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Co-mentorship / Le cancer de l’ovaire est le cancer gynécologique le plus létal, et cinquième cause de mort attribuable au cancer chez les femmes nord-américaines. La létalité de cette maladie est due notamment à sa détection tardive, à sa forte hétérogénéité, et à sa résistance au traitement. L’amélioration du sort des patientes atteintes du cancer de l’ovaire passera donc par une meilleure caractérisation de la maladie, ce qui inclut la découverte de biomarqueurs et le développement de voies de traitement efficaces. Pour ce faire, des modèles d’étude représentatifs et bien caractérisés sont nécessaires, et la nature hétérogène du cancer de l’ovaire souligne le besoin d’un grand nombre de modèles diversifiés sous plusieurs aspects. Les modèles cellulaires sont une option peu dispendieuse et facile à entretenir, avec lesquels il est possible d’effectuer des expériences à haut débit. La fiabilité des modèles cellulaires se base sur l’abondance et la diversité, où un grand nombre de lignées cellulaires issues de contextes cliniques et moléculaires variés sont requises pour dresser un portrait représentatif de la maladie. Dans le cadre de cette thèse, dix nouveaux modèles de cancer épithélial de l’ovaire, incluant des lignées de deux sous-types rares, sont décrits et caractérisés rigoureusement. Ces modèles sont diversifiés en phénotypes et en génotypes, et sont démontrés comme représentatifs de la maladie de laquelle ils sont issus. Ces nouvelles lignées, s’ajoutant à plusieurs autres dérivées dans notre laboratoire, pourront servir à étudier le cancer de l’ovaire sous plusieurs aspects. Notamment, un nombre de ces lignées ont servi à l’étude de la résistance au traitement aux inhibiteurs de la polymérase de poly(ADP-ribose) (PARP), une voie thérapeutique émergente des dix dernières années. Malgré des études prometteuses, plusieurs patientes ne répondent pas au traitement initial, ou cessent de répondre après une durée de traitement, menant à une rechute. Ces deux phénomènes, dits résistance intrinsèque et résistance acquise respectivement, nuisent grandement à la survie des patientes. À l’aide de lignées cellulaires initialement sensibles, nous avons développés des modèles de résistance acquise aux inhibiteurs de PARP par exposition prolongée. Ces lignées dérivées, en combinaison avec des lignées intrinsèquement résistantes, ont mené à la découverte d’un traitement combiné synergique entre les inhibiteurs de PARP et une autre classe de molécule, les inhibiteurs de la nicotinamide phosphoribosyltransférase (NAMPT). Cette enzyme étant responsable de la synthèse du substrat de PARP, la combinaison de ces deux thérapies éradique de façon efficace les modèles résistants, autant à résistance acquise qu’intrinsèque, et ralentit la croissance tumorale en modèle murin. Les inhibiteurs de PARP étant déjà approuvés, et les inhibiteurs de NAMPT étant déjà en essais cliniques, la combinaison de ces voies thérapeutiques serait facilement envisageable en clinique, et l’universalité de son efficacité pourrait drastiquement améliorer le sort de patientes atteintes du cancer de l’ovaire, n’ayant aucun autre recours efficace. / Ovarian cancer is the most lethal gynecological cancer, and fifth leading cause of cancer-related deaths in North American women. The lethality of this disease is notably due to its late detection, its strong heterogeneity, and its resistance to treatment. Improving the fate of ovarian cancer patients will require a better characterization of the disease, which includes discovering biomarkers and effective treatment options. To this effect, representative and well characterized study models are required, and the heterogeneous nature of ovarian cancer underlines the need for a vast number of models with diverse characteristics. Cellular models are an inexpensive and easy to maintain option, with which high throughput experiments are possible. The reliability of cellular models depends on their abundance and diversity, where a large number of cell lines from various clinical and molecular contexts are required to accurately represent the disease. In the context of this thesis, ten new models of epithelial ovarian cancer, including cell lines of two rare subtypes, are described and rigorously characterized. These models are diverse in phenotype and genotype, and are shown to accurately represent the disease from which they are derived. These new cell lines, in addition to many others described in our laboratory, will serve to better study ovarian cancer and its many facets. Notably, a number of these cell lines were used to study resistance to poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) inhibitor treatment, an emerging therapy of the past ten years. Despite encouraging studies, a number of patients do not respond initially, or cease to respond after a length of treatment, leading to relapse. These two phenomena, dubbed intrinsic and acquired resistance respectively, greatly hinder patient survival. Using initially sensitive cell lines, we developed models of acquired PARP inhibitor resistance by prolonged exposure. These derived cell lines, along with intrinsically resistant cell lines, served to discover a synergistic combination treatment between PARP inhibitors and another class of drugs, nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT) inhibitors. NAMPT as an enzyme is mainly responsible for synthesizing PARP’s substrate, and the combination of these two therapies effectively inhibits models of both intrinsic and acquired resistance, and slows tumor growth in mice. PARP inhibitors are already routinely used in the clinic, and NAMPT inhibitors are currently undergoing clinical trials, making this combination of therapeutic options easily conceivable for clinical use in the future, and the universality of its efficacy could drastically improve the fate of ovarian cancer patients who are out of options.

