Orientadora : Profª. Drª. Ida Chapaval Pimentel / Coorientador : Prof. Dr. Álvaro Figueredo dos Santos / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 19/02/2016 / Inclui referências : f. 72-82 / Área de concentração / Resumo: A peroba rosa (Aspidosperma polyneuron) é uma espécie florestal nativa da Floresta Estacional Semidecidual, que encontra-se ameaçada de extinção devido à intensa exploração predatória. Com a intensificação da procura por sementes, surge a necessidade de ampliar os conhecimentos sobre a qualidade das sementes de espécies florestais nativas. Frente a isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a qualidade sanitária e fisiológica de dez lotes de sementes de peroba rosa, identificando e avaliando fungos que são transmitidos pelas sementes e que possam causar danos à germinação e desenvolvimento das plantas. Foram utilizadas sementes oriundas de quatro regiões do Paraná (Oeste, Sudoeste, Centro-Sul e Noroeste). Para a germinação e vigor foram realizadas seis repetições de 25 sementes em rolos de papel, mantidas em germinador a 25°C por 26 dias com luz contínua. Os parâmetros de vigor avaliados foram a primeira contagem com 12 dias, índice de velocidade de germinação e comprimento de parte aérea e raiz. As análises sanitárias consistiram na detecção de fungos endofíticos e epifíticos, a qual requer níveis diferentes de desinfestação prévia das sementes. Para a detecção de fungos endofíticos (álcool 70% - 1 minuto; hipoclorito de sódio 1% - 4 minutos; álcool 70% - 30 segundos) e epifíticos (álcool 70% - 30 segundos; hipoclorito de sódio 1% - 1 minuto) foi utilizado meio de batata-dextrose-ágar (BDA) e meio seletivo de Fusarium (MSF). O material foi incubado a 20 °C, fotoperíodo de 12 horas de luz/ 12 horas de escuro, por sete dias. Em seguida, determinou-se a incidência (%) dos fungos. Para a transmissão, as sementes não desinfestadas foram semeadas em vermiculita. Avaliou-se a presença de sintomas nas plântulas. Aos 60 dias após a semeadura, as sementes não germinadas foram removidas e colocadas em câmara úmida para observação. Quanto à patogenicidade o teste foi realizado em mudas de peroba rosa, com ferimentos prévios nas folhas e inoculou-se um disco de meio BDA com micélio em crescimento ativo. As mudas foram colocadas em câmara úmida por 72 horas e mantidas por 30 dias em casa de vegetação. Os isolados de Fusarium spp. e Phomopsis spp. selecionados foram identificados por meio de sequências das regiões ITS1-5,8S e ITS2 do DNA ribossomal e região parcial do fator de elongação 1-alpha. A germinação das sementes de peroba rosa variou de 9,3% a 60%. Fusarium spp. e Phomopsis spp. foram os fungos fitopatogênicos encontrados como epífitos nas sementes de peroba rosa, com incidência entre 52 e 25%, respectivamente. Como endófitos apresentaram valores entre 5 e 65%, respectivamente. Houve transmissão de Fusarium spp. e Phomopsis spp. das sementes para as plântulas causando necrose de raízes e cotilédones. 27 isolados de Fusarium spp. e 26 de um total de 32 isolados de Phomopsis spp. foram patogênicos. Por meio das características morfológicas e moleculares foram identificadas sete espécies de Fusarium - Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Fusarium verticillioides, Fusarium equiseti, Fusarium fujikuroi, Fusarium pseudocircinatum e Fusarium subglutinans, associadas às sementes de peroba rosa. Quanto à Phomopsis spp., foram identificadas duas espécies: Diaporthe paranensis e Diaporthe oxe. Palavras-chave: Patologia de sementes, sementes florestais nativas, fungos endofíticos. / Abstract: The peroba rosa (Aspidosperma polyneuron) is a forest specie, native from the semideciduous forest, which is threatened of extinction due the intense predatory exploitation. The increasing on the demand for seeds arises the need to increase knowledge about the quality of seeds of native forest species. Based on that, the aim of this study was to check the sanitary quality and physiological of ten peroba rosa seed lots, identifying and assessing fungi what are transmitted for seeds and that can cause damage to the germination and development of plants. Ten lots of seeds from four regions of Paraná (West, Southwest, South Central and Northwest) were used. For germination and vigor, six repetitions of 25 seeds were performed in rolls of paper, maintained in germinator at 25 °C for 26 days with continuous light. The vigor parameters evaluated were the first count with 12 days, germination speed index and length of shoot and root. The sanitary analysis consisted in detecting endophytic and epiphytic fungi, which requires different levels of prior disinfection of the seeds. For detection of endophytic fungi (70% alcohol - 1 minute; 1% sodium hypochlorite - 4 minutes; 70% alcohol - 30 seconds) and epiphytic (70% alcohol - 30 seconds; 1% sodium hypochlorite - 1 minute) potato-dextrose-agar (PDA) and Fusarium selective medium (MSF) were used. The material was incubated at 20 °C, with photoperiod of 12 hours light / 12 hours dark, for seven days. Then, it was determined the incidence (%) of fungi. For the transmission test, the non-disinfested seeds were sown in vermiculite. The presence of symptoms in seedlings was evaluated. At 60 days after sowing, the non-germinated seeds were removed and placed in a humid chamber for observation. The pathogenicity test was performed in seedlings of peroba rosa, with previous injuries in the leaves where a disk of PDA with mycellium in active growth was inoculated. The seedlings were placed in humid chamber for 72 hours and maintained for 30 days in a greenhouse. The isolates of Fusarium spp. and Phomopsis spp. selected were identified by sequences of rDNA regions ITS1-5,8S and ITS2 and partial region of the elongation factor 1-alpha. The germination of seeds of peroba rosa ranged from 9.3% to 60%. Fusarium spp. and Phomopsis spp. were the phytopathogenic fungi found as epiphytes in peroba rosa, with incidence between 52 and 25%, respectively. As endophytes, they showed values between 5 and 65%, respectively. There was transmission of Fusarium spp. and Phomopsis spp. from the seeds to seedlings causing necrosis in roots and cotyledons. 27 isolates of Fusarium spp. and only 26 out of 32 isolates of Phomopsis spp. were pathogenic. Through morphological and molecular and characteristics, seven Fusarium species were identified - Fusarium solani, Fusarium oxysporum, Fusarium verticillioides, Fusarium equiseti, Fusarium fujikuroi, Fusarium pseudocircinatum and Fusarium subglutinans, all associated with peroba rosa seeds. Regarding the Phomopsis spp., two species were identified: Diaporthe paranensis and Diaporthe oxe. Keywords: Seed pathology, native forest seeds, endophytic fungi.

