Les lymphocytes T régulateurs (Tregs) jouent un rôle dans la grossesse précoce, localement dans l'utérus et de façon systémique, dans les organes lymphoïdes secondaires et dans le sang. Dans le tissu utérin, j'ai identifié une nouvelle population de Tregs effecteurs-mémoire résidant dans le tissu (uregTrm). Avant la grossesse, uregTrm ont un profil transcriptionnel et un phénotype unique en réponse au micro-environnement utérin. Au début de la grossesse, les uregTrm prolifèrent et expriment de nouveaux gènes impliqués dans des fonctions trophiques telles que le remodelage de la matrice extracellulaire, l'hypoxie et la vasculogenèse. La fonction trophique d'uregTrm a été comparée aux mécanismes développés par les Tregs dans l’infiltrat tumoral de mélanome. Dans les organes lymphoïdes secondaires et le sang, les Tregs en circulation contribuent à une grossesse réussie en favorisant la tolérance materno-foetale. Nous avons montré que ces Tregs orchestrent la régulation des réponses immunitaires dans l'utérus. En outre, les Tregs agissent en trois étapes. Tout d'abord, uregTrm et les Tregs des ganglions lymphatiques drainants auto-spécifiques contrôlent rapidement une réponse auto-immune qui aurait pu être déclenchée par la libération de débris cellulaires en raison de la prolifération de l'endomètre. Deuxièmement, uregTrm contribuent au besoin de remodelage du tissu utérin pour la placentation. Dans un troisième temps, accompagnant l'augmentation de la masse foetale, les Tregs inductibles aident à contrôler la réponse immunitaire anti-foetale. Ceci met en évidence la spécialisation des Tregs dans les tissus et souligne l’importance des Tregs pendant la grossesse et la pathologie. / Regulatory T cells (Tregs) play a role during early pregnancy locally in the uterus and systemically, in the secondary lymphoid organs and blood. In the uterine tissue, I identified a novel population of tissue-resident effectors-memory regulatory T cells (uregTrm). Before pregnancy, uregTrm have a unique transcriptional profile and phenotype in response to the uterine microenvironment. During early pregnancy, uregTrm expand and express new genes implicated in trophic functions such as extracellular matrix remodeling, hypoxia and vasculogenesis. uregTrm trophic function was compared to the mechanisms developed by Tregs from melanoma tumour infiltrate. In the secondary lymphoid organs and blood, circulating Tregs contribute to successful pregnancy by promoting maternal-fetal tolerance. We showed that these Tregs orchestrate down regulation of immune responses in the early pregnant uterus. Besides, Tregs act in three stages. First, self-specific uregTrm and draining lymph nodes Tregs rapidly contain an autoimmune response that could have been triggered by release of cell debris due to the endometrium tissue high proliferation. Second, uregTrm contribute to the increased need of uterine tissue remodeling for placentation. In a third stage, accompanying the fetal mass increase, inducible Tregs help to control the anti-fetal immune response. This further highlights the specialization of Tregs in tissues and underline the relevance of Tregs during pregnancy and disease.

