Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-07-18T18:06:11Z No. of bitstreams: 1 shayenneelizianneramos.pdf: 1074982 bytes, checksum: abf1f27a03503c8f798e487f18d495b1 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-07-22T15:11:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 shayenneelizianneramos.pdf: 1074982 bytes, checksum: abf1f27a03503c8f798e487f18d495b1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-22T15:11:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 shayenneelizianneramos.pdf: 1074982 bytes, checksum: abf1f27a03503c8f798e487f18d495b1 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Em um organismo, o sistema circadiano modula muitos processos fisiológicos e comportamentais, como aprendizagem e memória. Adicionalmente, a melatonina também tem sido mostrada como moduladora desses processos cognitivos. No entanto, diferentes programas de iluminação são utilizados em animais de produção e a melatonina tem sido usada como suplemento alimentar e no tratamento de alterações da ritmicidade circadiana. Logo, há necessidade de serem realizados mais estudos sobre os efeitos gerados por manipulações no ritmo circadiano e pela melatonina. Como ambos estão diretamente relacionados à iluminação, o presente trabalho teve como objetivo investigar o efeito de diferentes condições de claro/escuro no biotério e intensidade luminosa durante testes comportamentais na aprendizagem e memória de trabalho de camundongos Swiss. No biotério, camundongos Swiss foram mantidos em ciclo claro-escuro de 12:12 h (C), claro constante (L) ou escuro constante (E) e testados no labirinto Lashley III e Teste de Reconhecimento de Objetos sob iluminação de 500 ou 0 lux, resultando seis tratamentos (C500, C0, L500, L0, E500 e E0). Não houve diferença significativa entre o ciclo claro-escuro de 12:12 h, claro constante e escuro constante no biotério e nem entre os testes realizados a 500 e 0 lux. Somente os animais mantidos em escuro constante e testados a 0 lux, tratamento E0, tiveram a aprendizagem e memória de trabalho prejudicados, demonstrados pela aprendizagem mais lenta no labirinto Lashley III e o não reconhecimento do objeto no Teste de Reconhecimento de Objetos. / In an organism, the circadian system modulates many physiological and behavioral processes such as learning and memory. Additionally, melatonin has also been shown to modulate these cognitive processes. However, different lighting programs are used in production animal and the melatonin has been used as a food supplement and in the treatment of circadian rhythmic changes. Therefore, there is need for more studies be conducted on the effects caused by manipulations in the circadian rhythm and by melatonin. Because both are directly related to lighting, this study aimed to investigate the effect of different light/dark conditions in stock room and light intensity during behavioral tests in learning and working memory of Swiss mice. In a stock room, Swiss mice were kept on a 12:12 light/dark cycle (C), constant light (L) or constant darkness (E). They were tested in the Lashley III maze and Object-recognition task under 500 or 0 lx illuminations, resulting in six treatments (C500, C0, L500, L0, E0 and E500). There wasn´t significant difference between 12:12 light/dark cycle, constant light and constant darkness conditions in stock room neither between the tests conducted at 500 and 0 lx. Only animals kept in constant darkness and tested at 0 lx, E0 treatment, had impaired learning and working memory, demonstrated by slower learning in the Lashley III maze and the non-recognition of the object in Object-recognition task.

Neste estudo avaliamos a ativação de macrófagos por: (i) neutrófilos e (ii) melatonina e seus produtos de oxidação N1-acetil-N2-formil-5-metoxiquinuramina (AFMK) e N1-acetil-5-metoxiquinuramina (AMK). Para estudarmos o papel dos neutrófilos na ativação de macrófagos utilizamos um modelo experimental onde camundongos C57BL/6 receberam anticorpo anti-granulócitos (i.v.) e após 36 horas receberam o mitógeno Con A. Verificamos que a depleção dos neutrófilos diminuiu a atividade do sistema NADPH oxidase e a capacidade fagocítica e microbicida dos macrófagos, entretanto não comprometeu a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e óxido nítrico sintase (iNOS). Para estudarmos o efeito de melatonina, AFMK e AMK sobre a ativação de macrófagos, avaliamos a produção de citocinas e a atividade microbicida destas células. Primeiramente, acompanhamos a liberação de citocinas em cultura de células mononucleares humanas. Melatonina, AFMK e AMK inibiram a liberação de TNF-α, IL-12 e IFN-γ, mas não afetaram a liberação de IL-10. Num estudo posterior, macrófagos murino ativados com IFN-γ e infectados com T. cruzi foram incubados com melatonina, AFMK e AMK. Esta incubação resultou na diminuição de NO e aumento da replicação intracelular do parasita T. cruzi. Em conclusão, mostramos duas maneiras nas quais a ativação de macrófagos pode ser modulada. A primeira mostra que a interação de neutrófilos com macrófagos, no foco inflamatório parece ser um fator determinante para a atividade microbicida de macrófagos. E a segunda mostra que a interação da melatonina e seus produtos de oxidação com macrófagos contribui para a desativação do processo inflamatório, ampliando o conhecimento sobre o papel imunomodulador descrito para melatonina. / This study we evaluate macrophage activation by (i) neutrophils and (ii) melatonin and its oxidation products N1-acetyl-N2-formyl-5-methoxykynuramine (AFMK) and N1-acetyl-5-methoxykynuramine (AMK). Neutrophils role in macrophage activation was studied by an experimental model when mice C57BL/6 was injected with antigranulocyte antibody and 36 hours later they received the mitogenic ConA. We verified that neutrophil depletion decreased NADPH oxidase system activity, macrophage phagocytic and microbicide capacity. However, mieloperoxidase (MPO) and nitric oxide sintase (iNOS) activity was not compromised. Melatonin, AFMK and AMK effect in macrophage activation was evaluated by the cytokines production and microbicide activity of theses cells. We verified cytokines release in human mononuclear cells culture. Melatonin, AFMK and AMK inhibited TNF-α, IL-12 and IFN-γ release, but IL-10 was not affected. After that, IFN-γ-activated murine macrophage was infected with T. cruzi and incubated with melatonin, AFMK and AMK. We verify NO decrease and that intracellular replication of the parasite T. cruzi increased. In conclusion, we showed that there is two modulation ways for macrophage activation. First, neutrophil -macrophage interaction in inflammatory site seems to be a determinant factor to macrophage microbicide activity. And second, macrophage interaction with melatonin hormone and its oxidation products leads to deactivation of the inflammatory process, raising knowledge of immunomodulatory role described to melatonin.