Le cancer de l’ovaire épithélial (COE) est caractérisé par un mauvais pronostic dû au diagnostic tardif, à une résistance élevée à la chimiothérapie et à la fréquence élevée des récurrences, avec une survie après 5 ans d’environ 50% seulement. La sénescence est un des destins cellulaires qui peut être pris par les cellules tumorales suite à divers types de traitement, appelé sénescence induite par la thérapie (TIS). Bien que l’induction de la sénescence cellulaire suite à la thérapie permet initialement de freiner la prolifération des cellules cancéreuses, leur accumulation dans les tumeurs peut être délétère pour la patiente à long terme. Cette étude s’est penchée sur la sénescence induite par la thérapie dans des cellules de COE, plus précisément les TOV21G. Les résultats démontrent que les TOV21G entrent en sénescence suite à un traitement de carboplatine et paclitaxel (CP). Le facteur de transcription MYC a été montré comme une piste intéressante dans ce modèle de TIS, car ses gènes cibles se trouvent significativement diminués dans les cellules TIS. Cette étude a démontré que les niveaux protéiques de MYC sont significativement diminués dans les cellules TIS, alors que son ARN messager est légèrement augmenté. Cependant, ces résultats ne seraient pas dus à plus forte régulation post-traductionnelle de MYC dans les cellules TIS. Nous nous sommes ensuite intéressés à la surexpression de MYC dans l’entrée en sénescence suite aux traitements de chimiothérapies. Les résultats montrent que les niveaux augmentés de MYC auraient comme conséquence plus de morts cellulaires, bien qu’un certain pourcentage de ces cellules entrent quand même en sénescence. De plus, nous avons aussi observé une augmentation de la polyploïdie dans les cellules qui surexpriment MYC suite aux traitements de chimiothérapie. Notre étude est la première à montrer un rôle de MYC dans la régulation de l’entrée en sénescence dans le cancer de l’ovaire épithéliale. À long terme, cette étude pourrait nous aider à mieux comprendre le rôle de MYC dans la TIS ainsi ces résultats pourront également nous aider à trouver de meilleures cibles thérapeutiques afin de proposer de meilleurs traitements aux patientes atteintes de CEO afin de voir leur pronostic s’améliorer. / Epithelial ovarian cancer (EOC) is characterized by a poor prognosis due to late diagnosis, high resistance to chemotherapy, and a high recurrence rate, with a 5-year survival of approximately 50%. Senescence is one of the cellular fates that tumor cells can undergo following various types of treatment, termed Therapy-Induced Senescence (TIS). While cellular senescence initialy blocks cancer cell proliferation, their accumulation of TIS cells in tumors can be detrimental to the patient in the long term. This study focused on therapy-induced senescence in EOC cells, specifically TOV21G.The results demonstrate that TOV21G undergo senescence following treatment with carboplatin and paclitaxel (CP). The transcription factor MYC emerged as an interesting candidate in this TIS model, as its targets were significantly reduced in TIS cells. This study revealed a significant decrease in MYC protein levels in TIS cells, while its mRNA levels showed a slight increase. However, these results were not attributed to a stronger post-translational regulation of MYC in TIS cells. Subsequently, we investigated the overexpression of MYC in the induction of senescence following chemotherapy treatments. The results indicate that increased levels of MYC would result in more cell death, although a certain percentage of these cells still undergo senescence. Additionally, we observed an increase in polyploidy in cells overexpressing MYC following chemotherapy treatments. Our study is the first to demonstrate a role for MYC in the regulation of senescence in epithelial ovarian cancer. In the long term, this study could help us better understand the role of MYC in TIS, and these findings may also assist in identifying better therapeutic targets to offer improved treatments for patients with EOC, thereby enhancing their prognosis.

