Orientador: Iscia Teresinha Lopes Cendes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T06:36:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gonsales_MarinaCoelho_D.pdf: 5961380 bytes, checksum: 501b9df1659eb15a6a8545ae0943d967 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: As epilepsias são distúrbios cerebrais caracterizados por uma predisposição persistente para a geração de crises epilépticas, que são interrupções transitórias no funcionamento normal do sistema nervoso. Acredita-se que a maioria das epilepsias relacionadas com idade de inicio precoce possui etiologia presumivelmente genética. Sendo assim, elas representam um grupo para o qual o uso de testes genéticos seria potencialmente benéfico. Os objetivos principais deste trabalho foram: a caracterização das bases moleculares de diferentes formas de epilepsia da infância e da adolescência e a avaliação do potencial dos genes candidatos estudados para a utilização em testes genéticos para fins clínicos. A estratégia empregada foi à triagem de mutações nos seguintes genes: SCN1A, em pacientes com síndromes de Dravet e de Doose; SCL2A1 em pacientes com síndrome de Doose e epilepsias idiopáticas generalizadas (EIGs), especialmente a epilepsia mioclonica juvenil (EMJ); e EFHC1 e GABRA1, em pacientes com EMJ e outras formas comuns de EIGs. A triagem de mutações foi realizada por sequenciamento automático pela técnica de Sanger. As alterações potencialmente deletérias foram investigadas em um grupo controle composto por 100 indivíduos sem epilepsia. O potencial deletério das substituições que resultam em troca do resíduo de aminoácido na proteína codificada foi estimado utilizando-se diferentes algoritmos de predição. As mutações previamente descritas na literatura foram compiladas e analisadas quanto a sua provável localização na proteína e predição de efeito deletério. Analises por Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) foram realizadas para a detecção de variações no numero de copias de SCN1A. A analise de mutações no gene SCN1A revelou alterações potencialmente deletérias em 81% dos pacientes com síndrome de Dravet, e em apenas um paciente com síndrome de Doose. Esses dados, juntamente com os resultados das analises de compilação das mutações descritas na literatura, sugerem que o teste genético em SCN1A para fins clínicos seria altamente recomendável em indivíduos com síndrome de Dravet, mas não para os com síndrome de Doose típica. O gene SLC21A não parece estar envolvido na etiologia da síndrome de Doose e das EIGs em nossa casuística. A frequencia de alterações potencialmente deletérias no gene EFHC1 em indivíduos com EMJ foi relativamente baixa, sugerindo que esse gene não seja o principal causador dessa epilepsia, embora possa ser um fator de predisposição. Por fim, o gene GABRA1 não parece conferir predisposição para as EIGs comuns em nossa casuística / Abstract: Epilepsy is a brain disorder characterized by a long lasting predisposition to generate epileptic seizures, which are transient interruptions of normal brain function. Most epilepsies with early onset presumably have a genetic etiology. Thus, they represent a group for which the use of genetic testing would be potentially beneficial. The main goals of this study were to characterize the molecular basis of different forms of epilepsy in childhood and adolescence and to evaluate the potential clinical use of genetic testing in the context of these disorders. To achieve these goals we searched for mutations in the following genes: SCN1A in patients with Dravet and Doose syndromes; SLC2A1 in patients with Doose syndrome and idiopathic generalized epilepsies (IGEs), particularly juvenile myoclonic epilepsy (JME); and EFHC1 and GABRA1 in patients with JME and other common forms of IGEs. Mutation screening was performed by automated Sanger sequencing using capillary electrophoresis. Potentially deleterious nucleotide changes found were subsequently investigated in a control group of 100 individuals without epilepsy. In addition, the deleterious potential of amino acid changes identified was estimated using different prediction algorithms. Mutations previously described in the literature were compiled and analyzed regarding their putative location on the protein and predicted deleterious effect. Furthermore, Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) analyzes were performed to detect the presence of copy number variations in SCN1A. Our results showed potentially deleterious variants in SCN1A in 81% of patients with Dravet syndrome, but only in one patient with Doose syndrome. These data, along with the results of the compilation of mutations reported in the literature suggest that genetic testing for SCN1A is clinically relevant in Dravet syndrome, but not in typical Doose syndrome. SLC21A does not seem to be involved in the etiology of Doose syndrome and EIGs in our cohort. The frequency of potentially deleterious changes in EFHC1 in individuals with JME was relatively low, suggesting that this gene is not the main cause of this form of epilepsy, although it may be a predisposing factor. Lastly, GABRA1 does not seem to confer predisposition to common EIGs in our cohort / Doutorado / Fisiopatologia Médica / Doutora em Ciências

