L'autophagie maintient l'homéostasie cellulaire en dégradant les composants cellulaires. Chez l'humain, les protéines LC3 jouent un rôle central dans l'autophagie en interagissant avec d'autres facteurs contenant des régions d'interaction LC3 (LIR). Cette thèse porte sur le rôle de différents facteurs contenant des LIR, tels que le facteur nucléaire DOR et la protéine NSs du virus de la fièvre de la vallée du Rift (VFVR). Les protéines LC3 sont principalement présentes dans le noyau des cellules au repos normales, et leur passage au cytosol en réponse au stress nécessite une interaction avec DOR. Récemment, il a été démontré que cette interaction entre DOR et LC3B dépend de la désacétylation de deux résidus lysine conservés (K49/K51 de LC3A et K46/K48 de GABARAP). Cependant, les détails mécanistiques du rôle des résidus lysine individuels dans le transfert d'autres protéines LC3 demeurent inconnus. De plus, la caractérisation de l'interaction NSs-LC3 ainsi que son impact sur l'autophagie lors de l'infection par le RVFV demeurent évasives. Par conséquent, l'objectif de ces études est d'investiguer les différences structurelles et fonctionnelles des protéines humaines LC3 à différents stades de l'autophagie via leur interaction avec DOR et NSs. Nos études biophysiques et structurales ont permis d’identifier des éléments clés déterminant la spécificité de la région d'interaction LC3 de DOR (DORLIR) pour GABARAP. Nos études structurales ont défini une conformation en feuillet  chez DORLIR lorsqu'elle est en complexe avec GABARAP, ce qui joue un rôle important dans l'établissement de cette spécificité. Les études structurales ont également montré que l'acétylation de la deuxième Lys de GABARAP ou LC3A perturbe des interactions clés du W35 de DORLIR, ce qui conduit à une diminution de l'affinité qui est cohérente avec nos résultats ITC. Ces résultats ont été confirmés grâce à des expériences cellulaires en utilisant des substitutions K-en-Q pour imiter l'acétylation des Lys. En cellules, les substitutions K-en-Q à la deuxième Lys ont entravé le transfert cytoplasmique de GABARAP et de LC3A, ainsi que leur colocalisation avec DOR, tandis que les substitutions K-en-Q à la première Lys se comportent comme des protéines de type sauvage. Dans l'ensemble, la désacétylation de la deuxième Lys conservée est cruciale pour le transfert cytoplasmique de GABARAP et LC3A lors de l'autophagie, ce qui diffère de ce qui a été observé auparavant avec LC3B, où la désacétylation des deux Lys était nécessaire. Cette étude fournit également des informations sur les interactions entre la protéine NSs du VFVR et les protéines LC3, ainsi que l'impact de NSs sur l'autophagie lors de l'infection par le VFVR. Nous avons identifié quatre motifs potentiels d'interaction LC3 (NSs1-4) dans la protéine NSs, et des études d’ITC ont démontré que NSs4 interagit avec une affinité sous micromolaire-micromolaire avec les protéines LC3 humaines. De plus, nous avons confirmé que les protéines LC3 interagissent avec NSs dans les cellules, et que chez les cellules infectées par le RVFV, LC3A colocalise avec NSs. Dans l'ensemble, les résultats indiquent que la protéine NSs joue un rôle clé dans la modification de l'autophagie lors des infections par le VFVR. / Autophagy maintains cellular homeostasis through catabolism of cellular components including organelles, proteins, and pathogens. In humans, the six LC3 (Microtubule-associated protein 1 light chain 3) protein (LC3A, LC3B, LC3C, GABARAP, GABARAPL1 and GABARAPL2) play a pivotal role in autophagy through interactions with other factors that contain LC3-interacting regions (LIRs). This study focuses on the role of different factors that contain LIRs such as the nuclear factor DOR and the NSs protein from the RVFV. LC3 proteins are predominantly present in the nucleus of normal resting cells and their shuttling to the cytosol in response to stress requires interaction with DOR. Recently, this interaction between DOR and LC3B was shown to depend on the deacetylation of two conserved Lys residues (K49/K51in LC3 subfamily proteins and K46/K48 in GABARAP subfamily proteins). However, the mechanistic details of the role of the individual Lys residues in the shuttling other LC3 proteins is unknown. In addition, the characterization of NSs-LC3 interaction as well as its impact on RVFV (Rift Valley fever virus) infection on autophagy remains elusive. Therefore, the goal of these studies is to investigate the structural and the functional differences of the six human LC3 proteins in different stages of autophagy through their interaction with DOR and NSs. Our biophysical and structural studies identified key elements determining the specificity of the LIR from DOR (DORLIR) for the GABARAP subfamily. Our structural studies defined a -sheet conformation in DORLIR when complexed with GABARAP, which is important role for establishing this specificity. ITC studies with acetylated versions of LC3A and GABARAP demonstrated that acetylation of the second Lys significantly decreases binding to the DORLIR whereas acetylation at the first Lys has little to no effect. Our structural studies also demonstrate that acetylation at the second Lys of either GABARAP or LC3A disrupts key interactions between W35 of the DORLIR, which leads to the decreased affinity. The in vitro results were verified in cellular experiments using K-to-Q substitutions to mimic Lys acetylation. In cells, K-to-Q substitutions at the second Lys impaired the cytoplasmic shuttling of both GABARAP and LC3A from the nucleus as well as their colocalization with DOR, whereas K-to-Q substitutions at the first Lys behaved like wild-type proteins. Taken together, the deacetylation of the second conserved Lys is critical for the cytoplasmic shuttling of GABARAP and LC3A during autophagy, which is in contrast to what was observed with LC3B where deacetylation of both Lys was required. This study also provides insights into interactions between the NSs protein of RVFV and LC3 proteins and the impact of NSs on autophagy during RVFV infection. We identified four potential LIR motifs (NSs1-4) in the NSs protein and ITC studies demonstrated that NSs4 interacts with submicromolar-micromolar affinity with the human LC3 proteins. In addition, we confirmed that LC3 proteins interact with NSs in cells and that in RVFV infected cell LC3A colocalizes with NSs. Taken together, the results indicate that the NSs protein plays a key role in altering autophagy during RVFV infections.