[ES] El curso natural de los tumores va acompañado de la acumulación progresiva de alteraciones genómicas, propiciando una cadena de eventos que resultan en inestabilidad genómica (IG). Éste fenómeno, caracterizado por alteraciones en el número de copias, constituye un hallmark genómico con impacto pronóstico más allá de la histología y otras características moleculares del tumor. En el ámbito de la investigación en oncología ginecológica, la IG ha ganado fuerza en los últimos años, permitiendo la estratificación de pacientes de acuerdo al pronóstico y la respuesta a agentes que dañan el ADN, como las terapias basadas en platinos y los inhibidores de PARP. En el cáncer de ovario, en particular, se ha descrito un subgrupo molecular caracterizado por alta incidencia de alteraciones en el número de copias relacionado con un mejor pronóstico y respuesta a quimioterapia. Esta correlación presenta la IG como un buen marcador predictivo y pronóstico. Así, un modelo basado en la IG trasladable a la práctica clínica constituirá una herramienta útil para la optimización de la toma de decisiones. La era de la medicina personalizada llegó de la mano de los estudios integrativos, donde las técnicas de alto rendimiento se aplican de manera combinada para obtener una visión molecular global de los tumores, completando y complementando la caracterización clásica a nivel anatómico e histológico. Esta tesis propone un estudio global de la IG como biomarcador pronóstico y predictivo de respuesta en cáncer ginecológico, haciendo hincapié en el cáncer de ovario seroso de alto grado y cáncer de endometrio. A través de la aplicación de estrategias basadas en NGS con la adaptación de pipelines de análisis disponibles obtuvimos los perfiles de IG de muestras de tejido fijadas en formol y embebidas en parafina, de una manera fiable, portable y coste efectiva, combinando herramientas de machine learning para ajustar modelos predictivos y pronósticos. Partiendo de esta premisa, ajustamos y validamos, en cohortes clínicas bien caracterizadas, tres modelos a partir de los datos ómicos individuales y un modelo integrativo (Scarface Score) que demostró la capacidad de predecir la respuesta a agentes que dañan el ADN en un escenario clínico concreto de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado. Paralelamente, desarrollamos y validamos un algoritmo basado en el perfil de mutaciones, con impacto pronóstico, en cáncer de endometrio. Este algoritmo consiguió una estratificación que respondía al perfil de IG de los pacientes. Finalmente, se caracterizó un panel de líneas celulares de cáncer de ovario a nivel de respuesta, genético y genómico. Se interrogó el estatus de la vía de recombinación homóloga y su asociación a patrones de IG, completando el perfil molecular y estableciendo las bases para futuros estudios preclínicos y clínicos. Los resultados obtenidos en esta tesis doctoral presentan herramientas de gran valor para el manejo clínico en cuanto a la búsqueda de una medicina personalizada. Adicionalmente, diferentes estudios para trasladar el modelo predictivo a otros escenarios clínicos pueden ser explorados, usando como base el planteado, pero restableciendo puntos de corte nuevos y específicos. / [CA] El curs natural dels tumors va acompanyat de l'acumulació progressiva d'alteracions genòmiques, propiciant una cadena d'esdeveniments que resulten en inestabilitat genòmica (IG). Aquest fenomen, caracteritzat per la presencia de alteracions en el nombre de cópies, constitueix un hallmark genòmic amb impacte pronòstic més enllà de la histologia i altres característiques moleculars del tumor. En l'àmbit de la recerca en oncologia ginecològica, la IG ha guanyat força en els últims anys, permetent l'estratificació de pacients d'acord amb el pronòstic i la resposta d'agents que danyen l'ADN, com les teràpies basades en platins i els inhibidors de PARP. En el càncer d'ovari en particular, s'ha descrit un subgrup molecular caracteritzat per una alta incidència d'alteracions en el nombre de còpies relacionat amb un millor pronòstic i resposta a quimioteràpia. Aquesta correlació presenta la IG com un marcador predictiu i pronòstic adeqüat. Així, un model basat en la IG traslladable a la pràctica clínica constituirà una eina útil per a l'optimització de la presa de decisions. L'era de la medicina personalitzada va arribar de la mà dels estudis integratius, on les tècniques d'alt rendiment s'apliquen de