Orientadores: Liana Maria Cardoso Verinaud, Luciana Campos Paulino / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campoinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T22:23:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DiGangi_Rosaria_M.pdf: 3869352 bytes, checksum: 6c11f8a4be727a58eb3974501efd287e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica, cujo agente etiológico é o fungo Paracoccidioides brasiliensis, acomete primariamente os pulmões e pode causar lesões secundárias na pele e mucosas, que são extremamente dolorosas e de difícil tratamento por métodos convencionais com drogas anti-fúngicas. Estudos anteriores, conduzidos em nosso laboratório, usando modelos experimentais para PCM, mostraram a capacidade do laser HeNe em aumentar a produção de citocinas pró-inflamatórias e a síntese de fibras colágenas, reticulina e de elementos de matriz extracelular, como laminina e fibronectina. Estes eventos levaram a uma cicatrização tecidual mais rápida e eficaz das lesões. Além disso, as células fúngicas recuperados a partir das lesões após tratamento com laser mostrou nenhuma capacidade de crescimento, quando cultivadas in vitro. Neste trabalho foi avaliada a ação direta do laser HeNe sobre o fungo com o objetivo de fornecer suporte para o uso desta terapia durante a infecção PCM. Os resultados mostraram que o tratamento com laser de HeNe reduziu a capacidade de crescimento e a viabilidade de células fúngicas em 90% e 30%, respectivamente. Ademais, as células tratadas apresentaram núcleo mais eletrondenso, sugerindo que a irradiação com laser induz alterações ultra-estruturais que podem afetar a viabilidade e/ou a virulência do fungo. Entretanto, a patogenicidade do fungo não foi afetada, uma vez que nenhuma diferença foi observada no pulmão de animais infectados com o fungo tratado e não tratado. Além dos efeitos sobre a resposta inflamatória, acreditamos que o laser de HeNe modifica, ou mesmo destrói, estruturas que são usadas pelo patógeno como mecanismos de resistência. Certamente, esta atividade fungistática/fungicida do laser também desempenha um papel importante na aceleração da cicatrização de feridas e, deste modo, a terapia com o laser de HeNe pode ser considerada como um tratamento adjuvante na cura de lesões da pele observados durante PCM / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PMC), caused by the fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb), mainly affects the lungs and also causes painful lesions in the skin and mucous membranes that can remain active for months even after the beginning of antifungal treatment. In this work, we evaluated the effects of laser treatment on fungal cells, aiming to provide support for the use of this therapy during PCM. Pb yeast cells were exposed to laser for three consecutive days and then analyzed for growth inhibition, viability, 43-kDa glycoprotein (gp43) expression, infectivity, and ultra-structural alterations. HeNe laser treatment reduced the growth capacity and the viability of fungal cells, and increased gp43 expression. Laser-treated cells also showed pronounced structural alterations, since they were collapsed and presented deep folds. Additionally, remarkable changes were observed in the nucleus that presented a very electrondense form. The pathogenicity of P. brasiliensisafter laser treatment was also evaluated,and no differences were observed in pulmonary lesions comparing animals infected with laser-treated and non-treated yeast cells. Possibly HeNe laser is able to modify fungal structures involved in resistance and virulence mechanisms and therefore can be considered as an adjunctive therapy in the treatment of skin lesions observed during PCM / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Ana Marisa Fusco-Almeida / Coorientador: Andrei Munhoz / Banca: Juliana Barbosa Coitinho Gonçalves / Banca: Julhiany de Fátima da Silva / Banca: Juliana Campos Junqueira / Banca: Maria Célia Bertolini / Resumo: Paracoccidioides brasiliensis é um dos agentes etiológicos da paracoccidioidomicose, micose sistêmica de grande importância na América Latina devido a incidência. Durante a interação com o hospedeiro, P. brasiliensis sintetiza diversas moléculas que auxiliam no processo infeccioso, entre elas, a proteína Pb14-3-3 desempenha um importante papel no estabelecimento da infecção. Este estudo teve como objetivo aprofundar o conhecimento sobre esta proteína através de caracterização biofísica e estrutural, identificar proteínas ligantes tanto de P. brasiliensis quanto de células humanas e avaliar seu potencial imunogênico em G. mellonella. Para isso, a proteína Pb14-3-3 recombinante foi produzida e purificada por técnicas cromatográficas. O conteúdo de estrutura secundária e a avaliação da estrutura terciária foram avaliados por dicroísmo circular e fluorescência intrínseca do triptofano, respectivamente onde foi observado que a proteína obtida é composta majoritariamente por estruturas α-hélices e apresenta estrutura terciária. A estabilidade térmica também foi avaliada e a Pb14-3-3 recombinante mantém sua estrutura secundária até a temperatura 55°C, temperatura muito superior as utilizadas nos experimentos posteriores. A resolução da estrutura tridimensional por cristalografia de raios-X demonstrou que a proteína é composta por nove estruturas α-hélices dispostas em arranjo antiparalelo, formando um canal de ligação característico das proteínas da família 14-3-3. Curiosamente, obs... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract:Paracoccidioides brasiliensis is one the etiological agents of paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis of great importance in Latin America due its incidence. During the interaction with the host, P. brasiliensis synthetizes several molecules that assist in the infectious process, among them the Pb14-3-3 plays a crucial role in the establishment of the infection. This study aimed to increase the knowledge about this protein by performing the biophysical and structural characterization, identify binding protein from P. brasiliensis and host cells and evaluate its immunogenic potential in G. mellonella. For this, the Pb14-3-3 recombinant protein was produced in E. coli and purified by chromatography techniques. The secondary structure content and evaluation of tertiary structure was performed by circular dichroism and intrinsic tryptophan fluorescence, respectively and it was observed that the obtained protein is mainly composed by structures and presents tertiary structure. The thermal stability was also evaluated and the Pb14-3-3 recombinant protein maintains its secondary structure until 55°C, which is higher than the temperatures used in subsequent experiments. The resolution of the 3D structure by X-ray crystallography revealed that the protein is composed by nine α-helix, in antiparallel arrangement, forming a binding groove that is characteristic from 14-3-3 proteins family; Interestingly, it was observed that during the crystallization process the Pb14-3-3 interacts with a peptide, which dissociates when crosslinked with glutaraldehyde. The peptide sequence was predicted in silico and presented the binding motif mode II proposed for 14-3-3 proteins. The interactions assays showed that Pb14-3-3 interacts with several proteins from both P. brasiliensis and host cells (ATCC MRC-5). Among the biding proteins from P. brasiliensis... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Os efeitos da administração de anfotericina B a camundongos suscetíveis ao P. brasiliensis foram avaliados. A L-AmB reverte o padrão de suscetibilidade para o de resistência de forma mais eficiente do que a c-AmB, como observado na quantificação de UFC, NO e IgG2b. Porém, os níveis de TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, IgG total, IgM, IgG1, IgG2a e IgA não são significativamente alterados. Neutrófilos e macrófagos peritoneais co-cultivados com Pb e L-AmB tendem a apresentar maior capacidade fungicida, mas não maior síntese de mediadores. O melhor desempenho de L-AmB poderia se dever a sua interação com TLR4. Em TLR4-deficientes ou não, a progressão da doença é similar. A eficácia da terapia, porém, é menor nos deficientes, como observado na quantificação de UFC; os perfis leucocitários e as concentrações de NO, TNF-a, IL-12 e GM-CSF não são significativamente alterados. Logo, a droga é capaz de reverter os parâmetros micológicos, mas não os imunológicos. A interação entre TLR4, P. brasiliensis e L-AmB não parece ser importante para o estabelecimento da imunidade. / Amphotericin B effects in mice susceptible to P. brasiliensis were evaluated. L-AmB reverts the susceptibility pattern to the resistant one with more efficiency than c-AmB, as confirmed by the CFU, NO e IgG2b quantifications. However, TNF-a, IL-12, IFN-g, GM-CSF, total IgG, IgM, IgG1, IgG2a and IgA levels are not significantly altered. Neutrophils and macrophages cocultivated with Pb e L-AmB tend to present higher fungicidal ability, but not enhanced synthesis of mediators. The better performance of L-AmB could be due to its interaction with TLR4. In TLR4-deficient or sufficient mice, progression of the disease is similar. The efficiency of the therapy, however, is lower in deficient animals, as seen on CFU; leukocyte profiles and NO, TNF-a, IL-12 and GM-CSF levels are not significantly altered by L-AmB-TLR4 interaction. Therefore, the drug administration is capable of reverting mycological parameters, but not the immunological ones. Interaction between TLR4, P. brasiliensis and L-AmB does not seem to play a special role in the establishment of immunity.