Orientador: Edi Lúcia Sartorato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:12:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DeMoraes_VanessaCristineSousa_D.pdf: 4935241 bytes, checksum: ce8c385da6e3872d30f08426c629d34d (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O alargamento do aqueduto vestibular (EVA) é uma malformação da orelha interna que pode ser identificado por tomografia computadorizada ou ressonância magnética. O EVA é um dos principais sinais clínicos da Síndrome de Pendred (PDS), uma doença genética com padrão de herança autossômico recessivo causada na maioria dos casos por mutações no gene SLC26A4. Além de EVA, o bócio e defeito na organificação do iodeto na tireóide são achados clínicos típicos da PDS. Por sua vez, mutações no gene SLC26A4 têm também sido observadas em indivíduos com surdez não sindrômica associada ao EVA. Recentemente os genes FOXI1 e KCNJ10 também foram implicados na PDS. O gene FOXI1 é um fator de transcrição do gene SLC26A4. Medições electrofisiológicas mostraram que a alteração da pendrina, proteína codificada pelo gene SLC26A4, em modelos animais levava indivíduos à surdez pela falta do potencial endococlear devido à perda de expressão de canais potássio. Sendo atribuído ao gene KCNJ10 a função de manutenção do potencial endococlear. Desta maneira, o presente estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de mutações nos genes SLC26A4, FOXI1 e KCNJ10 em 60 indivíduos brasileiros portadores de perda auditiva sensorioneural, associada ou não a alterações no aqueduto vestibular. Foram encontradas 14 diferentes alterações no gene SLC26A4, das quais 3 ainda não haviam sido descritas na literatura (P142L, G149R e C282Y) e 4 já haviam sido descritas, porém ainda não haviam sido caracterizadas funcionalmente (T193I, Q413R, L445W e R776C). Dessa forma, foi realizada a análise funcional e a co-localização celular da proteína Pendrina com estas 7 variações alélicas. Não foi encontrada nenhuma evidência de contribuição digênica relacionada ao gene FOXI1 e/ou KCNJ10, uma vez que nenhum paciente desta casuística com alteração no gene SLC26A4 apresentou mutações nesses genes. Além disso, no grupo composto por 30 indivíduos surdos que não apresentam EVA, ficou evidente que o rastreamento do gene SLC26A4 não foi suficiente para explicar a perda auditiva nesses pacientes, uma vez que foram encontradas apenas alterações em um alelo do gene. Por outro lado, no grupo formado por 30 indivíduos surdos que apresentam EVA, o rastreamento do gene SLC26A4 possibilitou o esclarecimento do diagnóstico etiológico da perda auditiva em 5 pacientes que apresentaram mutações nos dois alelos do gene SLC26A4 / Abstract: Enlargement of the vestibular aqueduct (EVA) is a malformation of the inner ear that can be identified by computed tomography or magnetic resonance imaging. EVA is the main feature of Pendred syndrome (PDS), a genetic disease with autosomal recessive inheritance pattern, in most cases caused by mutations in the SLC26A4 gene. Besides EVA, goiter and defective organification of iodide in the thyroid are other typical clinical signs of PDS. In turn, SLC26A4 gene mutations have been also observed in patients with non-syndromic deafness associated with EVA. Recently the genes FOXI1 and KCNJ10 were also implicated in the PDS. The FOXI1 gene is a transcription factor of SLC26A4 gene. Electrophysiological measurements in animal models showed that the mutated pendrin, the protein encoded by the SLC26A4 gene, led individuals to deafness by the lack of endocochlear potential due to loss of expression of potassium channels. Being assigned to the KCNJ10 gene the maintenance of endocochlear potential. Thus, the present study aimed to evaluate the occurrence of mutations in SLC26A4, and KCNJ10 FOXI1 genes in 60 Brazilian patients with sensorineural hearing loss, with or without changes in the vestibular aqueduct. We found 14 different mutations in SLC26A4 gene, of which 3 had not yet been described in the literature (P142L, G149R and C282Y) and 4 had already been described, but had not been characterized functionally yet (T193I, Q413R, L445W and R776C). Thus, we performed the functional analysis and cellular co-localization of Pendrin protein with these 7 allelic variants. We found no evidence of digenic contribution related to FOXI1 and/or KCNJ10 genes, since no patient in with mutations in SLC26A4 gene showed mutations in these genes. In addition, the screening of SLC26A4 gene in 30 deaf individuals with no EVA was not sufficient to explain the hearing loss in these patients, since mutations were found only in one allele of the gene. On the other hand, the screening of SLC26A4 gene in 30 deaf individuals with EVA allowed the elucidation of the etiology of hearing loss in 5 patients with mutations in both alleles of this gene / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Irene Lorand-Metze, Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T22:11:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mello_MarianaRezendeBandeirade_D.pdf: 5178635 bytes, checksum: 8ac6a3134a752be699d5f1d5d6d8ba71 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A classificação atual da OMS para LMA reconhece a importância da pesquisa de anormalidades genéticas para diagnóstico e manejo adequado do paciente. A textura da cromatina dos núcleos está relacionada com fenômenos epigenéticos como a metilação. Nosso estudo teve como objetivos estudar o status de metilação dos genes CDKN2B (p15), CDKN2A (p16), CDKN1C (p57), TP73 (p73), ESR1 (ER) e ABCB1 (MDR1), verificar a freqüência das mutações nos genes FLT3 e NPM1 e analisar parâmetros da morfometria e textura da cromatina. Verificamos também a associação entre o perfil imunofenotípico, textura nuclear e características moleculares. Além disso, analisamos a relação destas variáveis com a sobrevida global. Foram estudados 106 pacientes com LMA de novo (19 com LMA M3 e 87 com outros subtipos de LMA) diagnosticados no nosso Serviço. Nas LMAs M3 foi encontrado 15,8% de pacientes com FLT3-TKD e 10,5% FLT3-ITD. Os pacientes com LMA M3 foram mais jovens, apresentaram menor número de leucócitos e plaquetas. Tiveram também maior expressão de CD45 e MPO do que os outros subtipos de LMA. Os pacientes com LMA M3 tiveram melhor sobrevida que os outros subtipos. Dentre esses pacientes as LMA M3 FLT3-ITD+ apresentaram