La gesse commune (Lathyrus sativus L.) est une légumineuse cultivée principalement en Inde, au Bangladesh et en Ethiopie qui présente des niveaux de résistance élevés pour de nombreuses contraintes abiotiques, telles que la sécheresse et l'inondation. Dans ce travail, les capacités de tolérance du Lathyrus (lignées locales "Raipur" et "Bangladesh") à une autre contrainte abiotique, la présence de plomb, ont été déterminées des points de vue physiologique et moléculaire. Un système expérimental de culture hydroponique a été mis au point pour ces plantes. Le plomb y est introduit sous forme de nitrate de plomb (Pb(NO3)2). Les teneurs en plomb des différents organes des plantes (racines, tiges, feuilles) ont été déterminées par ICP-OES. Les réponses cellulaires dans ces organes ont été étudiées par RTPCR quantitative (PCR en temps réel). Des amorces spécifiques du Lathyrus ont été dessinées à partir des 11 séquences d'ADN complémentaires (ADNc) isolées pour la première fois et séquencées. L'un des ADNc isolé est complet et code une cystéine protéase (LsCP, 427 aa). Les autres sont des ADNc partiels et correspondent à une aspartique protéase (LsAP, 270 aa), deux ascorbate peroxidases cytosolique (LsAPXc, 195 aa) et peroxisomale (LsAPXp, 226 aa), une protéine de choc thermique ("Heat Shock Protein 70" ; LsHSP70, 287), une homoglutathion synthétase (LshGSHS, 329 aa), une glutathion S-transférase (LsGST, 66 aa), une glutathion réductase (LsGR, 336 aa), une phytochélatine synthétase (LsPCS, 64 aa), une phospholipase D a (LsPLDa, 288 aa), un transporteur membranaire spécifique du Pb (LsCNGC, 136) et une protéine soluble (LsABCt, 331 aa). Les plantes exposées au nitrate de plomb accumulent de grandes quantités de métal dans leurs racines sous forme de plomb fortement lié aux tissus. L'accumulation d'ARN messagers de la LsPLDa suggère que les racines subissent une contrainte cellulaire et s'y adaptent. La stimulation de l'expression des gènes LsGST, LsGR et LsAPX correspondrait à la formation de complexes Pb-glutathion et à une activation du cycle ascorbate-glutathion pour la neutralisation des espaces activées de l'oxygène (ROS) délétères. Dans les feuilles exemptes de plomb, l'augmentation de l'expression des gènes LsCP, LsAP, LsAPXc, LsAPXp, LsHSP70, LsGR et LsPCS semble indiquer l'émission d'un signal racinaire transmis de manière systémique vers le reste de la plante où il déclenche la sur-expression de ces gènes. Ceci pourrait permettre aux tissus épargnés par le polluant de se préparer à son éventuelle arrivée. La chélation du Pb avec de l'EDTA dans le milieu de culture conduit à son transport vers les parties aériennes et à son accumulation dans les feuilles. L'expression du gène LsCNGC chez ces plantes est activée dans les feuilles, suggérant une participation de ce transporteur à l'entrée des complexes Pb-EDTA dans le symplasme. Comme observé chez d'autres espèces végétales, le plomb affecte le métabolisme du glutathion chez la gesse commune. Cependant, la mise en évidence d'une réaction systémique en réponse au plomb à partir des racines ainsi que la surexpression de gènes d'autolyse sont réalisées pour la première fois et pourraient être des éléments contribuant fortement à la tolérance au plomb chez cette espace végétale sous-utilisée. / Grass pea (Lathyrus sativus L.) is a legume plant cultivated mostly in India, Bangladesh and Ethiopia. It possesses high tolerance levels to abiotic stresses like drought and flooding. In the present work, the tolerance of Lathyrus sativus L. (local lines "Raipur" and "Bangladesh") to another abiotic stress: lead, has been determined, using a physiological and a molecular approach. A hydroponic culture system has been set up. Lead was introduced as lead nitrate (Pb(NO3)2). Lead contents in various plant organs (roots, stems, leaves) were determined using ICP-OES. Cell responses in these organs were studied using real-time RT-PCR. Grass pea-specific primers were designed from the 11 complementary DNA sequences that were isolated and sequenced here for the first time. One of the cDNA is full-length and codes a cystein protease (LsCP). The others are partial cDNA and code an aspartic protease (LsAP, 270 aa), two ascorbate peroxidases, a cytosolic (LsAPXc, 195 aa) and a peroxisomal (LsAPXp, 226 aa), a heat shock protein 70 (LsHSP70, 287), a homoglutathione synthetase (LshGSHS, 329 aa), a glutathione-S-transferase (LsGST, 66 aa), a glutathione reductase (LsGR, 336 aa), a phytochelatin synthetase (LsPCS, 64 aa), a phospholipase D a (LsPLDa, 288 aa), a membrane transporter specific of lead (LsCNGC, 136) and a soluble protein (LsABCt, 331 aa). The plants exposed to lead accumulate large amounts of the metal in their roots only and the metal is tightly bound to the tissues. mRNA accumulation for LsPLDa suggest that root tissues are under stress and coping. The increases in LsGST, LsGR and LsAPX transcripts suggest that Pb-glutathione complexes are formed and that the ascorbate-glutathione cycle is stimulated to scavenge deleterious activated oxygen species, in the root tissues. In lead-free leaves, LsCP, LsAP, LsAPXc, LsAPXp, LsHSP70, LsGR et LsPCS genes are overexpressed. This indicates that a root signal is emitted by these leaded tissues and transported systemically to the rest of the plant where it stimulates the expression of the genes mentioned above. This could be a prevention mechanism to prepare leaf tissues for the possibility of lead spreading. Chelation of lead with EDTA in the growth medium facilitates the transport of the pollutant to the leaves where it accumulates. In these tissues, the LsCNGC is over-expressed suggesting that this transporter is involved in the translocation of the Pb-EDTA complexes into the leaf symplasm. As was observed previously in other plant species, lead affects glutathione metabolism in grass pea. However, the observation of a systemic signal originating from the leaves in response to lead and the over-expression of autolytic genes are reported here for the first time and could be contributing elements to lead tolerance in this under-utilized plant species.