INTRODUÇÃO: Micose sistêmica mais importante da América do Sul e do Brasil, a Paracoccidioidomicose acomete difusamente os pulmões no seu principal modo de apresentação, a forma crônica. Os pacientes podem apresentar anormalidades respiratórias com repercussão clínica e na qualidade de vida relacionada à saúde mesmo após tratamento antifúngico adequado. Não há, todavia, estudos que avaliem as alterações pulmonares radiológicas e funcionais e sua real incidência e repercussão clínica e na qualidade de vida desses pacientes após o tratamento. MÉTODOS: Análise transversal de 50 pacientes através de tomografia computadorizada de tórax, prova de função pulmonar completa, teste cardiopulmonar de esforço, teste de caminhada de seis minutos (TC6M) e questionário de qualidade de vida relacionada à saúde e de índice de dispneia. Todos tiveram diagnóstico da forma crônica da paracoccidioidomicose e foram avaliados quando atingiram critérios de inatividade de doença. RESULTADOS: Os pacientes apresentaram anormalidades tomográficas em 98% dos casos, sendo distorção da arquitetura (90%), reticulado (88%), enfisema centrolobular e parasseptal (84%) e bandas parenquimatosas (74%) as mais frequentes. Os achados foram principalmente difusos, e foi predominante a combinação das localizações central e periférica (80%). Do ponto de vista funcional, apresentaram, em média, distúrbio obstrutivo leve sem resposta ao broncodilatador, com redução leve da difusão do CO. Ao teste de esforço cardiopulmonar, atingiram média de VO2 máx dentro da normalidade, e à caminhada de seis minutos atingiram distância média dentro da normalidade. O questionário de qualidade de vida relacionado à saúde mostrou um impacto baixo na qualidade de vida, e o índice de dispneia mostrou alteração leve (MRC 1). Quando divididos em dois grupos em relação à dessaturação no TC6M, o grupo mais grave apresentou valor de CIE inicial mais alto e mais enfisema na TCAR, porém não houve diferença na exposição tabágica, no número de alterações tomográficas cicatriciais encontradas, na capacidade aeróbica medida pelo TCPE e TC6M e tampouco no questionário de qualidade de vida relacionada à saúde ou índice de dispneia. CONCLUSÃO: Na forma crônica da paracoccidioidomicose, após tratamento antifúngico e atingidos critérios de inatividade de doença, os pacientes apresentam anormalidades tomográficas persistentes e disseminadas, porém sem determinar um comprometimento grave na função pulmonar, capacidade aeróbica ou qualidade de vida relacionada à saúde. Todavia, uma parcela da população tem acometimento funcional mais grave, com maior alteração da troca gasosa levando a maior dessaturação ao exercício. Ao ser estudado distintamente, esse grupo de indivíduos não se diferencia do restante em termos de exposição tabágica, capacidade aeróbica, impacto na qualidade de vida relacionada à saúde e índice de dispneia ou número de alterações radiológicas intersticiais cicatriciais encontradas na tomografia computadorizada de tórax, porém apresenta sorologia inicial (CIE) mais alta e enfisema mais proeminente na TCAR / BACKGROUND: Paracoccidioidomycosis (PCM), the most important systemic mycosis in Latin America and Brazil, can diffusely affect the lungs in its mains form of presentation, the chronic form. Even after adequate antifungal therapy, the patients may present residual respiratory abnormalities with potential clinical, functional and health-related quality of life impairment, due to fungus-induced lung fibrosis. METHODS: Cross-sectional analysis of 50 consecutive inactive chronic Paracoccidioidomycosis patients, through high resolution computed tomography (HRCT) reviewed by a chest radiologist and a pulmonologist, pulmonary function tests with diffusion capacity, ergoespirometry, six minute walk test (6MWT) and health-related quality of life questionnaire. All patients had achieved inactivity criteria when evaluation was performed. RESULTS: Radiological abnormalities were present in 98% of the cases, and the most frequent were architectural distortion (90%), reticulate and septum thickening (88%), centrolobular and parasseptal emphysema (84%) and parenchymal bands (74%). The findings were mainly diffuse, and predominantly with a combination of central and peripheral locations (80%). From the functional standpoint the patients presented, in average, a mild obstructive disorder without bronchodilator response, associated to a mild reduction in diffusion capacity. The ergoespirometry demonstrated a mean VO2 máx in the range of normality, and the patients achieved a mean normal distance in the 6MWT. The Saint-George Respiratory Questionnaire evaluation showed a low total impairment in health-related quality of life and the MRC questionnaire a low dyspnae index. When split in two groups in terms of exercise desaturation in the 6MWT, the more severely impaired group presented a higher initial serology (CIE) and more severe emphysema graded by HRCT, but there was no difference between the two groups in regards to interstitial fibrotic tomographic abnormalities, tobacco exposure, exercise capacity measured by ergoespirometry and 6MWT, nor in the health related quality of life and dyspnae index. CONCLUSIONS: In the chronic form of Paracoccidioidomycosis, after antifungal treatment, the patients show persistent and disseminated radiological abnormalities, but these findings appear to determine a short impairment in pulmonary function and low impact in aerobic capacity and health-related quality of life. However, in a minor subset of individuals the functional impairment can be severe. When this group is distinctly studied, the individuals present no difference in tobacco exposure, interstitial fibrotic radiological findings, exercise capacity nor health related quality of life and dyspnae index when compared to less severely afflicted patients, but do so in terms of higher initial serology (CIE) and severity of emphysema quantification by HRCT