pior sobrevida. O desvio padrão do nível de cinza foi um fator independente de prognóstico. Em relação aos casos de LMA não M3 foi encontrado 23,3% dos pacientes com presença da mutação FLT3-ITD, 8,1% FLT3- TKD e 29,1% da mutação no gene NPM1. As mutações nos genes NPM1 e FLT3 foram mais frequente em pacientes com cariótipo normal. Dos pacientes com outros subtipos de LMA, 3,4% apresentaram metilação no gene ESR1, 26,4% no gene CDKN2B, 11,5% no gene CDKN2A, 1,1% no CDKN1C e 23,0% no gene TP73. Os pacientes que apresentaram o gene CDKN2B metilado tiveram menor dosagem de hemoglobina e expressão do CD13. Os pacientes com metilação no gene TP73 apresentaram menor contagem de leucócitos, expressão de CD45, CD13, CD33 e MPO. Os pacientes com LMA sem maturação apresentaram menor R245. Na análise de sobrevida dos pacientes com LMA, excluindo M3, os casos com NPM1+ FLT3-ITD- tiveram melhor sobrevida. O R245, a entropia e a mutação FLT3-ITD foram fatores independentes de prognóstico. A frequência das mutações e de metilação encontrada foram semelhantes a outros estudos. O R245 pode ser uma variável nova para avaliação da textura da cromatina / Abstract: The WHO classification for acute myeloid leukemia (AML) has emphacized the cytogenetic and molecular aspects for diagnosis and proper management of the patients. The nuclear chromatin texture is related to epigenetic phenomena such as methylation. In our study we examined the frequency of mutations in FLT3 and NPM1 genes, the methylation status of genes CDKN2B (p15), CDKN2A (p16), CDKN1C (p57), TP73 (p73), ESR1 (ER) and ABCB1 (MDR1) and analyzed features of nuclear morphometry and chromatin texture. We studied the association between the immunophenotypic profile, nuclear texture and molecular features. In addition, we analyzed the relationship between these variables and overall survival of the patients. We studied 106 patients with de novo AML: 19 with promyelocytic leukemia (APL) and 87 with other subtypes of AML diagnosed in our Service. Patients with APL were younger, had lower peripheral leukocyte counts and platelets. They also showed a higher expression of CD45 and MPO than other subtypes of AML. Among them, 15.8% presented FLT3-TKD and 10.5% showed FLT3- ITD. CDKN2B was methylated in 21.0%, CDKN2A in 21.0% and TP73 in 10.5% of the patients. Methylation in CDKN1C, ER and MDR1 were not found. Patients with APL had better survival than other subtypes. The standard deviation of gray level was an independent factor of prognosis. Among the other cases of AML, we found the FLT3-ITD mutation in 23.3%, the FLT3-TKD mutation in 8.1%, and 29.1% of the patients had mutation of the NPM1 gene. Mutations in NPM1 and FLT3 were more frequent in patients with a normal karyotype. Among these patients, 3.4% had methylation of the ESR1 gene, 26.4% in CDKN2B, 11.5% in CDKN2A, 1.1% in the CDKN1C and 23.0% in TP73. Patients with methylated CDKN2B showed lower hemoglobin levels and a lower expression of CD13. Patients with methylation in the TP73 gene had lower peripheral leukocyte counts and lower expression of CD45, CD13, CD33 and MPO. Patients with AML without maturation had lower R245. In the survival analysis of patients with AML, except APL, the cases with NPM1+ FLT3 ITD- had better survival. The R245, entropy and FLT3-ITD mutation were independent predictors of prognosis. The frequency of mutations and methylation found were similar with other studies. The R245 can be a new variable for evaluation of chromatin texture / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientadores: Laura Sterian Ward, Márcio José da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T06:32:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_AlineCarolinaDeNadaida_M.pdf: 2484854 bytes, checksum: 084b0bdeea2ea5baa391d3e9acfc9841 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O câncer diferenciado de tiroide (CDT) é a malignidade endócrina mais comum e a quarta mais frequente entre as mulheres Brasileiras. O carcinoma papilífero da tiroide (CPT) representa 80-90% de todas as malignidades tiroidianas. As mais importantes vias envolvidas na formação e progressão do CDT são as vias MAPK e PI3K/AKT. O gene RAS possui como uma de suas vias efetoras a via PI3K/AKT, a qual tem um papel importante na sobrevivência e na proliferação celular. A mutação Q61R do gene NRAS é a mais frequentemente encontrada em CDT. O gene BRAF possui mutações pontuais que são identificadas em 40-45% nos CPT, sendo a V600E a mais comum encontrada nesta neoplasia e responsável por manter e promover a progressão a tumores mais agressivos do CPT. O gene AKT possui um papel importante na via de sinalização PI3K, regulando a sobrevivência, proliferação e crescimento celular, sendo que a isoforma AKT1 possui um papel de pró-motilidade em CDT. Para investigar a utilidade clínica das vias MAPK e PI3K/AKT no diagnóstico e prognóstico do CDT foi realizada a genotipagem da mutação dos genes NRAS, HRAS e BRAF e o seqüenciamento automático do éxon 3 do gene AKT1 em 281 pacientes com nódulos tiroidianos. Destes, 190 eram tumores benignos, incluindo 121 hiperplasias e 69 adenomas foliculares, e 91 eram tumores malignos, sendo 60 carcinomas papilíferos variante clássica, 26 carcinomas papilíferos variante folicular, 01 carcinoma papilífero variante células altas, 02 carcinomas foliculares e 02 carcinomas anaplásicos. Todos os pacientes foram tratados e seguidos de acordo com um protocolo padrão por 12 a 87 meses (38,06±19,9 meses). A genotipagem do códon 61 do gene NRAS mostrou que indivíduos com genótipo CT possuem maior risco de desenvolverem o CPT de variante folicular (p=0,025). Já a mutação de HRAS não teve nenhuma utilidade clínica. A presença do genótipo heterozigoto da mutação de BRAF teve associação com o desenvolvimento do CPT (p<0,001). Observamos