Dans le cortex visuel primaire (V1 ou l’aire 17) du chat, les neurones répondent aux orientations spécifiques des objets du monde extérieur et forment les colonnes d'orientation dans la zone V1. Un neurone répondant à une orientation horizontale sera excité par le contour horizontal d'un objet. Cette caractéristique de V1 appelée sélectivité d'orientation a été explorée pour étudier les effets de l'adaptation. Suivant un schéma d’entraînement (adaptation), le même neurone ayant initialement répondu à l’orientation horizontale répondra désormais à une orientation oblique. Dans cette thèse, nous étudions les propriétés d'ajustement d'orientation de neurones individuels dans des couches superficielles et plus profondes de V1 dans deux environnements d'adaptation. En raison de la grande interconnectivité entre les neurones de V1, nous émettons l'hypothèse que non seulement les neurones individuels sont affectés par l'adaptation, mais que tout le cortex est reprogrammé par l'adaptation. Des enregistrements extracellulaires ont été effectués sur des chats anesthésiés. Les activités neuronales ont été enregistrées simultanément aux couches 2/3 et à la 5/6 à l'aide d'une électrode de tungstène. Les neurones ont été adaptés à la fois par stimulation visuelle et son répétitif selon deux protocoles différents. Dans les deux cas, une plage stimulante constituée de sinusoïdes à défilement a été présentée pour évoquer les réponses dans V1 et générer des courbes de réglage d'activité multi-unités. La connectivité fonctionnelle entre les neurones enregistrés a été démontrée par un corrélogramme croisé entre les décharges cellulaires captées simultanément. En réponse à l'adaptation visuelle, les neurones des couches 2/3 et 5/6 ont montré des glissements attractifs et répulsifs classiques. En revanche en comparant le comportement des neurones de l'une et l'autre couche, on a observé une tendance équivalente. Les corrélogrammes croisés entre les trains de neurones des couches 2/3 et 5/6 ont révélé des décharges synchronisées entre les neurones. Durant l'adaptation au son, en l'absence totale de stimuli visuel, le glissement des courbes d’accord a été observés chez l'une et l'autre couche indiquant ainsi un changement de la sélectivité de l'orientation. Toutefois, il faut prendre note du fait que les cellules des deux couches ont un glissement aux directions opposées ce qui dénote un comportement indépendant. Nos résultats indiquent que les réponses des neurones du cortex V1 peuvent être évoqués par stimulation directe ou indirecte. La différence de réponses à différents environnements d'adaptation chez les neurones des couches 2/3 et 5/6 indiquent que les neurones de l'aire V1 peuvent choisir de se comporter de la même façon ou différemment lorsque confrontés à divers’ stimuli sensoriels. Ceci suggère que les réponses dans V1 sont dépendantes du stimulus environnemental. Aussi, les décharges synchronisées des neurones de la couche 2/3 et de la couche 5/6 démontre une connectivité fonctionnelle entre les paires de neurones. En définitive on pourrait affirmer que les neurones visuels subissent une altération de leur sélectivité en construisant de nouvelles cartes de sélectivité. À la lumière de nos résultats on pourrait concevoir que le cortex en entier serait multi sensoriel compte tenu de la plasticité entre les zones sensorielles. / In the cat primary visual cortex (V1 or area17), neurons fundamentally respond to orientations of the objects in the outside world. Neurons responding to specific orientations form the orientation columns in V1. A neuron responding to a horizontal orientation will get optimally excited towards the outline of a horizontal object. This feature of the visual cortex known as orientation selectivity has been continuously explored to study the effects of adaptation. Following a training paradigm called adaptation, the same neuron that was inherently responding to the horizontal orientation will respond to an oblique orientation. In this thesis, we seek to examine the orientation tuning properties of individual neurons in superficial and deeper layers of V1 in different adaptation environments. Due to the extensive interconnectivity between V1 neurons, we hypothesize that not only do individual neurons get affected by adaptation paradigm, but the whole cortex is reprogramed. To this aim, extracellular recordings were performed in conventionally prepared anesthetized cats. Neural activities were recorded simultaneously from layer 2/3 and layer 5/6 using a tungsten multichannel electrode. Neurons were adapted with a visual adapter (visual adaptation) and a repetitive sound (sound adaptation) in two different settings. Both types of adaptations were performed uninterrupted for 12 minutes. In both settings, sine-wave drifting gratings were presented to evoke responses in V1 and generate tuning curves from the recorded multiunit activity. The functional connectivity between the recorded neurons was revealed by computing cross-correlation between individual neuron pairs. In response to visual adaptation, layer 2/3 and 5/6 neurons displayed classical attractive and repulsive shifts. On comparing the behaviour of the neurons in either layer, an equivalent tendency was observed. Cross-correlograms between the spike trains of neurons in layers 2/3 and 5/6 revealed synchronized firing between the neurons suggesting coordinated dynamics of the co-active neurons and their functional connections. During sound adaptation, where the visual adapter was completely absent, shifts in the tuning curves were observed in either layer indicating a novel orientation selectivity. However, it is noteworthy that cells in both layers shifted in opposite directions indicating independent behaviour. V1 neurons might have an additional role besides processing visual stimuli. The visual neurons may have demonstrated multisensory properties when stimulated indirectly through neighbouring sensory regions. Our results indicate that primary visual neurons can be evoked by direct or indirect stimulation. The difference in the responses of layer 2/3 and layer 5/6 neurons towards the different adaptation environments indicate that neurons in V1 may behave similar or different towards the different sensory stimulus. This suggests that V1 responses are stimulus dependent. Additionally, the synchronized firing of layer 2/3 and layer 5/6 neurons towards visual adapter signify an existence of functional connectivity between the neuron pairs. Together, it can be summarised that visual neurons undergo an alteration of selectivity by building new orientation maps that ultimately potentiates plasticity within sensory regions that are highly suggestive of entire cortex being multisensory.

