Les maladies allergiques constituent une part importante des préoccupations de santé publique. Parmi elles, la maladie du poumon d’éleveur d’oiseaux (PEO) est une pathologie respiratoire liée à l’inhalation répétée de protéines antigéniques, localisées dans les fientes, les plumes et les squames des oiseaux. Actuellement, on connait peu de chose sur la nature des antigènes impliqués dans la maladie.La mise en évidence d’immunoglobulines G (IgG) spécifiques des agents étiologiques est un élément important dans la prise en charge diagnostique et thérapeutique. L’objectif de la thèse est d’identifier les protéines antigéniques de pigeon et de les produire par génie génétique afin de développer un test sérologique efficace et standardisé de type ELISA. L’approche immuno-protéomique développée combine l’utilisation d’analyses sérologiques (western blot, ELISA) et l’identification par spectrométrie de masse des protéines antigéniques et des protéines totales (shotgun) des fientes, squames et sérum de pigeon. Ainsi, 14 protéines antigéniques principalement localisées dans les fientes et les squames de pigeon ont été identifiées et 2 protéines recombinantes ont été produites, puis testées en ELISA. Les protéines recombinantes Immunoglobulin-lambda-like polypeptide-1 et Proprotéinase E sont très performantes pour le diagnostic sérologique du PEO avec une spécificité et une sensibilité respectives de 100% et 84%. Des protéines orthologues, potentiellement impliquées dans les réactions antigéniques croisées ont été identifiées à partir des fientes de perruche et de poule. Ce travail a permis d’identifier les protéines antigéniques des fientes de pigeon, d’apporter des précisions sur leur localisation, et de développer des antigènes recombinants standardisés et performants pour améliorer le diagnostic sérologique du PEO. Des études complémentaires, sur des modèles animaux et cellulaires, devront être menées pour explorer l'implication de ces protéines dans l'induction de la maladie. / Allergic diseases represent one of the most important public health concerns. Among them, Bird Fancier’s Lung disease (BFL) is a respiratory illness associated with repeated inhalation of antigenic proteins, present in bird droppings, feathers and blooms. Currently, little is known about the nature of the antigens involved in the disease. The detection of immunoglobulin G (IgG) specific etiologic agents is an important factor in diagnostic and therapeutic management.The objective of this thesis is to identify the antigenic proteins of pigeons and to produce them by genetic engineering in order to develop an effective and standardized ELISA-type serological test. The immuno-proteomic approach created combines the use of serological analyses (western blot, ELISA) and the identification by mass spectrometry of antigenic proteins and total proteins (shotgun) of pigeon droppings, blooms and serum. Thus, 14 antigenic proteins mainly located in droppings and blooms were identified, and 2 recombinant proteins were produced and then tested with ELISA.The recombinant proteins Immunoglobulin-lambda-like polypeptide-1 and Proproteinase E are highly effective for the serological diagnosis of BFL,with specificity and sensitivity rates of 100% and 84%, respectively. Orthologous proteins potentially involved in cross-antigen reactions were identified from budgerigar and hen droppings. This work made it possible to identify the antigenic proteins of pigeon droppings, to provide further details on their location, and to develop standardized and efficient recombinant antigens to improve the serological diagnosis of BFL.Additional studies on animals and cell models will be needed to explore the role of these proteins in the induction of the disease.

O trabalho teve por objetivo diagnosticar a infecção experimental e natural por Toxoplasma gondii em pombos (Columba livia), por técnicas sorológicas, biológicas e moleculares. Pombos foram infectados com oocistos esporulados de T. gondii e acompanhados por 60 dias com coleta de soro semanal para o acompanhamento da curva de anticorpos séricos e eutanásia quinzenal para avaliar a presença do parasito em diferentes tecidos. Observou-se concordância em todas as técnicas utilizadas, indicando serem eficazes no diagnóstico da infecção nessa espécie. Pombos de vida livre foram capturados nos municípios de São Paulo, Sorocaba e Ibiúna e anticorpos anti-T. gondii não foram observados. Nestas aves o bioensaio em camundongos foi realizado, independente da ausência de anticorpos e em nenhuma foi possível o isolamento do parasito. / The study aimed to diagnose the experimental and natural infection by Toxoplasma gondii in pigeons (Columba livia), by serological, biological and molecular techniques. Pigeons were infected with sporulated oocysts of T. gondii and monitored for 60 days with weekly serum collection for monitoring the curve of serum antibodies and euthanasia two weeks to assess the presence of parasites in different tissues. Agreement was observed in all the techniques used, indicating to be effective in the diagnosis of infection in this species. Free-living pigeons were captured in the municipalities of São Paulo, Sorocaba and Ibiúna and anti-T. gondii antibodies were not observed. In birds the bioassay was conducted in mice, regardless of the absence of antibodies and none was possible to isolate the parasite.