alterações genéticas no éxon 3 do gene AKT1 em 114 (41,76%) de 273 pacientes. Foram encontradas 3 alterações intrônicas (rs2494738, rs3730368, rs3730358) e uma exônica (L52R). A presença da alteração rs2494738 mostrou associação com ausência de invasão tumoral (p=0,004) e a rs3730368 como fator de proteção no desenvolvimento de tumores malignos (p=0,046), enquanto que o genótipo selvagem se relacionou com o desenvolvimento de tumores benignos menores de 2cm (p=0,033). A presença da alteração rs3730358 se associou com tumores malignos menores de 2 cm (p=0,032). Já a presença da alteração L52R apareceu em tumores malignos (p=0,004) e encapsulados (p=0,006), em tumores benignos menores de 2cm (p=0,029) e de 2-4cm (p=0,0387). Portanto, podemos concluir que existem alterações genéticas importantes que possam influenciar no desenvolvimento do CDT, sugerindo que estas alterações possam servir como possíveis marcadores de diagnóstico. Porém neste estudo estas alterações não tiveram relação com prognóstico, talvez pelo baixo tempo de seguimento destes pacientes / Abstract: Differentiated thyroid cancer (DTC) is the most common endocrine malignancy and the fourth most frequent among Brazilian women. Papillary thyroid carcinoma (PTC) represents 80-90% of all thyroid malignancies. The most important pathways involved in the formation and progression of DTC are the MAPK and PI3K/AKT pathways. The RAS gene has as one of its effectors the PI3K/AKT pathway, which plays an important role in the survival and proliferation. The mutation Q61R of NRAS gene is most often found in DTC. The BRAF gene mutations that have been identified in 40-45% in the CPT, and the V600E found this the most common malignancy and is responsible for maintaining and promoting the progression to more aggressive tumors of the PTC. The AKT gene has a role in signaling fosfotidilinositol-3 kinase (PI3K) pathway regulating the survival, proliferation and cell growth, and the AKT1 isoform plays a pro-motility in DTC. To investigate the clinical utility of the MAPK and PI3K/AKT pathways in the diagnosis and prognosis of DTC was performed by genotyping of the mutations of NRAS, HRAS and BRAF genes and sequencing of exon 3 of the AKT1 gene in 281 patients with thyroid nodule. Of these, 190 were benign, including 121 hyperplasias and 69 follicular adenomas, and 91 were malignant tumors, including 60 classic variant papillary carcinomas, 26 follicular variant papillary carcinomas, 01 tall cell variant of papillary carcinoma, 02 follicular carcinomas and 02 anaplastic carcinomas. All patients were treated and followed according to a standard protocol for 12 to 87 months (38.06 ± 19.9 months). Genotyping of codon 61 of NRAS gene showed that patients with CT genotype have increased risk of PTC developed the follicular variant (p=0.025). Already HRAS mutation had no clinical utility. The presence of the heterozygous genotype of the BRAF mutation was associated with the development of PTC (p <0.001). We observed genetic alterations in exon 3 of the AKT1 gene in 114 (41.76%) of 273 patients. We found three intronic changes (rs2494738, rs3730368, rs3730358) and one exonic (L52R). The genetic alteration rs2494738 showed no association with tumor invasion (p=0,004) and the rs3730368 as a protective factor in the development of malignant tumors (p=0,046), whereas the wildtype genotype associated with benign tumors smaller than 2 cm (p=0,033). The presence of the alteration rs3730358 was associated with malignant tumors smaller than 2 cm (p=0,032). The presence of the alteration L52R appeared in malignant tumors (p=0,004) and encapsulated (p=0,006), and in benign tumors smaller than 2 cm (p=0,029) and 2-4cm (p=0,0387). Therefore, we conclude that there are important genetic alterations that may influence the development of the CDT, suggesting that these changes may serve as potential diagnostic markers, but in this study these changes did not correlate with prognosis perhaps by the low follow-up of these patients / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Clínica Médica

Orientadores: Marcos Antônio Machado, Alessandra Alves de Souza / O último capítulo está em inglês / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T01:07:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_MarianadeSouzae_D.pdf: 4833630 bytes, checksum: 8baede33597b26761daf544db4af1291 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Xylella fastidiosa é o agente causal da clorose variegada dos citros (CVC), da doença de Pierce em videiras e doenças em muitas outras culturas. Com o seqüenciamento completo do genoma de várias linhagens deste organismo, a função de cada gene , principalmente os ligados à virulência ainda estão pouco caracterizados. A fixação da X. fastidiosa nos vasos do xilema e no canal alimentar dos insetos vetores, cigarrinhas, é necessária para a virulência, formação de biofilme e transmissão desta bactéria. Uma vez que o gene pilC esta envolvido na formação do pili tipo IV e este por sua vez é importante na motilidade e formação do biofilme, neste presente trabalho é mostrado dados fenotípicos obtidos com a interrupção de pilC na linhagem J1a12 de X. fastidiosa. A interrupção do gene pilC na linhagem J1a12 foi obtida por recombinação homóloga utilizando o plasmídeo pUCBM21oriC. Reação de polimerase em cadeia (PCR) e análises por Southern blot dos mutantes indicaram que o gene cromossômico foi substituido pelo gene truncado e com isso a produção da proteína correspondente, PilC, não foi indicada pelo Westen blot. Microscopia eletrônica de varredura transmissão revelou que o tamanho e o número das fímbrias foi reduzido para os mutantes de pilC de X. fastidiosa. Esses mutantes não mostraram capacidade de colonização das regiões acima do ponto de inoculação dos vasos do xilema da planta de laranja