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico patogênico agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose endêmica no Brasil. A busca por alternativas para reduzir o tempo de tratamento da PCM levou ao desenvolvimento de uma vacina de DNA contendo a sequência do peptídeo P10 de P. brasiliensis. Neste trabalho, avaliamos a geração de células T de memória e células T reguladoras em camundongos imunizados com esta vacina de DNA antes e após o desafio com o fungo, através da análise de seus esplenócitos e linfócitos pulmonares por citometria de fluxo. Os resultados mostram um aumento no percentual de células T reguladoras e de memória no baço e pulmões dos animais imunizados antes e depois de 30, 60 e 120 dias do desafio em comparação com os grupos controle e não imunizado. Outro experimento revelou que o modelo experimental da PCM in vivo é capaz de induzir a expressão de ROR&#947t. Este estudo mostra que nossa vacina de DNA contra a PCM gera células com fenótipo de reguladoras e de memória, caracterizando seu potencial para o tratamento desta micose. / Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungal pathogen that is the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a mycosis endemic in Brazil. The search for new alternatives to reduce the duration of PCM treatment led to the development of a DNA vaccine encoding the peptide P10 of P. brasiliensis. Presently, we evaluated the generation of memory and regulatory T cells in mice immunized with this DNA vaccine, before and after the challenge with the fungus by analizing their splenocytes and pulmonary lymphocytes by flow cytometry. The results show an increase in the percentage of regulatory and memory T cells on spleens and lungs of immunized mice before and after 30, 60 and 120 days of challenge compared with the control and untreated groups. Another experiment revealed that the PCM in vivo infection model is capable of inducing ROR&#947t expression. This study demonstrates that our DNA vaccine against PCM generates cells with a regulatory and memory phenotype, which shows its potencial in the treatment of this mycosis.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica causada pelos fungos Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidioideslutzii. O comprometimento da pele e mucosa oral são frequentes na PCM. As células dendríticas e queratinócitos do tegumento, devido à sua função como células apresentadoras de antígenos, atuam na resposta imune inata e adaptativa contra agentes patogênicos. Com o objetivo de verificar a interação do P. brasiliensis com essas células, estudamos 47 biopsias de mucosa oral e 52 de pele de lesões de doentes com diagnóstico comprovado de PCM. As biopsias foram submetidas à técnica de imuno-histoquímica de dupla-marcação com os anticorpos anti-fator XIIIa (marcador de dendrócitos dérmicos), anti-CD207 (marcador de células de Langerhans maduras), anti-pancitoqueratinas (AE1-AE3) e anti-P. brasiliensis. Fez-se também a reação de dupla marcação por técnica de imunofluorescência, com análise por microscopia confocal a laser, para a melhor visualização da interação entre queratinócitos e os fungos. Quarenta e dois por cento das amostras de mucosa oral exibiram formas fúngicas no citoplasma de dendrócitos dérmicos. As células de Langerhans, tanto nas biopsias de mucosa oral como de pele, não mostraram leveduras ou antígenos do fungo no seu citoplasma. Cinquenta e quatro por cento das biopsias de pele e sessenta por cento das amostras de mucosa exibiram leveduras no citoplasma de queratinócitos. Os resultados obtidos permitem concluir que o parasitismo de queratinócitos pode representar possível mecanismo de evasão do fungo aos mecanismos imunes locais. Os dendrócitos dérmicos fator XIIIa positivos e queratinócitos podem estar a atuar como células apresentadoras de antígenos para suprir a função, provavelmente prejudicada, das células de Langerhans nas lesões de pele e mucosa oral da PCM humana / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic disease caused by the fungus Paracoccidioides brasiliensis, which compromises various organs, mainly the lungs. The skin and oral mucosa are often affected. Dendritic cells and keratinocytes of the integument play a role in innate and adaptive immune response against pathogens, due to their function as antigen presenting cells. Aiming to verify the interaction of P. brasiliensis with these cell populations, we studied 52 biopsies of skin and 47 oral mucosa samples taken from patients with proven diagnosis of PCM. The biopsies were subjected to double immune staining technique with anti-factor XIIIa (marker of dermal dendrocytes), anti- CD207 (marker of mature Langerhans