Die Durchseuchungsrate der Bevölkerung in Deutschland mit den humanen ß-Herpesviren liegt zwischen 40 und 90%. Nach der Primärinfektion verbleiben die ß-Herpesviren latent in den Körperzellen und haben die Fähigkeit, z.B. nach körperlichem Stress, bei Immunsuppression oder unter UV-Strahlung erneut in den lytischen Vermehrungszyklus einzutreten. Die kommerziell erhältlichen serologischen Methoden für die Diagnostik der humanen ß Herpesviren haben sich in den letzten Jahren wenig weiterentwickelt. Der enzymgekoppelte Immunadsorptionstest (ELISA) und der Immunfluoreszenztest (IFT) sind die Standardmethoden für die Diagnostik der humanen ß-Herpesviren. Da bei der Bestimmung des IgM-Titers Kreuzreaktionen sowie falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse auftreten können, reicht der IgM-Titer als alleinige Aussage für die Diagnose einer akuten Infektion nicht aus. Weiterhin fehlt bei einer Superinfektion mit einem anderen Stamm des gleichen Virus oder im Falle einer Reaktivierung des Virus oft die IgM-Antwort. In diesen Fällen kann nur auf Grund des IgG-Titeranstieges eine Reaktivierung bzw. Superinfektion angenommen werden. Bei fehlender Immunkompetenz bleibt der Anstieg des IgG-Titers jedoch oft aus. Serologische ELISA-IgG-Tests und IFT-IgG-Tests auf der Basis von Mischantigenen für den Nachweis von HCMV- oder HHV6-Reaktivierungen zeigen bei immunsupprimierten Patienten zurückliegende Infektionen bzw. Reaktivierungen an. Kommerzielle Western Blots für den Nachweis von IgG-Antikörpern gegen „late antigens“ der Zytomegalieviren sind verfügbar, werden aber nur in Speziallaboratorien eingesetzt. Weiterhin ist eine Differenzierung der Subtypen HHV6 A und HHV6 B mit den kommerziell erhältlichen Methoden wie ELISA und IFT nicht möglich. Eine Unterscheidung der Subtypen HHV6 A und HHV6 B wäre aber auf Grund der Unterschiede in der Infektionsfähigkeit, im Replikationsmuster, in der Epidemiologie und der Pathogenität wünschenswert. Im Rahmen des BMBF-Projektes Bioresponse (Projektträger Jülich: Förderkennzahl beim BMBF: 03WKR03E) und der nachfolgenden Stipendiatenförderung durch die Jürgen-Manchot-Stiftung wurden für eine differenzierte ß-Herpesvirusdiagnostik auf Basis des Mikroblots je zehn HCMV- und HHV6-Antigene exprimiert und evaluiert. Die Mikroblottechnologie - eine an Mikrowellplatten angepasste und miniaturisierte Form der Streifentesttechnologie - ermöglicht den simultanen Nachweis von bis zu zehn Antigen-spezifischen IgG Antikörpern bei geringem Proben- und Reagenzienverbrauch. Von in der Literatur als antigen beschriebenen Strukturproteinen und Nichtstrukturproteinen der Betaherpesviren wurden Proteinbereiche mit und ohne bekannten Epitopen ausgewählt und als Fusionsproteine in BL-21 Zellen exprimiert. Jeweils zehn über die Ni-NTA-Agarose-Säule aufgereinigte virusspezifische Fusionsantigene wurden zur Herstellung der Mikroblots eingesetzt. Der HCMV-IgG-Mikroblot und der HHV6-IgG-Mikroblot wiesen zu den kommerziell erhältlichen serologischen Testsystemen (HHV6 IgG-IFT von Euroimmun, Lübeck, HCMV-IgG-ELISA von Dade Behring, Marburg, HCMV IgG recom Blot von Mikrogen, Neuried) vergleichbare Sensitivitäten auf. Im Vergleich zum HHV6-IgG-ELISA (Panbio, Rüsselsheim) ist der HHV6 IgG-Mikroblot die empfindlichere Nachweismethode. Die Spezifität des HHV6 IgG-Mikroblots ist mit den HHV6-Testsystemen (HHV6-IgG-IFT von Euroimmun, Lübeck, HHV6-IgG-ELISA von Panbio, Rüsselsheim) vergleichbar. Weiterhin wies der HCMV-IgG-Mikroblot im Vergleich zum kommerziell erhältlichen HCMV-IgG-ELISA (Dade Behring, Marburg) und zum HCMV-IgG-recom Blot (Mikrogen, Neuried) eine Spezifität von 80% bzw. 83% auf. Der Mikroblot hat sich als ein geeignetes diagnostisches Instrument erwiesen, um neben der Entwicklung des IgG-Antikörpertiters auch differenziert die Antigen-spezifischen IgG Antikörperantworten unter bestimmten Fragestellungen zu untersuchen. So ermöglicht der HHV6 IgG-Mikroblot erstmals eine serologische Unterscheidung von HHV6 A und HHV6 B monovalenten Seren und den Nachweis von HHV6 A/ B polyvalenten Seren. Die Mikroblottechnologie wurde primär für die serologische Testung von Seren und Plasmen etabliert. Mit dem HCMV-IgG-Mikroblot wäre aber auch eine Liquordiagnostik möglich. Jedoch konnte mit dem HHV6-IgG-Mikroblot vermutlich auf Grund nicht ausreichender Sensitivität eine Einsatzmöglichkeit in der Liquordiagnostik anhand dieser Arbeit wegen zu geringer Probenzahlen nicht gezeigt werden. In einer anschließenden Studie sollte dennoch die Eignung der HHV6-Antigene für die HHV6-Liquordiagnostik mit einem größeren Umfang an Liquores geprüft werden. Stabilitätstestungen zeigten, dass die Messergebnisse von am gleichen Tag wiederholt gemessenen Seren oder Plasmen reproduzierbar waren. An verschiedenen Tagen gemessene Seren und Plasmen wiesen jedoch unterschiedliche Messergebnisse auf. Mögliche Ursachen für die geringe Reproduzierbarkeit der Messergebnisse im Mikroblot sind die unterschiedlichen Epitopdichten ein und desselben Antigens in den Mikroblots, die unspezifische Hintergrundfärbung in den Mikroblots sowie die nicht konstante bivalente Gleichgewichts- und Bindungskonstante der IgG-Antikörper im Mikroblot. In folgenden Studien sollte durch eine Optimierung des Proteintransfers der Antigene auf die Nitrozellulosemembran eine gleiche Epitopdichte gewährleistet werden. Gleichzeitig muss der Algorithmus der Software dahingehend verbessert werden, dass dieser trotz einer möglichen Verunreinigung der Mikroblots oder schwacher Hintergrundfärbung die Markerbande erkennt und eine Auswertung gewährleistet