manera combinada per a obtenir una visió molecular global dels tumors, completant i complementant la caracterització clàssica a nivell anatòmic i histològic. Aquesta tesi proposa un estudi global de la IG com a biomarcador pronòstic i predictiu de resposta en càncer ginecològic, posant l'accent en el càncer d'ovari serós d'alt grau i càncer d'endometri. A través de la aplicación d'estratègies basades en NGS amb l'adaptació de pipelines d'anàlisis disponibles, vam obtenir els perfils de IG de mostres de teixit fixades en formol i embegudes en parafina d'una manera fiable, portable i cost efectiva, combinant eines de machine learning per a ajustar models predictius i pronòstics. Partint d'aquesta premissa, vam ajustar i validar, en cohortes clíniques ben caracteritzades, tres models a partir de les dades omiques individuals i un model integratiu (Scarface Score) que va demostrar la capacitat de predir la resposta a agents que danyen l'ADN en un escenari clínic concret de pacients amb càncer d'ovari serós d'alt grau. Paral·lelament, desenvoluparem i validarem un algoritme basat en el perfil de mutacions amb impacte pronòstic en càncer d'endometri. Aquest algoritme va aconseguir una estratificació que responia al perfil de IG dels pacients. Finalment, es va caracteritzar un panell de línies cel·lulars de càncer d'ovari a nivell de resposta, genètic i genòmic. Es varen interrogar l'estatus de la via de recombinació homòloga i la seua associació a patrons de IG, completant el perfil molecular i establint les bases per a futurs estudis preclínics i clínics. Els resultats obtinguts en aquesta tesi doctoral presenten eines de gran valor per al maneig clínic en quant a la cerca d'una medicina personalitzada. Addicionalment, diferents estudis per a traslladar el model predictiu a altres escenaris clínics poden ser plantejats, usant com a base el propost però restablint punts de tall nous i específics. / [EN] The natural course of tumors matches the progressive accumulation of genomic alterations, triggering a cascade of events that results in genomic instability (GI). This phenomenon includes copy number alterations and constitutes a genomic hallmark that defines specific outcomes beyond histology and other molecular features of the tumor. In the context of gynaecologic oncology research, GI has gained strength in the last years allowing the stratification of patients according to prognosis and response to certain DNA-damaging agents, such as platinum-based therapies and PARP inhibitors. Particularly in ovarian and endometrial cancers, it has been described a molecular subgroup characterized by high copy number alterations (CNA) related to good prognosis and better response to chemotherapy. This relationship highlights GI as a predictive and prognostic biomarker. Hence, a GI-based model translated into clinical practice would constitute a tool for optimizing clinical decision-making. The era of personalised medicine arrived together with the coming of integrative studies, where results of high-throughput techniques are combined to obtain a comprehensive molecular landscape of the diseases, bringing a new paradigm to characterize the tumors beyond classical anatomic and histological characteristics. This thesis proposes a global study of the phenomenon of GI as a prognostic and predictive biomarker of treatment response in gynaecological cancers, mainly focused on high-grade ovarian cancer and endometrial cancer. Through the development of an NGS-based strategy with the adaptation of available pipelines of analysis, we obtained GI profiles on formalin-fixed paraffin-embedded samples in a reliable, portable, and cost-effective approach, with the combination of Machine Learning tools to fit prognostic and predictive models based on the integration of omic data. Based on that premise, we fit and validated, in well-characterized clinical cohorts, three single-source models and an integrative ensemble model (Scarface Score) that proved to be able to predict response to DNA-damaging agents in a clinical scenario of High-Grade Serous Ovarian Cancer. In addition, a mutational-based algorithm (12g algorithm) with prognostic impact was developed and validated for endometrial cancer patients. This algorithm achieved a GI-based stratification of patients. Finally, a panel of ovarian cancer cell lines was characterized at the response, genetic and genomic level, interrogating homologous recombination