A pineal participa da sincronização do organismo pela síntese de melatonina. Diabetes é um distúrbio metabólico caracterizado por hiperglicemia. Diante da controvérsia sobre a síntese de melatonina em animais diabéticos, esse trabalho objetivou avaliar as alterações da glândula pineal mediante o diabetes induzido por STZ (60mg/kg, i.p.). Ratos wistar (250-280g, 12h/12h claro/escuro) foram utilizados em todos os procedimentos que envolveram técnicas de FACS, microdiálise, HPLC, radiometria da atividade enzimática e qPCR. Os resultados mostraram que o diabetes causa diminuição (50%) e perda do perfil mono/bifásico da síntese pineal de melatonina, que não é causada por necrose ou apoptose dos pinealócitos e reflete um desarranjo no metabolismo pineal, evidenciado pela diminuição na atividade da AANAT (55%). Observou-se também um desbalanço rítmico de fatores determinantes como a expressão do receptor ß1 e a atividade e expressão das enzimas TPH1 e HIOMT. A menor concentração de melatonina circulante pode ser um fator contribuinte para o desenvolvimento da doença. / The gland is involved in the organism synchronization via its hormone melatonin. Diabetes involves hyperglicemia and insulin synthesis/signaling impairment. The aim of this work was to evaluate the pineal melatonin synthesis in STZ-diabetic rats (60mg/kg, i.p.). Male wistar rats (250-280g, 12h/12h light/dark) were used as the animal model and FACS, microdialysis, HPLC, enzyme activity assay and qPCR were the techniques used to evaluate the pineal phisiology. The results show a decrease in pineal melatonin (50%) and a circadian profile impairment that were not due to necrosis or apoptosis. This finding reflects an important impairment in the pineal metabolism that was related to a decrease in AANAT activity (55%). An alteration in the rhthmicity of important factors, such as the ß1-adrenergic receptor expression and the TPH1 and HIOMT activity and expression, was also observed. This decrease in circulating melatonin may be of fundamental importance to the establishment and maintenance of diabetes.

É proposto que vias de sinalização controlem a sobrevivência e adaptação do Plasmodium, nos diferentes hospedeiros. No presente trabalho buscamos por diferentes abordagens estudar a via de sinalização de melatonina em P. falciparum. Para isso, avaliamos os níveis de RNA mensageiro de genes do sistema-ubiquitina proteossomo (UPS) bem como o perfil de ubiquitinação resultante do tratamento de parasitas com melatonina. Mostramos que a proteína quinase 7 de P. falciparum (PfPK7) atua na modulação dos genes do UPS em resposta a melatonina. Avaliamos também se o parasita é responsivo ao ácido indol-3-acético (AIA). Sabendo-se da importância de receptores de membrana na regulação de diversas funções celulares incluindo a percepção do meio externo, buscamos caracterizar um receptor serpentino putativo identificado previamente pelo grupo. Pudemos concluir que a via de sinalização por melatonina em P. falciparum envolve a participação da PfPK7, uma vez que em parasitas nocautes para pfpk7 são irresponsivos à melatonina quando comparados ao parental. / It is proposed that signaling pathways can control the parasite survival and adaptation into the hosts. In the present work we inquire about to study the melatonin signaling pathway trhough different metodologies. For this purpose we have analized post-translational modification of melatonin signaling, through ubiquitin-proteasome system (UPS) mRNA levels as well as the profile of ubiquitination resulted of melatonin treatment when compared with control. Moreover, we have found here that the P. falciparum protein kinase 7 (PfPK7) plays a major role in ubiquitin-proteasome system mRNA modulation in response to melatonin since parasites knockout to pfpk7 gene do not upregulate the UPS genes in response to melatonin. As for melatonin we have evaluated if P. falciparum parasites were responsive to indoleacetic acid. Last but not least, we made an effort to characterize a putative serpentine receptor previously identified by our group. We conclude that melatonin signaling pathway involves PK7 participation since pfpk- parasites are irresponsives to melatonin.