Orientadora : Profª Drª Vânia Aparecida Vicente / Coorientadora : Profª Drª Renata Rodrigues Gomes / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 04/02/2016 / Inclui referências : f. 76-92 / Resumo: As leveduras negras pertencentes à família Herpotrichiellaceae são microrganismos extremamente relevantes do ponto de vista ecológico e clínico. Esses organismos comuns sapróbios apresentam alta capacidade de adaptação e parecem apresentar um ciclo de vida composto e potencial de patogenicidade. No gênero Fonsecaea foram relatadas diferentes espécies associadas a hospedeiros humanos, animais e de fontes ambientais. Fonsecaea monophora é relatada como agente de cromoblastomicose com formação de corpos muriformes e agente de infecção cerebral. Buscando compreender a biologia e potencial de patogenicidade desta espécie, foi realizada sua análise genômica parcial e o desenvolvimento incial de um protocolo para caracterização carotípica do gênero. Para isto, o genoma parcial foi obtido utilizando a combinação de leituras de sequências provenientes das plataformas Illumina e Ion Proton. O draft de maior qualidade obtido apresenta tamanho de 34,21Mb, com 301 supercontigs e N50 de 268.916 pb. A partir do genoma parcial gerado, foi realizada a anotação automática e uma análise genômica preliminar. Para a caracterização cariotípica, podemos determinar o tiabendazol como agente bloqueador do desenvolvimento celular e estabelecer o protocolo para obtenção de protoplastos. Palavras-chave: Leveduras negras. Fonsecaea monophora. Anotação. Análise genômica. Cariótipo. / Abstract: Black yeast belonging to Herpotrichiellaceae family are extremely relevant microorganisms ecological and clinical point of view. These common saprobes organisms have a high capacity to adapt and appear to have a life cycle compound and potential pathogenicity. In the genus Fonsecaea different species were reported related to human, animal and environmental sources hosts whose ecology seems to direct the evolution of clinical conditions. Fonsecaea monophora is reported as chromoblastomycosis agent with training muriformes bodies and brain infection agent. Trying to understand the biology and potential pathogenicity of this species, it was carried out partial genomic analysis and the initial development of a protocol for carotípica characterization of the genre. For this, the partial genome was obtained using the combination of readings from sequences of Proton Ion and Illumina platform. The higher quality obtained draft has size 34,21Mb with 301 supercontigs and N50 of 268,916 bp. From the generated partial genome automatic annotation and preliminary genomic analysis was performed. For karyotype characterization, we can determine thiabendazole as blocking agent of cell growth and establish the protocol for protoplasts. Key words: Black yeasts. Fonsecaea monophora. Annotation. Genomic analysis.Karyotype.

Orientador : Profª. Drª. Giseli Klassen / Coorientador : Profª. Edneia A. S. R. Cavalieri / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 26/08/2016 / Inclui referências : f. 71-86 / Área de concentração: Patologia / Linha de pesquisa: Epigenética e câncer / Resumo: As metástases são a causa das mortes por câncer em 90% dos casos. No processo de metástases a destruição ou degradação da matriz extracelular é muito importante para o deslocamento das células tumorais malignas. Este processo é mediado por diversas enzimas, destacando-se a gelatinase B ou MMP-9. A epigenética estuda mecanismos de regulação da expressão gênica utilizando a metilação do DNA (em citosinas adjacentes a guaninas) e modificações pós-traducionais de histonas como principais mediadores. As ilhas de CpGs ao longo do promotor podem ser hipermetiladas e assim promover o silenciamento gênico e vice-versa. A partir deste conhecimento vem sendo utilizados diversos análogos de citosina a fim de inibir o processo de metilação de DNA. Nesse sentido esta em avançado estudo clínico o uso do 5-aza-2'- deoxicitosina (5-azadC) ou decitabine em alguns tipos de leucemias e doenças mielodisplásicas e provável inicio de utilização em tumores sólidos. Neste estudo o objetivo foi avaliar a expressão do gene MMP9 em linhagens de câncer de mama e com esses dados estudar o efeito da metilação do DNA e modificações de histonas no promotor e corpo do gene com e sem tratamento com decitabine. Para isso clonamos e sequenciamos uma região contendo CpGs da região promotora do gene MMP9 e também e ilhas de CpG no corpo do gene utilizando linhagens tumorais, PMC42, HeLa, MCF7 e MDA-MB-436. As linhagens MCF7 e MDA-MB-436 expressam baixos níveis de MMP9. Apos o tratamento destas 5- azadC foi observado aumento da expressão do gene e proteína MMP-9. O sequenciamento de CpGs na região promotora revelou que a metilação do DNA regula a expressão deste gene nas linhagens tumorais. Além disso a análise em amostras tumorais de pacientes que expressam MMP-9 também possuem estes CpGs desmetilados. A região intragênica contém 4 ilhas de CpG que foram clonadas em 2 fragmentos e denominadas CGI1 e CGI2. A CGI1 é altamente metiladas com ou sem tratamento com decitabine nas linhagens tumorais. Por outro lado a CGI2 apresentou alguns CpGs nas posições 12 a 30 que estavam metilados nas linhagens tumorais sem tratamento com decitabine, e que são desmetiladas após o tratamento. Novamente os resultados de contrapartida com amostras de tumores primários, estes mesmos CpGs encontraram-se desmetilados nos tumores mais agressivos e com presença de MMP-9 na imunohistoquímica. Afim de se avaliar o provável envolvimento de modificações de histonas foi realizada a imunoprecipitação de cromatina para as marcas de cromatina para abertura H3K4me3 e fechamento H3K27me3. Utilizando a linhagem MCF7 observou-se que após o tratamento