repair pathway status and its associated GI profiles, completing the molecular landscape, and establishing the basis and breeding ground of future preclinical and clinical studies. The results reported in this Doctoral Thesis provide valuable clinical management tools in the accomplishment of a reliable tailored therapy. Additionally, future studies in different tumor types and drugs for implementation of the predictive model can be planned, using as a base the defined one but re-establishing new and specific cut-offs. / The present doctoral thesis was partially funded by GVA Grants “Subvencions per a la realització de projectes d’i+d+i desenvolupats per grups d’investigació emergents (GV/2020/158)” and “Ayudas para la contratación de personal investigador en formación de carácter predoctoral” (ACIF/2016/008), “Beca de investigación traslacional Andrés Poveda 2020” from GEICO group and Phase II clinical trial (POLA: NCT02684318, EudraCT 2015-001141-08, 03.10.2015). This study was awarded the Prize “Antonio Llombart Rodriguez-FINCIVO 2020” from the Royal Academy of Medicine of the Valencian Community / López Reig, R. (2023). Genomic instability as a predictive biomarker for the application of DNA-damaging therapies in gynecological cancer patients [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/199026

Phosphorylierung und Dephosphorylierung gehören zu den zentralen Regulationsmechanismen jeder Zelle. Während einer der bekanntesten Signalwege, der Mitogen-aktivierte Protein-Kinase(MAPK)-Signalweg bereits intensiv untersucht wurde, ist über die MAPK-Phosphatasen als wesentliche Inaktivatoren dieser Signalwegfamilie bisher nur wenig bekannt. Die MAPK-Signalwege sind in Tumoren häufig aktiv. Dies ließe sich durch aktivierende Mutationen der Kinasen oder ihrer übergeordneten Rezeptoren erklären. Ein anderer Ansatz geht von der stromalen Entzündungsreaktion aus, die viele solide Tumoren begleitet. Zytokine, die durch die Entzündungszellen gebildet werden, sind physiologische Aktivatoren der MAPK und eine fehlende Gegenregulation durch inaktivierende Phosphatasen würde ebenso zu hoher Aktivität der MAPK führen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein solches Entzündungsgeschehen in Ovarialkarzinomzellinien simuliert und die Reaktion der Phosphatasen MKP-1 und MKP-3 auf proinflammatorische Zytokine untersucht. MKP-1 und MKP-3 reagierten mit erheblichen Unterschieden auf die Zugabe proinflammatorischer Zytokine, das Reaktionsmuster reichte von starker Aktivierung (MKP-1 in SKOV-3 und OVCAR-3) bis hin zu verringerter Aktivität der Phosphatasen (MKP-1 in OAW42 und CAOV-3). Zur Ergänzung der Zellkulturstudien wurde die Expression der Phosphatase MKP-1 in primären Ovarialkarzinomen, Zystadenomen sowie gesunden Ovarien immunhistochemisch untersucht. Der Proteinnachweis in insgesamt 101 Gewebeproben ergab eine signifikant geringere Expression der Phosphatase MKP-1 in Karzinomen im Vergleich zu normalem Ovarialepithel oder Zystadenomen. Innerhalb der Gruppe der Karzinome zeigte die MKP-1-Expression dennoch eine hohe Varianz, hierbei waren Malignome mit deutlicher MKP-1-Expression mit einer wesentlich schlechteren Prognose der Erkrankung verbunden. Die Phosphatase war in der multivariaten Analyse des rezidivfreien Überlebens ein unabhängiger Prognoseparameter (RR=4,03; 95%CI=1,72-9,48; p=0,001). Ein kürzeres rezidivfreies Überleben ist häufig mit der frühen Entwicklung von Chemoresistenzen verbunden. Ein möglicher Zusammenhang zwischen der Phosphatase MKP-1 und Chemoresistenz wurde in Zellkulturversuchen unter Verwendung von Cisplatin, einem wesentlichen Bestandteil der Standardchemotherapie bei Ovarialkarzinomen, untersucht. Die Expression der MKP-1 konnte durch Zugabe von Cisplatin deutlich induziert werden. Bemerkenswerterweise zeigten resistente Zellinien dabei eine frühe Reaktion, sensible Zellen reagierten deutlich verzögert. Diese frühe Induktion der MKP-1 könnte die therapeutisch induzierte Apoptose blockieren. Weitere Erkenntnisse über die daran beteiligten Signalwege sowie pharmakologische Inhibitoren der Phosphatasen sind daher vielversprechende Ansätze zur Optimierung der Chemotherapie. / Protein phosphorylation and dephosphorylation is a central regulatory system of cells. The mitogen-activated-protein-kinase(MAPK)-pathway as a typical example is one of the most investigated signalling pathways in cancers. In contrast, much less is known about MAPK-phosphatases, their physiological inactivators. MAPK pathways are frequently up-regulated in cancers. This might be explained by activating mutations of kinases or of up-stream receptors. Another view is based on the inflammatory stroma infiltrate that accompanies most solid carcinomas. Cytokines produced by inflammatory cells are physiological activators of MAPK pathways and missing balance of inactivating phosphatases would also result in up-regulated MAPK pathways. In this study, such an inflammatory situation was simulated in cell culture models and expression patterns of MAPK-phosphatases MKP-1 and MKP-3 were investigated after addition of proinflammatory cytokines. The expression of MKP-1 and MKP-3 after cytokine addition differed widely between the ovarian cancer cell lines investigated, ranging from strong induction in SKOV-3 and OVCAR-3 to down-regulation of phosphatases in OAW42 and CAOV-3. In addition to cell culture experiments, expression of MKP-1 was examined immunohistochemically in primary ovarian cancers, adenomas and normal ovaries (total of 101 samples). There was a lower expression of phosphatase MKP-1 in ovarian cancers compared to surface epithelium of normal ovaries and cystadenomas. However, MKP-1 expression in the group of carcinomas showed a high variation, including also a number of negative cases. Among all investigated cancer samples, those with a higher expression of MKP-1 were associated with poorer prognosis. Multivariate survival analysis revealed this phosphatase as an independant prognostic factor for progression-free survival (RR=4,03; 95%CI=1,72-9,48; p=0,001). Short progression-free survival is usually associated with early development of chemoresistance. Consequently, poor prognosis might result from different efficiencies of initial adjuvant chemotherapeutical treatments. Based on this presumption, the effects of cisplatin, a typically used drug against ovarian cancer, were investigated in cell culture. The phosphatase MKP-1 was highly inducable by cisplatin, remarkably as early reaction in cisplatin-resistant cell lines and with distinct delay in sensitive cells. This early induction of MKP-1 in resistant cells might block drug-induced apoptosis. Further studies about influencing pathways and pharmacological inhibitors of phosphatase MKP-1 might be promising efforts to optimize chemotherapy.

Metabolomics is the methodical scientific study of biochemical processes associated with the metabolome—which comprises the entire collection of metabolites in any biological entity. Metabolome changes occur as a result of modifications in the genome and proteome, and are, therefore, directly related to cellular phenotype. Thus, metabolomic analysis is capable of providing a snapshot of cellular physiology. Untargeted metabolomics is an impartial, all-inclusive approach for detecting as many metabolites as possible without a priori knowledge of their identity. Hence, it is a valuable exploratory tool capable of providing extensive chemical information for discovery and hypothesis-generation regarding biochemical processes. A history of metabolomics and advances in the field corresponding to improved analytical technologies are described in Chapter 1 of this dissertation. Additionally, Chapter 1 introduces the analytical workflows involved in untargeted metabolomics research to provide a foundation for Chapters 2 – 5. Part I of this dissertation which encompasses Chapters 2 – 3 describes the utilization of mass spectrometry (MS)-based untargeted metabolomic analysis to acquire new insight into cancer detection. There is a knowledge deficit regarding the biochemical processes of the origin and proliferative molecular mechanisms of many types of cancer which has also led to a shortage of sensitive and specific biomarkers. Chapter 2 describes the development of an in vitro diagnostic multivariate index assay (IVDMIA) for prostate cancer (PCa) prediction based on ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) metabolic profiling of blood serum samples from 64 PCa patients and 50 healthy individuals. A panel of 40 metabolic spectral features was found to be differential with 92.1% sensitivity, 94.3% specificity, and 93.0% accuracy. The performance of the IVDMIA was higher than the prevalent prostate-specific antigen blood test, thus, highlighting that a combination of multiple discriminant features yields higher predictive power for PCa detection than the univariate