Les opioïdes restent encore à l’heure actuelle les composés pharmacologiques les plus efficaces pour traiter les différentes formes de douleurs, et donc fournir une analgésie thérapeutique. Cependant, l’administration répétée de ces composés entraîne des effets secondaires majeurs comme la dépression respiratoire, la tolérance, mais également, il a été montré que certains de ces opioïdes pouvaient engendrer des états proépileptiques. D’un point de vue thérapeutique, il existe donc un réel besoin pour de nouveaux et meilleurs traitements analgésiques, n’élicitant pas ces effets secondaires. Notre laboratoire étudie la signalétique des récepteurs couplés aux protéines G comme les récepteurs opioïdes et leur capacité de sélectivité fonctionnelle depuis des années, et en particulier celle du récepteur delta opioïde (DOP). En effet, celui-ci présenterait moins d’effets indésirables que le récepteur mu opioïde (MOP) qui est la cible principale des opioïdes classiques comme la morphine. Cependant, il semblerait que le DOP justement soit à l’origine des états proépileptiques précédemment décrits. Ainsi malgré la promesse initiale des agonistes delta par rapport à la diminution des effets secondaires, les effets proépileptiques de certains ont notamment contribué à une baisse d’intérêt vers le DOP et aucun de ses agonistes n’a pu passer les phases de tests cliniques. Cependant, il a été démontré que certains agonistes delta n’entraînaient pas d’effet proépileptique; tandis que d’autres oui. Comment expliquer un tel phénomène ? Ceci est la question que pose la présente recherche. Ainsi notre objectif sera d’obtenir et de comparer les signatures pharmacologiques des agonistes connus pour être proépileptiques versus ceux qui ne le sont pas ; par rapport à la transduction de signal via le récepteur delta opioïde et sa protéine G hétérotrimérique ; et par rapport à un de ses effecteurs principaux pour l’analgésie, un canal potassique rectifiant entrant. Cette comparaison se fera selon les paramètres du modèle classique de la pharmacologie, comme l’efficacité et la puissance ; mais également avec un outil plus récent appelé modèle opérationnel, utilisant des paramètres comme l’affinité et le coefficient de transduction. Pour se faire, le transfert d'énergie par résonance de bioluminescence ou BRET sera utilisé afin de caractériser les différentes voies signalétiques impliquées. Cette recherche s’inscrit dans un vaste contexte de collaboration entre différents laboratoires, et au sein de chacun d’entre eux, dans l’espoir de pouvoir synthétiser un jour, de meilleurs composés pharmacologiques, capables de cibler uniquement les voies médiatrices des effets thérapeutiques voulus, ici l’analgésie ; sans éliciter celles entraînant les effets secondaires associés, ici, les états proconvulsifs. L’aboutissement de cette recherche permettrait donc d’impacter la vie de millions de gens en souffrance, et c’est pourquoi il nous semble plus qu’important de continuer à l’entreprendre. / Opioids are still nowadays the most efficacious pharmacological compounds available to treat the different types of pain, and therefore provide a therapeutic analgesia. However, repeated administration of those compounds lead to major secondary effects like respiratory depression, tolerance, but also it was shown that some opioid compounds could induce seizures. From a therapeutical point of view, there is a serious need for new and better analgesic treatments that do not elicit such adverse effects. Our lab has been studying for years the signaletics of G-protein coupled receptors like the opioid receptors, and their capacity for functional selectivity, especially more recently the one of the delta opioid receptor (DOP). Indeed, this receptor elicits fewer adverse effects compared to the mu opioid receptor (MOP) that is the main target of all clinically used opioids such as morphine. However, it seems like the DOP itself would be responsible for the pro-epileptic states previously described. Thus, despite initial promises of the delta agonists towards reducing adverse effects whilst providing analgesia, the pro-convulsive effects that some seem to elicit have induced a loss of interest towards the DOP, and so far none of its agonists have gone further than pre-clinical trials. However, it has been shown that not all of those DOP agonists had those pro-convulsive adverse effects. How to explain such a phenomenon? This is the question which the present research will be asking. Thus our goal is to obtain and compare pharmacological signatures of the agonists known for being pro-convulsive versus those that are not ; regarding the transduction of signals through the delta opioid receptor and its heterotrimeric G-Protein ; and also regarding one of its main effectors to induce analgesia, an inwardly rectifying potassium channel. This comparison will be done according to the classical parameters of pharmacology, such as efficacy and potency ; but also according to the newest operational model, with parameters such as affinity and transduction coefficients. In order to do so, bioluminescence resonance energy transfer or BRET, will be used in order to characterize and quantify the signalling pathways there implicated. This research is embedded in a vast collaboration context, in between laboratories around the world, and within those laboratories as well, in hope to be able to one day synthesize, better pharmacological compounds, capable of targeting only the pathways responsible for the desired effects, here analgesia ; without triggering the associated adverse effects, here pro-convulsive states. The culmination of this research could allow to impact the lives of millions of people throughout the world, and this is why it is more than important for us to keep on pursuing it.

