Made available in DSpace on 2015-04-09T12:28:05Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-27Bitstream added on 2015-04-09T12:48:25Z : No. of bitstreams: 1 000817619.pdf: 1071654 bytes, checksum: ea5ed62894b9a1e43e3eac685a926413 (MD5) / A ORF XAC1201 de Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) codifica uma proteína hipotética que, quando nocauteada por inserção de transposon, leva a alterações na patogenicidade da bactéria em citros. A ORF possui 819 pb e codifica a proteína XAC1201 que possui uma massa molecular de 29,1 kDa. A região codificadora foi clonada no vetor de expressão pET SUMO e a proteína de fusão His-SUMO-XAC1201 foi expressa na Escherichia coli linhagem BL21(DE3) pLysS. A melhor condição para expressão da proteína na forma solúvel foi a 28ºC e 250 rpm por 4h na presença de 0,2 mM IPTG. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados (IMAC) em coluna de Ni2+-Sepharose e a proteína de não fusão foi obtida após digestão com SUMO protease e nova cromatografia em coluna de Ni2+-Sepharose. O rendimento final do processo foi de 3,18% da proteína total, tendo a proteína recombinante nativa sido isolada com alto grau de pureza e na forma nativa. A identidade de XAC1201 recombinante foi confirmada pelas análises de espectrometria de massas, com mais de 80% de cobertura da sequência. Foram realizados testes enzimáticos para verificar as prováveis atividades de fosfohidrolase e histidina quinase, porém, estes testes não foram conclusivos. A análise de frequência e diversidade da ORF XAC1201 em bancos de dados sugere que se trata de uma proteína ubíqua e com função ancestral, presente em diversos filos dentro do Domínio Bacteria. A obtenção desta proteína na forma pura, solúvel e nativa é o primeiro passo para os estudos de caracterização da sua função e, devido à presença de alta identidade desta sequência com muitos outros grupos bacterianos, a elucidação da função desta proteína será de grande interesse, não apenas para Xac, como também para outros microrganismos / The ORF XAC1201 of Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) encodes a hypothetical protein and when knocked out by transposon insertion leds to changes in the pathogenicity of the bacterium in citrus. The ORF XAC1201 has 819 bp and encodes a protein with a molecular mass of 29.1 kDa. The coding region was cloned into the expression vector pET SUMO and His-SUMO-XAC1201 fusion protein was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS strain. The best condition for protein expression in soluble form was 28°C and 250 rpm for 4 hours in the presence of 0.2 mM IPTG. Purification was performed by immobilized metal ions affinity chromatography (IMAC) on a Ni2+-Sepharose column and the non-fusion protein was obtained after digestion with SUMO protease and new chromatography on Ni2+-Sepharose column. The final process yield was 3.18% of the total protein, and the protein was obtained highly pure and in the native form. The identity of the purified protein was confirmed by mass spectrometry analysis with sequence coverage above 80%. Enzymatic assays were made to verify phosphohydrolases and histidine kinase activities, however, the results are inconclusive. It is suggested that XAC1201 is a ubiquitous protein and plays an ancestral role, since it is found in several Phyla within the Bacteria Domain. Obtaining this protein in pure, soluble and native form is the first step towards characterization studies of its function. Since this protein is present not only in Xac but has a ubiquitous presence in many other bacterial groups, the understanding of its function is of great interest to many areas

Resumo: A citricultura vem sendo constantemente ameaçada pela bactéria gram negativa Xanthomonas axonopodis pv. Gitri (Xac-A) , causadora do cancro cítrico. Esta bactéria, quando em contato com uma planta hospedeira, lesiona folhas, frutos e ramos. Por outro lado, quando este patógeno infecta uma planta não-hospedeira provoca uma reação necrótica no sítio de infecção (reação de hipersensibilidade). Os diversos mecanismos de defesa da planta ao ataque do patógeno, incluem aqueles mediados por genes codificadores da produção de ácido salicílico, ácido jasmônico, fitoalexinas, proteínas PR, dentre outros. Neste trabalho investigou-se a expressão dos genes codificadores de Fenilalanina amônia liase (FAL), Aleno oxido sintase (AOS), Chalcona sintase (CHS) e J3-1,3-glucanase (PR-2) na interação Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii C (Xaa-C)::Citrus (resposta de resistência) e o comportamento dos mesmos na interação Xac-A::Citrus (cancro cítrico). Folhas de laranjeira (Citrus sinensis) inoculadas com suspensões bacterianas (Xac-A ou Xaa-C) foram coletadas em diferentes tempos de infecção. A expressão dos genes foi analisada por Northern blot com a ajuda de sondas específicas de C. sinensis obtidas via amplificação por PCR, com a utilização de oligonucleotídeos específicos dos genes em questão e DNA genômico de folhas de laranjeira. Os genes fal, aos, chs e pr-2 foram expressos mais intensamente na interação Xaa-C:Citrus onde uma reação de resistência não-hospedeira é capaz de evitar o desenvolvimento de sintomas de cancro, quando comparados com a interação Xac-A:Citrus que leva ao cancro cítrico. / Abstract: The production of citrus fruits has being constantly