analysis of a single marker. Chapter 3 describes two approaches that were taken to investigate metabolic patterns for early detection of ovarian cancer (OC). First, Dicer-Pten double knockout (DKO) mice that phenocopy many of the features of metastatic high-grade serous carcinoma (HGSC) observed in women were studied. Using UPLC-MS, serum samples from 14 early-stage tumor DKO mice and 11 controls were analyzed. Iterative multivariate classification selected 18 metabolites that, when considered as a panel, yielded 100% accuracy, sensitivity, and specificity for early-stage HGSC detection. In the second approach, serum metabolic phenotypes of an early-stage OC pilot patient cohort were characterized. Serum samples were collected from 24 early-stage OC patients and 40 healthy women, and subsequently analyzed using UPLC-MS. Multivariate statistical analysis employing support vector machine learning methods and recursive feature elimination selected a panel of metabolites that differentiated between age-matched samples with 100% cross-validated accuracy, sensitivity, and specificity. This small pilot study demonstrated that metabolic phenotypes may be useful for detecting early-stage OC and, thus, supports conducting larger, more comprehensive studies. Many challenges exist in the field of untargeted metabolomics. Part II of this dissertation which encompasses Chapters 4 – 5 focuses on two specific challenges. While metabolomic data may be used to generate hypothesis concerning biological processes, determining causal relationships within metabolic networks with only metabolomic data is impractical. Proteins play major roles in these networks; therefore, pairing metabolomic information with that acquired from proteomics gives a more comprehensive snapshot of perturbations to metabolic pathways. Chapter 4 describes the integration of MS- and NMR-based metabolomics with proteomics analyses to investigate the role of chemically mediated ecological interactions between Karenia brevis and two diatom competitors, Asterionellopsis glacialis and Thalassiosira pseudonana. This integrated systems biology approach showed that K. brevis allelopathy distinctively perturbed the metabolisms of these two competitors. A. glacialis had a more robust metabolic response to K. brevis allelopathy which may be a result of its repeated exposure to K. brevis blooms in the Gulf of Mexico. However, K. brevis allelopathy disrupted energy metabolism and obstructed cellular protection mechanisms including altering cell membrane components, inhibiting osmoregulation, and increasing oxidative stress in T. pseudonana. This work represents the first instance of metabolites and proteins measured simultaneously to understand the effects of allelopathy or in fact any form of competition. Chromatography is traditionally coupled to MS for untargeted metabolomics studies. While coupling chromatography to MS greatly enhances metabolome analysis due to the orthogonality of the techniques, the lengthy analysis times pose challenges for large metabolomics studies. Consequently, there is still a need for developing higher throughput MS approaches. A rapid metabolic fingerprinting method that utilizes a new transmission mode direct analysis in real time (TM-DART) ambient sampling technique is presented in Chapter 5. The optimization of TM-DART parameters directly affecting metabolite desorption and ionization, such as sample position and ionizing gas desorption temperature, was critical in achieving high sensitivity and detecting a broad mass range of metabolites. In terms of reproducibility, TM-DART compared favorably with traditional probe mode DART analysis, with coefficients of variation as low as 16%. TM-DART MS proved to be a powerful analytical technique for rapid metabolome analysis of human blood sera and was adapted for exhaled breath condensate (EBC) analysis. To determine the feasibility of utilizing TM-DART for metabolomics investigations, TM-DART was interfaced with traveling wave ion mobility spectrometry (TWIMS) time-of-flight (TOF) MS for the analysis of EBC samples from cystic fibrosis patients and healthy controls. TM-DART-TWIMS-TOF MS was able to successfully detect cystic fibrosis in this small sample cohort, thereby, demonstrating it can be employed for probing metabolome changes. Finally, in Chapter 6, a perspective on the presented work is provided along with goals on which future studies may focus.