La prostaglandine E2 est une hormone lipidique produite abondamment dans le corps, incluant dans le rein où elle agit localement pour réguler les fonctions rénales. Un couplage à la protéine Gαs menant à une production d’AMPc a classiquement été attribué au récepteur EP4 de PGE2. La signalisation d’EP4 s’est cependant avérée plus complexe et implique aussi un couplage aux protéines sensibles à la PTX Gαi et des effets reliés aux β-arrestines. Il y a maintenant plusieurs exemples de l’activation sélective de voies de signalisation indépendantes par des ligands des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), et ce concept désigné sélectivité fonctionnelle pourrait être exploité dans le développement de nouveaux médicaments plus spécifiques et efficaces. Dans une première étude, la puissance et l’activité intrinsèque d’une série de ligands d’EP4 pour l’activation de Gαs, Gαi et de la ß-arrestine ont été systématiquement déterminées relativement au ligand endogène PGE2. Dans ce but, trois essais de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET) ont été adaptés pour évaluer les différentes voies dans des cellules vivantes. Nos résultats montrent une sélectivité fonctionnelle importante parmi les agonistes évalués et ont une implication pour l’utilisation d’analogues de la PGE2 dans un contexte expérimental et possiblement clinique, puisque leur spectre d’activité diffère de l’agoniste naturel. La méthodologie basée sur le BRET utilisée lors de cette première évaluation systématique d’une série d’agonistes d’EP4 devrait être applicable à l’étude d’autres RCPG. Dans une deuxième étude, des peptides reproduisant des régions juxtamembranaires extracellulaires du récepteur EP4 ont été conçus selon le raisonnement que des peptides ciblant des régions éloignées du site de liaison du ligand naturel ont le potentiel de ne moduler qu’une partie des activités du récepteur. L’insuffisance rénale aiguë est une complication médicale grave caractérisée par un déclin brusque et soutenu de la fonction rénale et pour laquelle il n’y a pas de traitement efficace à l’heure actuelle. Nos résultats montrent que le peptidomimétique dérivé d’EP4 optimisé (THG213.29) améliore significativement les fonctions rénales et les changements histologiques dans une insuffisance rénale aiguë induite par cisplatine ou par occlusion des artères rénales dans des rats Sprague-Dawley. Le THG213.29 ne compétitionnait pas la liaison de la PGE2 à EP4, mais modulait la cinétique de dissociation de la PGE2, suggérant une liaison à un site allostérique d’EP4. Le THG213.29 démontrait une sélectivité fonctionnelle, puisqu’il inhibait partiellement la production d’AMPc induite par EP4 mais n’affectait pas l’activation de Gαi ou le recrutement de la ß-arrestine. Nos résultats indiquent que le THG213.29 représente une nouvelle classe d’agent diurétique possédant les propriétés d’un modulateur allostérique non-compétitif des fonctions du récepteur EP4 pour l’amélioration des fonctions rénales suite à une insuffisance rénale aiguë. / Prostaglandin E2 (PGE2) is a lipid hormone mediator widely produced in the body, including in the kidney where it acts locally to regulate renal function. Classically, the PGE2 receptor EP4 has been classified as coupling to the Gαs subunit, leading to intracellular cAMP increases. However EP4 signaling has been revealed to be more complex and also involves coupling to PTX-sensitive Gαi proteins and ß-arrestin mediated effects. There are now many examples of selective activation of independent pathways by G-protein coupled receptor (GPCR) ligands, a concept referred to as functional selectivity that could be exploited for the development of more specific and efficacious drugs. In a first study, the potencies and efficacies of a panel of EP4 ligands were systematically determined for the activation of Gαs, Gαi and ß-arrestin relative to the endogenous ligand PGE2. For this purpose, three bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assays were adapted to evaluate the respective pathways in living cells. Our results suggest considerable functional selectivity among the tested, structurally related agonists and have implications for the use of PGE2 analogues in experimental and possibly clinical settings, as their activity spectra on EP4 differ from that of the native agonist. The BRET-based methodology used for this first systematic assessment of a set of EP4 agonists should be applicable for the study of other GPCRs. In a second study, peptides were derived from extracellular juxtamembranous regions of the EP4 receptor following the rationale that peptides that target regions of the receptor remote of the ligand-binding site might modulate a subset of the EP4-mediated activities. Acute renal failure is a serious medical complication characterized by an abrupt and sustained decline in renal function and for which there is currently no effective treatment. Our results show that the optimized EP4-derived peptidomimetic THG213.29 significantly improved renal functions and histological changes in acute renal failure induced by either cisplatin or renal artery occlusion in Sprague-Dawley rats. THG213.29 did not displace PGE2 binding to EP4, but modulated PGE2 binding dissociation kinetics, indicative of an allosteric binding mode. THG213.29 exhibited functional selectivity, as it partially inhibited EP4-mediated cAMP production but did not affect Gαi activation or ß-arrestin recruitment. Our results demonstrate that THG213.29 represents a novel class of diuretic agent with noncompetitive allosteric modulator effects on EP4 receptor function for improving renal function following acute renal failure.

Les récepteurs couplés aux protéines GRCPG sont une des plus grandes familles de récepteur membranaire codifié par le génome humain et certainement la plus grande famille de récepteurs. Localisés au niveau des membranes plasmiques, ils sont responsables d’une grande variété de réponses cellulaires. L’activation de ces derniers par des ligands était traditionnellement associée à un changement de conformation de la protéine, passant d’un état inactif à un état actif. Toutefois, certaines observations entraient en contradiction avec cette théorie et laissaient supposer la présence de plusieurs conformations actives du récepteur. Ces différentes conformations pouvaient être actives pour certaines voies de signalisation ou de régulation et inactives pour d’autres. Ce phénomène, initialement appelé agoniste dirigé ou « biased agonism », est maintenant décrit comme étant la sélectivité fonctionnelle des ligands des RCPG. Cette sélectivité des voies de signalisation et de régulation permettrait en théorie de développer des ligands capables de cibler seulement les voies de signalisation et de régulation responsable des effets thérapeutiques sans activer les voies responsables des effets