com decitabine houve o enriquecimento da marca de abertura na região promotora onde se ligam os fatores de transcrição AP1 e NFkB. Além disso os CpGs 12-30 da CGI2 também apresentaram aumento da marca de abertura. Em conjunto esses resultados mostram um provável novo mecanismo de regulação da expressão gênica através de CpGs localizados em íntron no gene MMP9. Esses resultados são importantes no contexto do entendimento de mecanismos de expressão de MMP-9 em câncer de mama e também para o estudo de possível efeito de ativação de metástases com o uso do medicamento decitabine. / Abstract: Metastases are the cause of cancer deaths in 90% of cases. In the process of metastasis destruction or degradation of extracellular matrix it is important for the displacement of malignant tumor cells. This process is mediated by several enzymes, especially B-gelatinase or MMP-9. Epigenetic studies of regulatory mechanisms of gene expression using DNA methylation (adjacent cytosine to guanine) and post-translational modifications of histones as major mediators. The CpG islands along the promoter may be hypermethylated and thus promote gene silencing and vice versa. From this knowledge different cytosine analogues are used to inhibit the DNA methylation process. Accordingly this in advanced clinical study using 5-aza-2'-deoxicitosine (5-azadC) or decitabine in some types of leukemias and myelodysplastic diseases and probable beginning of use in solid tumors. In this study our goal was to evaluate the expression of MMP9 gene in breast cancer cell lines and study the effect of DNA methylation and histone modifications in the promoter gene and intragenic region with and without treatment with decitabine. To this we have cloned and sequenced a region containing CpGs of the MMP9 promoter region and CpG islands in the gene's body using tumor cell lines, PMC42, HeLa, MCF7 and MDA-MB-436. The lines MCF7 and MDA-MB-436 expressed low levels of MMP9. After treatment with 5-azadC was observed an increase in the gene expression and MMP-9 protein. The sequencing CpGs in the promoter region revealed that the DNA methylation regulates the expression of this gene in tumor cell lines. Further analysis of tumor samples from patients expressing MMP-9 also have these demethylated CpGs. The MMP9 intragenic region contains 4 CpG islands that were cloned in two fragments and called CGI1 and CGI2. The CGI1 was highly methylated with or without treatment with decitabine in tumor cell lines. On the other hand CGI2 have showed some CpGs in positions 12 to 30 that were methylated in tumor cell lines without treatment with decitabine, and are demethylated following treatment. Again counterpart results with primary tumor samples, the same CpG were demethylated in more aggressive tumors of MMP-9 positive in immunohistochemistry. In order to evaluate the probable involvement of histone modifications was performed chromatin immunoprecipitation to chromatin marks for H3K4me3 H3K27me3 opening and closing respectivelly. Using the MCF7 it was observed that after treatment with decitabine was enriching the opening tag in the promoter region which bind transcription factors NFkB and AP1. Additionally the CpG 12-30 of CGI2 also increased too. Together these results showed a possible new mechanism for regulation of gene expression through CpGs located in intron in MMP9 gene. These results are important in the context of understanding of MMP-9 expression mechanisms in breast cancer and also for the study of possible metastases activation with the use of decitabine drug.

Orientadora : Profª Drª Vanete Thomaz-Soccol / Co-orientadora : Profª Drª Silvana Maria Alban / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba,26/07/2014 / Inclui referências / Área de concentração: Parasitologia / Resumo:As leishmanioses são causadas por protozoários do gênero Leishmania Ross, 1903. Esta doença é uma das principais parasitoses negligenciadas, re-emergentes e afeta cerca de 350 milhões de indivíduos no mundo. O objetivo deste trabalho foi identificar peptídeos miméticos, para uso como antígenos em imunodiagnóstico e imunoprofilaxia da leishmaniose tegumentar americana (LTA). Bacteriófagos, expressando peptídeos em sua superfície, foram selecionados por imunoglobulinas específicas para Leishmania (Vianna) braziliensis (L. braziliensis). Posteriormente os mesmos foram submetidos à extração e sequenciamento do seu DNA. Três peptídeos (P-1, P-2 e P-3) foram identificados, sintetizados e inoculados individualmente ou combinados (MIX) em hamsters golden. Os animais imunizados com peptídeos produziram anticorpos que reconheceram diferentes proteínas do antígeno solúvel (AS) de L. braziliensis. A comparação das sequências dos três peptídeos, em banco de dados, demonstrou que elas apresentam homologia com glicoproteína de 63 kDa de Leishmania, lipofosfoglicano e com outras proteínas hipotéticas de Leishmania. Os peptídeos foram avaliados como antígenos no teste ELISA indireto. Dois grupos de pacientes foram investigados, sendo o primeiro constituído por 25 indivíduos que tiveram diagnóstico parasitológico confirmado e o segundo por 57 pacientes que apresentavam suspeita clínica de LTA, eram moradores de área endêmica e que tinham teste sorológico positivo para a doença. Os três peptídeos e o MIX foram imunorreativos contra soro de pacientes dos dois grupos. O peptídeo 1, 2, 3, MIX e AS reagiram com 64, 56, 44/56, 40/72 e 80% das amostras de soro, respectivamente. No Grupo 2, os três peptídeos só ou em combinação foram capazes de diagnosticar 82 a 84% dos indivíduos. Para obtenção do ponto de corte (Cut-off) entre soros positivos e negativos dois cálculos foram aplicados. O primeiro foi realizado calculando a média das absorbâncias obtidas para um grupo de indivíduos considerados