITS1 PCR e na kDNA PCR K20-K22 obtiveram mais de 90% de identidade com a cepa de L. (L.) chagasi, mediante análise das amostras na técnica do sequenciamento. Concluímos o presente estudo com a proposta de um algoritmo de diagnóstico molecular da leishmaniose visceral, que deverá considerar a realização prévia do diagnóstico parasitológico e imunocromatográfico. E sugerimos, quando necessário, a realização da kDNA PCR K20-K22 e a kDNA PCR RV1-RV2 para a determinação do gênero e de subgênero da Leishmania, respectivamente. Por fim, que se complemente com a ITS1 PCR, seguida da ITS1 RFLP para a definição do agente etiológico da leishmaniose visceral. / The definition of visceral leishmaniasis case is based on clinical, epidemiological and laboratory aspects. The gold standard techniques for laboratory diagnosis of visceral leishmaniasis are parasitological, smear and culture of bone marrow aspirate, which allow the identification of Leishmania in microscopic visualization, and the serological tests, like the immunochromatographic, which presents low sensitivity in immunodepressed individuals. In certain situations, such as Leishmania/HIV co-infection, for specific treatment or in epidemiological surveys, it is necessary to identify the etiological agent of visceral leishmaniasis, commonly caused by L. (L.) infantum. In this way, an algorithm for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis by kDNA PCR (K20/K22 and RV1/RV2) and ITS1 PCR (LITSR e L5.8S) was proposed, using as the gold standard, the parasitological and serological results, as well as clinical and epidemiological data of patients. Complementing our proposal, the performance of the Restriction Fragment Length Polymorphism of the ITS1 (ITS1 PCR RFLP) to identify the etiological agent, was evaluated as an alternative to technical laboriously isoenzyme electrophoresis, the gold standard for defining species in the diagnosis of leishmaniasis. The molecular techniques were validated on 82 samples (ITS 1 kDNA PCR and PCR-RV1 RV2) and 48 samples (K20-K22 kDNA PCR) from patients with confirmed visceral leishmaniasis and 30 samples from healthy patients. The following sensitivities were presented by the molecular tests: 97.5% (80/82) for the ITS1 PCR, 98% (47/48) for kDNA PCR K20-K22 and 92.7% (76/82) for kDNA PCR-RV2 RV1, and 100% specificity for all tests. When comparing the results from molecular tests ITS1 PCR, kDNA PCR K20-K22 and kDNA PCR RV1-RV2 with the established gold standard, we see an almost perfect agreement with kappa index higher than 0.80, and p value <0.001 were obtained. As regard to ITS1 PCR RFLP, from 80 positive samples, 52.5% (42/80) showed a similar profile to that of L. (L.) infantum. Three of the samples that did not demonstrate RFLP profile in the ITS1 PCR and PCR kDNA K20-K22 obtained more than 90% of identity with strain L. (L.) chagasi, by analyzing the samples in sequencing. As our conclusion, an algorithm for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis must consider a previous performance of the parasitological and immunochromatographic diagnosis. When necessary kDNA PCR K20-K22 and kDNA RV1-RV2 PCR are suggested to determine the genus and the subgenus Leishmania, respectively. In addition, this molecular diagnosis can be complemented, with the ITS1 PCR, followed by RFLP ITS1, which can define the etiological agent of visceral leishmaniasis.