secondaires ou indésirables. Le récepteur delta opiacé (DOR) est un RCPG impliqué dans la gestion de la douleur chronique. L’action analgésique de ses ligands est toutefois soumise à un effet de tolérance produite lors de leur utilisation à long terme. Cet effet secondaire limite l’utilisation thérapeutique de ces médicaments. Cette thèse s’est donc intéressée à la sélectivité fonctionnelle des ligands du DOR afin d’évaluer la possibilité de réduire les effets de tolérance produits par ces molécules. En premier lieu, nous avons déterminé que le DOR peut être stabilisé dans plusieurs conformations actives dépendantes du ligand qui le lie et ces conformations possèdent différents profils d’activation des voies de signalisation et de régulation. En deuxième lieu, nous avons déterminé que les différents ligands du DOR stabilisent des conformations du complexe récepteur/protéine G qui ne concordent pas avec la théorie des récepteurs à deux états, suggérant plutôt la présence d’une multitude de conformations actives. Finalement, nous avons démontré que ces différentes conformations interagissaient de façon distincte avec les protéines de régulation des RCPG; le ligand favorisant le retour du récepteur à la membrane produisant moins de désensibilisation et moins de tolérance aiguë à l’analgésie que le ligand favorisant la séquestration du récepteur à l’intérieur de la cellule. Les résultats de cette thèse démontrent que la sélectivité fonctionnelle des ligands opiacés pourrait être utilisée dans le développement de nouveau analgésique produisant moins de tolérance. / G protein coupled receptors (GPCRs) are one of the largest families of membrane receptor coded by the human genome and certainly the biggest family of receptors. Localized at the plasma membrane, they are responsible for a wide variety of cellular responses. Activation of GPCRs by ligands has been traditionally associated with change in protein conformation, switching from an inactive to an active state. However, some observations were inconsistent with this theory suggesting the presence of several active conformations of the receptor. These different conformations could be active in some signalling or regulatory pathways and inactive in others. This phenomenon, originally called biased agonism, is now described as the functional selectivity of GPCRs ligands. In theory, this type of selectivity could lead to the development of drugs that therapeutic action without activating signalling pathways responsible for side effect. The delta opioid receptor (DOR) is a GPCR involved in chronic pain management. However, analgesic action of its ligands is subject to tolerance that develops over the course of long-term treatment, limiting their clinical use. This thesis focuses on functional selectivity of DOR ligands to assess the possibility of reducing the effects of tolerance produced by these molecules. First, we determined that DORs adopt ligand-specific active conformations with distinct ability to activate different signalling pathways and regulatory responses. Second, we established that DORs constitutively associate with Gαi heterotrimeric subunits, and that different receptor ligands induce distinct conformational changes within these signalling complexes. These observations are inconsistent with a two-state model of receptor activation, pointing instead the presence of multiple active conformations. Finally, we demonstrated that conformations stabilized by different agonists distinctively interact with βarrestin2, such that the agonist who promoted a transient receptor interaction with this regulatory protein produced more recycling, less desensitization and less acute analgesic tolerance than the ligand who promoted a stable DOR-βarrestin2 interaction. Taken together, the results presented in this thesis show DORs adopt ligand-specific conformations that support ligand-specific profiles of analgesic tolerance. This type of functional selectivity of opioid ligands could be eventually exploited in the development of novel therapeutic agents with longer analgesic actions.

Ce travail a consisté à étudier la N et/ou O acylation enzymatique d’alcool aminés et de dipeptides.Une étude préliminaire consacrée à l’acylation enzymatique d’une molécule modèle, le 6-amino-1-hexanol a démontré la capacité de la lipase B de Candida antarctica immobilisée à catalyser l’acylation de ce substrat dans différents milieux réactionnels. La mise en œuvre de cette réaction en solvants organiques (hexane, 2-méthyl-2-butanol) a conduit à la formation du produit diacylé avec un rendement de 85 % montrant l’absence de chimio-sélectivité de la réaction. L’utilisation de système sans solvant à base d’acide gras libre et de CO2 supercritique a permis d’orienter la chimio-sélectivité de la réaction en faveur de la O-acylation. Les liquides ioniques à cation de type imidazolium et à anions faiblement nucléophiles ont conduit à un taux de conversion de l’alcool aminé de l’ordre de 99 % tout en conservant l’absence de chimio-sélectivité observée en solvant organique. L’étude s’est ensuite focalisée sur l’acylation de dipeptides modèles tels que la Lys-Ser,HCl et la Ser-Leu. L’étude de l’acylation catalysée par la lipase B de Candida antarctica immobilisée de la Lys-Ser,HCl a montré une sélectivité exclusive en faveur de l’acylation de la fonction amine en position e, indépendamment du milieu réactionnel. La O-acylation de la Ser-Leu a permis de mettre en évidence l’influence du groupe carboxylique Cterminal électro-attracteur de Lys-Ser sur la réactivité de la fonction hydroxyle de la sérine. Enfin, la N-acylation enzymatique d’un dipeptide naturel bioactif, la carnosine a été réalisée d’une part en solvant organique, catalysée par la lipase B de Candida antarctica immobilisée et d’autre part, en milieu aqueux biphasique catalysée par l’acyl-transférase de Candida parapsilosis. L’acylation de la carnosine, conduisant à la synthèse de N-oléyl carnosine, n’affecte pas son activité inhibitrice de la xanthine oxydase et semble améliorer son activité anti-radicalaire vis-à-vis de l’anion superoxyde / The present work consisted in studying the N and/or O-enzymatic acylation of amino alcohols and dipeptides. A preliminary study was firstly undertaken about the enzymatic acylation of a bifunctionnal model molecule, 6-amino-1-hexanol and demonstrated the ability of the lipase B of Candida antarctica to catalyze the acylation of this substrate in different reaction media. The reaction performed in organic solvents (hexane, 2-methyl-2-butanol) allowed to the synthesis of the diacylated product with a substrate conversion yield of 85 %, showing the absence of chimio-selectivity of the reaction. The use of a solvent-free system constituted of free fatty acid and the use of supercritical carbon dioxide permitted to orientate the selectivity of the reaction in