negativos e acrescidos de dois desvios padrão (2SD) e o segundo foi empregando a Curva ROC (Receiver Operating Characteristics). As sensibilidades do teste ELISA utilizando os peptídeos foram de 64 a 74% para o peptídeo 1, 56 a 65% para o peptídeo 2, 44 a 68% para o peptídeo 3, 40 a 79% para o MIX e de 80 e 91% para o AS. O MIX de peptídeos apresentou o melhor desempenho (79% de sensibilidade) entre os peptídeos seguido do P-1 (74%). A aplicação do teste t sugeriu que o P-1 seria melhor alternativa entre os peptídeos para o diagnóstico da LTA. As especificidades dos antígenos variaram de 92 a 100% demonstrando a habilidade destes em diagnosticar corretamente os indivíduos sadios. Reações cruzadas com soros de pacientes com doença de chagas, hanseníase e tuberculose foram avaliadas contra todos os antígenos. A reação cruzada com soro de pacientes com doença de chagas foi 0% para o P-1 enquanto que para o AS foi 60%. Os peptídeos sintéticos também foram testados em ensaios de imunoproteção contra leishmaniose experimental (LE) em hamsters. Foi possível observar que os animais do grupo controle positivo (que receberam o desafio com L. braziliensis e não receberam peptídeos) apresentaram lesões específicas de LE, enquanto que os animais imunizados com os peptídeos individualmente ou em combinação não apresentaram lesões ou as apresentaram em menor número. Os animais que receberam o peptídeo 2 não desenvolveram lesões. Promastigotas de L. braziliensis foram isoladas, em meio de cultura, da pata, baço e fígado de animais de todos os grupos, com exceção do grupo dois e do grupo controle negativo. Essas análises demonstram que a metodologia selecionada para a realização dessa pesquisa foi adequada, visto que sequências peptídicas com homologia aos principais fatores de virulência de Leishmania sp. foram obtidas, resultados promissores em testes sorológicos de diagnóstico foram alcançados e imunoproteção de animais contra a leishmaniose experimental foi observada. Palavras-chave: Phage display. leishmaniose. ELISA. Vacinas. / Abstract: Leishmaniosis are caused by protozoan parasites of the genus Leishmania Ross, 1903. This is one of the main neglected, re-emerging parasitic diseases and affects about 350 million people worldwide. The objective of this study was to identify mimetic peptides to use as antigens in immunodiagnosis and immunoprophylaxis of American Cutaneous Leishmaniosis (ACL). Bacteriophages expressing peptides on their surface were selected by specific immunoglobulins for Leishmania (Vianna) braziliensis (L. braziliensis). Subsequently, they were subjected to DNA extraction and sequencing. Three peptides (P-1, P-2 e P-3) were identified, synthesized and individually or combined (MIX) inoculated in Golden hamsters. Animals immunized with peptides produced antibodies that recognized different proteins from the Soluble Antigen (SA) from L. braziliensis. Comparison of the sequences of the three peptides in database showed that they have similarity with a 63 kDa glycoprotein of Leishmania, a lipophosphoglycan and other hypothetical proteins of Leishmania. The peptides were evaluated as antigens in indirect ELISA. Two groups of patients were studied: the first consists of 25 individuals who had confirmed parasitological diagnosis and the second group of 57 patients who had clinical suspicion of ACL and were residents of endemic area and also had a positive serologic test for the disease. The three peptides and the MIX were immunoreactive against sera of patients in both groups. Peptide 1, 2, 3, MIX and AS were reactive with 64, 56, 44/56, 40/72 and 80% sera samples, respectively. In Group 2, the three peptides alone or in combination were able to diagnose 82 a 84% of individuals. In order to obtain the cut-off between positive and negative sera, two calculations were applied. The first one was conducted by calculating the mean absorbance obtained for a group of individuals considered negative plus two standard deviations (2SD). The second calculation was using the ROC curve (Receiver Operating Characteristics). The sensibility of the ELISA assay using the peptides were 64 to 74% for peptide 1, 56 to 65% for peptide 2, 44 to 68% for peptide 3, 40 to 79% for the MIX and 80 to 91% for the SA. The MIX of peptides showed the best performance (79%) among the peptides followed by P-1 (74%). The application of the t-test suggested that P-1 was the best alternative among the peptides for the diagnosis of ACL.The specificities of antigens ranged from 92% to 100% demonstrating the ability to correctly diagnose the healthy individuals. Cross-reactions with sera from patients with Chagas disease, leprosy and tuberculosis were evaluated against all antigens. Cross-reactivity with Chagas disease was zero for the P-1 and 60% for SA. The synthetic peptides were also tested in assays of immune protection against experimental Leishmaniosis (EL) in hamsters. It was possible to observe that the animals in the positive control group (that received a challenge with L. braziliensis and did not receive peptides) presented specific lesions of EL, whereas animals immunized with the peptides alone or in combination presented a few or no lesions. The animals receiving the peptide 2 did not develop lesions. Promastigotes of L. braziliensis were isolated in culture medium from the paw, spleen and liver from animals of all groups except group 2 and negative control group. These analysis show that the methodology selected for this study was appropriate. Since peptide sequences with homology to the main virulence factors of Leishmania sp. were obtained, promising results in serological diagnostic tests were achieved and immune protection of animals against EL was observed. Keywords: Phage display. Leishmaniosis. ELISA. Vaccines.