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Efeito das lipoproteínas plasmáticas no parasitismo de células monocíticas humanas infectadas com Leishmania (Leishmania) infantum / Effect of plasma lipoproteins on the parasitism of human monocytic cells infected with Leishmania (Leishmania) infantum

Alline Martins Rodrigues Santos 02 February 2017 (has links)
Leishmaniose visceral (LV) é uma doença causada pelo protozoário Leishmania (Leishmania) infantum nas Américas que acomete células do sistema fagocítico mononuclear. Na doença ativa, ocorre redução nos níveis de lipoproteínas de alta densidade (HDL) e aumento nos níveis de colesterol total e triglicérides, sendo que a progressão da doença pode estar relacionada com essas alterações no nível de lipoproteínas. Desta forma, neste trabalho avaliamos: o efeito das lipoproteínas de muita baixa densidade (VLDL) e HDL no parasitismo de células de linhagem monocítica humana (THP-1) por L. (L.) infantum, a atividade da arginase e a expressão do mRNA do fator de crescimento insulina símile-I (\"insulin-like growth factor-I\" = IGF-I) e seu receptor (\"insulin-like growth factor-I receptor\" = IGF-IR). Células THP-1 foram infectadas por 6 h com promastigotas de L. (L.) infantum, na presença de 0,5% de soro com baixa concentração lipídica (infranadante) e na presença ou ausência das frações lipoprotéicas em diferentes concentrações. As células foram lavadas e mantidas depois em meio de cultura acrescido com infranadante por 24, 48 e 72 h. Quando as frações de VLDL e HDL foram adicionadas separadamente durante a incubação inicial o parasitismo aumentou em relação ao controle. Quando as frações de VLDL e HDL foram adicionadas concomitantemente houve diminuição do parasitismo em relação ao controle, mas aumento inesperado da atividade da arginase, nos períodos de 24 e 48 h. A expressão do mRNA de IGF-I e IGF-IR mostrou uma diminuição nas células infectadas na presença e ausência das frações em relação às células não infectadas. Os resultados obtidos sugerem um papel importante de VLDL e HDL na infecção de células THP-1 por L. (L.) infantum. / Visceral leishmaniasis (VL) is a disease caused by the protozoan Leishmania (Leishmania) infantum in Americas that affects cells of the mononuclear phagocytic system. During active disease reduction in high density lipoprotein (HDL) and increase in total cholesterol and triglyceride levels are observed. Thus in this study we evaluated the effect of very low density lipoprotein (VLDL) and HDL on the parasitism of cells of human monocytic line (THP-1) by L. (L.) infantum, the arginase activity and insulin-like growth factor-I (IGF-I) and insulin-like growth factor-I receptor (IGF-IR) mRNA expressions. THP-1 cells were infected for 6 h with L. (L.) infantum promastigotes in the presence of 0.5% low lipid concentration serum (infranatant) in the presence or absence of lipoprotein fractions at different concentrations. The cells were washed and then maintained in medium with infranatant for 24, 48 and 72 h. When VLDL and HDL were added separately the parasitism increased when compared with the control. When VLDL and HDL were added concomitantly the parasitism decreased in relation to the control but with unexpected increase in arginase activity. The evaluation of IGF-I and IGF-IR mRNA expression showed a decrease in the cells infected in the presence and absence of the fractions comparing with the uninfected cells. The results suggest an important effect of VLDL and HDL in the infection of THP-1 cells by L. (L.) infantum.
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Identificação e caracterização de tripanossomatídeos que infectam cães em área endêmica para leishmaniose visceral canina / Identification and characterization of the trypanosomatids infecting dogs in endemic areas for canine visceral leishmaniasis

Vanessa Figueredo Pereira 16 December 2016 (has links)