Tesis por compendio / [ES] El sistema de melanocortina es una estructura clave en la regulación de una amplia gama de funciones fisiológicas que incluyen la melanogénesis, la respuesta al estrés y el equilibrio energético, mediante la unión a una familia de receptores acoplados a la proteína G específicos (MC1R-MC5R). La sobreexpresión de agonistas inversos, la proteína de señalización agutí (Asip) y la proteína relacionada con agutí (Agrp) da como resultado un aumento de la ingesta de alimentos, de crecimiento lineal y de peso corporal. Asip regula la polaridad de pigmentación dorsoventral a través del MC1R, y la sobreexpresión induce obesidad en ratones al unirse al Mc4r central. La sobreexpresión de asip1 en el pez cebra transgénico (asip1-Tg) mejora el crecimiento, sin afectar la acumulación lipídica (obesidad), incluso cuando se alimentan bajo regímenes inductores severos. Los peces asip1-Tg no necesitan comer más para crecer más y más rápido, lo que sugiere una mayor eficiencia alimentaria. Además, los peces asip1-Tg criados en alta densidad son capaces de crecer mucho más que los peces de tipo salvaje (WT) criados en baja densidad, aunque los peces asip1-Tg parecen ser más sensibles al estrés por hacinamiento que los peces WT. El análisis transcriptómico comparativo del intestino de asip1-Tg refleja una expresión diferencial de transportadores aminoácidicos, monocarboxilatos, transportadores iónicos y de vitaminas. La sobreexpresión reduce la integridad del epitelio intestinal aumentando su permeabilidad paracelular y potencia el transporte electrogénico de aminoácidos. Así, los peces transgénicos poseen mayor capacidad para la absorción de nutrientes y, por extensión una mejora en la eficiencia alimenticia que podría explicar, en parte, ese crecimiento diferencial bajo tasas de ingesta similares. Esta tesis tuvo también como objetivo investigar si los asip1-Tg mantienen un fenotipo dominante asociado con una mayor tasa de alimentación. Los resultados muestran, por el contrario, un carácter reactivo/subordinado en los asip1-Tg que aboga por una participación del sistema de melanocortinas en la regulación del comportamiento de peces. El perfil subordinado de los animales asip1-Tg, junto con una activación del eje del estrés, sugiere que estos animales pueden mostrar un comportamiento de ansiedad. Los resultados indicaron que los peces asip1-Tg muestran un comportamiento de ansiedad que además relacionado con una severa disminución de los niveles centrales de serotonina (5HT) y dopamina y elevación de su recaptación neuronal y degradación. La administración de un inhibidor de la recaptación de 5HT, recupera el fenotipo comportamental salvaje, mitigando el comportamiento de ansiedad en los peces transgénicos y rescatando los niveles de 5HT. Esta ansiedad podría repercutir en una alteración del comportamiento locomotor de los animales, por ello estudiamos los ritmos circadianos de actividad locomotora. Los resultados muestran que los animales asip1-Tg exhiben una disrupción completa del ritmo de actividad, con una actividad muy elevada, especialmente durante la noche. Esta disrupción es concomitante con una desaparición del ritmo diario de serotonina y melatonina. Además, los resultados muestran una pérdida de ritmos de expresión de genes reloj (per1a y clock1a). La incubación, in vitro, de glándulas pineales con Asip1 produjo una inhibición de la secreción de melatonina replicando los resultados obtenidos in vivo y demostrando un efecto directo de Asip1, sobre la fisiología de la pineal. En esta tesis, se utilizó el pez cebra como modelo para investigar los efectos de la obesidad sobre la ansiedad y la memoria. La obesidad no tuvo ningún efecto sobre la ansiedad, pero produjo una disminución de la memoria a corto plazo, estudiada mediante test de condicionamiento aversivo. Este estudio proporciona, un protocolo fiable para evaluar el efecto de las enfermedades metabólica en la función cognitiva y conductual. / [CA] El sistema de melanocortina és una estructura clau en la regulació d'una ampla gamma de funcions fisiològiques que inclouen la melanogènesi, la resposta a l'estrès i l'equilibri energètic, mitjançant la unió a una família de receptors acoblats a la proteïna G específics (MC1R-MC5R). La sobreexpressió d'agonistes inversos, la proteïna de senyalització agutí (Asip) y la proteïna relacionada con agutí (Agrp) dona com a resultat un augment de la ingesta d'aliments, de creixement lineal i de pes corporal. Asip regula la polaritat de pigmentació dors-ventral a través del MC1R, y la sobreexpressió indueix obesitat en ratolins en unir-se al MC4R central. La sobreexpressió de asip1 en el peix zebra transgènic (asip1-Tg) millora el creixement, sense afectar l'acumulació lipídica (obesitat), inclús quan s'alimenten sota règims inductors severs. Los peces asip1-Tg no necessiten menjar més per a créixer més i més ràpid, lo qual suggereix una major eficiència alimentària. A més a més, els peixos asip1-Tg criats en alta densitat són capaces de créixer molt més que els peixos de tipus salvatge (WT) criats en baixa densitat, malgrat que els peixos asip1-Tg