L'incidence des candidoses invasives a considérablement augmenté au cours des dernières décennies, parallèlement à l'augmentation du nombre de patients à risque. Ces pathologies sont associées à une morbi-mortalité élevée. Ce pronostic peut toutefois être amélioré par l'instauration d'un traitement antifongique précoce. Quatre classes de molécules antifongiques sont aujourd’hui disponibles pour la prévention et le traitement des candidoses invasives : échinocandines, antifongiques azolés, polyènes et pyrimidines. Du fait d’une efficacité importante et d’une meilleure tolérance, les échinocandines et les antifongiques azolés sont les plus largement utilisés. L'utilisation massive de ces molécules a conduit à une modification de l'épidémiologie des candidoses invasives, avec l'émergence d'espèces non-albicans intrinsèquement moins sensibles à ces antifongiques, à l'exemple de C. glabrata ou C. parapsilosis. De plus, des souches résistantes voire multi-résistantes aux échinocandines et aux antifongiques azolés sont de plus en plus fréquemment isolées, et associées à des échecs thérapeutiques. L'activité de ces antifongiques est également limitée par le phénomène de tolérance, résultant de la capacité d'adaptation des levures aux stress membranaires et pariétaux induits par ces molécules.Pour toutes ces raisons, l'identification et le développement de nouvelles stratégies antifongiques sont nécessaires. Ce travail de thèse s'inscrit dans cette optique, avec pour objectifs l'étude de la tolérance et de la résistance aux antifongiques chez Candida spp. et la caractérisation de nouvelles cibles thérapeutiques impliquées dans ces processus.La première partie de ce travail a permis de démontrer l'intérêt du séquençage nouvelle génération et d'une approche multigénique pour l'étude des mécanismes impliqués dans la résistance aux antifongiques azolés et aux échinocandines chez Candida spp. Par ce biais, il a été possible d'appréhender de nouveaux mécanismes potentiellement impliqués dans la résistance aux antifongiques, qui nécessitent toutefois d'être confirmés.Dans un deuxième temps, ce travail a permis de mettre en évidence que l'ensemble des protéines de la voie de signalisation du pH ou voie Rim chez les levures est impliqué dans la tolérance aux antifongiques chez C. albicans, l'espèce la plus fréquemment isolée en pathologie humaine. De plus, de nouveaux gènes Rim-dépendants ont été identifiés par RNA-sequencing, à l'exemple de HSP90, codant pour une protéine chaperone responsable de la régulation de multiples processus biologiques, et IPT1, responsable de la biosynthèse du principal sphingolipide membranaire. Ces deux gènes ont précédemment été impliqués dans la tolérance aux antifongiques azolés et aux échinocandines chez C. albicans et pourraient participer à la tolérance aux antifongiques médiée par la voie Rim. Ces résultats ouvrent des perspectives intéressantes : en effet, en ciblant la voie Rim, il pourrait être possible de potentialiser l'activité des molécules antifongiques actuellement commercialisées et de cibler indirectement Hsp90 tout en s'affranchissant des problèmes de toxicité car cette voie de signalisation est spécifique du règne fongique.Enfin, une dernière partie de ce travail réalisée dans le cadre du partenariat de l'ANR FungiBET a permis de montrer que la protéine BET (Bromodomain and Extra-Terminal) Bdf1 de C. glabrata, impliquée dans la régulation épigénétique de la transcription, est essentielle à la croissance in vitro. Plus précisément, l'intégrité des deux bromodomaines BD1 et BD2 de Bdf1, responsables de la liaison de cette protéine aux histones, est essentielle chez cette espèce, qui est la deuxième la plus fréquemment isolée dans les candidoses invasives en Europe et aux Etats-Unis. Ce résultat confirme les premières données obtenues chez C. albicans, et l'intérêt de l'inhibition des protéines BET fongiques comme nouvelle stratégie antifongique / The incidence of invasive candidiasis (IC) has dramatically increased over the past decades, partly due to the increasing number of at-risk patients. IC is associated with high mortality rates: however, its prognosis can be improved by early treatment. Four antifungal classes are available today for the prevention and treatment of IC: echinocandins, azoles, polyenes and pyrimidines. Due to their high efficacy and interesting safety profile, echinocandins and azoles are more commonly used. Massive use of these compounds has led to epidemiological changes in IC, with the emergence of non-albicans species which are intrinsically less susceptible to these antifungals, such as C. glabrata or C. parapsilosis. In addition, Candida spp. strains resistant, or even multiresistant, to azoles and echinocandins are increasingly