cells), anti-pan cytokeratins (AE1-AE3) and anti P. brasiliensis antibodies. Analyses with confocal laser microscopy were also performed to better visualization of the interaction between keratinocytes and the fungi. Factor XIIIa + dermal dendrocytes of 42% samples of oral mucosa displayed yeast forms in their cytoplasm. We did not observe yeast cells in the cytoplasm of Langerhans cells in both skin and oral mucosa samples. Fifty -four percent of skin and 60% of mucosal samples displayed yeast cells in the cytoplasm of keratinocytes. The parasitism of keratinocytes may represent a possible mechanism of evasion of the fungus to local immune mechanisms, or even as a result of keratinocytes ability to antigen presentation in PCM. Factor XIIIa dendrocytes and keratinocytes may be acting as antigenpresenting cells to fulfill the function of Langerhans cells, probably impaired, in skin and mucosa of human PCM

Indolamina-2,3-dioxigenase (IDO) e o catabolismo do triptofano estão envolvidos no controle da imunidade inata e adaptativa contra patógenos. Investigamos o papel da IDO na paracoccidiodomicose pulmonar (PCM) de animais suscetíveis (B10.A) e resistentes (A/J) ao fungo. Observou-se uma ação marcante da IDO ao início da doença de camundongos B10.A onde a enzima controla a carga fúngica mas, também, induz anergia de células TCD4+ e TCD8+, creditada em parte à expansão de células Treg e aumento de linfócitos em apoptose. Em camundongos A/J, a IDO controla a carga fúngica inicial, porém, o seu efeito supressor sobre linfócitos TCD4+ é somente observado na 8ª semana. Assim como em camundongos B10.A, a IDO mostrou-se indutora de células Treg e linfócitos em apoptose durante a imunidade desenvolvida por camundongos A/J. Em conclusão, foi demonstrado pela primeira vez que a IDO exerce um importante mecanismo microbicida e imunorregulador na PCM de hospedeiros resistentes e suscetíveis ao P. brasiliensis. / Indoleamine-2, 3-dioxygenase (IDO) and tryptophan catabolism are involved in the control of innate and adaptive immunity against pathogens. We investigated the role of IDO in the pulmonary paracoccidiodomycosis developed by susceptible (B10.A) and resistant (A/J) mice to the fungus. We verified that IDO plays a different effect in innate the immunity of B10.A and A/J mice. Early in the infection, IDO controlled the fungal loads but also induced anergy of CD4+ and CD8+ T cells of B10.A mice. T cell anergy was partially due to the expansion of Treg cells and increased apoptosis of lymphocytes. In resistant mice, IDO controlled the initial fungal loads, but exerted a suppressive effect on T lymphocytes only at week 8. As in B10.A mice IDO was shown to induce Treg cells and apoptosis of lymphocytes in the course of immune response developed by resistant mice. In conclusion our work showed for the first time that IDO play an important role in the fungicidal and immunoregulatory mechanisms developed by susceptible and resistant mice to P. brasiliensis infection.

Introdução. A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica crônica, endêmica na América Latina, principalmente Brasil, sendo a oitava causa de morte entre as doenças infecciosas crônicas recorrentes. A PCM infecção é caracterizada por uma resposta Th1, a forma aguda por um perfil misto da resposta Th2/Th9, enquanto na forma crônica caracteriza-se pelo perfil Th17/Th22. A ocorrência e gravidade da PCM humana podem também estar associadas a fatores genéticos como os polimorfismos dos genes de citocinas. Objetivos. 1. Descrever a frequência dos polimorfismos de (SNPs) IFNG +874 T/A, IL12B 3\' UTR +1188 A/C e IL12RB1 11014 A/G no éxon 7 em pacientes e controles; 2. Investigar a associação entre esses polimorfismos e as diferentes formas clínicas da micose; 3. Verificar se há associação entre esses polimorfismos e a secreção das citocinas IFN-y, IL-12p40 e IL-12p70. Materiais e Métodos. 143 pacientes com PCM foram incluídos (40 com a forma aguda, 100 com a forma crônica multifocal e 17 unifocal). Critérios de inclusão: ter doença ativa (DA) comprovada por exame micológico ou histopatológico positivo ou presença de anticorpos anti-Paracoccidioides brasiliensis (>= 1/32 por contraimunoeletroforese) ou ter doença curada/tratada (CT) quando comprovada anteriormente pelos critérios de DA e atualmente com títulos de anticorpos estáveis e <= 4 em dois períodos com intervalo >= 6 meses. Analisaram-se os SNPs IFNG pela técnica de PCR-ARMS (\"Polymerase Chain Reaction - Amplification Refractory Mutational System\"), IL12B e IL12RB1 por RFLP (\"PCR-Restriction Fragment Lenght Polymorphism\"). Para a dosagem de citocinas foram utilizadas as técnicas de ELISA (n=29) e CBA (\"Cytometric Bead Array\"; n= 18), sendo considerados estatisticamente significantes, os valores de p < 0,05 para os testes de x2 e o teste de Kruskal-Wallis, com pós-teste de Dunn. Resultados. O genótipo AA do SNP IL12RB1 foi mais frequente na forma crônica multifocal e o genótipo AG, na forma unifocal masculina (p= 0,048). À análise desta forma clínica entre ambos os sexos, o genótipo AG foi também mais frequente no sexo masculino (p= 0,009). Segundo a etnia, foi demonstrada diferença estatisticamente significante nas frequências dos genótipos e alelos dos SNPs IFNG e IL12RB1 (p < 0,05). Em relação às formas clínicas da PCM, houve