semblen ser més sensibles a l'estrès per amuntegament que els peixos WT. L'anàlisi transcriptòmic comparatiu de l'intestí de asip1-Tg reflecteix una expressió diferencial de transportadors aminoacídics, monocarboxilats, transportadors iònics i de vitamines. La sobreexpressió redueix la integritat de l'epiteli intestinal augmentant la seua permeabilitat paracel·lular i potencia el transport electrogènic d'aminoàcids. Per tant, els peixos transgènics posseeixen major capacitat per l'absorció de nutrients i, per extensió una millora en la eficiència alimentària que podria explicar, en part, eixe creixement diferencial sota taxes d'ingesta similars. Aquesta tesi tingué també com a objectiu investigar si els asip1-Tg mantenien un fenotip dominant associat amb una major taxa d'alimentació. Els resultats mostren, pel contrari, un caràcter reactiu/subordinat en los asip1-Tg que advoca per una participació del sistema de melanocortines en la regulació del comportament de peixos. El perfil subordinat dels animals asip1-Tg, junt amb una activació de l'eix de l'estrès, suggereix que aquests animals poden mostrar un comportament d'ansietat. Els resultats indicaren que els peixos asip1-Tg mostren un comportament d'ansietat relacionat amb una severa disminució dels nivells centrals de serotonina (5HT) i dopamina i elevació de la seua recaptació neuronal i degradació. L'administració de un inhibidor de la recaptació de 5HT recupera el fenotip comportamental salvatge, mitigant el comportament d'ansietat en els peixos transgènics i rescatant els nivells centrals de 5HT. Esta ansietat podria repercutir en una alteració del comportament locomotor dels animals, per la qual cosa vam estudiar els ritmes circadians d'activitat locomotora. Els resultats mostren que els animals asip1-Tg exhibeixen una disrupció completa del ritme d'activitat, amb una activitat molt elevada durant tot el cicle diari, especialment durant la nit. Esta disrupció es concomitant amb una desaparició del ritme diari de serotonina i melatonina. A més a més, els resultats mostren una pèrdua de ritmes de expressió de gens rellotge (per1a y clock1a). La incubació, in vitro, de glàndules pineals con Asip1 va produir una inhibició de la secreció de melatonina replicant els resultats obtinguts in vivo y demostrant un efecte directe de Asip1 sobre la fisiologia de la pineal. En esta tesi, se va utilitzar el peix zebra com a model per investigar els efectes de la obesitat sobre la ansietat i la memoria. L'obesitat no va tindre cap efecte sobre l'ansietat, però va produir una disminució de la memòria a curt termini, estudiada mitjançant tests de condicionament aversiu. Aquest estudi proporciona, un protocol fiable per a avaluar l'efecte de les malalties metabòliques en la funció cognitiva i conductual. / [EN] The melanocortin system plays a key role in the regulation of a wide range of physiological functions including melanogenesis, stress response and energy balance, through binding to a family of specific G protein-coupled receptors (MC1R-MC5R). Overexpression of inverse agonists, agouti-signalling protein (Asip) and agouti-related protein (Agrp) results in increased food intake, linear growth and body weight. Asip regulates dorso-ventral pigmentation polarity through MC1R, and over-expression induces obesity in mice by binding to the central MC4R. Overexpression of asip1 in transgenic zebrafish (asip1-Tg) enhances growth, without affecting lipid accumulation (obesity), even when fed under severe inducing regimens. The asip1-Tg fish do not need to eat more to grow bigger and faster, suggesting increased feed efficiency. In addition, asip1-Tg fish reared at high density are able to grow much larger than wild-type (WT) fish reared at low density, although asip1-Tg fish appear to be more sensitive to overcrowding stress than WT fish. Comparative transcriptomic analysis of asip1-Tg gut reflects differential expression of amino acid, monocarboxylate, ionic and vitamin transporters. Overexpression reduces the integrity of the intestinal epithelium by increasing its paracellular permeability and enhances electrogenic amino acid transport. Thus, transgenic fish possess a greater capacity for nutrient absorption and, by extension, an improvement in feed efficiency that could explain, in part, this differential growth under similar intake rates. This thesis also aimed to investigate whether asip1-Tg maintain a dominant phenotype associated with a higher feeding rate. Experimental results show, on the contrary, a reactive/subordinate character in asip1-Tg which argues for an involvement of the melanocortin system in the regulation of fish behaviour. Improving feeding motivation without promoting aggression in fish, thus avoiding the threat to native populations in case of an escape, makes the inhibition of the melanocortin system, through the overexpression of asip1, a feasible target for the development of genetically modified lines. The subordinate profile of the asip1-Tg animals, together with an activation of the stress axis, suggests that these animals may exhibit anxiety-like behaviour. The results indicated that