A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma grave zoonose, causada pela Leishmania infantum (syn. chagasi). O ciclo deste parasito é heteroxeno e a transmissão acontece principalmente pela picada da fêmea do vetor, dípteros da espécie Lutzomyia longipapis. O cão doméstico é o principal alvo das campanhas de controle da doença por ser a principal fonte de infecção para o vetor no ambiente urbano. O Ministério da Saúde adota testes sorológicos para a detecção de animais positivos; no entanto a sensibilidade e especificidade desses testes são questionáveis. Além das falhas inerentes a qualquer teste diagnóstico, no caso da LVC existem alguns entraves, especialmente pela distribuição geográfica, comum a outras doenças causadas por tripanossomas, e pela similaridade genética com os outros parasitas da mesma família. Nessas áreas de sobreposição pode haver tanto reação cruzada quanto co-infecção, dificultando a interpretação dos testes. No presente estudo, foram coletadas amostras de suabe conjuntival e sangue de cães em inquérito soroepidemiológico realizado no município de Ilha Solteira - SP. A presença de Leishmania spp. e Leishmania infantum foram testadas por PCR convencional e PCR em tempo real com primers direcionados ao kDNA de Leishmania spp. A avaliação sorológica foi realizada através da RIFI, e a identificação e caracterização dos tripanossomatídeos foi realizada através da PCR com primers ITS1. A SC-qPCR foi o teste que detectou o maior número de animais. De 204 cães utilizados no estudo, 19,12% (30/204) foram positivos na SC-qPCR. Na SG-qPCR foram 12,74% (26/204) de animais positivos. O teste que detectou o menor número de animais foi a SC-cPCR, com 10,78% (22/204). Enquanto na SG-cPCR obtivemos 13,23% (27/204) animais positivos. De 28 amostras selecionadas para o sequenciamento do gene ITS1, 19 (67,85%) foram 100 ou 99% similares à L. infantum, sugerindo que a maioria dos cães positivos para LVC estavam realmente infectados com esta espécie. Entretanto, 2 cães (7,14%), que tiveram suas amostras sequenciadas para tal gene, revelaram 99% de similaridade com Crithidia fasciculata. Dos testes avaliados, esses cães foram positivos apenas na SG-cPCR para Leishmania spp. Os resultados indicam que a SC-qPCR foi o teste mais eficaz em detectar amostras realmente positivas para L. infantum, e que se deve atentar ao fato de existirem outros tripanossomatídeos infectando os cães em área endêmica de LVC, podendo dificultar o diagnóstico adequado dos animais infectados por L. infantum. / Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a serious zoonosis caused by Leishmania infantum (syn. chagasi). The life cycle of this parasite is heteroxenous and the transmission occurs through the bite of the female sandfly, diptera species Lutzomyia longipalpis. The domestic dog is the main focus disease control campaigns, since it is the most important source of infection for the vector in urban environment. For positive dogs detection the health ministry uses serological tests, however the sensitivity and specificity of these tests are questionable. In addition to flaws inherent in any diagnostic test, in case of CVL there are some obstacles, especially by geographic distribution, common to other diseases caused by trypanosomes, and also by genetic similarity with other parasites of the same family. In areas of disease overlap, cross-reaction or co-infection may occur, making it difficult to interpret the results. In this study, conjunctival swab samples and whole blood of dogs were collected in seroepidemiological survey conducted in Ilha Solteira - SP. The presence of Leishmania spp. and Leishmania infantum were tested by conventional PCR and real-time PCR with Leishmania spp. kDNA-targeted primers. The serological evaluation was carried out by RIFI, and the identification and characterization of trypanosomatids was performed by PCR with ITS1 primers. SC-qPCR was the test that detected the largest number of animals. Of 204 dogs used in this study, 19.12% (30/204) were positive in SC-qPCR. In SG-qPCR 12.74% (26/204) animals were positive. The test that detected the lowest number of animals was SC-cPCR, with 10.78% (22/204). While in the SG-cPCR we obtained 13.23% (27/204) positive animals. From 28 samples selected for ITS1 gene sequencing, 19 (67.85%) were 100 or 99% similar to L. infantum, suggesting that most CVL positive dogs were infected with this species. However, two dogs (7.14%), which had their samples sequenced for the same gene, showed 99% similarity with Crithidia fasciculata. From the evaluated tests, these dogs were only positive in SG-cPCR for Leishmania spp. The results indicate that SC-qPCR was the most effective test to detect L. infantum positive samples , and it should be noted that there are other trypanosomatids infecting dogs in an endemic CVL area, which can difficult to diagnose animals properly infected by L. infantum.