isolated and associated with therapeutic failures. Antifungal activity is also limited by tolerance, a reversible phenomenon resulting from the yeast's adaptation to membrane and cell wall stresses caused by these molecules.For these reasons, identification and development of new antifungal strategies are needed. This work aimed at studying antifungal resistance and tolerance in Candida spp. and characterizing new therapeutic targets involved in these process.First, this work showed the interest of next-generation sequencing and multigene approaches to study mechanisms involved in resistance to echinocandins and azoles antifungals in Candida spp. It notably allowed to identify new mechanisms involved in antifungal resistance, which still need to be confirmed.In a second part, this work allowed to show that all the proteins of the pH-signaling pathway, known as the Rim pathway in yeasts, are involved in antifungal tolerance in C. albicans, the most frequent species responsible for IC in humans. In addition, new Rim-dependent genes were identified through RNA-sequencing, such as HSP90, coding for a major chaperone involved in the regulation of multiple cellular process, as well as IPT1, responsible for the synthesis of the main membrane sphingolipid.Both genes were previously shown to be involved in azoles and echinocandins tolerance in C. albicans, and could therefore play a role in antifungal tolerance mediated by the Rim pathway. These results offer great perspectives. Indeed, targeting the Rim pathway would allow to enhance the activity of commercially available antifungals and to indirectly target Hsp90, with no or limited toxicity as this signaling pathway is fungal-specific.Thirdly, a last part of this work performed in the context of the ANR FungiBET consortium, allowed to show that the BET protein Bdf1 in C. glabrata, which is involved in epigenetic regulation of transcription, is required for in vitro growth. More precisely, the integrity of both BD1 and BD2 Bdf1 bromodomains are essential in this species, which ranks second among causes of IC. This result confirms the first data obtained in C. albicans and the interest of inhibiting fungal BET proteins as a new antifungal strategy

Les circuits reconfigurables (Field Programmable Gate Arrays - FPGAs) sont largement utilisés dans divers domaines d'application en raison de leur flexibilité, de leur haute densité d'intégration, de leur niveau de performance et du faible coût de développement associé. Toutefois, leur grande sensibilité aux défauts dus aux rayonnements électromagnétiques tels que les "Single Event Effets" (SEE), est un défi qui doit être abordée pendant la conception du système. Ces SEE sont une préoccupation majeure dans la sécurité et pour les systèmes critiques tels que les systèmes de l'automobile et de l'avionique. En général, la plupart des FPGA d'aujourd'hui ne sont pas conçus pour fonctionner dans ces environnements difficiles, sauf pour les circuits spécifiques qui ont été durcies par construction au niveau du processus de fabrication. Ces circuits ont un surcoût très élevé et des performances moindres, ce qui les rend moins intéressant que leur équivalent non protégé. Le projet ARDyT vise à développer une architecture FPGA fiable à faible coût avec une suite d'outils de conception, offrant un environnement complet pour la conception d'un système tolérant aux fautes. Ce travail de thèse présente l'architecture du FPGA ARDyT, qui intègre des stratégies de prises en charge des fautes adaptées aux différents éléments de l'architecture. L'un des principaux objectifs du projet ARDyT est de gérer les changements de valeurs multiples (multi bit upsets (MBUs)) dans le flux binaire de configuration du FPGA. Ces stratégies de tolérance aux fautes pour protéger les ressources logiques et le flux binaire de configuration sont discutées en détail. Une architecture spécifique du bloc logique élémentaire configurable est proposée afin de simplifier la stratégie de prise en compte des fautes dans les ressources logiques. Un nouveau système de correction d'erreur intégrée (3-Dimensional Hamming - 3DH) est proposé pour gérer les MBU dans le flux binaire de configuration. L'ensemble de la stratégie de gestion des fautes est implémenté dans l'architecture au travers d'un manager de la fiabilité centralisée nommée R3M (Run-time Reconfigurable Resource Manager), et d'une suite d'outils adaptée. / Reconfigurable Field Programmable Gate Arrays (FPGAs) are extensively employed in various application domains due to their flexibility, high-density functionality, high performance and low-cost development compared to ASICs (Application Specific Integrated Circuits). However, the challenge that must be tackled during system design