similaridade nas frequências dos genótipos e alelos dos SNPs estudados. Quanto aos níveis das citocinas, para os SNPs IFNG, IL12B e IL12RB1, maiores níveis de secreção de citocinas, frente a PHA, foram registrados nos grupos CT e CO em relação ao DA, sugerindo relação com a evolução da doença e com a imunossupressão já descrita na doença ativa. Conclusão. Não houve associação entre os SNPs IFNG, IL12B e IL12RB1 e as diferentes formas da doença quando todos os pacientes foram analisados; no sexo masculino, sugere-se que o genótipo AA esteja associado à doença crônica mais disseminada (IL12RB1). Houve diferença significante entre as etnias nos SNPs IFNG e IL12RB1, sugerindo-se a ampliação do número de pacientes em determinadas etnias e na forma clínica unifocal para melhor compreensão dessas associações / Introduction. Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic chronic mycosis, endemic in Latin America, mainly in Brazil where it is the eighth cause of death among chronic recurrent infectious diseases. PCM infection is characterized by the Th1 immune response, the acute form, by a mixed Th2/Th9 profile, while the chronic form is characterized by Th17/Th22 profile. The occurrence and severity of human PCM can also be associated with genetic factors such as polymorphisms on genes of cytokines. Objectives. 1. To describe the frequencies of the single nucleotide polymorphisms (SNPs) IFNG +874 T/A, IL12B 3\'UTR +1188 A/C and IL12RB1 11014 A/G on exon 7, on patients with PCM and non-PCM controls; 2. To investigate the association between those SNPs and the different clinical forms of PCM. 3. To verify the possible association between those SNPs and the secretion of the cytokines IFN-?, IL-12p40 and IL12p70. Materials and Methods. 143 patients with PCM were included (40 with acute form, 100 with multifocal chronic form and 17 unifocal). Inclusion criteria: active disease (DA) proved by fungal identification on direct microscopy/histopathology or culture, or presence of antibodies antiParacoccidioides brasiliensis ( >= 1/32 by counterimmunoelectrophoresis) or cured/treated disease (CT) when previously proved by criteria of DA and present stable antibodies titles =6 months in between. The SNP IFNG was analyzed by PCR-ARMS (Polymerase Chain Reaction - Amplification Refractory Mutational System) and the SNPs IL12B and IL12RB1 by PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism). The levels of cytokines were detected by ELISA (n= 29) and CBA (Cytometric Bead Array; n= 18) and values of p < 0.05 for ?2 test and Kruskal-Wallis\' test, with Dunn\'s post-test were considered statistically significant. Results. The AA genotype of SNP IL12RB1 was the most frequent in the multifocal chronic form while the AG was more frequent in men with the unifocal chronic form of PCM (p = 0.048). On this clinical form in the comparison between genres, the AG genotype was also more frequent in men (p= 0.009). On ethnicity, it was demonstrated statistical difference between the frequencies of genotypes and alleles of SNPs IFNG and IL12RB1 (p < 0.05). In the comparison between the clinical forms of PCM, the frequencies of genotypes and alleles of the evaluated SNPs were similar. On the levels of cytokines, for SNPs IFNG, IL12B and IL12RB1, increased levels of cytokines were observed with PHA on the CT and CO groups compared with DA, suggesting a connection with the evolution of the disease and the previously described immunosuppression during active disease. Conclusion. There was no association between the SNPs IFNG, IL12B and IL12RB1 and the different forms of PCM when all patients were analyzed; among men, it is suggested that the AA genotype of IL12RB1 is associated with a more disseminated chronic disease. There was a significant difference between the ethnicities on SNPs IFNG and IL12RB1, being the latter also associated with the chronic form in men. The increase in the number of patients in certain ethnic groups and in the unifocal clinical form of PCM might help the better understanding of these associations

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:26:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Patricia Fernanda Zambuzzi Carvalho.pdf: 3971188 bytes, checksum: 969d3e1c4e16d34d3b2fea9e30b2cebc (MD5) Previous issue date: 2010-09-10 / The termodimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic human mycosis geographically distributed in Latin America, being the eighth most common cause of death among chronic infections. PCM is acquired by inhalation of fungal propagules, which reach the lungs and is disseminate through the bloodstream and/or lymph to all parts of the body. The treatment of PCM is long, starting with a dosage of aggressive antifungal agents, extending for months or years. Resistance to antimicrobial drugs may limit the ability of effective treatment of patients, interfering with therapeutic efficacy. Thus, it is necessary to discover and develop new antifungal agents. Plants compounds have a great structural diversity, many of which are models for the synthesis of a vast number of drugs. The action of the oenothein B compound, purified from leaves of Eugenia uniflora, a plant from the Brazilian Savannah, was evaluated on growth, viability and expression of P. brasiliensis genes. The compound interfered with cell morphology