werden kann. Die unspezifische Hintergrundfärbung in den Mikroblots sollte nach Absprache mit dem Hersteller durch den Einsatz alternativer Blockreagenzien weitgehend reduziert werden. Weiterhin muss die Cutoff-Grenze so definiert werden, dass eine bestmögliche Sensitivität bei optimaler Spezifität der Mikroblotmethode ermöglicht wird. Dieser Cutoff kann sowohl durch die Anzahl der reaktiven Antigene als auch durch die Färbungsstärke der Antigen-Antikörperreaktion mit einem spezifischen Antigen definiert werden. In einem zweiten klinisch orientierten Teil dieser Arbeit wurden mit der Mikroblottechnologie die HCMV- und HHV6-Antikörperantworten nach hämatopoetischer Stammzell-transplantation (HSZT) untersucht. Die HCMV- und HHV6-Antikörperverläufe der Patienten nach HSZT wiesen keinen Zusammenhang zwischen nachgewiesener Reaktivierung und IgG-Antikörperentwicklung auf. Der Nachweis einer HCMV- bzw. HHV6-Reaktivierung bzw. -Infektion nur auf Grundlage des IgG-Antikörpertiters ist bei immunsupprimierten Patienten daher nicht möglich. Es konnte nicht nach jeder positiven HCMV- bzw. HHV6 PCR ein IgG-Antikörperanstieg beobachtet werden, was vermutlich durch die Immunsuppression der Patienten bedingt war. Weiterhin konnten HCMV- bzw. HHV6 IgG Antikörperanstiege selten zeitnah zu positiven HCMV- bzw. HHV6-PCR-Nachweisen gezeigt werden. Im Gegensatz dazu wurden bei weiteren Patienten mit HCMV- bzw. HHV6-positiven Transplantatspendern trotz negativer PCR frühe HCMV- bzw. HHV6-IgG-Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT nachgewiesen. Diese frühen IgG-Antikörperanstiege sind wahrscheinlich durch die mit dem Stammzelltransplantat übertragenen B Gedächtniszellen sowie Plasmazellen verursacht und tragen zur frühen Immunrekonstitution des Patienten bei. Chemoradioresistente langlebige Plasmazellen können ebenfalls eine Ursache für frühe IgG Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT bei HCMV-positiven Patienten mit negativen HCMV- bzw. HHV6-Transplantatspendern oder bei Patienten mit positiven HCMV bzw. HHV6-Transplantatspendern darstellen. Während die HCMV-IgG-Antikörperverläufe der Patienten nach der HSZT unabhängig von den positiven HCMV-PCR-Nachweisen durch mehrere HCMV-IgG-Antikörperanstiege und abfälle gekennzeichnet waren, wiesen die HHV6-IgG-Antikörperverläufe unabhängig von den positiven HHV6-PCR-Nachweisen nur einen HHV6-IgG-Antikörperanstieg auf, der von einem HHV6-Antikörperabfall gefolgt wurde. Da HHV6-Reaktivierungen mit 14-28 Tagen kurz nach der HSZT und im Gegensatz zu HCMV-Reaktivierungen nur in einem kurzen Zeitfenster nachgewiesen wurden, ist vermutlich nur für diesen begrenzten Zeitraum HHV6-Antigen als Trigger für die Antikörper produzierenden Plasmazellen verfügbar. Ob gesunde Probanden nach einer HHV6-Infektion oder HHV6-Reaktivierung eine ähnliche Antikörperkinetik wie HSZT-Patienten aufweisen, sollte in einer Folgestudie untersucht werden. Mit der Mikroblottechnologie konnte ein Einfluss des HCMV-Serostatus vom Transplantatspender auf die HCMV-IgG-Antikörperentwicklung nach HSZT gezeigt werden. Überwiegend nur HCMV-positive Patienten mit positiven HCMV-Transplantatspendern wiesen unabhängig von der HCMV-Reaktivierung frühe IgG-Antikörperanstiege bis zu 180 Tage nach der HSZT auf. Diese frühen IgG-Antikörperanstiege sind durch die mit dem Stammzelltransplantat übertragenen B-Gedächtniszellen oder Plasmazellen sowie seltener durch chemoradioresistente Plasmazellen verursacht und können zu einer frühen Immunrekonstitution beitragen. Im Gegensatz zu der kommerziell erhältlichen ELISA-Technik kann mit dem Mikroblot neben der Antikörperkinetik auch differenziert die Entwicklung der Antigen-spezifischen IgG-Antikörperreaktionen untersucht werden. So konnte bei sieben von 22 Patienten trotz Abfall des HCMV-Antikörpertiters bzw. stabilem HCMV-Antikörpertiter eine Zunahme von einzelnen HCMV Antigen spezifischen IgG Antikörpern nach hämatopoetischer Stammzell-transplantation beobachtet werden. Diese einzelen IgG-Antikörperanstiege könnten serologisch auf eine HCMV-Reaktivierung hinweisen. Weiterhin konnte bei drei von zehn Patienten mit HCMV-negativen Transplantatspendern unabhängig vom HCMV-IgG-Antikörpertiter ein Wechsel der HCMV Antigen-spezifischen IgG Antikörpermuster ab dem 6. Monat beobachtet werden. Der Wechsel der HCMV Antigen-spezifischen IgG-Antikörpermuster verweist auf die Bildung von neuen IgG-Antikörper sezernierenden B-Lymphozyten und vermutlich auf einen Wechsel der B Lymphozytenpopulation vom Empfänger zum Spender. Der Wechsel der B Lymphozytenpopulation vom Empfänger zum Spender ist für den Patienten ein wichtiger Schritt für die Rekonstitution der B Lymphozyten nach HSZT. Mit dem HHV6-IgG-Mikroblot hingegen konnte ein Wechsel der Antigen-spezifischen IgG-Antikörper nicht beobachtet werden. Eine Unterscheidung der HHV6-Subtypen auf serologischer Basis nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation wurde neu etabliert. Alle sieben mit dem HHV6-IgG-Mikroblot nachgewiesenen HHV6-IgG-Antikörperanstiege zeigten sowohl HHV6 A Antigen-spezifische, als auch HHV6 B Antigen-spezifische IgG-Antikörperreaktionen. Jedoch zeigten vier von sieben Antikörperverläufen überwiegend HHV6 B Antigen-spezifische IgG-Antikörperreaktionen. Weiterhin konnten HHV6 B Antigen-spezifische IgG Antikörper früher als HHV6 A Antigen-spezifische IgG-Antikörper nachgewiesen werden. Auf Grund dieser Beobachtungen ist zu vermuten, dass der HHV6 B-Subtyp zu einem früheren Zeitpunkt und häufiger nach der HSZT als der HHV6 A-Subtyp reaktiviert.:1. Einleitung 8 1.1 Humane