is their high susceptibility to the radiation induced faults such as Single Event Effects (SEEs). These radiation induced faults are a major concern in safety and mission critical systems such as automotive and avionics systems. In general, most of today’s COTS FPGAs are not designed to work under these harsh environments, except for specific circuits that have been radiation-hardened at the fabrication process level, but at a very high cost overhead, which makes them less interesting from an economic and performance point of view. The project ARDyT is aimed to develop a low-cost reliable FPGA architecture with supporting EDA tool-suite that offers a complete environment for a fault tolerant system design. This thesis work presents the proposed ARDyT FPGA architecture, which incorporates appropriate fault mitigation strategies at different levels. One of the main objectives of ARDyT project is to handle multi-bit upsets (MBUs) in the configuration bistream. Fault mitigation strategies to protect logic resources and configuration bitstream are discussed in detail. A fault-aware customized configurable logic block architecture is proposed to support logic resource fault mitigation strategy. A new built-in 3-Dimensional Hamming (3DH) error correcting scheme is proposed to handle MBUs in the configuration bitstream. The additional features introduced in this architecture ensure complete reliability with the help of centralized reliability manager named R3M (Run-time Reconfigurable Resource Manager), corresponding tool-suite and increased flexibility in the design.

L’étude des conséquences du réchauffement climatique sur les écosystèmes aquatiques est devenue un enjeu majeur pour la recherche. Nous avons mesuré l’impact de la température des eaux douces et du changement de végétation riparienne associé au climat sur six populations de Gammarus pulex (Amphipode) vivant au nord ou au sud de la vallée du Rhône (France). Ce crustacé, largement répandu dans les eaux douces européennes, est considéré comme une espèce clé pour le fonctionnement des écosystèmes aquatiques, car, en dégradant la litière de feuilles provenant de la ripisylve, il favorise son utilisation par d’autres invertébrés. Nos résultats sur l’effet de la température sur les réserves énergétiques, la consommation d’oxygène et la survie, suggèrent que la fenêtre thermique optimale est décalée de 2-3°C entre les gammares du nord et ceux du sud. L’investissement reproducteur varie saisonnièrement, avec des stratégies différentes selon l’origine des femelles. La provenance des feuilles (méditerranéenne/continentale) influence moins leur conditionnement et la vitesse de décomposition que leur dureté initiale. Une hausse de température accélère le conditionnement et la digestion des feuilles mais influence peu leur dégradation. Nos résultats montrent que des adaptations en bordure d’aire de distribution peuvent modifier la réponse des organismes aquatiques face aux changements climatiques. De plus, un changement de la nature des litières lié au réchauffement pourrait modifier la disponibilitédes ressources trophiques au cours des saisons et ainsi le fonctionnement des écosystèmes. / The study of global warming consequences on aquatic ecosystems has become amajor issue in current scientific research. We measured the impact of water temperature and the climate-related change in riparian vegetation on six populations of Gammarus pulex (Amphipoda) living in the North and in the South of the Rhône River valley (France). This crustacean, widely distributed in European freshwaters, is considered as a key species for the freshwater ecosystems functioning as it degrades the leaf litter from the riparian area, thus favouring its subsequent use by other invertebrates. Our results of temperature effect onenergy stores, oxygen consumption, and survival suggest that the optimal thermal window shifts from 2-3°C between northern and southern gammarids. Females’ investment into reproduction changes through seasons, with different strategies according to their geographical origins. Concerning the functional point of view, the leaf litter origin(Mediterranean/continental) less influences the conditioning of leaves and the decomposition rate than their initial toughness. An increase in water temperature accelerates the conditioning and the enzymatic digestion of leaves (in gammarids guts) but slightly influences their degradation by this crustacean. Our results show that adaptations at the limit of the species geographical distribution area can change the response to climate change in aquatic organisms. Moreover, a change in the type of the leaf litter could modify the availability of trophic resource through seasons and hence the ecosystem functioning.