favour of the O-acylation. Ionic liquids with imidazolium cation and few nucleophilic anions led to a substrate conversion of 99 % and to maintain the absence of chemo-selectivity observed in organic solvents. Then, the study focused on the acylation of model dipeptides like Lys-Ser, HCl and Ser-Leu. Results relative to the acylation of Lys-Ser, HCl catalyzed by the lipase B of Candida antarctica immobilized showed a selectivity in favour of the acylation of the e-amino function independently of the reaction medium. The Ser-Leu O-acylation permitted to demonstrate the influence of the molecular environment (electro-attractor C terminal carboxylic group) on the reactivity of the serine hydroxyl function. Finally, the enzymatic acylation of a bioactive dipeptide was catalyzed by the lipase B of Candida antarctica immobilized in organic solvent and by the acyl-transferase of Candida parapsilosis in lipid-aqueous biphasic medium. The acylation of carnosine allowed the N-oleyl carnosine synthesis. The acylation of carnosine did not affect its xanthine oxydase inhibition activity and seemed to improve its superoxyde anion scavenging property

Les Récepteurs Couplés aux Protéines-G forment la plus importante famille de protéines membranaires chez l’homme et sont impliqués dans de nombreux processus de signalisation cellulaire. Aussi, ils forment un vivier très important de cibles thérapeutiques, déjà identifiées ou potentielles. L’activation d’un RCPG est amorcée par la liaison d’un ligand dans sa partie extra-cellulaire, modifiant ainsi ses propriétés dynamiques intrinsèques. Ces changements structuraux vont alors se répercuter le long des domaines trans-membranaires et promouvoir la dissociation de la Protéine-G hétéro-trimérique, de l’autre côté de la membrane, propageant ainsi le signal au compartiment intra-cellulaire. Ce processus peut être modulé par la liaison de nombreux autres partenaires des RCPGs. Malgré de nombreuses données structurales existantes, ces mécanismes restent encore mal connus à l’échelle moléculaire. Ainsi, la dynamique moléculaire s’est révélée être un outil formidable pour mieux comprendre ces mécanismes. Toutefois, les échelles de taille et de temps requises pour discuter de la dynamique de ces systèmes membranaires limitent ces études aux laboratoires ayant accès à une très grande puissance de calcul. L’objectif des travaux présentés dans ce manuscrit a été de prédire et de mieux comprendre la dynamique d’interaction de différents récepteurs de cette famille avec leurs partenaires, en développant un protocole de dynamique moléculaire, peu coûteux en ressources de calcul, combinant le champ de forces gros-grains MARTINI à un protocole de dynamique moléculaire « Replica-Exchange ».Dans un premier temps, nous présentons la validation de notre protocole pour la prédiction de la liaison de peptides à leur récepteur avec l’étude des peptides Neurotensine, agoniste du Récepteur de la Neurotensine-1, et CVX15, antagoniste du Récepteur Chemokine C-X-C de type-4. Nous montrons également que notre protocole est capable de prédire la sélectivité de plusieurs peptides dérivés de la Neurotensine envers plusieurs récepteurs sauvages et mutés, ne présentant qu’un résidu de différence.Dans un second temps, nous nous sommes intéressés à la dynamique de formation d’un hétéro-dimère de RCPGs impliquant le Récepteur de la Ghréline et le récepteur de la Dopamine D2, couplés aux protéines Gq et Gi respectivement. Ce modèle validé au laboratoire par des mesures LRET montre une interface impliquant une forte complémentarité entre les protéines-G. En se basant sur notre modèle, nous avons conçu et synthétisé des peptides inhibiteurs de la formation de cet hétéro-dimère de protéines-G.Enfin, nous présentons d’autres exemples d’applications de notre protocole et comment il peut être utilisé de concert avec l’expérience avec : la prédiction de la liaison de toxines de serpents aux Récepteurs de la Vasopressine-1a et V2 ; la prédiction de la liaison des peptides Ghréline et Leap2 au Récepteur GHSR-1a et la prédiction de la sélectivité de couplage de différents récepteurs aux peptides C-terminaux de la sous-unité α des protéines-G. / G-Protein Coupled Receptors form the largest family of human membrane proteins and are involved in many cellular signaling processes. Thus, they constitute a pool of already identified or potential pharmacological targets. The activation of a GPCR starts with the binding of a ligand in its extra-cellular part, further modifying its intrinsic dynamical properties. These structural rearrangements are then transmitted along the transmembrane domains and promote the dissociation of the G-protein on the other side of the bilayer, thus propagating the signal into the intra-cellular compartment. This activation process can be modulated by the binding of many other partners of GPCRs. Despite many structural data now available, these mechanisms are still badly known at the molecular scale. In agreement, molecular dynamics simulations appear to be a method of choice to get a better description of these mechanisms. Nevertheless, the size and the time scales required for the simulation of these membrane systems limit such studies to laboratories having access to large computational facilities.The objective of this work was to predict and get a dynamical view of the interactions of several GPCRs with their partners, by developing an affordable molecular dynamics protocol that combines the coarse-grained MARTINI force field to Replica-Exchange MD simulations.In a first step, we validated our protocol by showing its ability to predict the dynamical binding of peptides to their receptors, through the study of Neurotensin, an agonist of the Neurotensin-1 receptor and CVX15, an antagonist of the CXCR4 chemokine receptor. We also show that the same protocol is able to predict the selectivity of several Neurotensin derived peptides against several wild-type/mutated receptors differing by a single residue.In a second step, we were concerned by the dynamical assembly of a GPCR heterodimer involving the Ghrelin and the Dopamine D2 receptors, respectively coupled to Gq and Gi proteins. Our model was validated by LRET measurements confirming a large protein:protein interface and a high complementarity between G-proteins. Based on this model, we designed and synthesized some peptides able to inhibit the assembly of this G-proteins heterodimer.Finally, we describe other applications of our protocol and how it can be employed and confronted to experiments to : predict the dynamical binding of toxins from snake’s venom to the Vasopressin-1a and Vasopressin-2 receptors ; predict the binding of the Ghrelin and Leap2 peptides to their GHSR-1a receptor and predict the coupling selectivity of several receptors to peptides mimicking the C-terminus of the α subunit of G-proteins.