Orientador : Prof. Dr. Wanderson Duarte da Rocha / Coorientadora : Profª. Drª. Larissa Magalhães Alvarenga / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 14/05/2014 / Inclui referências : f. 71-82 / Resumo: A doença de Chagas, causada pelo Trypanosoma cruzi, é uma doença parasitária que afeta em torno de 12 a 14 milhões de indivíduos, causando um importante impacto econômico. Uma vez que as formas de tratamento disponíveis apresentam eficiência questionáveis e sérios efeitos colaterais, a busca de formas alternativas à terapêutica atual se faz necessária. A melhoria na "entrega" de fármacos pode ser uma estratégia interessante para redução dos efeitos colaterais dos tratamentos utilizados. Além disso, os fármacos ideais são aqueles que interferem em mecanismos específicos do parasito, que são essenciais para sua sobrevivência no hospedeiro mamífero. Nesse sentido, foi demostrado previamente que as mucinas denominadas gp35/50 participam no processo de adesão e invasão celular possibilitando o estabelecimento da infecção, tornando-se candidatos interessantes para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas no tratamento desta parasitose. Adicionalmente, anticorpos monoclonais anti-gp35/50 (mAb-10D8) são capazes de interferir com o mecanismo de virulência de formas tripomastigotas metacíclicas. Conciliando todas as características, decidimos obter anticorpo recombinante anti-gp35/50 (scFv-10D8) para fins terapêuticos, uma vez que estas moléculas são específicas e tem sido utilizadas com sucesso em outras patologias. Desta forma, a tecnologia de anticorpos recombinantes a partir RNA total de hibridoma (mAb-10D8) foi utilizada aqui para obtenção das regiões variáveis das cadeias leves e pesada de mAb-10D8 por RT-PCR utilizando iniciadores específicos. Os fragmentos obtidos foram sequenciados e utilizados para síntese de um gene sintético de scFv (scFv-10D8) otimizado para expressão em E. coli. O gene de scFv-10D8 foi subclonado em vetor de expressão procariótico fusionado à cauda de histidinas (pET22b). Após otimização das condições de indução e enriquecimento de uma fração contendo scFv-10D8, foi demonstrado que a proteína recombinante é capaz de reconhecer as mesmas proteínas identificadas pelo mAb-10D8. Diante destes resultados, especula-se que esse anticorpo recombinante anti-gp35/50 de T. cruzi manterá as mesmas propriedades descritas para o mAb-10D8 e seu fragmento Fab na redução da virulência. Sendo assim, é provável que o scFv-10D8 poderá ser utilizado sozinho ou associado a outras moléculas tóxicas ao parasito. Palavras-chave: Trypanosoma cruzi, scFv-10D8, gp35/50, anticorpos recombinantes. / Abstract: Chagas disease is a parasitic disease caused by Trypanosoma cruzi, and affects approximately 10 million individuals causing a major economic impact. Since the available therapeutic approaches have questionable effectiveness and serious side effects, the search for alternatives to the current therapeutic strategies is required. The improvement on drug delivery can reduce the side effects caused by the treatment. Moreover, the ideal drugs are the ones that interfere with specific mechanisms from the parasite that is essential for its survival in the mammalian host. Thus, it was previously shown that the mucins called gp35/50 are involved in cell adhesion and invasion processes enabling the establishment of infection and become interesting candidates for the development of new chemotherapeutic agents. Additionally, it was published that anti-gp35/50 monoclonal antibodies (mAb-10D8) are capable of interfering with the virulence mechanisms of trypomastigotes. Combining all the features we decided to obtain anti-gp35/50 recombinant antibody (scFv-10D8) for therapeutic purposes, since these molecules are specific and have been successfully used in other pathologies. Here, the technology of recombinant antibodies was used to obtain the regions encoding the variable light and heavy chains of mAb-10D8 by RT-PCR using specific primers and total RNA from hybridoma cells. The fragments were sequenced and used for the synthesis of a synthetic gene of scFv (scFv- 10D8) optimized for E. coli expression. The scFv-10D8 gene was subcloned fused to a histidine tag into a prokaryotic expression system (pET22b). After testing some induction conditions and enriching a fraction containing scFv-10D8, it was demonstrated that the recombinant antibody is able to recognize in the same fashion as mAb-10D8 the parasite protein. These results encourage us to speculate that this scFv anti-T.cruzi gp35/50 can be used in a new therapeutic strategy for Chagas disease, since it may retain the features previously described for mAb-10D8 and its Fab fragment. Thus, scFv-10D8 may be used alone or conjugated to a known drug against T. cruzi. Keywords: Trypanosoma cruzi, scFv-10D8, Recombinant antibodies, gp35/50

Orientadora : Profª Drª Patricia do Rocio Dalzoto / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica. Defesa: Curitiba, 28/03/2014 / Inclui referências / Área de concentração: Microbiologia / Resumo: A corrosão influenciada por micro-organismos (CIM) é a mudança do potencial eletroquímico na interface metal/solução, causado pela produção de metabólitos de bactérias e fungos que crescem aderidos a superfícies metálicas na forma de biofilmes. O conhecimento da microbiota dos biofilmes permite a escolha do melhor antimicrobiano a ser utilizado para reduzir os efeitos da CIM. A abordagem polifásica, que consiste na associação de técnicas morfológicas, químicas e genéticas, é interessante para uma correta caracterização de micro-organismos. A espectroscopia no infravermelho aparece como uma opção para a identificação de fungos e bactérias devido à rapidez na execução e ao menor custo, quando comparado com as demais técnicas. O objetivo deste trabalho foi o isolamento e a identificação polifásica de micro-organismos presentes em corpos de prova metálicos instalados na Usina Hidrelétrica de Tucuruí (PA), e a avaliação do melhor biocida a ser utilizado para o controle da formação de biofilmes. As coletas foram feitas a cada dois meses entre 2011 e 2012, e os micro-organismos identificados por macro e micromorfologia, bioquimismo e biologia molecular. Os antimicrobianos Orobor, MXD-100 (MaxClean®), hidróxido de sódio, extrato de aroeira (Schinus terebinthifolius) e extrato de erva-mate (Ilex paraguariensis) foram testados quanto a sua eficiência. Os dados foram analisados por ANOVA (p<0,01) seguido por teste de Scott-Knott para comparação das médias (p<0,05). Foram isoladas 358 bactérias aeróbias ou anaeróbias facultativas, pertencentes em sua maioria aos gêneros Bacillus, Citrobacter, Shigella, Pseudomonas, Enterobacter e Acinetobacter. Foi verificada a presença de bactérias redutoras de sulfato e bactérias oxidantes de ferro, além do isolamento de 94 fungos, com predomínio dos gêneros Penicillium e Aspergillus. Os antimicrobianos MXD-100 1 ppm e 3 ppm, Orobor 10 mL/L e NaOH pH 14 foram os mais eficientes no controle, reduzindo em aproximadamente 35% o crescimento bacteriano e fúngico. A espectroscopia no infravermelho foi testada para classificação microbiana, e se mostrou eficiente na identificação de fungos filamentosos, mas novas metodologias devem ser testadas para a identificação bacteriana. A