asip1-Tg fish show a behaviour similar to our concept of anxiety related to a severe decrease in central serotonin (5HT) and dopamine levels as well as the elevation of their neuronal reuptake and degradation. The administration of fluoxetine, a serotonin reuptake inhibitor, recovers the wild-type behavioural phenotype, mitigating anxiety behaviour in transgenic fish and restoring central 5HT levels. This anxiety could have repercussions on the locomotor behaviour of the animals, so we studied circadian rhythms of locomotor activity. The results show that asip1-Tg animals exhibit a complete disruption of the activity rhythm, with very high activity levels throughout the daily cycle, especially during the night. This disruption is concomitant with a disappearance of the daily rhythm of serotonin and melatonin. In addition, the results show a loss of clock gene expression rhythms (per1a and clock1a). Incubation, in vitro, of pineal glands with Asip1 produced an inhibition of melatonin secretion replicating the results obtained in vivo and demonstrating a direct effect of Asip1 on pineal physiology. In this PhD thesis, zebrafish was used as a model to investigate the effects of overfeeding-induced obesity on anxiety-like behaviour and memory. Obesity had no effect on anxiety, but produced a decrease in short-term memory, studied by means of aversive conditioning tests. This study also provides a reliable protocol for assessing the effect of metabolic diseases on cognitive and behavioural function, supporting zebrafish as a model for cognitive and behavioural neuroscience. / Esta tesis ha sido realizada a través del programa de ‘Ayudas para la formación de personal investigador’ (FPI) BES‐2017‐082424 de la Agencia Estatal de Investigación, en Instituto de Acuicultura Torre de la Sal (IATS) del Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) en el Grupo de investigación de Control de la Ingesta en Peces dirigido por José Miguel Cerdá Reverter, director de esta tesis. Los trabajos llevados a cabo en esta tesis han sido financiados por Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MICIU) a través de los siguientes proyectos: MELANOCONDUCT: Implicación del sistema de melanocortinas en la regulación de los mecanismos temporales y conductuales de peces AGL2016-74857-C3-3-R; Cronopeces: Red temática de cronobiología de peces y sus aplicaciones en acuicultura RED2018-102487-T; MacForFish: Nuevos aspectos homeostáticos y comportamentales de la regulación de la ingesta en peces PID2019-103969RB-C33; FISHTASTE: Implicación de los mecanismos sensoriales del gusto en la regulación de la ingesta de peces - Involvement of taste sensing mechanisms in the regulation of feed intake of fish PID2022-136288OB-C33 / Godino Gimeno, A. (2024). Involvement of the Melanocortin System in the Regulation of Circadian and Behavioural Mechanisms in Zebrafish [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/203148 / Compendio

O objetivo desse trabalho foi estudar os mecanismos que alteram a produção de melatonina na glândula pineal durante o processo de caquexia associada ao câncer e o papel de citocinas neste contexto. Os resultados mostraram um aumento da produção de melatonina no grupo inoculado com o Tumor de Walker 256 (GT) junto com uma maior atividade e expressão gênica da enzima AA-NAT, principal enzima reguladora da síntese de melatonina. O estudo in vitro mostrou que a glândula do GT produziu menos melatonina que a glândula do grupo controle (GC) após estimulação com noradrenalina (NOR). Além disso, o TNF-<font face=\"symbol\">a foi capaz de modular a síntese de melatonina em cultura, promovendo um efeito estimulatório 2h após o inicio da estimulação com NOR, e um inibitório 4h após essa estimulação. Dessa forma, os resultados indicam que produtos na circulação do rato do GT estão envolvidos na modulação encontrada in vivo e que o TNF<font face=\"symbol\">a- é um forte candidato a participar dessa modulação promovida pelo estabelecimento da síndrome da caquexia sobre a produção de melatonina na glândula pineal. / The purpose of this work was to investigate the mechanisms that modify melatonin synthesis in pineal gland during cancer related cachexia and the involvement of cytokines in this context. The results showed an increment of melatonin production in the group inoculated with Walker 256 Tumor (GT) together with a higher activity and gene expression of AA-NAT enzyme, main enzyme that regulates melatonin synthesis. The in vitro study showed that glands from GT produced less melatonin than glands of the control group (GC) after noradrenalin (NOR) stimulation. Besides, TNF-<font face=\"symbol\">a was capable to modulate melatonin synthesis in pineal gland culture, promoting a stimulatory effect 2 hours after NOR stimulation and an inhibitory effect 4 hours after this stimulation. Therefore, the results indicate that products from tumor bearing rat\'s circulation are probably involved in the modulation found in vivo and that TNF-<font face=\"symbol\">a is a strong candidate to participate in cachexia-related modulation of melatonin production in pineal gland.