and inhibited the transcripts of &#946;-1- 3-glucan synthase. The synergistic effect between oenothein B and drugs used to treat PCM (amphotericin B, itraconazole, Sulfamethoxazole and Trimethoprim-Sulfamethoxazole Combination) was evaluated in this study by the method of sensitivity on plates. The highest inhibition of the fungal growth was observed in association of oenothein B with Trimethoprim-Sulfamethoxazole Combination, followed by amphotericin B, itraconazole and sulfamethoxazole, respectively. Representational Difference Analysis (RDA) was also performed to elucidate the mechanism of action of oenothein B in P. brasiliensis. We identified 463 ESTs up regulated and 121 ESTs down regulated after 90 min of incubation of P. brasiliensis yeast cells with the compound. After 180 min incubation 301 ESTs up regulated and 143 down regulated were identified. The ESTs were classified according to their functional categories using the program Blast2GO. The analysis indicated the presence of transcripts with functions related to cell wall and membrane, transcription factors and hypothetical proteins. In this study, we evaluated also the characteristics of the malate synthase (Pbmls) cDNA, regulation of Pbmls gene expression, and enzymatic activity of the MLS protein of P. brasiliensis (PbMLS), isolate Pb01. The cDNA contains 1617 bp, which encodes a protein of 539 amino acids. The protein has the signature of the MLSs, residues essential for catalytic activity and addressing signal for peroxisomes, PTS1. The high level of Pbmls transcript observed in the presence of 2C sources suggests that in P. brasiliensis, the primary regulation of carbon flux into glyoxylate cycle was at the level of the Pbmls transcript. Transcript analysis, protein levels and enzymatic activity in the presence of different carbon and nitrogen sources suggest that PbMLS acts in both pathways: in glyoxylate cycle, when 2C sources are used, and in alantoin degradation pathway, when proline is used as nitrogen source, or when oxalurate is used to induces genes from pathway. / O fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica humana geograficamente distribuída na América Latina, sendo a oitava causa de morte mais comum entre as infecções crônicas recorrentes. A PCM é adquirida pela inalação de propágulos do fungo, os quais chegam ao pulmão, e é disseminado pela corrente sanguínea e/ou linfática para todas as partes do corpo. O tratamento da PCM é longo, iniciando com uma dosagem de agentes antifúngicos agressiva, se estendendo por meses ou anos. A resistência às drogas antimicrobianas pode limitar a capacidade do tratamento efetivo dos pacientes, interferindo na eficácia da terapêutica. Desta forma, torna-se necessário a descoberta e desenvolvimento de novos agentes antifúngicos. Compostos de plantas são produtos biológicos, com uma grande diversidade estrutural, muitas das quais são modelos para a síntese de um vasto número de fármacos. A atuação do composto oenoteína B, purificado das folhas de Eugenia uniflora, uma planta do Cerrado Brasileiro, foi avaliado no crescimento, viabilidade e expressão de genes de P. brasiliensis. O composto interferiu com a morfologia das células e inibiu os transcritos de &#946;-1-3-glicana sintase. O efeito sinérgico entre oenoteína B e os fármacos utilizados no tratamento da PCM (anfotericina B, itraconazol, sulfametoxazol e a combinação trimetoprim-sulfametoxazol), foi avaliado no presente estudo, através do método de sensibilidade em placas. A maior inibição no crescimento das colônias do fungo foi observada na associação da oenoteína B com a combinação trimetoprimsulfametoxazol, seguido com anfotericina B, itraconazol e sulfametoxazol, respectivamente. A Análise Diferencial Representacional (RDA) também foi realizada visando elucidar o mecanismo de ação da oenoteína B em P. brasiliensis. Foram identificadas 463 ESTs induzidas e 121 ESTs reprimidas, após 90 min de incubação de células leveduriformes do fungo com o composto. Após 180 min de incubação foram identificadas 301 ESTs induzidas e 143 reprimidas. As ESTs foram classificadas de acordo com suas categorias funcionais utilizando o programa Blast2GO. As análises indicaram a presença de transcritos com funções relacionados à parede e membrana celular, fatores de transcrição e proteínas hipotéticas. No presente trabalho, foi avaliado ainda, as características do cDNA, a regulação da expressão gênica de Pbmls, e a atividade enzimática da proteína de P. brasiliensis (PbMLS), isolado Pb01. O cDNA contém 1617 pb, que codifica uma proteina de 539 aminoácidos. A proteína apresenta a assinatura das MLSs, resíduos catalíticos essenciais para a atividade e o sinal de endereçamento para os peroxissomos, PTS1. O maior nível do transcrito Pbmls observado na presença de fontes de 2C sugere que em P. brasiliensis, a regulação primária do fluxo de carbono no ciclo do glioxalato foi ao nível dos transcritos de Pbmls. As análises de transcritos, níveis de proteínas e atividades enzimáticas na presença de diferentes fontes de carbono e nitrogênio sugerem que PbMLS esteja atuando em ambas as vias: no ciclo do glioxalato, quando fontes de 2C são utilizadas, e na via da degradação da alantoína, quando prolina é utilizada como fonte de nitrogênio, ou quando oxalurato é utilizado para induzir os genes da via.