Le cancer épithélial de l’ovaire (CÉO) est le cancer gynécologique le plus létal. Le CÉO de type séreux, la forme la plus commune avec plus de 50% des cas, est souvent diagnostiqué tardivement et associé à un mauvais pronostic. Le CÉO avancé, surtout traité par chimiothérapie, va devenir chimiorésistant chez la majorité des patientes traitées. Bien que des lignées cellulaires du CÉO aient été dérivées à partir de tumeurs solides et d’ascites de patientes ayant ou non subi une chimiothérapie, aucune des lignées cellulaires du CÉO provenant d’une même patiente avant et après ses traitements de chimiothérapie n’ont été établies précédemment. Notre laboratoire est le premier à développer de telles lignées cellulaires. Nos nouvelles lignées cellulaires sont dérivées de trois patientes différentes (1369, 2295 et 3133) et classées selon leur provenance, soit la tumeur solide (TOV) ou l’ascite (OV). Nous avons donc caractérisé ces nouvelles lignées de cellules pré-chimiothérapie (TOV1369TR, OV2295, TOV3133D et TOV3133G) et post-chimiothérapie (OV1369(2), OV2295(2), TOV2295, OV3133 et OV3133(2)) par diverses approches. Par immunohistochimie et immunobuvardage de type Western, nous avons caractérisé les niveaux d’expression de marqueurs épithéliaux typiques de kératines (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19, KRT20) pour confirmer l’origine épithéliale et ovarienne des cellules. Nous avons également analysé le niveau d’expression de HER2 et p53, deux marqueurs importants dans le CÉO. Cependant, il ne semble pas y avoir d’expression différentielle évidente de ces marqueurs entre les lignées pré-chimiothérapie et post-chimiothérapie. Plus encore, nous avons étudié plusieurs caractéristiques tumorigéniques des lignées cellulaires, dont la prolifération cellulaire (par compte cellulaire), la migration cellulaire (par recouvrement de plaie), la capacité à former des sphéroïdes en 3D (par la méthode des gouttelettes inversées), et la formation de tumeurs in vivo dans des souris SCID (xénogreffes sous-cutanées). En général, il ne semble pas y avoir de différences claires entre les cellules pré-chimiothérapie et post-chimiothérapie au niveau du comportement cellulaire, à l’exception du fait qu’aucune des lignées post-chimiothérapie semblent être en mesure de former des structures tridimensionnelles compactes, contrairement à certaines lignées post-chimiothérapie. Nos résultats pourront servir à mieux comprendre les différents mécanismes régissant les tumeurs malignes du CÉO de type séreux et à mieux comprendre la progression de la maladie à travers les différents traitements, ce qui nous permettra d’acquérir des informations essentielles pour mieux évaluer et traiter différentes patientes. / Epithelial ovarian cancer (EOC) is the deadliest of all gynecologic cancers. The serous type of EOC is the most common form of the disease, and it accounts for more than 50% of the cases. It is often diagnosed at advanced stages where its prognosis is poor. Advanced EOC is treated mainly with chemotherapy. However, chemoresistance development eventually impedes the success of the treatments for most patients. Researchers have derived cell lines from EOC from solid tumors or from ascites. So far, there has not been EOC cell lines established from samples taken before and after chemotherapy treatments within the same patient. Our laboratory is thus the first to develop a new and powerful model of pre-chemotherapy and post-chemotherapy cell lines. All cell lines were derived sequentially from 3 different patients (1369, 2295 and 3133), from either solid tumors (TOV) or ascites (OV). We therefore characterized these new pre-chemotherapy cell lines (TOV1369TR, OV2295, TOV3133D and TOV3133G) and post-chemotherapy cell lines (OV1369(2), OV2295(2), TOV2295, OV3133 and OV3133(2)) through several approaches. Using immunohistochemistry and Western blot, we have characterized the level of expression of typical epithelial keratin markers (KRT7, KRT8, KRT18, KRT19, KRT20) to confirm the epithelial and ovarian nature of the cells. We have also analysed the expression level of important EOC markers, such as that of HER2 and p53, and found no clear difference between the pre-chemotherapy and post-chemotherapy EOC cells. Moreover, we have studied various tumorigenic features of the cell lines, such as cell proliferation (by cell count), cell migration (by the wound healing assay), 3D spheroid formation (by the hanging drop method), in vivo tumor formation in SCID mice (subcutaneous xenografts). In general, there were no notable differences between the two categories of cell lines at the cellular level, except that post-chemotherapy cell lines seemed to be unable to form compact 3D structures, contrary to some pre-chemotherapy cell lines. The obtained results would aid in better understanding the different mechanisms that malignant serous EOC tumors undergo and the progression of the disease with respect to the different treatments. Such study would allow us to gain valuable insight into the optimal treatment decisions to take for different EOC patients.