Pêra e, além disso, não apresentaram formação de biofilme. No estudo da formação do biofilme, a caracterização da expressão de proteínas foi realizada através do uso da eletroforese de primeira e segunda dimensão e a espectrometria de massa encontramos um total de 456 proteínas expressas na condição de biofilme maduro e 387 proteínas no crescimento planctônico, sendo que, o biofilme apresentou 37% (ou 144 proteínas) diferencialmente expressas em relação ao crescimento planctônico. As alterações encontradas no estado fisiológico das células em biofilme podem ser explicadas pela diferença no padrão de proteínas encontrado. Essas proteínas são produtos correspondentes à 31 genes presentes no biofilme maduro da linhagem isolada de citros 9a5c, esses foram envolvidos na adaptação, no metabolismo e na adesão dessa bactéria. Foi observado superexpressão de genes relacionados ao quorum sensing, comprovando a existência da comunicação entre células e com isso, o desenvolvimento da estruturação do biofilme (biofilme maduro) levando à obstrução dos vasos e desenvolvimento da doença / Abstract: Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis (CVC), Pierce's disease in grapevines and other diseases in many crops. With the full genome sequencing of several strains of this organism, the function of each gene, particularly those related to virulence are still poorly characterized. The setting of X. fastidiosa in xylem vessels and the alimentary canal of insects, leafhoppers, is required for virulence, biofilm formation and transmission of this bacterium. Once the gene is involved in the formation pilC of type IV pili and this in turn is important in motility and biofilm formation, this work is shown in this phenotypic data obtained with the interruption in the strain of pilC J1a12 X. fastidiosa. The interruption of the gene pilC in the strain J1a12 was obtained by homologous recombination using the plasmid pUCBM21oriC. Polymerase chain reaction (PCR) and Southern blot analysis of mutants indicated that the chromosomal gene was replaced by the truncated gene and thereby producing the corresponding protein, PilC was not indicated by Western blot. Scanning transmission electron microscopy revealed that the size and number of fimbriae was reduced for the mutants of pilC X. fastidiosa. These mutants showed no ability to colonize the region above the inoculation of the plant xylem vessels of Pera and, moreover, did not show biofilm formation. In the study of biofilm formation, the characterization of protein expression was performed by using electrophoresis of first and second dimension and mass spectrometry we found a total of 456 proteins expressed in condition of mature biofilm and 387 proteins in planktonic growth, and , the biofilm showed 37% (or 144 proteins) differentially expressed in relation to planktonic cells. The changes found in the physiological state of cells in biofilm can be explained by the difference in the pattern of proteins found. These proteins are products corresponding to 31 genes present in the mature biofilm of strain isolated from citrus 9a5c, they were involved in the adaptation, metabolism and adhesion of bacteria. We observed overexpression of genes related to quorum sensing, proving the existence of communication between cells and thus, the development of the biofilm structure (mature biofilm) leading to obstruction of vessels and development of disease / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:59:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_natalia_dias_gomes_da_silva.pdf: 607017 bytes, checksum: 8181995ebd6e935c42ebf574ca9486d6 (MD5) Previous issue date: 2013-03-04 / Blackberry is belonging to the genus Rubus, and cultive this has great potential for growth, however, still seek improvement programs cultivars with higher productivity, taste sweeter, larger fruits, plants with upright stems and mostly thornless. Because of these needs, gamma radiation and micropropagation technique, become a possibility in the induction, monitoring and storage germplasm. With this it aimed to radiate with different doses of gamma rays, explants of blackberry established in vitro, to induce changes compared to non-irradiated explants, and seek alternatives that enable the storage of germplasm blackberry black, stored for 120 days at a temperature of 6 ° C and subsequently verify the return rate of multiplication of explants. For this, containing an axillary bud explants were irradiated with different doses of gamma radiation (0, 5, 10, 20 and 40 Gy) and cultured in vitro. For the experiment of slow growth were also used micro-cuttings with one bud, which were cultured for 30, 60, 90 and 120 days at 6 ° C and grown in culture medium with different concentrations of sucrose (15, 30 and 45 g L-1) and presence or absence of mannitol and subsequently transferred to a growth chamber with a temperature of 24 ° C for 30 days. For a percentage multiplication, length of shoot and root growth was observed with increasing radiation for both cultivars, however the length of roots increased up to 20 Gy, for both cultivars. The number of roots was increased to 5 Gy, followed by reduction according to the increase of the radiation dose for the experiment slow growth was observed a gradual increase in multiplication rate until 120 days, the presence of mannitol and sucrose in the medium culture reduced the rate of multiplication, for both cultivars, indicating the importance of these osmoregulators in slow growth. After returning to growth room, it was found that the explants returned their metabolic activities, returning the rates indicated multiplication per explant. Thus, it can be concluded that the radiation causes changes in explants of blackberry and adding osmorregulators in the culture medium provides a reduction in the rate of proliferation during the storage period the cold, but does not affect the rate multiplied after returning to room growth. / A amoreira-preta é pertencente ao gênero Rubus e o seu cultivo apresenta grande potencial de crescimento. No entanto, programas de melhoramento ainda buscam cultivares com maior produtividade, sabor mais doce, maior tamanho das frutas, plantas com hastes eretas e principalmente sem espinhos. Devido a essas necessidades, a radiação gama e a técnica de micropropagação, tornam-se uma possibilidade na indução, acompanhamento e armazenamento de germoplasma. Com isso o presente trabalho teve como objetivo irradiar, com diferentes doses de raios Gama, explantes de amoreira-preta estabelecidos in vitro, a fim de induzir alterações, além de buscar alternativas que possibilitem o armazenamento do germoplasma de amoreira-preta, por até 120 dias a 6°C. Para isso, explantes contendo uma gema axilar foram irradiados com diferentes doses de radiação gama (0, 5, 10, 20 e 40 Gy) e cultivados in vitro. Para o experimento de crescimento lento também foram usados segmentos nodais contendo uma gema, os quais foram cultivados por 30, 60, 90 e 120 dias a 6°C em meio de cultura com diferentes concentrações de sacarose (15, 30 e 45 g L-1), presença ou ausência de manitol e posteriormente transferidos para sala de crescimento, com temperatura de 24°C, por 30 dias. Para a percentagem de multiplicação, comprimento de parte aérea e de raízes foi observado crescimento com aumento da radiação para ambas cultivares, contudo o comprimento de raízes aumentou até 20 Gy, para ambas cultivares. O número de raízes, foi crescente até 5 Gy, seguido de redução conforme aumento da dose de radiação. No crescimento lento, foi observado um aumento gradual na taxa de multiplicação até os 120 dias, a presença do manitol e da sacarose no meio de cultura reduziu a taxa de multiplicação, para ambas cultivares, evidenciando a importância destes osmorreguladores na redução do crescimento. Após o retorno à sala de crescimento, foi verificado se os explantes retornaram as taxas de normais multiplicação. Com isso, pode-se concluir que a radiação promove alterações em explantes de amoreira-preta e que a adição de osmorreguladores no meio de cultura proporciona redução na taxa de multiplicação, durante o período de armazenamento ao frio, porém não afeta a taxa de multiplicação após o retorno as condições padrões em sala de crescimento.

Resumo não disponível

Orientador: Maria Beatriz Puzzi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T22:49:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souto_MariamPatriciaAuada_D.pdf: 7783740 bytes, checksum: ba776e2125f132647d619bed067b9da5 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A síndrome de Sjögren-Larsson (SSL) é uma ictiose congênita com alterações neurológicas decorrentes da deficiência enzimática da enzima aldeído graxo desidrogenase (FALDH). Mutações no gene ALDH3A2 são responsáveis pela doença. A proposta foi estudar os aspectos clínicos, histológicos, estruturais e moleculares de dez pacientes com SSL. Métodos: Foram selecionados dez pacientes com SSL de quatro famílias distintas. Foi realizada ressonância magnética cerebral (RM) em oito pacientes e, em sete destes, também espectroscopia de prótons; os resultados foram comparados com a espectroscopia de sete voluntários sadios. Foram coletadas biópsias de pele de cada paciente e pele sã de 17 voluntários. Os espécimes foram corados com hematoxilina-eosina e imagens digitais foram adquiridas a partir do exame histológico de rotina; a luminância em escala de cinza foi analisada utilizando método quantitativo de análise de textura de imagem digital: transformada rápida de Fourier, calculada a partir dos valores do momento de inércia (função harmônica) das frequências espaciais nas direções vertical e horizontal da camada espinhosa da epiderme. Amostras de pele de nove pacientes com SSL também foram obtidas para cultura de fibroblastos utilizando método padrão para dosagem da enzima FALDH. Para a extração de DNA genômico foi coletado sangue total periférico de nove pacientes. Os fragmentos foram amplificados por PCR. Os resultados obtidos foram analisados e comparados com a seqüência normal de DNA. Resultados: A mutação encontrada foi a 1108-1G?C no intron 7/exon 8. Os pacientes exibiram diferenças na presença e intensidade dos sinais e sintomas da doença (prurido, retardo mental, espasticidade, fotofobia e alterações da retina). No exame de RM dos pacientes com SSL foi observada desmielinização da substância branca profunda; na espectroscopia, presença de pico anormal de lípídios. O estudo da textura da camada espinhosa da epiderme, sob a Transformada de Fourier, mostrou amplitudes de função harmônica mais largas no grupo com SSL na direção vertical e não na direção horizontal, correspondendo a núcleos e nucléolos maiores e ao espessamento focal da carioteca dos ceratinócitos. Conclusões: As manifestações clínicas e histológicas da SLS não são exclusivamente decorrentes da mutação c.1108-1G>C, mas também expressão de outras modificações genéticas e influências ambientais. A mutação descrita pode ser classificada como uma causa comum da doença no Brasil. Os achados de textura podem ser explicados pela maior síntese de DNA na epiderme na SSL, tendo sido descrita, também, uma produção mais rápida da camada córnea e uma renovação celular 3,5 vezes o normal / Abstract: Background: Sjögren-Larsson syndrome (SLS) is an autosomal recessive disorder characterized by ichthyosis, mental retardation, and spasticity. Various mutations in the ALDH3A2 gene that codes for fatty aldehyde dehydrogenase (FALDH) are responsible for the disease but the genotype-phenotype relationships are undefined. Objectives: The purpose of this study was to describe ten