Chaque année, des centaines de milliers de ressortissants de pays tiers en séjour irrégulier ne peuvent être éloignés de l'Union européenne (UE). L'inéloignabilité de certains étrangers n'est pas toujours transitoire, et nombreuses sont les personnes qui y demeurent pendant des années. Et pourtant, l'inéloignabilité de longue durée ne mène pas forcément à la régularisation du séjour. Je suis intéressé par la manière dont l'UE gère l'inéloignabilité, ainsi que par les raisons pour lesquelles autant de personnes inéloignables se retrouvent dans des limbes juridiques d'exclusion du séjour régulier. Dans une première partie, je conceptualise la nature et les conséquences des divers statuts d'étrangers inéloignables, tels que réglementés par le droit de l'UE. Je propose ainsi une typologie des limbes juridiques entre le séjour irrégulier et régulier. Il existe des limbes de tolérance, d'un côté, et des limbes de séjour régulier non-Reconnu, de l'autre. Je me consacre principalement aux limbes de tolérance. Dans une deuxième partie, j'examine la manière dont l'UE a gouverné ces limbes juridiques, notamment son impact sur le lien dans ses États membres entre divers types d'obstacles à l'éloignement, d'un côté, et les statuts de tolérance, de l'autre. Dans une troisième partie, j'analyse les fonctions attribuées aux limbes de tolérance par des acteurs institutionnels de l’UE. Je soutiens que les statuts de tolérance peuvent se voir attribuer des fonctions de rétribution, de dissuasion, d'éloignabilité, de spectacle étatique, de sélection, et de réduction des dépenses publiques. / Hundreds of thousands of illegally staying third country nationals (TCN) cannot be removed from EU Member States despite the issue of return measures against them. Illegally staying TCNs may not be removable as a result of legal, policy, or practical obstacles to removal. Non-Removability is not always temporary and can in many cases last a very long time. And yet protracted non-Removability does not necessarily lead to regularisation of status. I am interested in how the EU has managed non-Removability and why so many non-Removable persons have been left in a limbo of exclusion from legal residence. In Part I, I provide a conceptual framework for understanding the nature and consequences of a variety of positions that non-Removable TCNs may find themselves in. I do so by providing a typology of what I call limbo spaces between illegal and legal stay. There are limbo spaces of toleration, on the one hand, and limbo spaces of unrecognised legal residence, on the other. I mainly focus on toleration. In Part II, I examine how the EU has governed limbo spaces of toleration, namely its important impact on the nexus in Member States between various forms of non-Removability, on the one hand, and limbo spaces of toleration, on the other. In Part III, I analyse the functions of limbo spaces of toleration. I argue that toleration positions can be viewed as sanctions of membership exclusion, and may be perceived by certain EU institutional actors as performing a range of functions akin to administrative detention and imprisonment: retribution, deterrence, enhanced removability, the expressive power of the State, and selection/rehabilitation.