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Avaliação do efeito da medicação homeopática Antimonium crudum em culturas de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi / Evaluation of the effect of the homeopathic medicine Antimonium crudum in cultures of Leishmania (Leishmania) infantum chagasi

Silva, Karinne Marques da 23 March 2016 (has links)
Atualmente, a busca por opções de tratamento com medicações financeiramente mais acessíveis e menos agressivas ao organismo, aliada à uma visão mais humana de tratar o paciente, fez da homeopatia uma prática mais utilizada. Em se tratando de uma das sete endemias de maior impacto mundial, a Leishmaniose é uma doença negligenciada causada pelo parasita do gênero Leishmania, com estimativas alarmantes de novos casos e óbitos por ano, se tornando um grande problema de saúde pública. No Brasil, a Leishmaniose Visceral em áreas urbanas se destaca pelo fato de ser uma zoonose que possui como principal reservatório também o cão, que sempre esteve presente e em estreito contato com grande parte das famílias brasileiras. O mesmo, quando infectado pela doença, é submetido à eutanásia como norma do Ministério da Saúde, por apresentar riscos à população. Utilizando-se a Lei da Similitude, instruída por Hahnemann, chegou-se à medicação Antimonium crudum para possível tratamento e profilaxia da Leishmaniose Visceral Canina. Portanto, no presente trabalho, visou-se o estudo da ação da medicação homeopática Antimonium crudum, in vitro, diretamente em promastigotas de Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, através do teste de MTT (brometo de 3-[4.5 dimetitiazol- 2- il) 2,5 difenil- 2 H- tetrazólio), que visa mensurar a atividade metabólica e a observação da curva de crescimento do parasito na forma promastigota, bem como a ação na infecção das Leishmanias em macrófagos da linhagem J774, em sua forma amastigota. Os resultados obtidos para a forma promastigota mostram que o estímulo homeopático não teve influência direta sobre os parasitos, tanto no teste de MTT quanto na curva de crescimento, corroborando os estudos que sugerem que a homeopatia não age diretamente sobre o parasito e sim em conjunto com o sistema imune do hospedeiro. Já nos resultados dos ensaios infectivos, observa-se, em geral, maior porcentagem de macrófagos infectados, assim como maior taxa de fagocitose nos grupos tratados com Antimonium crudum, o que sugere uma maior atividade dos mesmos levando à uma resposta imune secundária mais representativa e consequentemente, à destruição do antígeno. Quando se verificou o pré e o pós-tratamento de macrófagos, observou-se que as potências mais baixas, CH6 e CH12, parecem ter maior eficiência e quando a infecção já está instalada, a potência CH30 parece ter uma maior significância na profilaxia da infecção. Apesar disso, a resolução da doença dependerá da ação imunológica de cada hospedeiro, que irá controlar o crescimento e manutenção do parasito ou não / Currently, the search for treatments with medicines that are financially affordable, less aggressive to the host, and more humane in treating the patient, homeopathy is the most practical course. When it comes to one of the seven largest worldwide impact endemics, Leishmaniasis is a neglected public health complex with alarming estimates of new cases and deaths per year. In Brazil, urban Visceral Leishmaniasis also stands out because the reproductive cycle of this zoonotic disease can include the dog, which has always been present and in close contact with most Brazilian families. Dogs, when infected by the disease are euthanized as a rule from the Ministry of Health to prevent risks to the population. Using the Law of Similars, developed by Hahnemann, the medication Antimonium crudum was identified as possible treatment and prophylaxis for Canine Visceral Leishmaniasis. Therefore, the present work was to study the direct action of the homeopathic medicine Antimonium Crudum in vitro against the promastigotes of Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, through the MTT test (3- [4.5 - dimetitiazol- 2-yl) - 2.5 diphenyl tetrazolium H 2), which aims to measure the metabolic activity; the promastigote growth curve; as well as the performance of promastigote infectivity in J774 macrophages. The results from both the MTT assay as well as the growth curve show that the homeopathic stimulus did not directly influence the promastigote form of the parasites, corroborating studies that suggest that homeopathy has no direct action on the parasite, but may function together with the host\'s immune system. Treatment with Antimonium crudum led to a higher percentage of infected macrophages in the infectivity assays and a higher rate of phagocytosis, which suggests increased activity leading to a stronger secondary immune response and as a result, antigen destruction. Assays in which macrophages were treated before or after infection suggest that lower concentrations (CH6 and CH12) seem most effective when the cells are already infected, however a higher concentration (CH30) appears to have greater activity in preventing infection. Ultimately, the resolution of the disease depends on the immunological action of each host, which may control the growth and maintenance of parasite