O tecido adiposo marrom (TAM), caracterizado pela presença da proteína termogênica UCP-1, é conhecido há muitas décadas como um tecido termogênico em mamíferos, porém sua significância clínica em humanos era considerada pequena, com exceção de neonatos, até que o desenvolvimento e uso de métodos de PET-FDG terem demonstrado que humanos adultos também possuem TAM ativo, especialmente após exposição ao frio. Essa descoberta levou a um enorme aumento nas pesquisas sobre o assunto, já que sua ativação, levando a um aumento do gasto energético, poderia, pelo menos na teoria, ser uma possível arma no tratamento da obesidade e diabetes tipo 2 e sua redução ou ausência ser uma causa de ganho de peso. Muitos compostos vêm sendo estudados como possíveis recrutadores e ativdadores desse tecido. A melatonina é um deles, embora nenhum estudo tenha sido feito em humanos. A melatonina, um hormônio pineal sintetizado à noite com um papel crítico na sincronização do ritmo circadiano, é estudado há várias décadas como um regulador chave do metabolismo energético em diversas espécies animais. Ratos pinealectomizados ganham peso e tem distúrbios metabólicos durante sua vida, e a suplementação noturna de melatonina, reverte estas alterações, sem redução da ingesta alimentar. Devido a isso, uma hipótese é que o papel central da melatonina no metabolismo energético inclui sua função no gasto energético, possivelmente relacionado à ativação do TAM. Muitos modelos experimentais, a maioria em animais hibernantes, demonstraram o papel da melatonina no recrutamento do TAM. Nesse estudo, o objetivo é determinar se a suplementação de melatonina para indivíduos e animais de experimentação (ratos Wistar) deficientes de melatonina aumenta sua ativação. Foi encontrado que, em ratos Wistar, animais pinelaectomizados possuem uma capacidade termogênica do TAM reduzida após exposição ao frio comparado com a temperatura ambiente, e a suplementação de melatonina normaliza essa capacidade termogênica. Esse dado sugere um papel da melatonina na resposta máxima de ativação do TAM após um desafio ao frio agudo. Também foi observado um aumento de expressão de UCP-1 (RNA) em animais repostos com melatonina, tanto em controles como em pinealectomizados, e animais pinealectomizados não repostos apresentam uma expressão de UCP-1 menor que um grupo controle. Em humanos, a suplementação de melatonina aumenta o volume e atividade do TAM em quatro indivíduos pinealectomizados (por tumores pineais) com baixo nível de melatonina no basal, analisado por tomografia de emissão de prótons acoplada a ressonância magnética (PET-RM). Embora a análise do TAM em ambos os protocolos tenha sido distinta, seus resultados apontam para a mesma regulação positiva do TAM pela melatonina. A termografia infravermelha (TIV) foi também realizada em humanos, com aumento de atividade de TAM após exposição ao frio, poréma correlação entre as respostas com a TIV e o PET-RM foi moderada e não significativa. Diferenças entre o protocolo frio e limitação da TIV em indivíduos mais obesos podem ter contribuído para esses resultados. Uma relação positiva da suplementação de melatonina nos lípides (principalmente colesterol e triglicérides) também foi encontrada, porém sem impacto na gordura hepática / Brown adipose tissue (BAT), characterized by the presence of the thermogenic protein UCP-1 have long been known as a thermogenic tissue in mammals, however its significance in humans was considered minor, with the exception of newborns, until FDG-PET exams demonstrated that human adults still have active BAT, especially after cold exposure. This prompted to an incredible increase in research on the field, since its activation, leading to increased energy expenditure could, at least theoretically, be a possible tool for the treatment of obesity and type 2 diabetes and its reduction or absence be a cause of weight gain. Many compounds aiming to recruit and activate BAT have been studied. Melatonin has been one of them, although no study has been performed in humans. Melatonin, a pineal hormone synthetized at night with a critical role in the synchronization of circadian rhythms, has long been studied as a key regulator of energy metabolism in many animal species. Pinealectomized rats gain weight and have metabolic disturbances during life, and the circadian supplementation of melatonin, at night, reverts these alterations, without decrease in energy intake. Due to that, it is hypothesized that a main role of melatonin in energy metabolism includes its action on energy expenditure, possibly related to activation of BAT. Many experimental models, mainly in hibernating animals, have shown a role of melatonin on BAT recruitment. In the present study, we ought to determine if the supplementation of melatonin for melatonin deficient subjects and experimental animals (Wistar rats) increases BAT activation. We found, in Wistar rats, that pinealectomized animals have a reduced BAT thermogenic capacity after acute cold exposure compared with ambient temperature, and melatonin supplementation in this animals leads to normalization of BAT thermogenic capacity. This data suggests a role of melatonin in improving the maximal response of BAT after an acute challenge. We also found that melatonin supplementation increases UCP-1 RNA expression both in control and pinealectomized rats, and pinealectomized rats without supplementation have a reduced UCP-1 expression compared with controls. In humans, we found that melatonin supplementation increased BAT volume and activity in four pinealectomized (due to pineal tumors) individuals with low melatonin at baseline, analyzed by Positron Emission Tomography associated with magnetic resonance (PET-MR). Although the analysis of BAT in both studies was different, their results point to the same positive regulation of BAT by melatonin. We also performed infrared termography (IRT) in humans, but the results were not conclusive since although we also found an increase in BAT activity measured in Watts, the correlation between the methods was moderate. The difference may be due to different protocols of cold exposure between methods, probably inadequate in IRT, as well as maybe to a limitation of IRT in more obese individuals. We also found that melatonin supplementation in melatonin deficient humans may have a positive impact on blood lipid concentrations, (mainly total cholesterol and triglycerides) but, at least for the time studied, does not appear to have an impact on liver fat

O objetivo deste estudo foi caracterizar a influência da melatonina sobre a atividade de colinoceptores nicotínicos em miotubos de rato em cultura e determinar seu mecanismo de ação. Neste modelo verificamos que a melatonina reduz a densidade de sítios de ligação para ?-bungarotoxina e também a produção de AMP cíclico induzida por forscolina, adenosina e CGRP, mas não por isoprenalina. Estes efeitos foram mimetizados por N-acetilserotonina e 4-P-PDOT, mas não por 2-Iodo-melatonina e 5-MCA-NAT, e foram bloqueados por luzindol. A redução da produção de AMP cíclico não foi inibida por toxina pertussis. O calmidazolium bloqueia tanto a redução da densidade dos colinoceptores nicotínicos quanto a inibição da produção de AMP cíclico. Avaliando a via da guanilil ciclase determinamos que melatonina e calmidazolium inibem a produção de GMP cíclico induzida por KCl. Podemos concluir que a melatonina não está atuando via receptores de membrana, mas provavelmente, está atuando internamente bloqueando a enzima calmodulina. / The objective of this study was characterize the influence of melatonin on the nicotinic-colinoceptors activity in myotube culture from rats and seeks its action mechanism. In this model we demonstrated that melatonin decreases the binding-sites density to ?-bungarotoxin and cyclic AMP synthesis induced by forskolin, adenosine and CGRP, but not by isoprenaline. These effects were mimetized by N-acetylserotonin and 4-P-PDOT, but not by 2-iodomelatonin and 5-MCA-NAT and were blocked by luzindol. Reduction of the cyclic AMP synthesis was not inhibited by pertussis toxin. Calmidazolium blocked both the reduction of nicotinic colinoceptors density and the inhibition of AMP cyclic synthesis. After evaluate the guanylyl cyclase via, we determined that melatonin and calmidazolium inhibit the cyclic GMP synthesis induced by KCl. Then we concluded that melatonin does not act via membrane receptors, but probably, acts blocking the calmodulin enzyme.