caracterização de micro-organismos encontrados nos corpos de prova metálicos mostra a biodiversidade da região e está relacionada ao processo de biocorrosão, possibilitando o desenvolvimento de novas estratégias de controle. Palavras chave: Biofilme, biocorrosão, biocida e NIRS. / Abstract: Microbially Influenced Corrosion (MIC) is the change of electrochemical potential at the interface metal/solution, caused by metabolites produced by bacteria and fungi growing in metallic surfaces as biofilms. The knowledge of biofilms’ microbiota allow us to choose the best biocide to reduce the effects of MIC. Polyphasic approach, consisting in associate morphological, chemical and genetical techniques, is interesting for the correct characterization of micro-organisms. Infrared spectroscopy shows up as an option to identify fungi and bacteria because of faster response and lower costs, when compared with other techniques. The aim of this work were the isolation and the polyphasic identification of micro-organisms present in metallic coupons installed in Tucuruí’s Power Plant (PA), and the evaluation of the best biocide to be used for the control of biofilm formation. Samples were collected every two months during 2011 and 2012, and micro-organisms were identified by macro and micromorphology, biochemical assays and molecular tools. The efficiency of biocides Orobor, MXD-100 (MaxClean®), sodium hydroxide, Schinus terebinthifolius extract and Ilex paraguariensis extract were tested. Data were analyzed by ANOVA (p<0.01) followed by Scott-Knott test for comparison of means (p<0.05). It was isolated 358 aerobic or facultative anaerobic bacteria, belonging mostly to the genera Bacillus, Citrobacter, Shigella, Pseudomonas, Enterobacter and Acinetobacter. Sulfate-reducing and iron-oxidizing bacteria were also found, in addition of isolation of 94 fungi, with prevalence of the genera Penicillium and Aspergillus. MXD-100 1 ppm and 3 ppm, Orobor 10 mL/L and NaOH pH 14 were the most efficient biocides, reducing approximately 35% of bacteria and fungi. Infrared spectroscopy was tested for micro-organisms classification, and it was efficient to identify filamentous fungi, but new methodologies need to be tested to bacterial identification. The characterization of micro-organisms found on metal surfaces highlights the biodiversity of the region and can be related to the process of biocorrosion, enabling the development of new strategies for its control. Key words: Biofilm, biocorrosion, biocide and NIRS.

Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 2017 / Inclui referências : f. 55-60 / Resumo: A proteína STI1 foi descrita como uma molécula relacionada ao estresse térmico de leveduras, e por isso é denominada Stress-Inducible Protein 1. Sua homóloga humana é a Hop (Heat-shock organizing protein). Ela tem expressão praticamente ubíqua e é encontrada em vesículas intracelulares, complexo de Golgi ou dispersa no citoplasma. Estudos indicam que esta proteína participa de vários eventos celulares como desenvolvimento de astrócitos, diferenciação de neurônios, neuroproteção, neuritogênese, formação da memória em ratos e proliferação celular em tumor de ovário. Além disso, a STI1 foi também recentemente caracterizada como ligante da GTPase Rnd1. As GTPases de baixa massa molecular são um grupo de moléculas que ciclam entre as formas ativa e inativa. Aquelas pertencentes à subfamília Rnd possuem pouca atividade GTPásica intrínseca, encontrando-se constitutivamente ativas, sendo desse modo diferentes das outras Rho GTPases. A proteína Rnd1 é encontrada principalmente no cérebro, e está envolvida em vários mecanismos celulares, como a inibição de fibras de estresse e a indução da desorganização do citoesqueleto de actina e adesão focal. Além disso, Rnd1 está presente na extensão inicial de neuritos em células PC-12, e no desenvolvimento de dendritos em neurônios hipocampais de ratos. Foi demonstrada que a interação da STI1 com a Rnd1 pode interferir na fenomenologia (colapso do cone de crescimento) desencadeada pelo eixo Sema3A/Plexina-A1. Por outro lado ainda não foi determinado quais são as vias de sinalização que estão a jusante da interação STI1- Rnd1, responsáveis por esta interferência. Desse modo, as proteínas recombinantes GST, GST-RhoA G14V e GST-RBD foram expressas para a realização de ensaios de pulldown visando elucidar o papel de STI1 na atividade de p190RhoGAP e seu substrato RhoA. Primeiramente foi possível detectar que a presença de STI1 ao inativar Rnd1, leva também a inativação de sua ligante p190RhoGAP. Porém, não foi possível esclarecer o papel desta proteína na atividade de RhoA bem como sua atuação na atividade de cofilina. A produção de anticorpo monoclonal anti-Rnd1 também foi um objetivo do presente trabalho, porém apesar da indicação da presença de anticorpos anti-Rnd1 em soro policlonal, não foi possível detectar a clone positivo para este anticorpo na produção de hibridomas. Palavras-chave: GTPases, Rnd1, STI1, atividade. / Abstract: STI1 protein has been described as a yeast thermal stress-related molecule, and is therefore called Stress-Inducible Protein 1. Its human counterpart is Hop (Heat-shock organizing protein). It has virtually ubiquitous expression and is found in intracellular vesicles, Golgi complex or dispersed in the cytoplasm. Studies indicate that this protein participates in several cellular events such as astrocyte development, differentiation of neurons, neuroprotection, neuritogenesis, memory formation in rats and cell proliferation in ovarian tumor. In addition, STI1 has also recently been characterized as GTPase Rnd1 linker. Low molecular weight GTPases are a group of molecules that cycle between active and inactive forms. Those belonging to the subfamily Rnd have little intrinsic GTPase activity, being constitutively active, thus being different from the other Rho GTPases. Rnd1 protein is found primarily in the brain, and it is involved in several cellular mechanisms, such as inhibition of stress fibers and induction of actin cytoskeleton disorganization and focal adhesion. In addition, Rnd1 is present in the initial extension of neurites in PC-12 cells, and in the development of dendrites in hippocampal neurons of rats. It has been shown that the interaction of STI1 with Rnd1 can interfere in the phenomenology (growth cone collapse) triggered by the Sema3A / Plexin-A1 axis. On the other hand, it has not yet been determined which are the signaling pathways that are downstream of the STI1-Rnd1 interaction, responsible for this interference. Thus, the recombinant GST, GST-RhoA G14V and GST-RBD proteins were expressed for pulldown assays to elucidate the role of STI1 in p190RhoGAP activity and its RhoA substrate. First, it was possible to detect that the presence of STI1 when inactivating Rnd1 also leads to the inactivation of its p190RhoGAP ligand. However, it was not possible to clarify the role of this protein in RhoA activity as well in cofilin activity. The production of anti-Rnd1 monoclonal antibody was also an objective of the present work, but despite the presence of anti-Rnd1 antibodies in polyclonal serum, it was not possible to detect the positive clone for this antibody in the production of hybridomas. Key words: GTPases, Rnd1, STI1, activity.