threatened by the gram negative bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac-A) , the citrus canker disease agent. This bacterium, when in contact with host plants, induce canker lesions on leaves, fruits and branches. On the other hand, when this pathogen infects a non-host plant a necrotic reaction is induced at the infection site as a hypersensitive-like reaction. Plant defense mechanisms to pathogen attack include induction of genes coding to salicylic acid, jasmonic acid, phytoalexines and PR proteins. The expression of resistance related genes phenylalanine ammonia Iyase (PAL), aliene oxide syntase (AOS), chalcone syntase (CHS) and 13-1,3-glucanase (PR-2) were investigated on the Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii C (Xaa-C)::Citrus sinensis interaction (resistance response) or on Xanthomonas axonopodis pv. citri estirpe A (Xac-A)::Citrus sinensis (citric canker) interaction. Orange leaves inoculated with bacterial suspensions (Xac-A or Xaa-C) were collected at different moments during infection. Resistance related gene expression was analyzed by Northern blot with the aid of citrus probes obtained by PCR amplification using specific oligonucleotides and orange leaves genomic DNA. The resistance related genes paI, aos, chs and pr-2 have shown a more intense expression on the (Xaa-C)::Citrus interaction which induce non-host resistance response, when compared to the citrus canker Xac-A::Citrus inducing interaction. / Orientador: Julio Cezar Franco de Oliveira / Coorientador: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: Poliana Fernanda Giachetto / Mestre

Resumo: A bactéria fitopatogênica Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) é o agente causal do cancro cítrico, responsável por perdas significativas na citricultura nacional e mundial. Com a finalidade de se obter um primeiro mapa proteômico de referência da Xac, as bactérias foram cultivadas em dois meios não indutores de virulência (meios CN e TS8), e as proteínas foram digeridas com tripsina e analisadas pela tecnologia de MudPIT (Tecnologia de Identificação Multidimensional de Proteínas). Trinta e nove por cento de todas as proteínas preditas pelo genoma da Xac foram identificadas através de seus peptídeos, e estão distribuídas em todas as categorias funcionais. Além disso, 25% das proteínas designadas como hipotéticas conservadas do genoma foram identificadas. Outro objetivo deste trabalho foi analisar o perfil de expressão protéico durante a patogênese decorrente do contato Xac::citros. Para isso, Xac em condição infectante foi cultivada em meio indutor de virulência XAM1 por 24 h, ou recuperadas de folhas de laranjeiras inoculadas após 3 ou 5 dias de infecção, tendo como referência a Xac cultivada em meio CN. A tecnologia 20 + MS detectou 228 proteínas diferencialmente expressas em condição infectante, e a tecnologia MudPIT identificou 1.679 proteínas de Xac. Um total de 57 proteínas diferenciais [17 (20 + MS) + 40 (MudPIT)] associadas à patogenicidade e virulência, na interação Xac::citros são discutidas neste trabalho, destacando-se proteínas do Sistema de Secreção Tipo 111 (SSTT), 11 (SSTO) e IV (SSTO), efetoras do SSTT, proteínas relacionadas a estresse, goma xantana, carência nutricional, entre outras. / Abstract: The phytopathogenic bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) is the causal agent of the citrus canker disease, which responds for important losses in national and worldwide citriculture. In arder to obtain the first proteomic reference map of Xac, the bacterium was grown on two non-inductive media for bacterial virulence (CN and TSB media) and proteins were proteolysed with trypsin and analyzed by MudPIT technology (Multidimensional Protein Identification Technology). Thirty nine per cent of ali predicted proteins from Xac genome were identified with their component peptides as belonging to ali functional categories. Besides, 25% of proteins described as conserved hypothetical in Xac's genome were identified. Another aim of this study was to analyze the proteome profile during Xac::citrus pathogenesis. For this reason, infecting Xac was grown in XAM1 virulence inductive medium for 24 h, or recovered from infected citrus leaves at 3 or 5 days of infection, taking Xac grown on CN medium as reference. The 20 + MS technology has detected 228 differentially expressed proteins in infecting conditional, and MudPIT technology identified 1679 Xac proteins. A total of 57 differential proteins [17 (20 + MS) + 40 (MudPIT)] related to pathogenicity and virulence during Xac::citrus interaction are discussed in this study, emphasizing proteins of type 111 (SSTT), 11 (SSTO) and IV (SSTQ) secretion system, effectors of SSTT, proteins related to stress, xanthan gum, starvation, among others. / Orientador: Maria Inês Tiraboschi Ferro / Coorientador: Julio Cezar Franco de Oliveira / Banca: Haroldo Alves Pereira Júnior / Banca: Márcia Regina Soares da Silva / Banca: Manoel Victor Franco Lemos / Banca: João Martins Pizauro Júnior / Doutor