Esse trabalho teve como objetivo estudar os efeitos do glutamato sobre a síntese de melatonina, avaliando a participação dos diferentes tipos de receptores e uma possível interação entre pinealócitos e astrócitos; além de avaliar o papel do fator de transcrição NF-<font face=\"symbol\">kB nos efeitos modulatórios do glutamato. Para tanto, glândulas pineais de ratos foram mantidas em cultura e estimuladas com diferentes concentrações de glutamato e também com diversos agonistas glutamatérgicos. Culturas de pinealócitos isolados e co-culturas de pinealócitos e astrócitos também foram usadas. A melatonina foi quantificada em HPLC com detecção eletroquímica. Para caracterização dos receptores de glutamato foi feita uma análise de RT-PCR, e a ativação do NF-<font face=\"symbol\">kB foi avaliada por ensaio de gel de retardo. Os resultados mostram que o glutamato exerce um efeito inibitório sobre a síntese de melatonina através de uma ação sobre os receptores metabotrópicos dos grupos I e II e ionotrópico do tipo AMPA e que as ações do glutamato são mediadas pela ativação do NF-<font face=\"symbol\">kB dos astrócitos. / The aim of this work was to study the effects of glutamate on melatonin synthesis, investigating the glutamate receptors involved and a possible interaction between the two predominant cell types of the pineal gland, pinealocytes and astrocytes; moreover, it was investigated the involvement of the transcription factor NF-<font face=\"symbol\">kB on the glutamate effects. To accomplish this, pineal glands were kept in culture and stimulated with glutamate or glutamate agonists. Isolated pinealocytes or in association with astrocytes in culture were also stimulated with glutamate. Melatonin was quantified by HPLC with electrochemical detection. Glutamate receptors were characterized by RT-PCR and NF-<font face=\"symbol\">kB activation was evaluated by gel shift assay. The data showed that glutamate has an inhibitory effect on melatonin synthesis that is mediated by groups I and II glutamate metabotropic receptors and AMPA receptor and that this effect involves the activation of astrocytic NF-<font face=\"symbol\">kB.

La mayoría de los ligandos de GPCR que actúan como agonistas, antagonistas o agonistas inversos, se unen al mismo dominio del receptor reconocido por los agonistas endógenos, es decir, el lugar de unión ortostérico. Muchos GPCR poseen sitios alostéricos topográficamente distintos a los ortostéricos. Esto ha llevado a la identificación y estudio de ligandos que actúan como moduladores alostéricos, que pueden regular indirectamente la actividad de los ligandos ortostéricos y/o mediar directamente efectos agonista/antagonista. Este es el caso del híbrido trans-indoloquinolicidina-péptido 28 (IP28) estudiado en la primera parte de esta Tesis Doctoral. Este compuesto es un modulador alostérico de los receptores de dopamina D1, actuando como ligando ortostérico para los receptores D2, D3, D4 y D5 de dopamina; disminuyendo la afinidad del ligando y la potencia de los receptores, preservando al mismo tiempo la eficacia de los mismos y actuando como un agonista débil por si mismo. A pesar de una cierta resistencia inicial por parte de la comunidad científica, la existencia de heterómeros entre diversos receptores de neurotransmisores y neuromoduladores es, hoy por hoy, un hecho aceptado. La heteromerización implica cambios en la forma de entender la neurotransmisión. Así, los receptores no pueden considerarse como una única unidad funcional, sino como agregados multimoleculares localizados en el plano de la membrana plasmática. Bajo esta idea, en la segunda parte de esta tesis se demostró que los receptores de dopamina D2S, D4.2 y D4.4, pero no la variante D4.7 asociada con el trastorno de déficit de atención e hiperactividad (ADHD), forman heterómeros funcionales en células transfectadas y en cerebro de ratón. La coestimulación de los receptores D2S y D4 en el heterómero D2S-D4 tiene un efecto sinérgico en la señalización, hecho que no ocurre en células que expresaban la variante D4.7 o en el estriado de ratones mutados (knock-in) portadores de la variante de 7 repeticiones (D4.7) en el tercer bucle intracelular del receptor D4 de dopamina. Estos resultados indican una diferencia funcional de la variante D4.7 del receptor D4 respecto a las variantes D4.2 y D4.4, la cual puede tener implicaciones importantes para la comprensión de la patogénesis de ADHD. Otra particularidad del receptor de dopamina D4 es que es el único receptor dopaminérgico en la glándula pineal de rata sin que se conozca cual es su función a pesar de que se expresa de manera circadiana. Por tanto, la glándula pineal de rata es una región del cerebro con