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Leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica causada pela Leishmania infantum chagasi no município de Amapala, Valle, Honduras: caracterização imuno-histopatológica das lesões de pele / Non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania (L.) infantum chagasi in the municipality of Amapala, Valle, Honduras: immunohistotopathological characterization of skin lesions

Sandoval Pacheco, Carmen Maria 01 September 2017 (has links)
Nas Américas, em especial na América do Sul, a infecção por Leishmania (L.) infantum chagasi causa manifestações subclínicas e leishmaniose visceral (LV), a qual quando não tratada é potencialmente fatal. Na América Central, especialmente em Honduras, a leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica e a leishmaniose visceral são causadas pelo mesmo agente etiológico Leishmania (L.) infantum chagasi e ocorrem na mesma região geográfica. Pouco se conhece sobre o perfil da infecção humana por Leishmania (L.) infantum chagasi em Honduras, especialmente sobre a forma não ulcerada ou atípica, sendo assim, no sentido de compreender melhor a patogênese da infecção causada por esta espécie de parasito no município de Amapala (Valle) e Orocuina (Choluteca), Honduras, o presente estudo visou a caracterização histopatológica e da resposta imune celular in situ em lesões de pacientes com leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica. Foram utilizadas 20 biópsias de pele de pacientes com diagnóstico parasitológico confirmado por raspado de lesão corado por Giemsa e observado em microscópio ótico. A histopatologia foi avaliada em cortes histológicos corados por hematoxilina-eosina (HE) e a resposta imune por meio da reação de imunoistoquímica utilizando anticorpos primários para macrófagos (CD68), linfócitos T (CD4, CD8), células natural killer - NK (CD56), linfócitos B (CD20), óxido nítrico sintetase (NOS2) e interferon-gama (IFN-y. Microscopicamente as alterações histopatológicas mais significativas foram observadas na derme superficial e profunda caracterizando-se por um infiltrado inflamatório predominantemente linfohistiocitário de intensidades variável com arranjo difuso e, por vezes, associado à formação de granulomas epitelioides. A observação de formas sugestivas do parasito ocorreu em apenas 55 % dos casos. A análise imunoistoquímica das lesões confirmou a presença de células mononucleares no infiltrado inflamatório caracterizada principalmente pela presença de linfócitos TCD8+, seguido por TCD4+, macrófagos, linfócitos B e células NK. A grande densidade de células INF-y+ e a presença da enzima iNOS, responsável pela produção de óxido nítrico, molécula com atividade leishmanicida, em quase a totalidade dos macrófagos do infiltrado inflamatório, sugere uma resposta imune local bastante efetiva, que colabora para o controle do número de parasitos e consequentemente a evolução do tamanho da lesão / In America, especially in South America, infection by Leishmania (L.) infantum chagasi causes subclinical manifestations and visceral leishmaniasis (VL), which when untreated is potentially fatal. In Central America, especially in Honduras, non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis and visceral leishmaniasis are caused by the same etiologic agent Leishmania (L.) infantum chagasi and occur in the same geographic region. Little is known about the profile of human infection by Leishmania (L.) infantum chagasi in Honduras, especially on the non-ulcerated or atypical form. In order to better understand the pathogenesis of the infection caused by this species of parasite in the municipality of Amapala (Valle) and Orocuina (Choluteca), Honduras, the present study aim the characterization of histopathological changes and cellular immune response in situ in lesions of patients with non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis. Twenty skin biopsies from patients with parasitological diagnosis confirmed by scraping of Giemsa-stained lesion and observed