Herpesviren 8 1.1.1 Die humanen Betaherpesviren 9 1.2 Nachweis der HCMV- und HHV6-Viren 11 1.2.1 Nachweis der HCMV- und HHV6-Viren mittels Virusanzucht 12 1.2.2 Nachweis der HCMV- und HHV6-Viren durch molekularbiologische Methoden 12 1.2.3 Nachweis der HCMV- und HHV6-Viren durch serologische Methoden 13 1.3 Multiparameterdiagnostik 14 1.4 B-Lymphozyten, die Produzenten der Antikörper 14 1.4.1 Bildung und Reifung von B-Lymphozyten 14 1.4.2 B-Zellaktivierung und Antikörperproduktion 15 1.4.3 Aufbau und Funktion des Immunglobulins G 16 1.5 Hämatopoetische Stammzelltransplantation 17 1.5.1 Rekonstitution der B-Lymphozyten nach hämatopoetischer Stammzell-transplantation (HSZT) 18 1.5.2 HCMV und HHV6, ein pathogenes Potential nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 19 1.6 Zielstellung 21 2. Material und Methoden 22 2.1 Material 22 2.1.1 Geräte 22 2.1.2 Chemikalien und Substanzen 22 2.1.3 Medien 24 2.1.4 Zelllinie 24 2.1.5 Bakterien- und Virusstämme 24 2.1.6 Plasmide 25 2.1.7 Enzyme 25 2.1.8 DNA-Marker und Proteinmarker 25 2.1.9 Kits 25 2.1.10 Primer 26 2.2 Methoden 29 2.2.1 Expression der HCMV- und HHV6-Antigene 29 2.2.2 Evaluierung der viralen Antigene im Mikroblot 49 2.2.3 Vergleichsanalysen 50 2.3 Patientenproben 52 2.4 Statistische Methoden 52 3. Ergebnisse 53 3.1 Expression der HCMV- und HHV6-Antigene 53 3.1.1 Auswahl der Zielsequenzen 53 3.1.2 Klonierung der Zielsequenzen in den Expressionsvektor pet 28a (+) 54 3.1.3 Aufreinigung der Fusionsantigene 57 3.2 Evaluierung der Virusantigene im Mikroblot 59 3.2.1 Auswertung der Mikroblotdaten 62 3.2.2 Optimierung der Reaktionsbedingungen im Mikroblot 67 3.2.3 Plasma- und Liquordiagnostik – ein weiteres Einsatzfeld der Mikroblots 68 3.2.4 Untersuchungen zur Reproduzierbarkeit der Messergebnisse im Mikroblot 77 3.2.5 Sensitivitäts- und Spezifitätstestung des HCMV-Mikroblots 82 3.2.6 Sensitivitäts- und Spezifitätstestung des HHV6-Mikroblots 85 3.2.7 Beurteilung der Testseren mit dem HHV6-IgG-Mikroblot 89 3.2.8 Untersuchungen zur serologischen Unterscheidung der HHV6-positiven Seren 93 3.3 Antikörperkinetiken nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation 97 3.3.1 Entwicklung der HCMV spezifischen IgG-Antikörperantwort nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 97 3.3.2 Entwicklung der HHV6 spezifischen IgG-Antikörperantwort nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 100 4. Diskussion 104 4.1 Probleme der heterologen Proteinexpression 104 4.2 Grenzen der Aufreinigung über die Ni-NTA-Agarose-Säule 104 4.3 Semiquantitative Auswertung der Mikroblotdaten 105 4.4 Optimierung der Farbreaktion im Mikroblot 106 4.5 Seren, Plasmen und Liquores - im Mikroblot einsetzbare Probenmaterialien 107 4.5.1 Vergleich der Reaktivität von Seren und Plasmen im Mikroblot 107 4.5.2 Liquordiagnostik – Möglichkeiten und Grenzen mit dem Mikroblot 108 4.6 Untersuchungen zur Stabilität der Mikroblots 109 4.6.1 Reproduzierbarkeit der Messergebnisse in einem Reaktionsansatz 109 4.6.2 Signifikante Unterschiede bei wiederholter Messung an verschiedenen Tagen 110 4.7 HCMV-Mikroblot - ein sensitives diagnostisches Testsystem 111 4.8 Drei verschiedene HHV6-Testsysteme – drei verschiedene HHV6-Prävalenzen 112 4.9 Der Mikroblot – eine serologische Methode zur Unterscheidung von monovalenten HHV6 A- und HHV6 B-Seren 114 4.9.1 Serologische Dominanz des HHV6 B-Subtyps 115 4.9.2 Interpretation der IgG-Antikörperreaktionen mit den homologen HHV6-Antigenpaaren 116 4.10 Unterschiedliche HCMV- bzw. HHV6-IgG-Antikörperkinetiken nach allogener hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 118 4.11 Reduktion der HCMV-Reaktivierung durch HCMV-positive Transplantatspender 121 4.12 HCMV pp52-F1 Antigen-spezifische IgG-Antikörperreaktionen – möglicherweise ein Nachweis für HCMV-Reaktivierungen nach HSZT 122 4.13 Wechsel der Antigen-spezifischen IgG-Antikörpermuster 182, 204 und 283 Tage nach der HSZT 123 4.14 Differenzierung der HHV6 A-Antigen- und HHV6 B-Antigen-spezifischen Antikörperreaktionen nach hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) 123 5. Zusammenfassung, Ausblick und Perspektiven für die Mikroblottechnologie 125 6. Literatur 129 7. Danksagung: 142 8. Thesen 144

There is an ongoing need for high-precision serological assays for the quantitation of anti-SARS-CoV-2 antibodies. Here, a trimeric SARS-CoV-2 spike (S) protein was used to develop an ELISA to quantify specific IgG antibodies present in serum, plasma, and dried blood spots (DBS) collected from infected patients or vaccine recipients. The quantitative S-ELISA was calibrated with international anti-SARS-CoV-2 immunoglobulin standards to provide test results in binding antibody units per mL (BAU/mL). The assay showed excellent linearity, precision, and accuracy. A sensitivity of 100% was shown for samples collected from 54 patients with confirmed SARS-CoV-2 infection more than 14 days after symptom onset or disease confirmation by RT-PCR and 58 vaccine recipients more than 14 days after vaccination. The assay specificity was 98.3%. Furthermore, antibody responses were measured in follow-up samples from vaccine recipients and infected patients. Most mRNA vaccine recipients had a similar response, with antibody generation starting 2–3 weeks after the first vaccination and maintaining positive for at least six months after a second vaccination. For most infected patients, the antibody titers increased during the second week after PCR confirmation. This S-ELISA can be used to quantify the seroprevalence of SARS-CoV-2 in the population exposed to the virus or vaccinated.

Humorale Immunantworten gehen einher mit der Veränderung der Zusammensetzung und der Konzentration des Antikörper (AK)-Repertoires. Signalintensitäts-basierte AK-Bindungsprofile (ABP), gemessen mit Zufallspeptidmikroarrays, versuchen diese Veränderungen zu detektieren, um sie für serologische Diagnostik nutzbar zu machen. Gegenstand dieser Arbeit ist die Analyse des Einflusses des AK-Repertoires auf ABP mittels eines mathematischen Modells für AK-Peptidbindung. Das Modell basiert auf dem MWG und beinhaltet als Parameter (i) AK- und Peptidsequenzen sowie (ii) AK-Konzentrationen. Die Affinität simulierter monoklonaler AK hängt nichtlinear von den Aminosäurepositionen in den Peptidsequenzen ab. Das Modell wurde mathematisch analysiert und in silico implementiert. Simulationen ergaben, dass ABP von Mischungen hochdiverser, zufällig generierter AK-Sequenzen, welche nicht durch wenige AK konzentrationsdominiert sind, genannt ideale Mischungen, linear ausschließlich mit Hilfe der Aminosäurezusammensetzung der Peptidbibliothek vorhergesagt werden können. Dieser Zusammenhang führte zu der Formulierung eines linearen Regressionsmodells, aus welchem Aminosäure-assoziierte Gewichte (AAWS) hervorgehen, welche eine kompakte, verlustfreie Abbildung von ABP idealer Mischungen darstellen. Für niedrig-diverse Mischungen ist die Vorhersagekraft des Regressionsmodells eingeschränkt. Die in vitro-Relevanz der mathematisch vorhergesagten Ensembleeigenschaften von AK-Mischungen wurde durch Inkubationen monoklonaler AK und Serum-AK mit derselben Peptidbibliothek bestätigt. Diese Arbeit zeigt, dass Kenntnisse über die Zusammensetzung einer polyklonalen Mischung essentiell für die Interpretation von ABP in Bezug auf serologische Diagnostik und Epitopkartierung sind. Die Spezifität und damit auch die Klassifizierbarkeit von ABP ist sowohl eine Funktion der untersuchten AK-Mischung als auch technologischer Faktoren. / Humoral immune responses are associated with changes of both the composition and the concentration of serum antibodies. Signal intensity- based antibody binding profiles (ABP) measured with random-sequence peptide microarrays attempt to capture these changes to render them applicable to serological diagnostics. In this work, the antibody repertoire’s impact on ABP is studied. This model is based on the law of mass action and incorporates as parameters (i) antibody and peptide sequences and (ii) antibody concentrations. The binding affinity of simulated monoclonal antibodies depends non-linearly on amino acid positions in the peptide sequences. The model was both mathematically analyzed and implemented in silico. Mathematical analysis and simulations predicted that mixtures of highly diverse random antibodies which are not dominated concentration-wise by few antibodies, termed unbiased mixtures, could be linearly predicted based only on the amino acid composition of the peptide library used. This linear relationship led to the formulation of a linear regression model of which amino acid associated-weights (AAWS) emerge as a compact, lossless representation of unbiased mixtures’ ABP. For lowly diverse antibody mixtures, this linear regression model breaks down. In order to test the in vitro relevance of the mathematically predicted ensemble properties of antibody mixtures, monoclonal and serum antibodies were incubated with the same peptide library. In conclusion, this work shows that serum antibody ensemble properties impact the genesis of ABP measured with random-sequence peptide microarrays. This thesis indicates that a knowledge of both a polyclonal mixture’s diversity and composition is essential for the interpretation of ABP with respect to both serological diagnostics and B-cell epitope mapping. Specificity, and thus classifiability, of serum ABP is a function of both the investigated antibody mixtures and technological features.

A legislação brasileira obriga a realização de testes sorológicos em todas as amostras de sangue de doadores, com o objetivo de prevenir a transmissão transfusional de microorganismos causadores de doenças como hepatite B, hepatite C, síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), doença de Chagas, HTLV I/II e sífilis. Este procedimento é importante, porém não é suficiente para garantir a segurança do procedimento transfusional, sendo assim durante todo o ciclo do sangue, atitudes são adotadas para minimizar sinistros no objetivo final que a transfusão. Para receptores, a mesma legislação só obriga a realização de testes imuno-hematológicos pré-transfusionais, o que não revela o perfil sorológico deles, que por vezes pode ser positivo para algum dos marcadores antes da transfusão. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o perfil sorológico pré-transfusional para doenças infecciosas transmissíveis por transfusão sanguínea em receptores de sangue de um hospital brasileiro de referência, o Hospital Geral de Palmas (HGP), no Estado do Tocantins. Foram realizados testes sorológicos pré-transfusionais para SIDA, hepatite B, hepatite C e sífilis em 514 receptores de transfusão do HGP, no período de fevereiro de 2014 a agosto de 2014. Vinte e nove receptores (5,65%) apresentaram-se reagentes para pelo menos um dos marcadores sorológicos testados. Os receptores apresentaram sorologia positiva para hepatite B (1,57%), hepatite C (0,58%), SIDA (1,17%) e sífilis (2,33%). Dentre os receptores de sangue que apresentaram sorologia positiva para alguma das doenças infecciosas testadas, 37,93% foram atendidos no centro cirúrgico e 27,59% na unidade de tratamento intensivo do HGP. Dentre os receptores com sorologia positiva, 62% não haviam sido transfundidos anteriormente. Este estudo determinou a prevalência de doenças infecciosas em receptores de sangue de um hospital brasileiro de referência, bem como discutiu a viabilidade e importância da implementação de testes sorológicos pré-transfusionais em receptores de sangue no Brasil. A avaliação sorológica pré-transfusional tem grande relevância pois possibilita o diagnóstico precoce de infecções nos receptores de sangue, minimizando assim o risco de comorbidade. Por outro lado, confere uma maior segurança judicial para os Serviços de Hemoterapia e para o Estado, quando da necessidade de esclarecimentos sobre possíveis transmissões de doenças infecciosas por transfusão sanguínea. / Brazilian law requires serological tests in all donors of blood samples, in order to prevent transfusion transmission of disease-causing organisms such as hepatitis B, hepatitis C, acquired immunodeficiency syndrome ( AIDS), Chagas disease, HTLV I/II and syphilis. This is important, but not sufficient to ensure the safety of the transfusion procedure, so all the blood cycle, actions are taken to minimize losses in the ultimate goal that the transfusion. For receivers, the same legislation only requires the completion of pre-transfusion immuno-hematological tests, which does not reveal the serological profile of them, which can sometimes be positive for any of the markers prior to transfusion. The objective of this study was to evaluate the pre-transfusion serological profile for transfusion-transmitted infectious diseases in blood recipients from reference Brazilian hospital, Palmas General Hospital (HGP), State of Tocantins, Brazil. Pre-transfusion serological tests for HIV, HBV, HCV and syphilis were performed in 514 transfusion recipients of HGP, from February 2014 to August 2014. Twenty and nine receivers (5.65%) presented reactivity for at least one of the evaluated serological markers. The recipients were positive for hepatitis B (1.57%), hepatitis C (0.58%), AIDS (1.17%), and syphilis (2.33%). Among the blood recipients with positive serology for any of the tested infectious diseases, 37.93% were treated at the surgical center and 27.59% in the intensive care unit of the HGP, and 62% of recipients had not been previously transfused. Thus, this study determined the prevalence of infectious diseases in blood recipients from a Brazilian reference hospital, and discussed the feasibility and importance of implementing pre-transfusion serological tests for blood recipients in Brazil. The pre-transfusion serological evaluation is important because it provides both an early diagnosis of infections in blood recipients, thus minimizing the risk of comorbidity, and a greater legal certainty for Hematology Services and for the State, when clarification about possible transmissions of infectious diseases by blood transfusion are needed.

Neste trabalho foi feito uma investigação sorológica em moradores na região amazônica e moradores rurais do sudeste brasileiro, através do teste de inibição da hemaglutinação (HI) para a cepa vacinal da Febre Amarela mais 17 sorotipos diferentes de arbovírus, sendo quatro do gênero Alphavirus (ALP), nove do gênero Flavivirus (FLA) e cinco do gênero Orthobunyavirus (ORT), para verificar qual desses vírus estão circulando nessas regiões. Os resultados do HI foram divididos em quatro áreas: na cidade Machadinho dOeste (Rondônia) (N=285) tivemos para ALP=50 (17,54%), FLA=270 (94,74%), ORT=58 (20,35%) e negativos (NEG)=12 (4,20%). Nas pessoas que moram ao longo do Rio Machado (Rondônia) (N=343) tivemos ALP=99 (28,86%), FLA=229 (66,76%), ORT=41 (11,95%) e NEG=93 (27,10%). Na cidade Teodoro Sampaio (São Paulo) (N=78) tivemos FLA=55 (70,51%) e NEG=23 (29,5%). Na cidade Jacupiranga (São Paulo) (N=149) tivemos ALP=7 (4,7%), FLA=50 (33,56%), ORT=20 (13,42%) e NEG=84 (56,4%). Concluímos que os resultados obtidos sugerem a circulação desses vírus nas regiões estudadas. / In this work we performed a serological investigation in residents of Amazon region and country people who lives in Southeastern of Brazil, by hemagglutination inhibition (HI) for Yellow fever vaccine and 17 different serotype of arboviruses: four from the genus Alphavirus (ALP), nine from the genus Flavivirus (FLA), and five from the genus Orthobunyavirus (ORT), to try to ascertain which of these arboviruses are circulating in these areas. The results of HI were divided into four areas: In Machadinho dOeste city (Rondônia) (N=285) we had to ALP=50 (17,54%), FLA=270 (94,74%), ORT=58 (20,35%) and negatives (NEG)=12 (4,20%). In people who live along the Machado River (Rondônia) (N=343) we had to ALP=99 (28,86%), FLA=229 (66,76%), ORT=41 (11,95%) and NEG=93 (27,10%). In Teodoro Sampaio City (São Paulo) (N=78) we had to FLA=55 (70,51%) and NEG=23 (29,5%). In Jacupiranga City (São Paulo) (N=149) we had to ALP=7 (4,70%), FLA=50 (33,56%), ORT=20 (13,42%) and NEG=84 (56,4%). In conclusion, the obtained data suggest the circulation of these viruses in these regions.

L’hépatite allo-immune post-greffe de moelle osseuse (GMO) est très mal définie. Le premier objectif de notre thèse était d’identifier, par analyse sérologique du protéome, les antigènes (Ag) cibles d’auto-anticorps (Ac) présents dans le sérum de patients. Cinq patients, ayant reçu une GMO, ont développé des troubles hépatiques à l’arrêt du traitement immunosuppresseur, avec des signes histologiques ressemblant à ceux des hépatites auto-immunes (HAI). Avant et pendant l’épisode hépatique, des serums ont été testés sur des immunoblots réalisés avec des protéines nucléaires, cytosoliques, microsomiques et mitochondriales obtenues à partir d’homogénat de foie de rat, séparées par électrophorès bi-dimensionnelle et transférées sur membrane de nitro-cellulose. Après digestion trypsique, les protéines d’intérêt, marquées uniquement ou plus intensément par les sérums en phase d’hépatite, étaient identifiées par spectrométrie de masse MALDI-TOF/TOF et nanoHPLC LTQ-Orbitrap®. Un nombre total de 103 protéines antigéniques a été identifié, parmi lesquelles 12 sont reconnues par les sérums de 3 patients. A l’issue de cette première description immunologique des hépatites allo-imunes post-GMO, nous formulons des hypothèses physiopathologiques permettant d’expliquer l’évolution d’un mécanisme allo-immun vers une réaction auto-immune. En outre, nous recommandons la réduction très progressive des doses d’immunosuppresseur après GMO.La protéine hnRNP A2/B1 est une cible des anticorps anti-nucléaires (AAN) dans le lupus érythémateux disséminé (LED), la polyarthrite rhumatoïde (PR) et l’HAI. Dans la deuxième partie de la thèse, le but était de caractériser les interactions Ag-Ac en fonction de la pathologie, en utilisant la résonance plasmonique de surface par imagerie (SPRi). Trente-neuf peptides chevauchants de 17 acides aminés, couvrant l’ensemble de l’isoforme B1 de la protéine humaine, ont été immobilisés à la surface d’un prisme. Les interactions entre les peptides immobilisés et les sérums de 8 patients de chaque pathologie et de donneurs sains (D) ont été étudiées en temps réel. Les constantes de vitesse de dissociation koff, calculées pendant la phase de dissociation des complexes Ag-Ac formés, reflètent la stabilité de ces complexes.Plusieurs interactions significatives ont été observées : i) avec une stabilité élevée entre P55-70 et les sérums d’HAI par rapport aux contrôles (p= 0.003); ii) avec une faible stabilité entre P118-133 et P262-277 et les serums de LED, P145-160 et les sérums de PR par rapport aux serums D (p=0, 006; p=0,002; p=0,007). Le peptide P55-70 est donc un biomarqueur potentiel dans l’HAI. Les courbes d’interaction et les koff observés après la formation de complexes avec des anticorps anti-IgG et anti-IgM d’une part, et le traitement des sérums par des nucléases d’autre part, montrent que : i) les IgM sont majoritaires et ii) des acides nucléiques, présents ou non selon la maladie auto-immune, participent aux interactions entre les anti-hnRNP B1 et le peptide AA55-70 ainsi qu’entre les autres peptides et les sérums témoins, et contribuent à la stabilité des complexes Ag-Ac. Les résultats de nos travaux et les innovations technologiques en spectrométrie de masse et en SPR permettent d’envisager la mise au point de nouveaux tests pour le suivi des patients atteints d’hépatites auto et allo-immunes. / Alloimmune hepatitis following bone marrow transplantation (BMT) is poorly characterized. The first goal of this thesis was to identify antigens (Ag) targets of autoantibodies (auto-Ab) in sera from patients, using serological proteome analysis. Five patients who received an allogeneic BMT developed liver dysfunctions with histological features suggestive of autoimmune hepatitis (AIH) after the withdrawal of immunosuppressive therapy. Before and during the onset of hepatic dysfunction, sera were tested on immunoblots performed with cytosolic, microsomal, mitochondrial and nuclear proteins from rat liver homogenate, resolved by two-dimensional electrophoresis and transferred onto nitrocellulose membranes. After tryptic digestion, antigenic targets were identified by two tandem mass spectrometry techniques: MALDI-TOF/TOF and nanoHPLC LTQ Orbitrap®. A total of 103 different proteins were identified. Twelve of them were recognized by sera from three patients. This is the first immunological description of hepatitis occurring after BMT, enabling a discussion of the mechanisms that transform an alloimmune reaction into an autoimmune response. Any decision to withdraw immunosuppression after allogeneic BMT should be made with caution and hepatic parameters monitored systematically.Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) A2/B1 is a target for antinuclear autoantibodies in systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), and autoimmune hepatitis (AIH). In the second part of the thesis, the goal was to characterize Ag-Ab interactions as a function of pathology, using surface plasmon resonance imagery (SPRi). Sera from 8 patients from each pathology and healthy donors (D) were passed across a SPRi surface containing 39 overlapping peptides of 17 mers covering the human hnRNP B1. Interactions involving the immobilised peptides were followed in real time and dissociation rate constants koff for each interaction were calculated. koff values reflect the stability of the complex. Several significant interactions were observed: i) high stability (lower koff values) between P55-70 and the AIH sera compared to controls (p= 0.003); ii) lower stability (higher koff values) between P118-133 and P262-277 and SLE sera, P145-160 and RA sera compared to controls (p=0.006, p=0.002, p=0.007). These results indicate that P55-70 of hnRNP B1 is a potential biomarker for AIH in immunological tests.The binding curves and koff values observed after the formation of complexes with anti-IgM and anti-IgG antibodies and after nuclease treatment of the serum indicate that i) IgM isotypes are prevalent and ii) circulating nucleic acids, present or absent according to the autoimmune disorders, participate in the interaction between anti-hnRNP B1 and P55-70 and also between controls and the peptides studied and are involved in antigen-antibody stability. Results from our work as well as promising innovations in mass spectrometry and SPR technologies lead us to consider the development of new tests, usable in monitoring patients with auto and alloimmune liver diseases.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Recombinant proteins from Toxoplasma gondii have been used in several experimental models, as well as for serodiagnosis of human toxoplasmosis, particularly to differentiate acute from chronic phases of the infection. In the present study, we evaluated the kinetics of IgM, IgA, and IgG isotypes, in addition to IgG1 and IgG3 subclasses, by testing sequential serum samples from patients with acute toxoplasmosis. It was carried out immunoassays by using SAG2A recombinant antigen and soluble antigen of Toxoplasma (STAg). The avidity of IgG1 antibody was assessed using slot blot assay. Additionally, a ratio between IgG1 and IgG3 subclasses (IgG3:IgG1) was determined and evaluated its degree of association with levels of IgM and IgA specific for STAg and the avidity index of IgG1 specific for SAG2A. The results showed a decreasing kinetic profile for SAG2A and STAg for IgM and IgA. The kinetic profile for the IgG antibody was increasing for both antigens. Compared to the avidity for IgG1, it was observed that sera from an early stage showed a low average avidity of IgG1 for SAG2A while the same samples showed intermediate mean avidity of IgG1 when STAg was used as antigen. In a later phase, the average avidity observed was high for STAg and intermediate for SAG2A in the same tested sera suggesting that SAG2A may be a promising tool for the detection of avidity. Associations between IgG3/IgG1 and specific IgM and IgA levels for STAg and the avidity index of specific IgG1 for SAG2A were found, and together these parameters could be used as valuable tools in the diagnosis of human toxoplasmosis, especially in situations when the determination of different phases is critical. / Proteínas recombinantes de Toxoplasma gondii têm sido utilizadas em diversos modelos experimentais, assim como para o diagnóstico sorológico da infecção humana por este parasito, principalmente com o intuito de diferenciar as fases aguda e crônica da toxoplasmose. Neste estudo, foi avaliada a cinética dos anticorpos IgM, IgA ,IgG e subclasses (IgG1 e IgG3) através de imunoensaios realizados em amostras seqüenciais de soros humanos, provenientes de pacientes com toxoplasmose aguda. Estas amostras foram testadas frennte ao antígeno recombinante SAG2A, utilizando-se como paradigma de comparação o antígeno solúvel total de Toxoplasma (STAg). A avidez do anticorpo IgG1 foi avaliada utilizando a metodologia slot-blot. Adicionalmente, a razão entre as subclasses IgG3 e IgG1 (IgG3:IgG1) foi determinada e avaliada quanto ao grau de associação com os níveis de IgM e IgA específicos para STAg e aos índices avidez de IgG1 específicos para SAG2A. Os resultados demonstraram a presença de níveis decrescentes de IgM e IgA para ambos os antígenos utilizados, enquanto que para o isotipo IgG o perfil cinético demonstrou níveis crescentes para ambas preparações antígênicas. Em relação aos índices de avidez para IgG1, foi observado que amostras de soros de uma fase inicial apresentaram baixa avidez média de anticorpos IgG1 dirigidos para SAG2A, enquanto que as mesmas amostras demonstraram avidez média intermediária de IgG1 quando STAg foi utilizado como antígeno. Já em uma fase mais tardia, a avidez média observada foi alta para STAg e intermediária com SAG2A. A razão entre IgG3:IgG1 obtida no primeiro bimestre foi significantemente maior para SAG2A em comparação com STAg. Tomados em conjunto, os resultados obtidos no presente estudo indicam que a proteína recombinantes SAG2A pode se constituir em uma ferramenta efetiva na diferenciação das fases da infecção humana por T. gondii. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CHAPTER I: Leprosy presents a clinical spectrum that spans from a strong cellular mediated immunity and bacili growth control of Mycobacterium leprae at the tuberculoid pole to a poor T cell immunity with extensive bacterial load at the lepromatous pole. The antigenic profile characterization in both clinical forms is a necessary step for discover and evaluation of recombinant peptides that are mimotopes of M. leprae antigens, which may present immunogenic potential, in order to obtain a beTer understanding of the disease evolution, and allowing the improvement of diagnosis, prognosis and therapeutics. Mimotopes of M. leprae antigens were selected from a random heptapeptide conformational library expressed in fusion with the pIII protein of the M13 phage, using as the ligand target the total purified IgM from leprosy patients of clinical forms, tuberculoid (TT) and lepromatous (LL), and a healthy control population. Recombinant peptides were selected by glycine elution (unspecific) and by mitsudin elution (specific). All clones, after bioinformatic analyses, were validated by immunoenzymatic and colony reduction assays. For the glycine selection, the TT pole presented 24 distinct fagotypes, while the LL pole presented only 14 fagotypes. For the mitsudin selection, only 4 fagotypes were obtained in the LL pole, and 8 fagotypes in the TT pole. The two most frequent mimotopes, in both TT and LL poles and in both elution protocols, were coincidents. The peptides LFPAMHQ and VERHPST were more frequent in the LL pole, and the peptides KNPTTGT and ETHPTTR were more frequent in the TT pole. The three cited first mimotopes had an accentuated plaque reduction with incubation of sera from LL patients; however, the mimotope ETHPTTR presented the highest reduction with sera from TT patients. The immunogenic potential of these mimotopes may be useful in the development of new diagnostic and therapeutic strategies for leprosy control in the future. CHAPTER II: The phenolic glycolipid 1 (PGL-1) is a membrane antigen highly specific of M. leprae, and it is not found in other mycobacteria. Serological tests with PGL-1 have been performed to detect circulating antibodies in multibacillary patients. Due to its importance in the clinical classification of leprosy patients, we have developed mimotopes of this non-proteic antigen through phage display in order to improve serological assays. In this investigation, a random heptapetide conformational library was selected to obtain specific ligands to the monoclonal antibody anti-PGL-1 CS-48. After three rounds of selection, 14 clones were sequenced and translated, generating six distinct peptides. The mimotope HWMLPED was the most frequent one (57%), suggesting an immunodominance. Serological tests with this mimotope were performed in comparison to the synthetic PGL-1 for 39 patients, classified according to their clinical form, together with their 44 household contacts, classified according to their index cases. Results were similar for T and LL patients. However, the intermediate forms were variable, differently from those results with PGL-1, which presented positivity only for multibacillary patients. The clinical form BT presented a seropositivity of 55.5% for the mimotope against 0% for the PGL-1, probably due the greater avidity of the mimotope to circulating antibodies, or due to the greater spepcificity of the peptide in detecting pure neural reaction, or yet a cross reaction with other human antibodies. The serological tests of household contacts for this same phage clone presented an average positivity of 20.5% versus an average of 7.5 for the PGL-1 antigen. It is probable that there was cross reaction of the mimotope with other antibodies; once it presented partial identity with other M. leprae proteins. The mimotopes must be further investigated, once they may be putative targets for the PGL-1 action in the immune humoral response, and also they could be useful in diagnostics and therapeutic strategies. / CAPITULO I: A hanseníase apresenta um espectro clínico que varia de uma forte resposta imune mediada por células e controle do crescimento do bacilo Mycobacterium leprae no pólo tuberculóide (T), a uma anergia em resposta celular, com alta carga bacteriana, no pólo virchoviano (V). A caracterização do perfil antigênico do bacilo nas formas clínicas se faz necessária para que novos peptídeos recombinantes, mimotopos de antígenos de M. leprae, sejam avaliados quanto ao seu potencial imunogênico, para que se tenha um melhor entendimento dos mecanismos de evolução da doença, e para permitir o aprimoramento do diagnóstico, prognóstico e terapêutica. Mimotopos de antígenos de M. leprae foram selecionados a partir de uma biblioteca conformacional de heptapeptídeos randômicos expressos em fusão com proteína pIII de fagos M13, utilizando como alvo ligante IgM total purificada de pacientes portadores de hanseníase de ambos os pólos, tuberculóide e virchoviano, e de contatos intradomiciliares sadios. Os peptídeos recombinantes foram selecionados por eluição em tampão glicina (inespecífico) e por eluição com mitsudina (específico). Todos os clones, após análises de bioinformática, foram validados por ensaios imunoenzimáticos e alguns por ensaios de redução de colônias. Na eluição com glicina, o pólo tuberculóide apresentou 24 fagótopos distintos, enquanto que o virchoviano apresentou 14. Já na eluição com mitsudina, foram obtidos apenas 4 fagótopos para pólo virchoviano e 8 para o pólo tuberculóide. Os dois mimotopos mais freqüentes, em ambas as formas clínicas e para as duas eluições foram coincidentes, sendo que os peptídeos LFPAMHQ e VERHPST foram os mais freqüentes no pólo virchoviano e os peptídeos KNPTTGT e ETHPTTR os mais freqüentes no pólo tuberculóide. Os três primeiros peptídeos, dos quatro acima citados, tiveram redução de colônias mais acentuada com soro de pacientes V, e o mimotopo ETHPTTR foi o que apresentou a maior redução com soro de pacientes T. O potencial imunogênico destes mimotopos pode ser útil no desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para o controle da hanseníase. CAPITULO II: O Glicolipídeo Fenólico-1 (PGL-1) é um antígeno de membrana altamente específico de M. leprae, não sendo encontrado em outras micobactérias. Os testes sorológicos com o PGL-1 têm sido implementados para a detecção de anticorpos circulantes nas formas clínicas multibacilares. Por ser um alvo importante na classificação clínica dos pacientes, procurou-se desenvolver peptídicos miméticos deste antígeno não-protéico por phage display, como forma de aprimorar o teste sorológico. Neste estudo uma biblioteca conformacional de heptapeptídeos randômicos foi selecionada para obtenção de ligantes específicos ao anticorpo monoclonal anti-PGL-1 CS-48. Após 3 ciclos de seleção, 13 clones foram seqüenciados e traduzidos, gerando seis mimotopos distintos. O mimotopo HWMLPED foi o mais freqüente (61,5%), indicando ser imundominante entre os peptídeos. Testes sorológicos com este mimotopo foram realizados em comparação com o PGL-1 sintético para 37 pacientes, classificados conforme a forma clínica, juntamente com seus 44 contatos, classificados conforme seus casos índice. Os resultados obtidos com o mimotopo e PGL-1 foram similares nos pacientes com as formas clínicas polares T e V. Contudo, as formas intermediárias dimorfas foram altamente variáveis e significantes, diferentemente do PGL-1, que apresentou positividade somente para as formas multibacilares. A forma clínica DT, apresentou 55,5% de positividade com a utilização do fagótopo, contra 0% para o PGL-1, podendo ser uma maior avidez do fagótopo ao anticorpo circulante, ou maior especificidade do fagótopo para lesão neural pura, como também reação cruzada com outros anticorpos. O teste sorológico em contatos intradomiciliares para o fagótopo selecionado, apresentou uma média de 20,5% de positividade contra uma média de 7,5% no teste sorológico para o PGL-1. É provável que tenha ocorrido reação cruzada do mimotopo por este apresentar identidade parcial com proteínas do M. leprae. Os mimotopos devem ser analisados mais profundamente, pois podem indicar provável alvo de ação do PGL-1 na resposta imune humoral e ainda podem ser usados em estratégias diagnósticas e terapêuticas. / Doutor em Genética e Bioquímica