gran interés para investigar las características del receptor D4. Dado que la glándula pineal está bajo el control de los receptores α1B y β1 adrenérgicos, de cuya activación depende la regulación del ritmo circadiano y la síntesis y liberación de serotonina y melatonina, una posibilidad es que los receptores de dopamina D4, que en animales no presenta formas polimórficas, puedan modular la función de los receptores adrenérgicos de la glándula pineal mediante un proceso de heteromerización. Basado en esta hipótesis, en la tercera parte experimental de esta tesis se ha identificado un nuevo mecanismo que describe como la dopamina regula la función de los receptores adrenérgicos durante el ritmo circadiano. Utilizando diversas técnicas experimentales se ha puesto de manifiesto que: 1) los receptores D4 de dopamina forman heterómeros con receptores adrenérgicos α1B y β1 en células transfectadas y en la glándula pineal 2) los heterómeros α1B-D4 y β1-D4 permiten la modulación inducida por agonistas y antagonistas del receptor D4 de la activación de MAPK y Akt mediada por agonistas de los receptores adrenérgicos en células transfectadas y en la glándula pineal 3) la síntesis y la liberación de serotonina y melanina, promovida por la estimulación de los receptores adrenérgicos en la glándula pineal, está controlada por el receptor D4 a través de la activación de los heterómeros α1B-D4 y β1-D4, y 4) la modulación de los heterómeros a través de los receptores D4 depende de los ciclos circadianos de día/noche. La búsqueda de ligandos específicos para receptores que puedan acoplarse a un sistema de transferencia de energía es de gran interés, ya que las técnicas de BRET y FRET no son aplicables a tejidos ex vivo. Debido a ello, en la cuarta y última parte de esta Tesis se ha querido contribuir al desarrollo de ligandos para receptores de dopamina útiles para detectar heterómeros que contengan estos receptores. Para ello se ha desarrollado y caracterizado ergopéptidos biotinilados como herramientas para el estudio de heterómeros que contengan receptores de dopamina. Así pues, se ha utilizado una quimioteca de ergopéptidos unidos a biotina mediante un espaciador apropiado que conservan sus propiedades como ligandos de receptores de dopamina, identificándose el compuesto 13 como un agonista de elevada afinidad para los receptores D1, D2 y D3 de dopamina y convirtiéndose así en una herramienta útil para estudiar heterómeros que contengan estos receptores. / In the first part of this thesis, we obtained a trans-indoloquinolizidine-peptide hybrid (IP28) obtained by a combinatorial approach, behaved as an orthosteric ligand of all dopamine D2- like receptors (D2, D3, and D4) and dopamine D5 receptors, but as a negative allosteric modulator of agonist and antagonist binding to striatal dopamine D1 receptors. Indoloquinolizidine-peptide 28 induced a concentration-dependent hyperbolic increase in the antagonist apparent equilibrium dissociation constant values and altered the dissociation kinetics of dopamine D1 receptor antagonists. In the second part of this thesis, we show that whereas the most frequent 4-repeat (D4.4) and the 2-repeat (D4.2) variants form functional heteromers with the short isoform of the dopamine D2 receptor (D2S), the 7-repeat risk allele (D4.7) does not. D2 receptor activation in the D2S–D4 receptor heteromer potentiates D4 receptor- mediated MAPK signaling in transfected cells and in the striatum, which did not occur in cells expressing D4.7 or in the striatum of knockin mutant mice carrying the 7 repeats of the human D4.7 in the third intracellular loop of the D4 receptor. Using the same receptor, le dopamine D4R, in the third part of this thesis, we describe that the production of both melatonin and serotonin by the pineal gland is regulated by a circadian-related heteromerization of adrenergic and dopamine D4 receptors. Through α1B-D4 and β1-D4 receptor heteromers dopamine inhibits adrenergic receptor signaling and blocks the synthesis of melatonin induced by adrenergic receptor ligands. And this inhibition was not observed at hours of the day when D4 was not expressed. Finally, in the last part of this thesis, we made the systematic derivatization of two ergopeptides with different peptide-based spacers and we realized their evaluation by radioligand binding assays. Selected spacer-containing ergopeptides with minimal biological alteration and a proper anchoring point were further derivatized with a biotin reporter. Detailed characterization studies identified 13 as a biotin ergopeptide maintaining high affinity and agonist behavior at dopamine receptors, being a useful tool for the study of heteromers involving D1R, D2R, or D3R.