using an optical microscope. Histopathology, was evaluated by hematoxylin-eosin (HE) and the immunohistochemistry using the primary antibodies to macrophages (CD68), T lymphocytes (CD4, CD8), natural killer cells - NK (CD56), B lymphocytes CD20), nitric oxide synthase (NOS2) and interferon-gamma (IFN-y). Microscopically, the most significant histopathological changes were observed in the superficial and deep dermis, characterized by a predominantly lymphohistiocytic inflammatory infiltrate of variable intensities with diffuse arrangement and sometimes associated with the formation of epithelioid granulomas; the observation of suggestive forms of the parasite occurred in only 55 % of the cases. The immunohistochemical analysis of the lesions confirmed the presence of mononuclear cells in the inflammatory infiltrate characterized mainly by the presence of T-CD8+ lymphocytes, followed by T-CD4+, macrophages, B lymphocytes and NK cells. The high density of INF-y+ cells and the presence of iNOS, enzyme responsible for the production of nitric oxide, molecule with activity leishmanicide, in almost all of the macrophages in the inflammatory infiltrate, suggest an effective local immune response that collaborate to the control in the number of parasites and consequently the evolution of the lesion
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Identificação e caracterização de tripanossomatídeos que infectam cães em área endêmica para leishmaniose visceral canina / Identification and characterization of the trypanosomatids infecting dogs in endemic areas for canine visceral leishmaniasis

Pereira, Vanessa Figueredo 16 December 2016 (has links)
A leishmaniose visceral canina (LVC) é uma grave zoonose, causada pela Leishmania infantum (syn. chagasi). O ciclo deste parasito é heteroxeno e a transmissão acontece principalmente pela picada da fêmea do vetor, dípteros da espécie Lutzomyia longipapis. O cão doméstico é o principal alvo das campanhas de controle da doença por ser a principal fonte de infecção para o vetor no ambiente urbano. O Ministério da Saúde adota testes sorológicos para a detecção de animais positivos; no entanto a sensibilidade e especificidade desses testes são questionáveis. Além das falhas inerentes a qualquer teste diagnóstico, no caso da LVC existem alguns entraves, especialmente pela distribuição geográfica, comum a outras doenças causadas por tripanossomas, e pela similaridade genética com os outros parasitas da mesma família. Nessas áreas de sobreposição pode haver tanto reação cruzada quanto co-infecção, dificultando a interpretação dos testes. No presente estudo, foram coletadas amostras de suabe conjuntival e sangue de cães em inquérito soroepidemiológico realizado no município de Ilha Solteira - SP. A presença de Leishmania spp. e Leishmania infantum foram testadas por PCR convencional e PCR em tempo real com primers direcionados ao kDNA de Leishmania spp. A avaliação sorológica foi realizada através da RIFI, e a identificação e caracterização dos tripanossomatídeos foi realizada através da PCR com primers ITS1. A SC-qPCR foi o teste que detectou o maior número de animais. De 204 cães utilizados no estudo, 19,12% (30/204) foram positivos na SC-qPCR. Na SG-qPCR foram 12,74% (26/204) de animais positivos. O teste que detectou o menor número de animais foi a SC-cPCR, com 10,78% (22/204). Enquanto na SG-cPCR obtivemos 13,23% (27/204) animais positivos. De 28 amostras selecionadas para o sequenciamento do gene ITS1, 19 (67,85%) foram 100 ou 99% similares à L. infantum, sugerindo que a maioria dos cães positivos para LVC estavam realmente infectados com esta espécie. Entretanto, 2 cães (7,14%), que tiveram suas amostras sequenciadas para tal gene, revelaram 99% de similaridade com Crithidia fasciculata. Dos testes avaliados, esses cães foram positivos apenas na SG-cPCR para Leishmania spp. Os resultados indicam que a SC-qPCR foi o teste mais eficaz em detectar amostras realmente positivas para L. infantum, e que se deve atentar ao fato de existirem outros tripanossomatídeos infectando os cães em área endêmica de LVC, podendo dificultar o diagnóstico adequado dos animais infectados por L. infantum. / Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a serious zoonosis caused by Leishmania infantum (syn. chagasi). The life cycle of this parasite is heteroxenous and the transmission occurs through the bite of the female sandfly, diptera species Lutzomyia longipalpis. The domestic dog is the main focus disease control campaigns, since it is the most important source of infection for the vector in urban environment. For positive dogs detection the health ministry uses