individuals with Sjögren-Larsson syndrome from four families representing the first cohort of Brazilian patients defined at the molecular level and investigate whether image analysis of routine H&E skin sections using fast Fourier transformation (FFT) could detect structural alterations in SLS. Patients and methods: A 5-mm punch biopsy for histologic analysis was obtained under local anesthesia from each patient. Similar biopsies were obtained from age- and anatomical site-matched from 17 controls. The samples were stained with haematoxylin and eosin and observed under a light microscope. Digital images of routine histologic sections were taken and their gray scale luminance was analyzed by FFT. The inertia values were determined for different ranges of the spatial frequencies in the vertical and horizontal directions. Skin biopsies were also obtained from nine patients with SLS for establishing fibroblast cultures using standard methods to determine FALDH enzyme activity. MR imaging was performed in eight patients. Singel-voxel proton MR spectra were acquired from cerebral white matter in seven patients with SLS and in seven controls. Total genomic DNA was extracted from peripheral blood of nine patients using standard methods. ALDH3A2 exons and their flanking sequences were amplified by PCR and sequenced. Results: All patients were homozygous for a unique c.1108-1G>C splice-site mutation and displayed a profound reduction in fatty aldehyde dehydrogenase enzyme activity. The patients exhibited a moderate-to-severe form of Sjögren-Larsson syndrome with respect to mental retardation, spastic diplegia and ichthyosis. Within this phenotypic context, patients varied, even within a family, in the presence of pruritus, thickness of the epidermal granular layer, retinal glistening white dots and photophobia. Brain MR imaging revealed retardation of myelination. Proton MR spectroscopy of white matter revealed abnormal high-lipid peak. The study of epidermal spinous layer texture by Fast Fourier Transform showed higher amplitudes in the vertical direction in SLS patients, corresponding to greater nuclei and nucleoli, higher number of nucleoli and focal thickening of keratinocytes¿ carioteca. Conclusion: We concluded that the latter clinical features are not strictly determined by the c.1108-1G>C mutation, but are subject to modification by other genetic/environmental factors. The c.1108-1G>C mutation may be classified as a common cause of Sjögren-Larsson syndrome in Brazil. The textural findings are in keeping with higher DNA synthesis and a 3.5x turn over that were demonstrated in SLS epidermis / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Antonio Condino Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:07:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AgudeloFlorez_PiedadMatilde_D.pdf: 7673448 bytes, checksum: 14c8d7fc8437933b652076b21b9f6ff6 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Doença Granulomatosa. Crônica (DOC) é uma imunodeficiência caracterizada por infecções recorrentes graves. Os defeitos moleculares que lavam a DGC são geralmente devidos a mau funcionamento, ausência o baixa expressão de um dos componentes do sistema NADPH oxidase. Este trabalho analisou o uso de RT-PCR para a triagem de defeitos moleculares responsáveis por DGC ligada ao X em 8 pacientes. RNA total foi preparado de linfócitos B transformados com vírus de Epstein-Barr e transcrição reversa com hexâmeros randomicos. O cDNA resultante foi amplificado por PCR com oligonucleotídeos específicos para 3 regiões exônicas abrangendo toda a extensão do gene. Com esta estratégia foi possível a detecção da expressão defeituosa de gp91-phox em 7 pacientes. Concluímos que a análise por meio de RT-PCR, um método alternativo menos complexo, rápido e econômico foi apropriado para detecção inicial de defeitos moleculares em 7 de 8 pacientes com DOC ligada ao X. Posteriormente investigamos em detalhe os defeitos genetico-moleculares de 7 crianças não relacionadas com DGC ligada ao X. Todos os pacientes foram procedentes do Chile e Brasil. Encontramos uma inserção c.1267_1268insA no paciente JY no exon 10 levando a uma mutação tipo "&ameshill:". Esta mutação é um novo registro na literatura. Detectamos duas substituições "nonsense", uma no paciente PT, c.95 G>A no exon 2 que leva a um códon de parada W28X e outra no paciente MF, c.229 C>T no exon 3 que leva a um códon de parada R73X. Em 4 casos, nos pacientes IC, Vin, RS, GO, diferentes erros de "splicing" foram encontrados. Dois pacientes apresentaram uma subtitução c.264 G> A ao final do exon 3. Os dois restantes apresentaram uma subtitução c.1326 + 1 G>A no intron 10 e outra subtitução c.1164 - 2 A>O no intron 9. Esta última mutação também é um novo registro na lit_ratura. As mutações identificadas na proteína gp91-phox confirmam um alto grau de heterogeneidade molecular como é relatado em outros grupos étnicos e a importância de investigar os defeitos moleculares em diferentes populações. Contrastando com esta heterogeneidade, a DGC associada com defeitos na proteína p47-phox, apresentam pouca variabilidade. Neste estudo, os pacientes analisados, dois irmãos, mostram uma deleção homozigota OT (L}.GT) no começo do exon 2. L Também é analisado o caso de um paciente com infecções recorrentes que inicaJmente recebeu o diagnóstico de deficiência de G6PD. Estudos moleculares mostraram que a deficiência de G6PD foi devida a uma mutação 202 G_A, variante Afi:icana. . O paciente também mostrou uma reduzida atividade da explosão respiratória como observado em DGC ligada ao X. A análise do gDNA mostrou uma subtitução 264 G_A na região do splicing do exon 3 da proteína gp91-phox. A seqüência do cDNA detectou uma deleção do exon 3, levando a uma mutante inestável ou não funcional da proteina gp91-phox e resultando no