L’objectif de cette thèse a été d’élaborer une stratégie de détoxification la quantité d'un composé intracellulaire en permettant sa sortie hors de la cellule via l'utilisation d'un système d’efflux.L’hôte choisi pour cette étude est un nouvel organisme modèle, Deinococcus geothermalis. Nous avons utilisé les pompes d'efflux comme outils biologique pour permettre la sortie d'un composé devenu toxique en intracellulaire. Pour ce faire, nous avons dans un premier temps inséré par recombinaison homologue une sélection de gènes codant pour des pompes d’efflux hétérologues dans le chromosome de D. geothermalis. Puis la seconde étape a été de déterminé la susceptibilité des recombinants obtenus vis à vis de composés à forte valeur ajoutée. Un certain nombre de recombinants présentant une résistance plus élevée que la souche sauvage à plusieurs composés ont alors été sélectionnés. L'étape suivante a été de vérifier que le gain de résistance observé était effectivement dû à l’insertion dans l’enveloppe bactérienne d’une pompe d’efflux fonctionnelle. Pour ce faire, des tests d’efflux employant un marqueur fluorescent, le composé Hoechst 33342 ou avec un antibiotique fluorescent ont été réalisés. Nous avons réussi à obtenir la preuve de concept qu' un gène codant pour une pompe d'efflux hétérologue pouvait conduire à l'expression d'une protéine fonctionnelle chez D. geothermalis et cette protéine membranaire permettait la diminution la quantité intracellulaire d'un composé donné. / The objective of this thesis was to develop a strategy for detoxifying the amount of an intracellular compound by allowing its exit from the cell through the use of an efflux system.The host chosen for this study is a new model organism, Deinococcus geothermalis. We used efflux pumps as biological tools to allow the release of a compound that became toxic intracellularly. To do this, we first inserted by homologous recombination a selection of genes encoding heterologous efflux pumps into the D. geothermalis chromosome. Then the second step was to determine the susceptibility of the recombinants obtained to high value-added compounds. A number of recombinants with higher resistance than the wild multi-compound strain were then selected. The next step was to verify that the observed resistance gain was indeed due to the insertion of a functional efflux pump into the bacterial shell. To do this, efflux tests using a fluorescent marker, Hoechst compound 33342 or with a fluorescent antibiotic were performed. We were able to obtain proof of concept that a gene encoding a heterologous efflux pump could lead to the expression of a functional protein in D. geothermalis and that this membrane protein allowed the intracellular amount of a given compound to be decreased.

Des populations tolérante (métallicole: M) et sensible (non-métallicole: NM) d’Agrostis capillaris L. ont été exposées à des doses croissantes de Cu (1-50 μM) pour étudier la tolérance au Cu par une approche pluridisciplinaire. Selon les paramètres phénotypiques (biomasse, longueur des feuilles et symptômes visuels), les plantes M ont une meilleure croissance aux expositions supérieures à 10 μM Cu. Les concentrations en Cu des tissus reflètent une rétention racinaire (phénotype d’exclusion) et une réduction de la translocation vers les feuilles quand le stress augmente. En excès de Cu, le protéome soluble racinaire présente des altérations du métabolisme énergétique chez M et NM, plus marquées chez NM (glycolyse, cycle de Krebs /phosphorylation oxydative). Le protéome foliaire indique des impacts sur les phases claires et obscures de la photosynthèse chez M et NM, et un besoin plus important en acides aminés soufrés (augmentation des cystéine et méthionine synthases). Chez NM, l’augmentation d’enzymes de la glycolyse, de la voie des pentoses phosphates et du cycle de Calvin indiquent un besoin énergétique accru, tandis que la stimulation des chaperonnes et des processus de synthèse protéique suggère des impacts sur le métabolisme des protéines et celle des enzymes redox un stress oxydatif plus fort. Plusieurs protéines, surexprimées ou accumulées, interviendraient dans la tolérance au Cu chez M, en protégeant le métabolisme des protéines (HSP70, racines et feuilles) et en augmentant les mécanismes anti-oxydants (ascorbate péroxydases), de détoxification (GST et aldéhyde déshydrogénase) et de protéolyse (peptidase et protéasomes, racines). / Cu-tolerant (metallicolous: M) and sensitive (non-metallicolous: NM) populations of Agrostis capillaris L. were exposed to increasing Cu concentrations (1-50 μM) to investigate Cu tolerance by a pluridisciplinary approach. Phenotypic parameters (biomass production, shoot length, and visual symptoms) indicated a higher growth and a better fitness of M plants over 10 μM Cu. Plant Cu concentrations indicated root Cu retention (‘excluder’ phenotype) and a reduced root-to-shoot translocation with increasing Cu stress. Based on root soluble proteome energy metabolism was altered by Cu excess in both populations with stronger impacts in NM (glycolysis, Krebs cycle/oxidative phosphorylation). Changes in shoot proteome showed impacts on both light dependent and independent photosynthesis phases in both populations, and an enhanced need in S-containing amino-acids (up-regulation of cysteine/methionine synthases). In NM leaves, increase of enzymes involved in glycolysis, pentose phosphate pathway and Calvin cycle indicated a stimulation of energy metabolism, while enhanced protein synthesis processes and protein chaperones suggested impacts on protein metabolism and increase of redox enzymes indicated a higher oxidative stress. Several over-expressed or accumulated proteins may be pivotal for Cu tolerance in M plants, for protecting protein metabolism (Heat shock protein 70kDa, roots and leaves), increasing anti-oxidative (ascorbate peroxidases, roots) – detoxification (Glutathione S-transferase and aldehyde dehydrogenase, roots) and proteolysis (peptidase and proteasome subunits) processes.