Trata a presente tese da sustentação da indispensabilidade de utilização, em um sistema tributário, para almejar ser justo, da tributação indireta. E não basta a utilização dela como elemento complementar do sistema. É necessário que sua participação seja equilibrada em relação à utilização da tributação direta, igualmente indispensável à justeza do sistema. Assim, entre a tributação direta e a indireta, não se deve cogitar de qual das duas é mais justa, sim que uma e outra contribuem igualmente para que o sistema como um todo, possa ser o mais justo possível. A exposição se inicia com um escorço histórico em que se procura analisar e situar o funcionamento dos sistemas tributários na evolução e conformação das diversas sociedades que antecedem à nossa, com uma natural ênfase à civilização ocidental como a entendemos, isto é, centrada em uma corrente econômica, cultural e técnica, de linha mediterrânea e européia. Neste escorço, superada a exposição referente às origens mais remotas, foram feitos alguns destaques temáticos, o primeiro e mais importante destacando a atuação de Colbert no reinado de Luiz XIV, na França, pela sua contribuição crítica ao sistema tributário então vigente naquele país, e a reforma que implementou com a introdução de impostos indiretos e redução de impostos diretos, no sentido de institucionalizar e fortalecer o reino. Outros destaques foram feitos, merecendo especial citação Ricardo, Enno Becker e Keynes, o primeiro pela sua exposição crítica dos impostos vigentes na Inglaterra em seu tempo, o segundo pela sua notável participação na elaboração da Constituição de Weimar e o terceiro pela sua atuação nos Estados Unidos após a crise de 1929 e sua participação na conferência de Bretton Woods. Findo o escorço histórico, segue-se uma exposição de natureza pessoal, historiando a forma como a presente tese se conformou, sob o título de \"Reintrodução\". A partir da conceituação de \"justiça fiscal\", a tese propriamente dita se delineia, passando-se de uma análise crítica relacionada ao objetivo maior, a justiça, para a análise do papel dos impostos indiretos e diretos e da contribuição de melhoria. Em sua parte final cuida-se do ajustamento sistêmico do problema, inspirando, além do desejável ajuste científico e cibernético, uma profunda reforma tributária, que poderia destinar-se ao Brasil, ou a qualquer outro país, em qualquer estágio de desenvolvimento que se encontre. O modelo é inspirado na reforma que, produzida inicialmente na França com a introdução da T.V.A. (\"Taxe a la Valeur Ajoutée\"), depois estendida à comunidade econômica européia, praticamente institucionalizou naqueles quadrantes um tipo de imposto único indireto, altamente simplificador desse sistema impositivo. Propõe-se desta forma, a introdução também de um imposto único similar, direto, que aliado à uma nova contribuição de melhoria, melhor instituída, e da terceirização sistêmica das taxas, dariam estrutura final a todo o conjunto tributário nacional, tendo por objetivo maior o estado de direito democrático moderno. Esta, assim, seria a \"grande síntese\" tributária passível de ser alcançada, em qualquer sistema moderno. / Cette thèse concerne le maintien du caractère indispensable de Ia tributation indirecte dans un système tributaire qui vise à Ia justice. Cependant, il ne suffit pas I\'emploie de Ia tributation indirecte en tant qu\'élement complémentaire du système. Il faut que sa participation soit equilibrée par rapport à I\'emploie de Ia tributation directe, également indispensable à Ia justesse du système. Ainsi, entre les impôts directs et les indirects, Ia cogitation est que tous les deux contribuent également pour que le système soit juste et non qu\'an entre le deux est plus juste. L\'exposition part d\'un raccourci historique dont le but est d\'analyser et placer le fonctionnement des systèmes tributaire dan I\'évolution et Ia conformation de plusieurs societés ultérieures, comprennant surtout Ia civilisation occidentale en tant que nous I\'envisageons. Ça veut dire, dont I\'axe consiste dans une chaine économique, culturelle et technique d\'origine meditarrenée et européenne. Dans ce raccourci, apres avoir surmonté I\'exposition concernant les origines les plus lointaines, on a choisi quelques groupes thématiques, dont le premier et le plus important concerne I\'action de Colbert dans le royaume de Louis XIV, en France, en raison de sa contribution critique au système tributaire lors y en vigueur, ainsi que Ia reforme qu\'il a implanté, dont I\'innovation consistait dans I\'introduction des impôts indirects et dans Ia reduction des impôts directs, de façon à institucionaliser et rendre plus puissant le royaume. Ensuite, on passe à d\'autres souslignements, et on doit mentionner de façon spéciale ceux-Ià concernant Ricardo, Enno Becker et Keynes. Le premier en raison de son exposition critique des impôts, lors en vigueur dans l\'Angleterre. Le second en fonction de sa remarquable participation dans I\'élaboration de Ia Constitution de Weimar. Et le troisième en raison de son sction aux États Unis aprés Ia débâcle de 1929, ainsi que sa participation dans Ia réunion de Bretton Woods. Apres ce raccourci historique, on passe à une exposition d\'ordre personnel, en racontant en detail le développement de cette thèse, sous le titre \"Reintroduction\". À partir de Ia conceptualisation de \"justice fiscale\", Ia thèse, en son essence, se delinée, et on passe à une analyse critique par rapport à son but majeur - Ia justice -, par I\'analyse de Ia fonction des impôts indirects et directs et Ia contribution d\'amélioration. La dernière section est consacrée à I\'ajustement systémique du problème, qu\'inspire, au-delà d\'un souhaitable couplage scientifique et cybernétique, une reforme tributaire profonde, capable d\'être employée soit au Brésil soit à un autre pays quelconque, independamment du degrée de développement qu\'il a atteint. Le modele s\'inspire à Ia reforme qui a commencé en France, avec I\'introduction par Maurice Lauré de Ia T.V.A. (Taxe à Ia Valeur Ajoutée) et, qu\'ensuite, étendue à Ia Communauté Européenne, a contribué pour I\'institutionnalisation, dans Ia pratique, d\'un genre d\'impôt unique indirect, de façon à simplifier remarquablement de système de ces impôts. On propose, donc, I\'introduction d\'un impôt unique similaire, direct, que s\'alliant à une nouvelle contribution d\'amélioration, meilleurment instituée, et de Ia concession systématique des services, serait capable de donner une structure finale à tout I\'ensemble tributaire national, en une grande synthèse, ayant pour but majeur I\'état de droit démocratique moderne.