serological tests, however the sensitivity and specificity of these tests are questionable. In addition to flaws inherent in any diagnostic test, in case of CVL there are some obstacles, especially by geographic distribution, common to other diseases caused by trypanosomes, and also by genetic similarity with other parasites of the same family. In areas of disease overlap, cross-reaction or co-infection may occur, making it difficult to interpret the results. In this study, conjunctival swab samples and whole blood of dogs were collected in seroepidemiological survey conducted in Ilha Solteira - SP. The presence of Leishmania spp. and Leishmania infantum were tested by conventional PCR and real-time PCR with Leishmania spp. kDNA-targeted primers. The serological evaluation was carried out by RIFI, and the identification and characterization of trypanosomatids was performed by PCR with ITS1 primers. SC-qPCR was the test that detected the largest number of animals. Of 204 dogs used in this study, 19.12% (30/204) were positive in SC-qPCR. In SG-qPCR 12.74% (26/204) animals were positive. The test that detected the lowest number of animals was SC-cPCR, with 10.78% (22/204). While in the SG-cPCR we obtained 13.23% (27/204) positive animals. From 28 samples selected for ITS1 gene sequencing, 19 (67.85%) were 100 or 99% similar to L. infantum, suggesting that most CVL positive dogs were infected with this species. However, two dogs (7.14%), which had their samples sequenced for the same gene, showed 99% similarity with Crithidia fasciculata. From the evaluated tests, these dogs were only positive in SG-cPCR for Leishmania spp. The results indicate that SC-qPCR was the most effective test to detect L. infantum positive samples , and it should be noted that there are other trypanosomatids infecting dogs in an endemic CVL area, which can difficult to diagnose animals properly infected by L. infantum.
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Leishmania infantum extracellular material and human invariant natural killer T cells : a functional study / Le matériel extracellulaire de Leishmania infantum et les lymphocytes T natural killer invariants : une étude fonctionnelle

Costa, Renata Cardoso Belo da 22 September 2017 (has links)
Les cellules iNKT (de l’anglais invariant Natural Killer T) constituent un sous-type particulier de lymphocytes T caractérisé par un profil de type inné. Ces cellules répondent rapidement à des antigènes lipidiques et glycolipidique présentés par le CD1d, une glycoprotéine exprimée par les différentes cellules présentatrices d'antigène. Suite à l’activation, les cellules iNKT sont capables de produire de grandes quantités de cytokines anti-inflammatoires et pro-inflammatoires et elles sont impliquées dans différentes maladies, telles que l'allergie, l'auto-immunité, le cancer et les infections, parmi lesquelles la leishmaniose. Les parasites protozoaires de les espèces Leishmania sont les agents causaux de la leishmaniose, une maladie tropicale négligée dont la manifestation la plus grave affecte les organes viscéraux et qui peut être mortelle si elle n'est pas traitée. Le succès de l'infection dépend de la capacité du parasite à maitriser la réponse immunitaire de l'hôte. Récemment, quelques groupes, y compris le nôtre, ont observé que les parasites Leishmania libèrent des vésicules extracellulaires (VE). Les VE sont formées par une bicouche membranaire lipidique, contenant des lipides, des protéines et du matériel génétique et elles peuvent transmettre des molécules dérivées des pathogènes aux cellules hôte sans contact direct entre les cellules. Les VE produites par les parasites Leishmania et aussi par d’autres protozoaires ont été associés à des effets pro-parasite car elles favorisent un environnement plus permissif à l'établissement de l'infection. Dans cette thèse, nous avons étudié l'effet du matériel extracellulaire (ME), correspondant aux VE et aux molécules non-associées aux VE, libéré par les promastigotes de L. infantum sur les cellules iNKT. Dans le début de ce travail, il a été observé que le ME de L. infantum empêche l'expansion ex-vivo des cellules iNKT humaines à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique. Cela a mis en évidence la communication entre les cellules iNKT et le ME de L. infantum, ce qui a été exploré par la suite. Le ME de L. infantum module la capacité très importante des cellules iNKT à produire des cytokines. En effet, le ME de L. infantum empêche la production des différentes cytokines par les cellules iNKT, comme par exemple IL-4 et IFNγ. De plus, nous avons aussi démontré que le ME de L. infantum compète avec