La thérapie génique peut être définie comme le transfert du gène thérapeutique dans le tissue d’intérêt à l’aide d’un vecteur. A ce jour, les vecteurs dérivés du virus adéno-associés (AAV) représentent les vecteurs de choix pour le transfert de gène in vivo. Cependant, les réponses immunitaires dirigées contre la capside AAV représentent l’obstacle majeur à l’efficacité du transfert de gène médié par le vecteur AAV. Ce travail de thèse a eu pour objectifs de prévenir et d’inhiber la réponse humorale dirigée contre le vecteur AAV. En administrant des nanoparticules contenant de la rapamycine (ou SVP[Rapa]) avec le vecteur AAV, nous avons démontré une inhibition spécifique des réponses humorale et cellulaire dirigées contre la capside AAV. De plus, cette stratégie nous a permis de re-administrer efficacement le vecteur AAV dans des modèles murins et chez le singe. Nos données ont aussi démontré l’élimination des anticorps préexistants dirigés contre le vecteur AAV en administrant SVP[Rapa] avec le bortezomib. Au cours de travail de thèse, nous avons aussi développée et testée l’efficacité des vecteurs AAV associés aux vésicules extracellulaires (vecteurs exo-AAV) à améliorer l’efficacité des vecteurs AAV. En utilisant les vecteurs exo-AAV, nous avons démontré une expression stable et durable du transgène. De plus, les vecteurs exo-AAV ont montré une résistance aux anticorps neutralisants préexistants. Ainsi, au cours de ce projet de thèse des stratégies efficaces ont été développées afin de prévenir et de contrôler les réponses immunitaires dirigés contre le vecteur AAV, permettant ainsi une re-administration efficace du vecteur AAV. / Gene therapy aims to achieve sustained expression of the therapeutic transgene by the introduction of vector cargo into target tissue. To date, viral vectors based on adeno-associated virus (AAV) represent the leading gene delivery tools in vivo. However, immune responses against AAV vector represent the biggest challenge for the widespread use of AAV-based products. In this PhD project, we aimed at the inhibition and prevention of humoral immune responses to AAV capsid. Using nanoparticles containing rapamycin (SVP[Rapa]) given at the time of vector administration, we demonstrated complete abrogation of anti-capsid humoral and cellular immune responses in antigen-specific manner. Using this strategy, we further demonstrated successful vector re-administration in murine models and in non-human primates. Our data also demonstrated elimination of pre-existing antibodies to AAV vector using a combination of SVP[Rapa] and bortezomib. In this PhD thesis project, we also developed and tested the ability of AAV vectors associated with extracellular vesicles (exo-AAV vectors) to enhance AAV vector potency. Using exo-AAV vectors, we demonstrated higher and sustained transgene expression at low vector doses. Exo-AAV vectors also exhibited resistance to neutralization by pre-existing anti-capsid neutralizing antibodies. Thus in this PhD project, powerful strategies have been developed to prevent and control immune responses against AAV vectors, enabling successful AAV vector re-administration.

Ce document présente les travaux de recherche que j'ai menés sur la problématique de la tolérance aux fautes dans les architectures et systèmes distribués entre 1987 et 1998. Comment concilier efficacité et tolérance aux fautes dans des systèmes construits à partir de composants standard tout en assurant la transparence de la tolérance aux fautes pour les applications ? Cette problématique a été abordée dans le contexte de la conception du système distribué Gothic, d'une architecture multiprocesseur à mémoire partagée tolérante aux fautes, d'une architecture multiprocesseur à mémoire partagée extensible (COMA) à haute disponibilité puis d'un système de mémoire partagée répartie. Le document présente ma démarche dans la conduite de ces travaux, les résultats obtenus et leur validation expérimentale.