fenótipo de DGC ligada ao X. Propomos que ftente a um paciente com deficiência de G6PD com episódios de infecções graves considerem a possibilidade de um defeito na atividade fagocítica e uma eventual associação com DGC / Abstract: Chronic granulomatous disease (CGD) is a rare primary immunodeficiency characterized by ear1y onset recurrent severe infections. The molecular defects causing CGD are generally due to the absence, low expression or malfunctioning of one of the NADPH oxidase components. This work analyzed the potential use of reverse transcription (RT)PCR for screening molecular defects responsible for X-linked CGD in 8 Brazilian patients. Total RNA was prepared from EBV-transformed B-lymphocytes and reverse transcribed using random hexamers. The resultant cDNA was PCR-amplified by specific and overlapping pairs of primers regarding 3 exonic regions of gp91-phox gene. This strategy made possible the detection of defective gp91-phox expression in 7 patients. We conclude that RT -PCR analysis, a less complex, more economic and faster alternative method, was appropriate for screening molecular defects in 7 out 8 X-linked CGD patients. We further investigated the molecular genetic defects in 7 unrelated patients with X-linked CGD, from Chile and Brazil. We found an insertion c.1267_1268insA in exon 10 leading to a frameshift mutation. This mutation is a novel reporto we detected two single base-pair substitutions that lead to nonsense mutations. The first was a c.95 G>A substitution in the exon 2 which predicts a stop codon W28X and the second was a c.229 C> T substitution in the exon 3 which predicts a stop codon R73X. We also identified different splice site mutations in 4 cases. Two patients presented a c.264 G> A substitution at the end of exon 3. The remaining two patients presented either a c.1326 + 1 G>A substitution in intron 10 or a c.1164 - 2 A>G substitution in intron 9. This Iast mutation is also novel. The gp91-phox mutations identified in these patients show a high degree of molecular heterogeneity as reported in other ethnic groups and the importance to investigate molecular genetic defects in diferent populations. Contrasting with the heterogeneity of mutations observed in X-linked CGD, the disease associated with defect in p47-phox shows less variability. In this report, the patients with CGD, two sib1ings, show a homozygotous dinucleotide GT deletion (.6.GT) at the beginning of exon 2. We also reported a child with recurrent infections who initially received the diagnosis of G6PD deficiency. Molecular studies showed that the G6PD deficiency was due a 202 G-+A mutation, the A- variant common in African ethnic groups. The proband also exln'bited severely impaired respiratory burst activity, as observed in X-linked CGD. Sequence analysis of genomic DNA showed a 264 G-+A substitution at the 3' splice junction of gp91-phox exon 3. The cDNA sequence showed a deletion of gp91-phox exon 3, giving rise to an unstable or nonfunctional mutant gp91-phox and to the phenotype of Xlinked CGD. We propose that clinicians in face of a patient with G6PD deficiency under a severe infection episode consider the possibility of temporary or permanent impairment of the phagocytes microbicidal activity, and the eventual association of G6PD deficiencyand chronic granulomatous disease / Doutorado / Saude da Criança e do Adolescente / Doutor em Saude da Criança e do Adolescente

Orientador: Vitor Barbanti Pereira Leite / Banca: Jorge Chahine / Banca: Luis Gustavo Dias / Banca: Nelson Augusto Alves / Banca: Pedro Geraldo Pascutti / Resumo: As interações eletrostáticas desempenham um papel crucial no enovelamento de proteínas. Além disso, essas interações entre resíduos carregados são fundamentais para a estabilidade proteica e para que as proteínas realizem suas funções biológicas. A distribuição de carga nessas macromoléculas é definida pelos tipos de resíduos que as compõem e pelas condições do ambiente a que elas estão sujeitas, como, por exemplo, concentração de sal e pH. Compreender como esses aspectos podem governar a estabilidade e o enovelamento de proteínas é de fundamental importância no desenvolvimento racional de aplicações biomédicas e biotecnológicas. No presente estudo, utilizou-se modelos computacionais simplificados visando investigar esses efeitos eletrostáticos nos processos de enovelamento, na estabilidade térmica e na presença e ausência de mutações do seguinte conjunto de proteínas: o domínio N-terminal da proteína ribossomal L9 (NTL9); a variante da proteína G (1PGB-QDD), a proteína Cold Shock A (CspA); e a proteína 5 do ácaro Blomia tropicalis (Blo t 5). A partir desses modelos computacionais, buscou-se avaliar os efeitos causados pelas mutações, pelo pH e pela concentração de sal na dinâmica e na estabilidade proteica. Os resultados obtidos via simulações foram comparados com dados experimentais e obtiveram uma excelente concordância, tendo em vista a simplicidade dos modelos utilizados. Além disso, os resultados computacionais permitiram obter uma enorme gama de informações sobre o... / Abstract: Eletrostatic interactions play a crucialrole in protein folding. In addition, these interactions between charged residues are fundamental for protein stability and for proteins to perform their biological functions. The charge distribution in these macromolecules is defined by the types of residues composing them and by the conditions of the environment to which they are subject, such as salt concentration and pH. Understanding how these aspects can govern protein folding and stability is of fundamental importance in the rational development of biomedical and biotechnological applications. In the present study, simplified computational models to investigate these electrostatic effects in the folding processes ... / Doutor