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica causada pelos fungos Paracoccidioides brasiliensis e Paracoccidioideslutzii. O comprometimento da pele e mucosa oral são frequentes na PCM. As células dendríticas e queratinócitos do tegumento, devido à sua função como células apresentadoras de antígenos, atuam na resposta imune inata e adaptativa contra agentes patogênicos. Com o objetivo de verificar a interação do P. brasiliensis com essas células, estudamos 47 biopsias de mucosa oral e 52 de pele de lesões de doentes com diagnóstico comprovado de PCM. As biopsias foram submetidas à técnica de imuno-histoquímica de dupla-marcação com os anticorpos anti-fator XIIIa (marcador de dendrócitos dérmicos), anti-CD207 (marcador de células de Langerhans maduras), anti-pancitoqueratinas (AE1-AE3) e anti-P. brasiliensis. Fez-se também a reação de dupla marcação por técnica de imunofluorescência, com análise por microscopia confocal a laser, para a melhor visualização da interação entre queratinócitos e os fungos. Quarenta e dois por cento das amostras de mucosa oral exibiram formas fúngicas no citoplasma de dendrócitos dérmicos. As células de Langerhans, tanto nas biopsias de mucosa oral como de pele, não mostraram leveduras ou antígenos do fungo no seu citoplasma. Cinquenta e quatro por cento das biopsias de pele e sessenta por cento das amostras de mucosa exibiram leveduras no citoplasma de queratinócitos. Os resultados obtidos permitem concluir que o parasitismo de queratinócitos pode representar possível mecanismo de evasão do fungo aos mecanismos imunes locais. Os dendrócitos dérmicos fator XIIIa positivos e queratinócitos podem estar a atuar como células apresentadoras de antígenos para suprir a função, provavelmente prejudicada, das células de Langerhans nas lesões de pele e mucosa oral da PCM humana / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic disease caused by the fungus Paracoccidioides brasiliensis, which compromises various organs, mainly the lungs. The skin and oral mucosa are often affected. Dendritic cells and keratinocytes of the integument play a role in innate and adaptive immune response against pathogens, due to their function as antigen presenting cells. Aiming to verify the interaction of P. brasiliensis with these cell populations, we studied 52 biopsies of skin and 47 oral mucosa samples taken from patients with proven diagnosis of PCM. The biopsies were subjected to double immune staining technique with anti-factor XIIIa (marker of dermal dendrocytes), anti- CD207 (marker of mature Langerhans cells), anti-pan cytokeratins (AE1-AE3) and anti P. brasiliensis antibodies. Analyses with confocal laser microscopy were also performed to better visualization of the interaction between keratinocytes and the fungi. Factor XIIIa + dermal dendrocytes of 42% samples of oral mucosa displayed yeast forms in their cytoplasm. We did not observe yeast cells in the cytoplasm of Langerhans cells in both skin and oral mucosa samples. Fifty -four percent of skin and 60% of mucosal samples displayed yeast cells in the cytoplasm of keratinocytes. The parasitism of keratinocytes may represent a possible mechanism of evasion of the fungus to local immune mechanisms, or even as a result of keratinocytes ability to antigen presentation in PCM. Factor XIIIa dendrocytes and keratinocytes may be acting as antigenpresenting cells to fulfill the function of Langerhans cells, probably impaired, in skin and mucosa of human PCM