La valorisation des réservoirs gaziers compacts, dits Tight Gas Reservoirs (TGR), dont les découvertes sont importantes, permettrait d’augmenter significativement les ressources mondiales d’hydrocarbures. Dans l’objectif d’améliorer la production de ces types de réservoirs, nous avons mené une étude ayant pour but de parvenir à une meilleure compréhension de la relation entre l’endommagement et les propriétés de transport des géomatériaux. L’évolution de la microstructure d’éprouvettes qui ont été soumises préalablement à des chargements dynamiques est étudiée. Une estimation de leurs perméabilités avec l’endommagement est tout d’abord présentée à l’aide d’un modèle de pores parallèles couplant un écoulement de Poiseuille avec la diffusion de Knudsen. Nous avons ensuite mené des travaux expérimentaux afin d’estimer l’évolution de la perméabilité avec l’endommagement en relation avec l’évolution de la distribution de tailles de pores. Les mesures de perméabilité sont effectuées sur des cylindres en mortier similaire aux roches tight gas, soumis à une compression uniaxiale. La caractérisation des microstructures des mortiers endommagés est réalisée par porosimétrie par intrusion de mercure. Afin d’estimer l’évolution de la perméabilité, un nouveau modèle hiérarchique aléatoire est présenté. Les comparaisons avec les données expérimentales montrent la capacité de ce modèle à estimer non seulement les perméabilités apparentes et intrinsèques mais aussi leurs évolutions sous l’effet d’un chargement introduisant une évolution de la distribution de taille de pores. Ce modèle, ainsi que le dispositif expérimental employé, ont été étendus afin d’estimer à l’avenir les perméabilités relatives de mélanges gazeux. Le dernier chapitre présente une étude de l’adsorption de méthane dans différents milieux fracturés par chocs électriques. Les résultats, utiles pour l’estimation des ressources en place, ont montré que la fracturation permet de favoriser l’extraction du gaz initialement adsorbé. / The valorization of compact gas reservoirs, called tight gas reservoirs (TGR), whose discoveries are important, would significantly increase the global hydrocarbon resources. With the aim of improving the production of these types of gas, we have conducted a study to achieve a better understanding of the relationship between damage and the transport properties of geomaterials. The microstructure evolution of specimens, which were submitted beforehand to dynamic loading, has been investigated. An estimation of their permeability upon damage is first presented with the help of a bundle model of parallel capillaries coupling Poiseuille flow with Knudsen diffusion. Then, we have carried out an experimental work to estimate the permeability evolution upon damage in relation to the evolution of the pore size distribution in uniaxial compression. The measurements of permeability have been performed on mortar cylinders, designed to mimic typical tight rocks that can be found in tight gas reservoirs. Microstructural characterization of damaged mortars has been performed with the help of mercury intrusion porosimetry (MIP). To estimate the permeability evolution, a new random hierarchical model has been devised. The comparisons with the experimental data show the ability of this model to estimate not only the apparent and intrinsic permeabilities but also their evolutions under loading due to a change in the pore size distribution. This model and the experimental set up have been extended to estimate the relative permeabilities of gas mixtures in the future. The final chapter presents a study of the adsorption of methane on different porous media fractured by electrical shocks. The results, concerning the estimation of the in-place resources, have shown that fracturing can enhance the extraction of the initial amount of adsorbed gas.

L’étude repose sur l’hypothèse que les aides d’État fiscales sont autonomes, se singularisant par rapport aux autres règles du droit fiscal de l’Union. Cela est dû au fait que la véritable nature de l’intégration, la véritable finalité du contrôle des aides fiscales, n’est pas facilement perceptible.Le régime des aides fiscales dépasse son cadre initial de contrôle des systèmes fiscaux pourintégrer celui d’élaboration de règles juridiques communes. Les autorités de l’Union, par le biais du régime des aides fiscales, contrôlent les systèmes fiscaux nationaux ; en même temps, elles parviennent à jouer un rôle important pour la coopération interétatique au regard de la lutte contrela concurrence fiscale dommageable. Plus important encore, elles réussissent à coordonner les systèmes fiscaux nationaux, procédant d’une instrumentalisation du contrôle des aides fiscales,contrôle étant conçu comme un succédané de l’harmonisation fiscale. La démonstration des finalités protéiformes de ce contrôle repose d’abord sur la méthode d’identification d’une aide fiscale, identification qui correspond aux finalités recherchées. La vérification de l’hypothèse initiale de singularisation des aides fiscales pose également la question de sa finalité. Ce contrôle est-il susceptible de façonner la structure même du droit fiscal de l’Union et, d’une manière plus substantielle, la répartition des compétences entre les autorités européennes et nationales ? Une technique comme celle du contrôle des aides fiscales peut-elle potentiellement contribuer à redéfinir la ligne de démarcation entre souveraineté fiscale des États membres et limitation tolérable de celle-ci par le droit de l’Union ? / This thesis is based on the premise that tax state aids differentiate themselves from other tax law related rules of the European Union. This is due to the fact that the true nature of the integration, the true purpose of the regulation of tax state aids, is not so easily discernible. The legal status oftax state aids outreaches its original scope—the scrutiny of fiscal systems—to integrate that of creation of common legal rules. The authorities of the Union, through the tax aids regime, monitor domestic tax systems; at the same time, they come to play an important role in the context of the interstate cooperation tackling harmful tax competition. More importantly, they manage to coordinate domestic tax systems as a result of the “instrumentalization” of the regulation of taxaids. The latter is then regarded as a substitute to tax harmonization. This manifestation of themultifarious objectives of tax state aids regulation is firstly based on the technique ofcharacterization of a tax aid, a characterization corresponding ultimately to the goals as expected.The proof of the initial hypothesis of the self-containment of tax aids raises the question of its purpose. Is this regulation likely to weave the very structure of Union tax law and, more substantially, the division of competences between European and domestic authorities? Is a technique like the one related to tax state aids regulation likely to contribute to redefining the dividing line between member States tax sovereignty and its tolerable limitation by Union law?