Orientador: Reinaldo José da Silva / Banca: Eliana Reiko Matushima / Banca: Luciano Alves dos Anjos / Banca: Cecília Baptistotte / Banca: Rodney Kozlowiski de Azevedo / Resumo: O presente estudo teve como objetivo realizar um levantamento da fauna de helmintos parasitas de tartarugas marinhas da Costa brasileira. Foram estudados 590 quelônios pertencentes a cinco espécies: Chelonia mydas (n = 508), Caretta caretta (n = 31), Eretymochelys imbricata (n = 31), Lepidochelys olivacea (n = 12) (Cheloniidae) e Dermochelys coriacea (n = 8) (Dermochelidae). Somente animais mortos ou que vieram a óbito nos Centros de Reabilitação das Bases do Projeto Brasileiro de conservação e manejo de tartarugas marinhas (TAMAR-ICMBIO) foram incluídos no estudo. A análise parasitológica foi realizada no trato digestório, sistema circulatório e cavidade dos animais. Um total de 36.186 helmintos parasitas das classes Trematoda e Nematoda foram encontrados, sendo que a maior predominância foi observada para os trematódeos. Treze famílias, 34 gêneros e 41 espécies foram identificados. Dados sobre prevalência, riqueza, intensidade de infecção e abundância de parasitas são apresentados para cada parasita encontrado e por hospedeiro estudado. Os resultados obtidos representam uma importante contribuição para o conhecimento da fauna de helmintos parasitas de tartarugas marinhas e sobre a distribuição geográfica destes helmintos ao longo da Costa brasileira / Abstract: The present study aimed to evaluate the helminth parasites of sea turtles from Brazilian Coast. A total of 590 chelonians from five species were studied: Chelonia mydas (n = 508), Caretta caretta (n = 31), Eretymochelys imbricata (n = 31), Lepidochelys olivacea (n = 12) (Cheloniidae) and Dermochelys coriacea (n = 8) (Dermochelidae). Only dead animals or that died in TAMAR-ICMBio Project Marine Sea Turtle Rehabilitation Center were included in the study. The parasitological analysis was performed in the animal's digestive tract, circulatory system and cavity. A total of 36,186 helminthes of the classes Trematoda and Nematoda were found, with great predominance of the trematodes. Thirteen families, 34 genera and 41 species were identified. Data on prevalence, richness, intensity of infection and abundance of parasites are presented for every helminthes species, for each studied host. The obtained results represent an important contribution to the knowledge of helminth fauna of sea turtles and on the geographic distribution of these helminthes in the Brazilian Coast / Doutor

Orientador: Alessandro Francisco Talamini do Amarante / Banca: Lúcia Helena O'Dwyer de Oliveira / Banca: Helder Louvandini / Banca: Stevam Guilherme Lux Hoppe / Banca: José Maurício Sforcin / Resumo: A variação sazonal e a intensidade de infestação por larvas de Oestrus ovis em ovinos criados em Botucatu-SP foi avaliada de abril de 2008 a março de 2011. Dois cordeiros traçadores foram colocados, mensalmente, junto com um rebanho ovino, onde permaneceram por 28 dias. Após esse período, os traçadores foram sacrificados e as larvas de O. ovis recuperadas, identificadas e quantificadas de acordo com o estádio de desenvolvimento. Dos 72 cordeiros traçadores, 50% estavam infestados por larvas O. ovis com intensidade média de 16,8 larvas/cabeça com média de 7,8 larvas de primeiro estádio (L1), 5,3 de segundo (L2) e 3,7 de terceiro (L3). Sinais clínicos de oestrose foram mensalmente avaliados em todas as ovelhas do rebanho e a prevalência média de animais com sinais clínicos de oestrose foi de 13,4% (máxima de 31,4% em janeiro de 2009 e mínimo de 1% em setembro de 2010). Além disso, a prevalência do parasitismo por O. ovis e a intensidade de infestação foram avaliados em cabeças de ovinos obtidas de um abatedouro localizado em Itápolis - SP. Das 139 cabeças examinadas, 13,7% estavam parasitadas pelas larvas O. ovis e a intensidade de infestação média mensal variou de 1 até 10,2 larvas/cabeça com intensidade média geral de 4,5 larvas/cabeça. Do total de 85 larvas, 21,2% eram L1, 37,6% L2 e 41,2% L3. Os resultados demonstraram que as condições climáticas do Estado de São Paulo são favoráveis para a atividade da mosca e desenvolvimento dos estágios larvais praticamente durante todo o ano. Em outro estudo, foi avaliada, comparativamente, a resistência de cordeiros de duas raças ovinas, Ile de France (IF) e Santa Inês (SI) contra infestações naturais por O. ovis, bem como a associação entre a ocorrência deste parasita com as infecções naturais por nematódeos gastrintestinais... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The seasonal factors which influence Oestrus ovis infestation in sheep in Botucatu-SP were determined from April 2008 until March 2011. Two tracer lambs were exposed monthly to natural infestation by O. ovis larvae for 28 consecutive days, by grazing with a sheep flock. Tracer animals were then euthanized and the larvae of O. ovis recovered from nasal and sinus cavities. Of the 72 tracer lambs, 50% were infested with O. ovis larvae and the mean intensity of infestation per head infested was 16.8 larvae with an average of 7.8 first instar (L1), 5.3 second instar (L2) and 3.7 third instar (L3). Clinic signs of oestrosis were evaluated in all sheep of the flock monthly and the average prevalence of animals with clinical signs of oestrosis was 13.4% (maximum of 31.4% in January 2009 and minimum of 1% in September 2010). Additionally, the O. ovis prevalence and infestation intensity were evaluated in heads from slaughtered sheep from Itápolis-SP. Of the 139 head examined 13.7% were parasitized by O. ovis larvae with monthly mean of intensity of infestation ranging from 1 until 10.2 larvae/infested head with general mean intensity of 4.5 larvae/infested head. Of the total of 85 larvae, 21.2% were L1, 37.6% L2 and 41.2% L3. The results suggest that the climatic conditions in São Paulo State are favorable to fly activity and larval development during the whole year. In other study, were evaluated comparatively, the resistance in lambs of two sheep breeds, Ile de France (IF) and Santa Ines (SI) against O. ovis infestation, well as the association between the occurrence of this parasite with natural infections by gastrointestinal nematodes (GIN). SI (n=12) and IF (n=12) young male lambs weaned at two months of age were kept together in a paddock from September to early December 2009, when were sacrificed. All animals were... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Banca: Hiro Goto / Banca: Jayme Augusto de Souza Neto / Banca: Cassiano Victória / Banca: Carlos Magno Castelo Branco Fortaleza / Resumo: Leishmaniose Visceral Americana (LVA) é uma doença tropical negligenciada em expansão no Brasil, ocorrendo em áreas onde antes não havia registro. Seu agente etiológico e a Leishmania chagasi um protozoário pertencente à classe Kinetoplastida caracterizada por uma organela denominada cinetoplasto a qual possui um DNA organizado em uma rede contendo maxicírculos, responsáveis pelas funções respiratórias e minicírculos, envolvidos na pordução de RNAs-guia, os quais possuem um papel importante na edição dos RNAs dos maxicírculos. Os minicírculos são divididos em uma região convervada de aproximadamente 120 p.b. e uma região variável de aproximadamente 600 p.b. O foco desse estudo está na análise das seqüências da região variável a fim de entender sua distribuição nos diferentes estágios de vida da L. chagasi. As amostras foram coletadas de cães e pacientes sintomáticos por aspiração dos linfonodos e, em alguns casos, foram obtidas culturas primárias. A extração do DNA foi realizada com o kit comercial Nucleo Spin Blood Kit (Macherey - Nagel) seguindo as instruções do protocolo. O kDNA foi amplificado por PCR, utilizando o par de oligonucleotídeos LIN R4 - forward (5'-GGT TGG TGT AAA ATA GGG-3) e LIN 19 - reverse (5'-GAA CGC CCC TAC CCG-3'), produzindo um fragmento de aproximadamente 720 p.b. Os produtos da PCR foram clonados no vetor pTZ57R/T de acordo com o protocolo do InsTAclone PCR cloning kit. As seqüências (aproximadamente 182) foram individualmente comparadas com as depositadas no GenBank, alinhadas com o software Clustal X2 e tiveram uma árvore filogenética construída utilizando o software MEGA 4.0 adotando o algoritmo UPGMA e escolhendo um bootstrap com 1000 replicatas. A distribuição entre os diferentes hospedeiros foi homogênea. A princípio, um lato polimorfismo é observado, mas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: American Visceral Leishmaniasis (AVL) is a neglected tropical disease in expansion in Brazil currently occurring in areas where there has never been reports. Its etiologic agent is Leishmania chagasi, a protozoan belonging to the order Kinetoplastida characterized by an organelle named kinetoplast wich has a DNA organized in a network containing maxicircles, responsible for respiratory functions and minicircles, involved in the production of guide RNAs, which play a role in the RNA editing of maxicircles. The minicircles are divided into an approximately 120 b.p. conserved region and an approximately 600 b.p. variable region. The focus of this study is on the sequence analysis of the minicircles variable region in order to understand its distribution on different life stages of L. chagasi. Samples were collected from dogs and symptomatic patients by lymphonod aspiration and, in some cases, primary cultures were obtained. DNA extraction was carried out with the commercial kit Nucleo Spin Blood Kit (Macherey - Nagel) following its protocol. kDNA was amplified by PCR, using a pair of oligonucleotides LIN R4 - forward (5'-GGT TGG TGT AAA ATA GGG-3) and LIN 19 - reverse (5'-GAA CGC CCC TAC CCG-3'), producing a fragment of 720 b.p. PCR products were cloned in pTZ57R/T vector according to the InsTAclone PCR cloning kit protocol. Sequences (182) were individually compared with the ones deposited at the GENBANK, aligned with Clustal X2 software and had a phylogenetic tree constructed utilizing MEGA 4.0 software adopting UPGMA algorithm and choosing bootstrap with 1000 replicates. Sequences distribution among different hosts was homogeneous. At first, high polymorphism is observed but, when analyzed in more detail, i.e. by branch, sequences proved to be conserved and minimal SNP (Single Nucleotide Polymorphism) was found... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor