Made available in DSpace on 2015-12-06T23:01:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2001 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Durante os processos de rejeicao de alo e xenotransplantes, celulas endoteliais (CE) transformam-se e passam a apresentar caracteristicas fenotipicas pro-inflamatorias e protromboticas. Alguns membros da familia de genes Bcl-2 (bcl-2, bclx1 e A1) exercem uma dupla funcao protetora em CE, ou seja, protecao contra apoptose e inflamacao. Essa ultima funcao esta diretamente ligada a inibicao do fator de transcricao NF-kB, que e fundamental para a inducao dos principais genes pro-inflamatorios na CE: E-seletina, VCAM-1, IL-8, MCP-1, fator tecidual e PAI-1. Diferentemente de bcl-2 Bcl-Xl1 , o gene A1 nao expressa-se constitutivamente em CE, mas de forma induzida por mediadores pro-inflamatorios tais como LPS ou TNF. O gene A1 codifica 3 dominios homologos ao bcl-2 (denominados BH1, BH2 e BH4) e nao apresenta o dominio pro-apoptotico BH3. Membros da familia de onco-proteinas Bcl-2 apresentam ainda um dominio carboxi-terminal transmembrana (TM), responsavel pelo ancoramento das mesmas a membrana mitocondrial. Estudos previos demonstraram que a funcao inibitoria do fator NF-kB pelo gene bcl-2 relaciona-se ao dominio BH4 enquanto o papel do dominio TM com relacao as funcoes protetoras exercidas por membros da familia Bcl-2 em CE ainda nao foi completamente estabelecido. Os objetivos principais deste estudo foram o de avaliar as funcoes protetoras (anti-apoptotica e anti-inflamatoria) do gene A1 transferido para CE; mapear as mesmas funcoes, correlacionando-as aos dominios BH4 e TM. A confirmacao das funcoes protetoras do gene A1 transferido para CE podera abrir perspectivas para sua utilizacao futura na terapia genetica de patologias onde a apoptose e inflamacao de CE sejam observadas. Utilizando-se a tecnica de amplificacao por polimerase em cadeia (PCR) com overlap extension (OLE-PCR), deletamos o dominio BH4 do gene A1 proveniente de cDNA marcado com hemaglutinina (HA), usando primers especificos. Também por PCR, deletamos o domínio TM de A1. Após confirmação, por sequenciamento genético automatizado, das mutações dirigidas e amplificação por PCR, os produtos (A1DBH4 ou A1TM) foram inseridos em plasmídeos de expressão (pAC), sob controle de um promotor CMV. Da mesma forma, construimos um plasmídeo expressando uma sequência repetida (4X) do domínio BH4 de A1 (polyA1BH4). Células aórticas bovinas (BAEC) em cultura foram co-transfectadas pela técnica de lipossomas não catiônicos, permitindo a transferência do gene A1 wild type ou de seus mutantes (A1DBH4 ou polyBH4), além dos genes repórteres luciferase-NF-kB e b-galactosidase. A expressão proteica foi confirmada por immunoblotting, utilizando-se anticorpos monoclonais anti-HA. A deleção do domínio BH4 anulou ambas funções anti-inflamatória e anti-apoptótica do gene A1 em CE. A expressão da proteína A1 desprovida do domínio BH4 (A1DBH4) foi incapaz de inibir a indução do reporter NF-kB por TNF, e não exerceu proteção das CE contra apoptose induzida por TNF-cicloheximida. A deleçnao do domínio TM não afetou as funções protetoras de A1 nas CE estudadas. Entretanto, a expressão da proteína polyA1BH4 em BAEC reproduziu completamente a função anti-inflamatória da proteína A1 wild-type. Finalmente, construimos um adenovírus recombinante codificando o gene A1 desprovido de domínio transmembrana (rAd.A1DTM). O sucesso na transferência genética de A1, mediada por adenovírus, para das CE porcinas (PAEC) foi confirmado, através de immunoblotting e por imuno-histoquímica,, pela expressão da proteína transgênica A1 em aproximadamente 100% de células infectadas. Esses resultados demonstram que a transferência do gene A1 para CE é possível através da utilização de vetores virais e nãovirais. Nosso estudo demonstra ainda que o domínio BH4, capaz de interagir em outros genes da família Bcl-2 com moléculas de sinalização como Ras, Raf-kinase e alcineurina, é necessário e suficiente para a função anti-inflamatória, e necessário para a função antiapoptótica, de A1, enquanto o domínio TM não é necessário para as mesmas funções em CE. A definição dos sítios de interação do domínio BH4 de A1 com outras moléculas de sinalização poderá revelar novos candidatos potenciais para o tratamento farmacológico ou genético de doenças onde o processo de ativação e apotose de CE estejam envolvidos, tais como a rejeição aguda ou crônica de alo e xenotransplantes. / Acquisition by endothelial cells (EC) of a pro-inflammatory phenotype as well as apoptosis are common features of allo and xenograft rejection. It has been shown that the Bcl family members bcl-2, bcl-xL and A1 mediate a dual cytoprotective function in EC i.e. protection from apoptosis and prevention of inflammation. This latter function relates to the inhibition of the transcription factor NF-kB that is required for the induction of most proinflammatory genes in EC such as E-selectin, VCAM-1, IL-8, MCP-1, Tissue Factor and PAI- 1. Unlike bcl-2 or bcl-xL, A1 is not constitutively expressed in EC but rather induced by pro-inflammatory mediators such as LPS or TNFa. The A1 gene encodes 3 Bcl homology domains - BH1, BH2 and BH4 - but is devoid of the pro-apoptotic BH3 domain. Previous studies have shown that, in bcl-2, most of NF-kB inhibitory function resides within the BH4 domain. The aim of this study was to map the protective anti-apoptotic and antiinflammatory functions of A1 in EC, considering the possibility of its use in gene therapy. The BH4 domain of HA-tagged human A1cDNA was deleted by overlap-extension PCR using 2 pairs of selected primers and its sequence confirmed (A1DBH4). The PCR product was further cloned into the pAC expression plasmid under the control of the CMV promoter. Similar strategy was used to construct a “BH4-only” plasmid (polyA1BH4) consisting of a repetitive sequence (4X) of the BH4 domain of A1. Bovine aortic endothelial cells (BAEC) were co-transfected, using cationic liposome-mediated gene transfer, with A1 or A1 mutant expression plasmids (wild type A1, A1DBH4 or polyBH4), a luciferase-NF-kB reporter and a b-galactosidase reporter. Protein expression was demonstrated by western blot using an anti-HA MoAb. Deletion of the BH4 domain abrogated both the inhibitory effect of A1 upon NF-kB activation and its anti-apoptotic function. Expression of A1DBH4 in EC has neither inhibited LPS or TNF-mediated induction of the NF-kB reporter nor cyclohexamide/TNF-mediated apoptosis. Expression of polyA1BH4 fully reproduced the anti-inflammatory and anti-apoptotic effects of wild type A1. Finally, we have constructed a recombinant adenovirus coding for the A1 gene deleted from its transmembrane domain (rAd.A1DTM). PAEC infected with rAd.A1DTM have successfully expressed the A1 transgene protein in approximately 100% of cells. Our results indicate that A1 gene transfer to EC is feasible and can be achieved using viral and non-viral vectors. Our study shows that the BH4 domain of A1, which has been shown in other bcl genes to interact with molecules involved in signaling, such as Ras, Raf-kinase and calcineurin, is necessary and sufficient for the anti-inflammatory function of A1 in EC. Defining the targets of the BH4 domain of A1 in EC may reveal new potential therapeutic candidates in diseases where EC activation and apoptosis are involved, such as allo and xenograft rejection. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T22:54:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Citocinas do tipo 2 estão presentes em fases mais avançadas do desenvolvimento de diversos tumores humanos, funcionando em alguns casos como fatores prognósticos de neoplasias. O desenvolvimento do melanoma murino B16F10 está relacionado a um aumento na produção de IL-10 por células NK e linfócitos T CD4+ e uma diminuição acentuada na produção de IFN- por essas células, nas fases mais avançadas da progressão tumoral. Embora o modelo singeneico do melanoma murino B16F10-Nex2 apresente baixa imunogenicidade in vivo, uma pequena porcentagem de camundongos C57Bl/6 são naturalmente resistentes ao desenvolvimento subcutâneo desse tumor, mesmo após mais de uma inoculação das células tumorais. Animais naturalmente resistentes produziram maiores concentrações de IFN- e animais susceptíveis ao tumor produziram maiores concentrações de interleucinas anti-inflamatórias, IL-10 e IL-6. Confirmando o papel imunoregulador negativo da IL-10 na resposta imune protetora natural desse modelo, camundongos geneticamente deficientes em IL-10 (IL-10KO) foram mais resistentes à implantação subcutânea de células B16F10-Nex2. Animais que resistiram à progressão tumoral produziram uma resposta protetora com perfil de citocinas do tipo 1 (IFN- e IL-12), e a proteção foi dependente de IFN- . Macrófagos e células dendríticas de animais IL-10KO após estímulo in vitro com antígenos do melanoma B16F10-Nex2 apresentaram maior produção de citocinas pró-inflamatórias (IFN- , TNF- e IL-12) e uma maior expressão de marcadores de ativação celular (MHCII, CD40, CD80 e CD86). Com a transferência adotiva de células dendríticas IL-10KO, mas não IL-10 competentes, associadas a um lisado de células B16F10-Nex2, animais C57Bl/6 foram protegidos contra o desenvolvimento tumoral, sugerindo que células dendríticas que não expressam IL-10 sejam responsáveis pela indução da resposta protetora natural mais eficiente observada em animais IL-10KO. Tendo em vista o papel imunossupressor da IL-10 na resposta protetora induzida pelo melanoma B16F10-Nex2, foi construído um vetor plasmidial eucariótico contendo o mini-gene referente à porção extracelular do receptor da IL-10 murina, a ser utilizado em protocolos de terapia gênica para neutralização da IL-10 in vivo pela expressão de um receptor decoy da interleucina. Animais tratados com o plasmídeo recombinante apresentaram aumento na sobrevida, em um efeito dependente de IFN- e potencializado pela associação de uma terapia gênica adjuvante para produção de IL-12. Células dendríticas de animais C57Bl/6 foram transfectadas com esse plasmídeo recombinante, associadas a antígenos tumorais e transferidas adotivamente à animais C57Bl/6, que foram subsequentemente desafiados com células tumorais subcutaneamente. Essas células, que tiveram o IL-10 neutralizado pelo receptor decoy, induziram resposta protetora significativamente mais eficiente que as células controle transfectadas com o plasmídeo vazio, sugerindo que essas células estejam envolvidas in vivo na indução da resposta protetora observada após a imunização com o plasmídeo recombinante e neutralização da IL-10 sistêmica. Concluímos que a terapia gênica desenvolvida foi eficaz na neutralização da IL-10 sistêmica, podendo ser aplicada como uma nova alternativa imunoterapêutica antitumoral. / Type 2 cytokines are increased in late phases of several human tumors, and in some cases are considered prognostic factors for these neoplasias. Late development phases of murine melanoma B16F10 correlate with an increased production of IL-10 by NK cells and CD4+ T lymphocytes, and also with a decreased production of IFN- by these cells. Syngeneic murine melanoma B16F10-Nex2 shows low immunogenicity in vivo, however, a small percentage of C57Bl/6 mice are naturally resistant to subcutaneous tumor development, even after several tumor cell inoculations. Naturally resistant animals produced higher concentrations of IFN- and tumor susceptible animals produced higher concentrations of anti-inflammatory cytokines, IL-10 and IL-6. The immunoregulatory role of IL-10 on the natural protective immune response induced in this model was confirmed by the increased resistance to tumor development observed in IL-10 genetically-deficient mice (IL- 10KO) subcutaneously inoculated with B16F10-Nex2 cells. A type 1 immune reponse (IFN- and IL-12) was induced in resistant IL-10KO animals, and the protection was IFN- -dependent. IL-10KO macrophages and dendritic cells stimulated in vitro with B16F10-Nex2 melanoma antigens secreted higher concentrations of proinflammatory cytokines (IFN- , TNF- e IL-12), and expressed an increased amount of surface activation markers (MHCII, CD40, CD80 e CD86). Adoptive transfer of IL-10KO dendritic cells, but not IL-10-competent cells, in association with tumor antigens, induced a protective response in C57Bl/6 mice, suggesting that IL-10-negative dendritic cells induce the efficient protective response observed in IL-10KO animals. As IL-10 showed a clear immunosuppressive role on the natural protective response induced by B16F10-Nex2 cells, we constructed an eukaryotic plasmidial vector carrying the murine IL-10 receptor extracellular portion gene, to be used in gene therapy protocols for IL-10 neutralization in vivo by the expression of a decoy receptor. Recombinant plasmid-treated animals showed an IFN- -dependent increased survival, and this protective effect was augmented by the association with an adjuvant IL-12 gene therapy Dendritic cells from C57Bl/6 animals were transfected with recombinant plasmid, adoptively transferred to C57Bl/6 mice, and treated animals were challenged subcutaneously with B16F10-Nex2 tumor cells. Interleukin-10-neutralized dendritic cells induced a significantly increased survival, as compared to IL-10-containing dendritic cells, suggesting that dendritic cells induce the protective response observed in vivo after recombinant plasmid immunization and systemic IL-10 neutralization. We concluded that gene therapy using a plasmid expressing the IL-10 receptor extracellular region was effective on systemic IL-10 neutralization, and this tool could be used as a novel antitumor immunotherapeutic alternative. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / O remodelmento cardíaco é em última instância regulado por compenentes da matriz extracelular (MEC). Investigamos o importante papel que os fatoresde crescimento desempenham na regulação do remodelamento da MEC cardíaca decorrente do infarto agudo do miocárdio. Ratos foram submetidos à ligação da artéria coronaria descendente esquerda e subsequente transferência gênica intramiocárdica do plasmídeo pVEGF165 no grupo tratado. Os animais foram divididos de acordo com o tamanho do infarto em grande (LMI), pequeno (SMI), com ou sem tratamento com a transferência gênica. O plasmídeo contendo o cDNA que codifica para o VEGF165 foi injetado no músculo cardíacoe seus efeitos sobre os componentes da MEC foram analisados. Os ensaios de transfecçnao foram realizados com células endoteliais e musculares lisas, utilizando pcDNA3.1 recombinante contendo cDNA do VEGF165.Os glicosaminoglicanos foram identificados e quantificados por eletroforese em gel de agarose e ELISA como também por imunohistoquímica para investigar aterações da expressão da catepsina B, heparanase e sindecam-4. A quantidadede ácido hialurônico (HA) (p < 0.005), dermatam sulfato (DS), condroitim sulfato (CS) e heparam sulfato (HS) (p < 0.001) foram significativamente maiores no grupo LMI tratado em comparação com os demais grupos, corroborando com a dominuição na expressão da heparanase. Uma diminuição da massa molecular do HA foi observada no tecido cicatricial do grupo tratado. Os dados obtidos fortemente sugerem que alterações da MEC e de seus compenentes são importantes determinantes do remodelamento cardíaco após infarto do miocárdio, podendo ser essenciais na resposta inflamatória e na tentativa de recuperar os danos e prover mecanismos compensatórios para manter a fração de ejeção cardíaca, visto que os componentes da MEC analisados estão diretamente envolvidos na angiogênese, proliferação e diferenciação cellular. Os ensaios in vitro mostraram que a resposta aos fatores de crescimento com relação à síntese dos glicosaminoglicanos é dependente do tipo celular e dose utilizada. / Cardiac remodeling is ultimately regulated by components of the extracellular matrix (ECM). We investigated the important role that growth factors play in the regulation of ECM remodelling that occurs as a consequence of myocardium damage. Rats were submitted to the ligation of the left anterior coronary artery and pVEGF165 was immediately injected intramyocardially in the treated group. The animals were divided into large (LMI) and small infarct (SMI), with or without gene transfer. The plasmid containing cDNA encoding VEGF165 was injected into the cardiac muscle and its effect was observed on the ECM components. Transfection assays were also performed with endothelial and smooth muscle cells using recombinant pcDNA3.1 containing VEGF165 cDNA. Glycosaminoglycans were identified and quantified by agarose gel based electrophoresis and ELISA as well as immunocytochemistry to examine specific cathepsin B, heparanase and syndecan-4 changes. The amounts of hyaluronic acid (HA), (p<0.005), dermatan sulfate (DS), chondroitin sulfate (CS) and heparan sulfate (HS) (p<0.001) were significantly increased in the LMI treated group in comparison to the other groups, which correlates with the decrease in the expression of heparanase. A decrease in the molecular mass of HA was found in the scar tissue of treated group. The data obtained strong support the idea that changes in the ECM and its components are important determinants of cardiac remodelling after myocardium infarct and may be essential for inflammatory response and attempt to stabilize the damage and provide a compensatory mechanisms to maintain cardiac output since the ECM components analyzed are involved with angiogenesis, cell proliferation and differentiation. In vitro assays showed that growth factors affect glycosaminoglycans synthesis in a cell specific and dose dependent manner. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Joyce Maria Annichino-Bizzacchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T17:15:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paula_ErichViniciusde_D.pdf: 3311580 bytes, checksum: 0e2725586b5aed078f6a78de1edd1d14 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A doença arterial oclusiva (DAO) é a principal causa de morbidade e mortalidade em países industrializados. Com o aumento da expectativa de vida da população mundial a DAO tornou-se um problema de saúde publica também em países em desenvolvimento. O tratamento de uma das formas graves de DAO, a isquemia crítica de membros inferiores (ICMI), normalmente oferece alívio temporário e muitas vezes requer a amputação do membro afetado. No Brasil, a sobrevida desses pacientes é comparável a algumas formas de câncer. Desta forma, a busca de estratégias terapêuticas alternativas à amputação é fundamental para estes pacientes. Nesse estudo, nós exploramos o papel da angiogênese terapêutica induzida por terapia gênica (TG) em modelos animais ICMI. A angiogênese terapêutica se baseia na utilização de fatores de crescimento vascular sob a forma de proteínas recombinantes ou TG. A reposição de proteína deve ser mantida por períodos prolongados e normalmente requer administração sistêmica. Isto aumenta o risco de formação de vasos em locais indesejáveis como tumores ocultos ou retina. Estudos clínicos anteriores demonstraram que a indução de angiogênese terapêutica utilizando apenas um fator pró-angiogênico é eficaz. No entanto, esses estudos sugerem que integridade destes neovasos é deficiente pela ocorrência de edema de membros inferiores ou proteinúria após a monoterapia angiogênica.Neste trabalho avaliamos a eficácia da TG combinada usando vetores não virais com os genes de dois fatores de crescimento: FGF-2 e PDGF-BB, em comparação com a transferência gênica isolada do VEGF-A. A escolha destes dois fatores deveu-se ao fato de eles atuarem em etapas distintas e complementares do processo de formação vascular: formação e estabilização dos novos vasos, respectivamente. Para este fim utilizamos o modelo de isquemia da pata posterior em ratos, e um novo método não invasivo, o 99mTc-sestamibi para avaliação da neovascularização. A expressão combinada do FGF-2 e PDGF-BB induziu a formação de neovasos com a mesma intensidade e com a mesma relevância funcional que o uso do VEGF-A isolado. No entanto, a estratégia combinada se mostrou mais atraente por induzir a formação de vasos mais íntegros, e necessitar de doses individuais 50% menores de cada gene terapêutico. Em conjunto esses dados demonstram que a TG combinada com FGF-2/PDGF-BB é eficaz e potencialmente mais segura para o tratamento da ICMI. Com o objetivo de definir fatores que afetam a resposta angiogênica pós-natal, nós investigamos o papel da trombina durante a indução de neovasos. Animais receberam diversos inibidores da coagulação imediatamente ou após 72 horas da indução de isquemia periférica. Nós documentamos que a inibição da coagulação sangüínea na fase aguda da isquemia diminui a resposta angiogênica, mas esse efeito não é observado quando a anticoagulação é iniciada após 72 horas. A ativação dos receptores celulares da trombina (e outras proteases) pode oferecer um novo alvo para otimizar a resposta angiogênica pós- natal. Em conjunto, os resultados obtidos formam a base para estudos futuros utilizando a TG combinada com FGF-2/PDGF-BB como uma alternativa potencialmente eficaz e segura paro tratamento da ICMI / Abstract: Arterial occlusive disease (AOD) is the main cause of mortality and morbidity in industrialized countries. Global improvements in life expectancy have turned it into a public health problem in developing countries as well. The treatment of one of the severe presentations of DAO, which is critical limb ischemia (CLI) normally offers temporary relief to symptoms, often requiring major amputations of the affected limb. In Brazil, the prognosis of CLI is similar to that of some forms of cancer. Therefore, new therapeutic strategies alternative to amputations are necessary for these patients. In the present work we evaluated the role of therapeutic angiogenesis induced by gene therapy (GT) in animal models of CLI. Therapeutic angiogenesis consists in the use of vascular growth factors by means of recombinant proteins or GT. When using protein formulations, therapy must be maintained for prolonged periods and normally involves systemic administration. These requirements increase the risk of inducing the formation of neovessels in undesired places such as occult malignant lesions or retina. Previous studies have demonstrated that therapeutic angiogenesis using a single pro-angiogenic factor is effective. However, these studies suggest that the new formed vessels are leaky, as evidenced by the occurrence of lower limb edema and proteinuria after pro-angiogenic monotherapy. In the present work we evaluated efficacy of a combined GT strategy using non-viral vectors expressing two vascular growth factors: FGF-2 and PDGF-BB, and compared this strategy to the gene transfer of VEGF-A alone. The choice of these two growth factors was due to their complementary roles in the process of vascular development: formation and stabilization of new vessels. In order to do so we used a hindlimb ischemia model in rats, and a new non-invasive method based on 99mTc-sestabimi scintigrapy, to evaluate the neovascularization response. Dual gene transfer of FGF-2 and PDGF-BB using non-viral vectors was able to induce a similar revascularization response as VEGF-A alone, both in terms of anatomical and functional parameters. In regard to safety, the dual gene transfer strategy was more attractive because it was able to induce more stable capillaries, and required a 50% lower individual dose of each therapeutic gene. Taken together our data demonstrate that this dual gene transfer strategy is an effective safer strategy for the treatment of CLI by therapeutic angiogenesis. In order to investigate factors that might affect the revascularization post-natal response, we further investigated the role of thrombin during the induction of neovascularization. Animals were treated with different coagulation inhibitors immediately after or 72 hours after the creatin of hindlimb ischemia in rats. We documented that the inhibition of blood coagulation in the acute phase of ischemia impairs the angiogenic response. In contrast, this effect was not observed when anticoagulation was initiated after 72 hours of ischemia. The activation of cellular receptors of thrombin and other proteases might therefore offer an new target to optimize post-natal revascularization. Based on our results, future studies using combined GT with FGF-2 and PDGF-BB are warranted in order to translate these findings into a new and safer strategy for the treatment of CLI / Doutorado / Medicina Experimental / Doutor em Fisiopatologia

Orientadores: Adriano Rodrigues Azzoni, Anete Pereira de Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T06:15:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Toledo_MarceloAugustoSzymanskide_D.pdf: 15660446 bytes, checksum: 8e64c5b4455cf458c2eb0d9b8e030e70 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Apesar de seguros e simples de produzir, o uso de vetores não virais como o DNA plasmidial (DNAp) em estudos de terapia gênica e vacinação por DNA tem sido limitado pela baixa eficiência quando comparados aos vetores virais. Essa limitação provém principalmente da reduzida capacidade de superar as barreiras físicas, enzimáticas e difusionais encontradas durante o tráfego intracelular para o interior do núcleo das células alvo. Dentro deste contexto, o presente trabalho demonstra a utilização de cadeias leves modificadas de Dineína (Lc8 e Rp3) como vetores não-virais de entrega gênica. A escolha de cadeias leves de Dineína justifica-se pela possibilidade de utilizar o transporte retrógrado celular mediado por complexos motores de Dineína para facilitar o tráfego de material genético exógeno através do citoplasma em direção à periferia nuclear. Através da adição de pequenos domínios peptídicos, ricos em aminoácidos polares positivos (arginina e lisina), ao N-terminal de cadeias leves de Dineína foi possível conferir a estas proteínas a habilidade de interagir com material genético condensando-o em partículas. Ensaios de transfecção demonstraram que tais partículas apresentam elevada eficiência de entrega do material genético exógeno ao núcleo de células HeLa, eficiência esta superior àquela apresentada pelo peptídeo protamina, amplamente estudado como vetor não-viral de entrega gênica. A formação de complexos ternários utilizando-se DNA plasmidial, cadeias leves de Dineína modificadas e lipídios catiônicos apresentou eficiência de entrega superior àquelas apresentadas na ausência do lipídio. Adicionalmente, complexos de entrega formados apenas com DNA plasmidial e cadeias leves de Dineína modificadas apresentaram baixo efeito citotóxico em células HeLa, característica esta de grande relevância uma vez que a toxicidade dos vetores de entrega gênica atua como importante fator limitante em sua aplicação clínica. O mecanismo envolvido no processo de entrega gênica mediado por cadeias leves de Dineína modificadas também foi estudado, podendo ser observado que (1) a entrada dos complexos de entrega na célula é altamente dependente do processo de endocitose, (2) a eficiência de entrega observada depende da rede de microtúbulos e (3) parte significativa dos complexos de entrega é degradada na via de endossoma/lisossomo celular. Os vetores não-virais de entrega gênica descritos no presente estudo associam elevada eficiência de transfecção, baixa toxicidade celular e relativo baixo custo de produção, uma vez que as cadeias leves de Dineína recombinantes são produzidas em sistema heterólogo utilizando-se Escherichia coli. Ressalta-se ainda a possibilidade de adição de novos domínios peptídicos às cadeias leves de Dineína modificadas, agregando novas funções/capacidades que poderiam resultar em maior eficiência de entrega gênica através da otimização dos processos de internalização celular ou escape endossomal. A abordagem de se utilizar a via de transporte retrógrado celular para o desenvolvimento de vetores não-virais para entrega gênica é pouco explorada pela comunidade científica e o presente estudo apresenta-se entre os poucos da área, esperando assim contribuir para o desenvolvimento de vetores não-virais mais eficientes e seguros / Abstract: The use of non viral vectors such as plasmidial DNA (pDNA) in gene therapy and DNA vaccination protocols has been limited due to its low transfection efficiency when compared to viral vectors. This limitation occurs mainly due to the physical, enzymatic and diffusion barriers faced during the transport of the genetic material to the nucleus of target eukaryotic cells. Regarding this subject, the present work demonstrates the feasibility of using modified Dynein light chains (Lc8 and Rp3) as non viral vectors for gene delivery. The use of Dynein light chains relies on the possibility to exploit the Dynein based cellular retrograde transport in order to improve the exogenous genetic material transport across the citosol towards the nuclear periphery. By adding small peptide domains, based in positively charged aminoacids (arginine and lysine) to the N-terminal of Dynein light chains, the resulting recombinant proteins were able to interact and condense genetic material into delivery particles. Transfection assays demonstrated that these particles are highly efficient to delivery plasmidial DNA to nucleus of HeLa cells when compared to the transfection efficiency presented by protamine, a well characterized non viral vector peptide. Ternary complexes formed by modified Dynein light chains, pDNA and a cationic lipid showed even higher transfection efficiency. Additionally, the light chain based non viral delivery vectors presented low citotoxic effect to HeLa cells, a valuable feature as toxicity is regarded as one of the main concerns on delivery vectors development. The mechanism by which the modified Dynein light chain based vectors mediates gene delivery was also investigated and we could observe that (1) the internalization process deeply relies on endocytosis, (2) it depends on the microtubule network and (3) a significant fraction of the delivery complexes are trapped and degraded in the endocytic pathway. The non viral vectors developed in the present study combine high transfection efficiency, low toxicity and relative low production cost, as all modified proteins were produced in Escherichia coli prokaryotic host. Its noteworthy that additional peptide domains can be further associated to the delivery vectors described providing it with new abilities such as higher internalization or endosomal escape capacity. The approach to use the cellular retrograde transport in order to develop non viral vectors is poorly exploited by the scientific community and the present study stands among few in the field hopefully contributing to the development of more efficient and safer non viral vectors for gene delivery / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Lucimara Gaziola de la Torre / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T17:50:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sipoli_CarolineCasagrande_D.pdf: 4303538 bytes, checksum: 416499c84401c29f761041b6fe23813d (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O estudo de processos de produção de nanopartículas poliméricas, mais especificamente a quitosana (CHI), para aplicações em vacinação/terapia gênica é um desafio. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento do processo de produção de nanopartículas de CHI com o agente reticulante tripolifosfato de sódio (TPP), sendo dividido em 3 etapas. A primeira etapa consistiu na produção destas partículas, avaliando a influência do pH da solução inicial de CHI (pH 4; 5 e 5,5). Para isso, utilizou-se um sistema de reator com chicanas e agitação mecânica com impelidor do tipo cowles facilmente escalonável. A caracterização físico-química das nanopartículas permitiu verificar as diferenças das partículas produzidas nos diferentes pH¿s. Um estudo de estabilidade simulando o ambiente de aplicação biológica foi realizado para avaliar as nanopartículas produzidas em pH¿s diferentes e verificou-se que as partículas produzidas nos pH¿s menores apresentaram maior estabilidade no período estudado (4 horas). A avaliaçãp biológica dos complexos preparados (DNA-CHI/TPP), em termos de transfecção in vitro em células HeLa indicou que não houve diferença entre as partículas produzidas nos diferentes pHs. A segunda, etapa do trabalho avaliou a influência da temperatura durante o processo de produção de nanopartículas de CHI/TPP utilizando o mesmo sistema anteriormente descrito. Foram avaliadas três diferentes condições isotérmicas e também a variação de temperatura ao longo da gelificação ionotrópica. Para este último caso, obteve-se nanopartículas com índice de polidispersidade significativamente menor do que os processos isotérmicos. 2 porcentagens de DNA (10 e 40% m/m) foram incoporadas às nanopartículas e a diferença em termos de pDNA incoporado apresentou diferentes eficiências de transfecção em células A293 ao longo do tempo, indicando uma liberação sustentada. Em termos de citotoxicidade, observou-se queda da viabilidade celular após 120 horas de incubação, sem ocorrer dependência da dose. Na terceira etapa realizou-se o uma análise exploratória para o desenvolvimento de um processo microfluídico para produção de partículas de CHI/TPP. Dois métodos foram estudados: focalização hidrodinâmica e emulsão temporária. O processo de emulsão temporária não foi reprodutível visto que a finalização desta etapa foi comprometida devido a precipitação da quitosana nos microcanais. As condições avaliadas para o método de focalização hidrodinâmica geraram nanopartículas de CHI/TPP com alto índice de polidispersidade. Este trabalho apresenta uma nova área de desenvolvimento de processos de produção de partículas poliméricas / Abstract: The study of polymeric nanoparticle production process, specifically chitosan (CHI), for gene vaccine/therapy application is a challenge. This work aims to the development of production process of chitosan (CHI) with the crosslinking agent pentasodium triphosphate (TPP), and it was divided into three steps. The first step was the production of these nanoparticles evaluating the influence of pH of chitosan solution (pH 4; 5; 5.5). For this purpose, the system used was a reactor with baffles, mechanical stirring with cowles impeller, easy to scale up. Physico-chemical characterization reveals the difference between the produced nanoparticle in the different pH¿s. One stability tests simulating the biological application environment was carried out to evaluate the nanoparticle produced in different pH¿s and it was possible to verify that the nanoparticles produced in lower pH¿s presented higher stability at the evaluated period (4 hours). The biological study of the prepared complexes (DNA-CHI/TPP), in terms of in vitro tranfection in in HeLa cells indicated no difference between between the nanoparticles produced in the different pHs. The second step of this work studied the influence of temperature the CHI/TPP nanoparticles production using the same system as previously reported. Three isothermal conditions and also temperature variation during the ionic gelation were tested. For this last condition, nanoparticles produced were significantly smaller in terms of PDI if compared to the isothermal process. 2 percentage of pDNA were incorporated (10 and 40% w/w) to the nanoparticles and the difference in terms of amount of pDNA showed different transfection efficiency in A293 cells over the time, suggesting sustained release capability. In terms of cytotoxicity, it was noticed that the cell viability decreased after 120 hours of incubation, and it is no dose-dependent. The third step was the exploratory investigation of microfluidic processes to obtain CHI/TPP nanoparticles. Two methods were studied: (i) temporary emulsion and (ii) hydrodynamic flow focusing. The temporary emulsion process was not reproducible since this step was not concluded due to the chitosan precipitation inside the microchannels. In hydrodynamic flow focusing, CHI/TPP nanoparticles presented high values of polydispersity index at the studied conditions. This work presents new area in the development of polymeric nanoparticles production processes. Keywords: chitosan nanoparticles, sodium triphsosphate, pH, temperature, plasmidial DNA, microfluidic, HeLa cells, A293 cells / Doutorado / Engenharia Química / Doutora em Engenharia Quimica

Orientador: Erich Vinícius de Paula / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T18:53:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Faiotto_VanessaBoury_M.pdf: 2777980 bytes, checksum: 26068f6f5813665c531b744d7a8c8f60 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A sepse representa uma condição potencialmente fatal em que a resposta do organismo a uma infecção resulta em lesão em seus próprios tecidos. A terapia gênica (TG) consiste na modificação do repertório de células somáticas com fins terapêuticos, substituindo genes defeituosos que causam doenças. Na sepse, vetores não virais podem representar uma estratégia excelente para a transferência do gene terapêutico, uma vez que não provoca resposta imune significativa e são expressos apenas transitoriamente. Além disso, a sua produção é mais simples. Métodos: O estudo foi dividido em três etapas. Em primeiro lugar, dois genes repórter (lacZ e F9) foram testados em dois modelos experimentais de sepse (endotoxemia e ligadura e punção cecal, CLP) para confirmar a viabilidade da transferência gênica no contexto da sepse. A expressão foi avaliada por métodos qualitativos (histoquímica) e quantitativos (avaliação funcional; métodos coagulométricos). Em seguida avaliou-se a eficácia terapêutica da transferência do gene de sFlt-1, um antagonista de VEGF natural, no modelo de endotoxemia. A expressão foi avaliada por ELISA, e a eficácia foi avaliada através de uma curva de sobrevida. Os camundongos foram tratados com o plasmídeo DNA (pDNA) contendo o cDNA do gene Flt1 (tratamento) lacZ (controle), 6 horas após o desafio com LPS. A propósito, sFlt-1 foi capaz de proteger da sepse experimental murina em outros estudos, devido a sua propriedade estabilizadora da barreira endotelial (BE). Na última etapa, avaliamos os níveis séricos de quatro proteínas envolvidas na modulação da integridade BE, utilizando amostras de soro de indivíduos diagnosticados com sepse grave e choque séptico (n = 53), através de um kit Multiplex comercial. Resultados: No primeiro passo, a transferência gênica por vetores não virais foi demonstrada no modelo de endotoxemia, pois tanto a expressão de ?-galactosidase quanto de F IX mostraram-se aumentadas nos animais tratados neste modelo. A expressão não foi confirmada no modelo CLP, embora o número reduzido de animais por grupo não permita uma conclusão definitiva sobre o assunto. Em relação à segunda etapa, apenas 4/14 animais tratados apresentaram níveis detectáveis de sFlt-1 por Elisa. Além disso, não houve diferença na sobrevida entre os animais tratados e controles. Juntos, estes resultados confirmam que a transferência gênica com vetores não virais é possível no contexto de uma inflamação grave, mas apresenta baixa eficiência e previsibilidade. Por fim, observamos diferenças significativas nos níveis séricos de endoglina (maior expressão) e HB-EGF (menor expressão) em pacientes com choque séptico, em comparação ao grupo controle. Os níveis de BMP-9 e FGF-2 não foram significativamente diferentes no choque séptico. Conclusões: Nosso estudo nos permite concluir que, apesar de factível, a utilização de vetores não-virais não parece representar uma estratégia terapêutica eficaz na sepse experimental. Maiores estudos são necessários para validar o uso de endoglina e HB-EGF como biomarcadores de sepse grave / Abstract: Sepsis represents a potentially fatal condition that occurs when the body's response to infection results in injury to its own tissues. Gene therapy (GT) consists in modification of the repertory of somatic cells with therapeutic purposes, replacing defective genes that cause diseases. In sepsis, non-viral vectors, could represent an excellent strategy for therapeutic gene transfer, since they do not elicit intense immune responses in the individual and are expressed only transiently. Besides, their production is easy and inexpensive. Methods: The study was divided in 3 steps. First, two reporter genes (lacZ and F9) were tested in two experimental models of sepsis (endotoxemia and cecal ligation and puncture, CLP) to confirm the feasibility of gene transfer in the context of sepsis. We assessed expression by qualitative (histochemistry) and quantitative methods (functional evaluation, through coagulometric methods). Next we evaluated the efficacy of the therapeutic gene transfer of sFlt-1, a natural VEGF antagonist, in the endotoxemia model. Expression was evaluated by ELISA, and efficacy was evaluated by a survival curve. Mice were treated with pDNA containing the Flt1 (treatment) or lacZ (control) cDNA, 6 hours after challenge with LPS. Of note, sFlt-1 has been previously shown to protect from experimental sepsis due to its endothelial barrier (EB) stabilizing properties. In the last step, we evaluated serum levels of 4 proteins involved in the modulation of EB integrity, using serum samples of subjects diagnosed with severe sepsis and septic shock (n=53), through a commercial Multiplex kit. Results: In the first step, we could confirm the expression of both reporter genes by non-viral vectors in the endotoxemia model. Of note, expression of ?-galactosidase showed a notable increase when compared with control group. Similarly, we noted increased expression of factor IX in the mice which were submitted to gene transfer with pDNA, when compared with the controls that received the lacZ pDNA (111,4 ± 16,10 vs 64,73 ± 12,34; p<0,001) in the endotoxemia model, and similar result in the group without sepsis induction by endotoxemia (163,4± 73,46 vs 79,88 ± 9,39; p=0,0006). Expression was not confirmed in the CLP model, although the limited number of animals per group does not allow a definite conclusion on this matter. In relation to the second step, only 4/14 treated animals presented detectable levels of sFlt-1 by Elisa. In addition, no difference could be observed in the survival between treated and control animals. Together, these results confirme that gene transfer with non-viral vectors is feasible in the context of severe inflammation, but with a low efficiency and predictability. Finally, we demonstrated significant differences in serum levels of endoglin (higher expression) and HB-EGF (lower expression) in patients with septic shock, compared to controls. BMP-9 and FGF-2 levels were not significantly different in septic shock. Conclusions: Our study allows us to conclude that although feasible, the use of non-viral vectors does not seem to represent an effective therapeutic strategy in experimental sepsis. Larger studies are needed to validate the use of endoglin and HB-EGF as biomarkers of severe sepsis / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Ciências

O treinamento físico aeróbio (TF) e a hipertensão arterial (HA) induzem hipertrofia cardíaca (HC) com características diferentes, e entre as diferenças moleculares podem estar a elucidação de abordagens terapêuticas como os microRNAs (miRNAs). Selecionamos de dados de miRNAarray, 15 miRNAs cardíacos induzidos por dois protocolos de treinamento físico de natação (TF) e comparamos com o miRNAarray em modelo de hipertensão arterial (animais espontaneamente hipertensos, SHR). Foram selecionados 4 miRNAs de interesse (miRNA-27a, 27b, 126 e 29c) que seguiram para a confirmação de sua expressão por qRT-PCR. Destes, selecionamos o miRNA-29c para que fosse realizada a modulação in vivo em SHR jovens. Foi realizada injeção cardíaca intramuscular de partículas de vetor lentiviral para a superexpressão do miRNA-29c. Foram testadas duas doses: baixa (B), 0,6x109 pv/animal e alta (A), 3x109 pv/animal; e por dois períodos de tratamento: 7 e 14 dias. Foi avaliada a expressão de GFP em fígado e coração por western blott para observar a eficiência da transdução viral in vivo. Os efeitos do tratamento na pressão arterial (PA) foram analisados por pletismografia de cauda; na HC pela razão VE/PC (peso do ventrículo esquerdo/peso corporal), peso do coração/PC e (cor/PC), e pelo diâmetro de cardiomiócitos (dCMO) por histologia. qRT-PCR foi utilizado para investigar a expressão do miRNA-29c e seus alvos, colágeno do tipo I e do tipo III (COLIAI e COLIIIAI). O conteúdo de colágeno também foi medido por análise histológica (picrossírius), pela fração volumétrica de colágeno (% col), e pela concentração de OHprolina no VE. Os grupos que receberam baixa dose das partículas lentivirais foram positivos para GFP em coração e fígado, tendo sido assumida a dose baixa como eficiente para futuras transduções. Todos os grupos tratados apresentaram aumento da expressão do miRNA-29c. A expressão gênica do COLIAI diminuiu para os grupos tratados o que não ocorreu para o COLIIIAI. A fração volumétrica foi menor em todos os grupos tratados o que mostra evidência que o tratamento foi eficaz para diminuir a concentração de colágeno cardíaco. Houve diminuição no cor/PC de 7-11% para os grupos SHR7A e SHR7B, que foi concatenada com um aumento no dCMO, com diminuição da fibrose. Nossos resultados sugerem, portanto, que o tratamento com o miRNA29c induz remodelamento cardíaco benéfico, abrindo perspectivas para investigações adicionais sobre terapias antifibróticas para doenças cardiovasculares / Both aerobic exercise training (ET) and Hypertension (HY) induce different cardiac hypertrophy (CH) phenotypes which molecular differences and may lead to new targets for therapies in cardiovascular disease, as microRNAs (miRNAs). We selected 15 miRNAS that were changed by ET from miRNAarray data and compared them with other from HY miRNAarray data. Four miRNAs were selected for qRT-PCR confirmation: miRNA-27a, 27b, 126 e 29c. Among then, miRNA 29c was choosen to be modulated by lentiviral vector due its role in fibrosis regulation. Intramuscular cardiac injection of the lentiviral vector particles was performed following two doses; low-dose , 0,6x109 vp/rat and high 3x109 vp/rat; and for two different times (7 and 14 days). The transduction efficiency was assessed by GFP expression by western blot. Blood pressure (BP) was measured by caudal pletysmography, CH was analysed by ratio LVw/BW (left ventricle weight/body weight), heartw/BW (heart weight/body weight) and by cardiomyocyte diameter (dCMO). qRT-PCR was used to assess miRNA-29c expression and its targets COLIAI and COLIIIAI gene expression. The LV collagen content was assessed by histology (Picrossirius red), by collagen volume fraction, and by Hydroxiproline concentration. Both groups that received the lowe doses were GFP positive in the heart and liver tissue,We assumed that low doses were better for future in vivo transduction. BP did not increase to SHR14A and SHR14B, what did not occurred to the 7 days groups. The miRNA-29c expression increased in all treated groups versus their control (CSI). COLIAI expression decreased in treated groups, while COLIIIAI did not change. Collagen volume fraction decreased in all treated groups, which shows that the treatment was efficient to decrease the cardiac collagen. Heart/BW decreased 7-11% in SHR14B and SHR14A and there were an increase in dCMO in all treated groups, that shows that cardiac remodeling of treated SHR included an increase in size of CMO and a decrease in cardiac fibrosis Our data suggests that there is a beneficial cardiac remodeling after treatment with miRNA-29c, which opens perspective for further investigation of antifibrotic therapies for cardiovascular disease

O melanoma é um dos tipos de câncer de pele cuja frequência tem crescido nos últimos anos e apresentado elevada taxa de mortalidade, apesar de ter reduzida prevalência. Mesmo havendo um considerável avanço nas propostas terapêuticas nos últimos anos, ainda se vê necessário o desenvolvimento de novas abordagens, sendo a terapia gênica uma promissora possibilidade para tal. Utilizando vetores adenovirais com promotor responsivo à p53 (PGTx beta) para a transferência gênica de p19Arf (proteína supressora de tumor) e interferon-beta (citocina imunomodulatória) em células de melanoma murino com o gene Trp53 selvagem, o nosso grupo demonstrou previamente que a combinação dos dois genes, mas não o tratamento individual, promove efeito citotóxico sinérgico com a liberação de marcadores de morte imunogênica, in vitro; e significativa redução da progressão tumoral acompanhada de uma forte resposta imunológica de linfócitos T CD4+ e CD8+, células NK e neutrófilos contra desafios tumorais, in vivo. Porém, como a translação para modelos de melanomas humanos ainda estava em estágio inicial, ainda não haviam sido confirmamos se esses benefícios também seriam recapitulados. Observações inicias sugeriam que apenas a transferência gênica de interferon-beta seja suficiente para induzir morte celular em linhagens humanas portadoras de TP53 selvagem, sem ainda terem sido identificado o efeito da transferência de p14ARF e nem a necessidade de p53 endógeno para a resposta. Dessa forma, o presente projeto buscou avaliar os efeitos antitumorais provocados pela terapia gênica combinada de p14ARF e interferon-beta em modelos de melanoma humano utilizando linhagens com e sem a via da p53 integra. Para isso, foram utilizadas diferentes linhagens celulares com TP53 selvagem ou com distintas mutações e também foram construídos vetores adenovirais com o promotor constitutivo CMV, tornando assim possível a expressão dos transgenes de maneira independente do status do TP53 endógeno. O presente trabalho revelou que a transferência combinada do interferon-beta e p14ARF revelou vantagem quanto ao estímulo citotóxico e regulação negativa na dinâmica da população em ambas as linhagens UACC-62 e SK-Mel-29, independentemente do estado da via da p53. Na avaliação dos mecanismos de morte foi observado que ambas a linhagens apresentaram marcação positiva para marcadores da via da apoptose, porém com possível participação de outras modalidades de morte-celular, como a necrose, para a linhagem com o TP53 mutado (SK-Mel-29). Além disso, mostramos que os tratamentos potencialmente induzem vias de morte com caráter imunogênico pela secreção de ATP e exposição da calreticulina, sendo este último marcador mais significantemente observado mediante o tratamento combinado. Assim, recapitulamos o benefício observado em modelo murino para a transferência gênica do interferon-beta e p14ARF em modelo de melanoma humano, e investigamos marcadores importantes à translação da proposta terapêutica para o melanoma / Melanoma is one of the types of skin cancer whose frequency has grown in the last years and presents a high mortality rate, despite its low prevalence. Although there has been considerable progress in therapeutic proposals in recent years, it is still necessary to develop new approaches, being gene therapy a promising possibility for this. With the use of adenoviral vectors with a p53 responsive promoter (PGTx beta) for the gene transfer of p19Arf (tumor suppressor protein) and interferon-beta (immunomodulatory cytokine) in murine melanoma cells bearing wild-type Trp53 gene, our group previously demonstrated that the combination of the two genes, but not individual treatment, promotes a synergistic cytotoxic effect with the release of immunogenic death markers in vitro; and significant reduction of tumor progression with a strong immune response mediated by CD4+ and CD8+ T lymphocytes, NK cells and neutrophils in tumor challenges in vivo. However, as the translation for human melanoma models was still at an early stage, it still was not possible to confirm whether these benefits would also be recapitulated in a human model. Initial observations suggested that interferon-beta gene transfer is sufficient to induce cell death in wild-type TP53-bearing human melanoma cell lines, with the effect of p14ARF gene transfer and the role for endogenous p53 in this response yet to be investigated. Thus, the present work aimed to evaluate the antitumor effects induced upon the combined gene transfer of p14ARF and interferon-beta in human melanoma cell lines with and without a functional p53 pathway. For this, different cell lines bearing wild-type TP53 or with different mutations were used and adenoviral vectors with the constitutive CMV promoter were also constructed, making possible the expression of the transgenes independently of the endogenous TP53 status. The present work showed that the combined transfer of interferon-beta and p14ARF was advantageous in cytotoxic stimulation and negative regulation in population dynamics for both cell lines UACC-62 and SK-Mel-29, regardless of p53 pathway status. In the evaluation of the triggered cell death mechanisms it was observed that both cell lines presented positive markers of the apoptosis pathway, but with possible participation of other cell death mechanism, such as necrosis, for the mutated TP53 cell line SK-Mel-29. In addition, we showed that the treatments potentially induced cell death pathways with immunogenic features including the secretion of ATP and calreticulin exposure, being the latter marker more significantly presented after the combined treatment. Thus, we recapitulated the benefit observed in murine model for the gene transfer of interferon-beta and p14ARF in the model of human melanoma, and investigated important markers for the translation of the melanoma therapeutic proposal

Introdução: A apneia do sono é condição prevalente e apresenta forte correlação com as principais causas de morbidade e mortalidade na sociedade ocidental. A perda do controle neuromotor proveniente de estágios mais profundos do sono está associada ao colapso faríngeo e a patogênese da apneia obstrutiva do sono (SAOS). A língua é implicada como principal protagonista na patogênese da obstrução das vias aéreas superiores (VAS) durante o sono. Não há farmacoterapia para SAOS. Novas tecnologias moleculares para controle neuronal através da inserção de um receptor de membrana geneticamente modificado, denominado Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs [DREADDs], o qual pode ser ativado por uma droga inicialmente inerte, de alta especificdade, clozapina-n-oxide (CNO). Objetivos: 1) Modificar geneticamente os neurônios motores do núcleo do hipoglosso utilizando-se de DREADDs, o qual permite regular sua atividade; 2) Analisar a atividade do músculo genioglosso sob administração de CNO; 3) Desenvolver abordagens para rastreamento dos músculos protrusores e retratores da língua por marcadores retrógrados, injecção de subunidade B de toxina colérica (CTB-AF) e do vírus de pseudoraiva (PRV) 267 transportando um gene repórter, nos músculos efetores. Métodos: Receptores muscarínicos mutados em um vetor adenoviral associado (AAV) foram infundidos no núcleo do hipoglosso de camundongos via injeção esterotáxica bilateral. Após quatro semanas, período para expressão fenotípica, foram comparadas a atividade eletromiográfica do músculo genioglosso (EMGGG) em resposta a administração de ligante (CNO) versus solução salina. Em um segundo grupo foram realizadas infusões com vírus controle e comparação da EMGGG pré e pós infusão de CNO. Para rastreamento neural a CTB-AF foi injetado nos músculos protusores e retratores da língua e para expressão de Cre o vírus PRV-267 foi injetado no músculo genioglosso. A expressão dessas substâncias no núcleo do hipoglosso foi avaliada através de microscopia de fluorescência. Resultados: Dos dezoito camundongos injetados com DREADDs, dezesseis foram transfectados pelo vetor de AAV. Em camundongos onde o núcleo motor do hipoglosso foi corretamente atingido a EMGGG apresentou importante aumento após a administração de CNO. Em contraste, a atividade do genioglosso não apresentou alteração após a administração de soro fisiológico. Em três camundongos onde a transfecção ultrapassou os limites do núcleo foi observado arritmia respiratória após infusão do ligante. Todos animais infundidos com vírus controle foram adequadamente transfectados mas não apresentaram alteração eletromiográfica após a infusão de CNO. Foram diferenciados no núcleo do hipoglosso os neurônios motores da musculatura retratora e protusora da língua. A expressão intranuclear da enzima Cre-recombinase foi identificada no núcleo hipoglosso. Conclusão: A utilização de métodos quimiogenéticos para ativar grupos selecionados de neurônios motores em áreas cerebrais específicas representa técnica promissora para o estudo do controle neuromotor das VAS. Estes resultados sugerem que a terapia transgênica pode ser eficaz no tratamento da SAOS além de uma vasta gama de patologias que resultam de perturbações no controle neural das VAS. Através da manipulação das fibras musculares efetoras na língua foi possível a identificação do seu respectivo neurônio motor no núcleo do hipoglosso e induzi-lo a sintetizar uma enzima específica (Cre-recombinase) / Introduction: Sleep Apnea is a prevalent condition and strongly correlates with the major causes of morbidity and mortality in Western Society. The loss of motor input from deeper sleep stages is associated with pharyngeal collapsibility and the pathogenesis of obstructive sleep apnea (OSA). The tongue plays a major role in the pathogenesis of upper airway (UA) obstruction during sleep. There is no pharmacotherapy for OSA. New molecular techniques allow to control neuronal function by inserting a genetically modified membrane receptor termed the Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs [DREADDs] which can be activated by a highly specific and otherwise pharmacologically inert drug clozapine-N-oxide (CNO) Objectives: 1) To genetically modify the hypoglossal nucleus motor neurons using DREADDs, which allows to regulate their activity; 2) To analyze the genioglossal activity upon administration of CNO; 3) to develop novel approaches to targeting tongue protruders and retractors by retrograde tracers, cholera toxin subunit B (CTB-AF) and pseudorabies virus (PRV) 267 injection carrying a reporter gene into the effector muscles. Methods: Mutated muscarinic receptors in an adenoviral associated vector (AAV) were delivered to the hypoglossal nucleus via stereotactically bilateral injection. Four weeks after adenoviral delivery (expression period), responses in genioglossal electromyography (EMGGG) activity to intraperitoneal administration of CNO ligand vs. Saline (control) were compared in mice. In a second group, control-virus was infused and genioglossus muscle EMGGG was compared before and after CNO infusion. For neuronal tracing CTB-AF was injected into the protrusor and retractor muscles of the tongue and for Cre induction PRV-267 virus was injected in the genioglossus muscle. Expression of these substances in the hypoglossal nucleus were evaluated by fluorescence histology. Results: Of eighteen DREADDs injected mice, sixteen were transfected with AAV vector. After CNO administration EMGGG activity increased in mice where the hypoglossal motor nucleus was correctly targeted. In contrast, genioglossal activity was not augmented following saline administration. In three mice where transfection surpassed the nucleus limits, breathing arrhythmia was observed following ligand infusion. All animals infused with control virus were adequately transfected but did not present electromyographic change following CNO infusion. The motor neurons of the rectractor and protrusor musculature of the tongue were well differentiated in the hypoglossal nucleus. Intranuclear expression of Cre recombinase enzyme was identified in the hypoglossal nucleus. Conclusion: Utilizing chemogenetic methods to activate motor neuron groups in selected brain areas show promise to UA neuromotor control, and suggest that transgenic therapy may be effective in treating OSA and a wide range of pathologies that result in disturbances of UA neural control. By manipulating the effector muscle fibers of the tongue, it was possible to identify its respective motor neuron in the hypoglossal nucleus and to induce synthesis of a specific enzyme (Cre recombinase)