l’α-GalCer, un agoniste très puissant des cellules iNKT, pour la liaison à la molécule CD1d, ce qui justifie l’effet inhibiteur dans l'activation des cellules iNKT. Nous avons aussi montré que les lipides qui sont présents dans chaque fraction du ME de L. infantum ont un rôle très important dans l’inhibition de l'activation et l'expansion des cellules iNKT. Ainsi, le ME de L. infantum, par ces lipides, peut participer à l’altération de l’activation des cellules iNKT dépendante du CD1d. Cela ajoute une nouvelle évidence de la contribution du ME de L. infantum dans la subversion de la réponse immunitaire de l’hôte. La communication entre le ME libéré par un pathogène et les cellules iNKT a été étudié pour la première fois, ce qui a suggéré un mécanisme de modulation de ces cellules qui n’avait jamais été décrit. Ce travail ouvre des perspectives pour l'étude de l'interaction de ME libéré par d'autres pathogènes avec des cellules iNKT. De plus, l'analyse des lipides contenus dans le ME de L. infantum pourra aboutir à la découverte de nouvelles molécules spécifiques pour inhiber les cellules iNKT. Cela apporterait des avantages significatifs dans les approches cliniques ciblant la modulation de l'activation des cellules iNKT. / The invariant natural killer T (iNKT) cells constitute a particular subset of T lymphocytes characterized by an innate-like profile. These cells rapidly respond to lipid and glycolipid antigens bound by the glycoprotein CD1d expressed by different antigen presenting cells. Once activated, they release large amounts of anti- and proinflammatory cytokines. Thus, iNKT cells are endowed with a remarkable immunomodulatory potential and they have been implicated in different disorders, such as allergy, autoimmunity, cancer and infection, among which is leishmaniasis. Leishmania spp. are a group of protozoan parasites that includes the causative agents of leishmaniasis. This is a neglected tropical disease in which the most severe form of manifestation affects visceral organs and could be fatal if left untreated. Importantly, the success of Leishmania infection relies on the capacity of the parasite to subvert host immune responses. Recently, a few groups, including ours, observed that Leishmania parasites release extracellular vesicles (EVs). EVs are vesicles formed by a lipid bilayer membrane, containing other lipids, proteins and genetic material on their surface as well as in their lumen. Due to their potential to transmit messages between pathogens and host cells without a direct cell contact, they have been a focus of great interest regarding infection. EVs derived from Leishmania and other protozoan parasites have been associated with pro-parasite effects, by creating a more permissive environment to the establishment of the infection. Herein, we studied the effect of the extracellular material (ExM), which encloses both EVs and vesicle-depleted material, released by L. infantum promastigotes in iNKT cells. In the first steps of this work, it was observed that L. infantum ExM is capable of impairing the expansion of human iNKT cells ex vivo from peripheral blood mononuclear cells. This evidenced the cross-talk between iNKT cells and L. infantum ExM that we explored further. L. infantum ExM also modulates the important capacity of iNKT cells to release cytokines, impairing the production of different cytokines, such as IL-4 and IFNγ by these cells. Furthermore, we also show that L. infantum ExM competes with α-GalCer, a potent iNKT cell agonist, for CD1d binding, which justifies its effect in the impairment of iNKT cell activation. Additionally, we also proved the lipids present in each fraction of L. infantum ExM take an important role in the inhibition of iNKT cell activation and expansion. Thus, L. infantum ExM, through their lipids, is suggested to participate in the impairment of CD1d-mediated activation of iNKT cells, adding a new evidence regarding the contribution of the parasite ExM to subvert host immune responses. To the best of our knowledge, this is the first time that the cross-talk between the ExM released by a microbe and iNKT cells was assessed, shedding light on a mechanism of iNKT cell modulation that remained unexplored so far. This opens new perspectives regarding the study of the interaction of the ExM released by other pathogens with iNKT cells. Moreover, a further analysis of the lipid content of L. infantum ExM might allow the finding of new inhibitory molecules specific to iNKT cells, which can bring significant advantages in clinical approaches targeting the modulation of iNKT cell activation.

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