Resumo: O cancro cítrico é uma doença de importância mundial para o cultivo de laranjas e seu agente causador é a bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri. Embora todos os genes presentes nessa bactéria já tenham sido sequenciados, grande parte destas sequências não apresenta qualquer informação experimental sobre a contribuição para o sucesso da instalação do patógeno na planta hospedeira. Por outro lado, torna-se cada vez mais evidente que várias bactérias fitopatogênicas utilizam mecanismos de adaptação de origem genética que podem induzir efeitos fisiológicos na planta e adequar o ambiente de tal forma que permita a ocorrência da doença. Dentre estes mecanismos, está a possibilidade da bactéria produzir substâncias que se assemelhem a hormônios vegetais, como a auxina (AIA). O objetivo deste trabalho foi desenvolver metodologia genômica de busca para investigar se há genes que codificam para a produção de compostos iguais ou semelhantes a este hormônio em X. axonopodis pv. citri e se a sua participação no processo de patogênese é fundamental para o sucesso da infecção. Para tal, foi produzida coleção de mutantes genéticos funcionais aleatoriamente em X. axonopodis pv. citri, com posterior submissão desta mesma coleção a teste de produção de auxina utilizando o reagente Salkowski. Após produção e análise de grupo de mutantes dirigidos e coleção de aproximadamente 14200 mutantes aleatórios não foi detectada linhagem defectiva para a produção de AIA ou composto semelhante. Os resultados obtidos neste estudo, no entanto, mostram que a biossíntese do composto em X. axonopodis pv. citri é dependente do triptofano e que existe uma concentração ótima deste aminoácido a ser adicionado no meio de cultura para que a bactéria realize a biossíntese. Este é o primeiro estudo... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The citrus canker is a disease of global significance for the cultivation of oranges and its causative agent is the bacterium Xanthomonas axonopodis pv. citri. Although all the genes present in this bacterium have been sequenced, most of these sequences have no experimental information regarding the contribution to the successful installation of the pathogen on the host plant. On the other hand, it has been clearly demonstrated that several pathogenic bacteria use adaptative mechanisms that can induce physiological effects in plants and adjust the environment in a way that allows the occurrence of the disease. Among these mechanisms there is the possibility the bacteria produce substances that are similar to plant hormones such as auxin (IAA). The objective of this study was to develop a screening methodology to investigate the presence of genes that code for a compound identical or similar to auxins in X. axonopodis pv. citri as well as if it plays a role during the pathogenesis process. The main goal of this study was to produce a collection of random and directed genetic mutant strains of X. axonopodis pv. citri for the screening of auxin production by using the Salkowski reagent. After production and analysis of the group of mutants, including a collection of approximately 14,200 random mutant strains, defective production of IAA or similar compound was not detected. On the other hand, the results of this study show that such compound mimics effects of hormonal properties in X. axonopodis pv. citri and is dependent of tryptophan. In addition, it is shown that there is an optimum concentration of this amino acid to be added in the culture medium for the bacteria to carry out biosynthesis. To our knowledge, this is the first study to investigate systematically the production of auxin-like compounds in Xanthomonas axonopodis pv. citri. / Orientador: Alexandre Morais do Amaral / Coorientador: Henrique Ferreira / Banca: Nelson Wulff / Banca: Dario Abel Palmieri / Mestre

Orientador: Edson Luis Furtado / Banca: Marli Teixiera de Almeida Minhoni / Banca: Celso Garcia Auer / Resumo: O termo cancro é utilizado para designar lesões localizadas na casca do caule de plantas lenhosas que podem resultar no anelamento do caule e no secamento da parte superior da copa e a morte da planta. A melhor opção para o controle da doença é a resistência genética dos indivíduos quanto ao patógeno utilizado. Com o objetivo de estudar o comportamento de resistência e mecanismos moleculares de clones dos parentais e das progênies de eucalipto quanto ao cancro causado por Chrysoporthe cubensis e Botryosphaeria sp. foram executados ensaios em casa de vegetação e em campo. Os isolados utilizados foram Chrysoporthe cubensis e Botryosphaeria sp. sendo produzidos em meio BDA e inoculados nos indivíduos pelo método do disco. A avaliação foi realizada 60 dias após a inoculação, medindo a área da lesão de cada material. Para o patógeno C. cubensis inoculados nos parentais foi encontrado uma média de 3,20 e 6,14 cm2 de área de lesão do tronco causado pelos isolados provenientes de Piracicaba e Bofete, respectivamente, enquanto que para Botryosphaeria sp. a média variou de 7,29 cm ² a 9,72cm ² da área da lesão. Dos indivíduos testados, com C. cubensis, foram encontrados 46,66% de plantas classificadas como resistentes; 6,67% plantas moderadamente resistente, 13,33% planta moderadamente suscetíveis e 33,34% plantas suscetíveis. Já para o teste de clones com Botryosphaeria sp. verificou-se 91,67% resistentes, 5% moderadamente resistentes, 1,67% moderadamente suscetível e 1,67% suscetíveis. As variâncias fenotípicas encontradas foram de 41,32 a 0,23 inoculados com C. cubensis e 0,285 a 156,88, quando inoculados com Bothyosphaeria sp. Os coeficientes de variação foram de 125% a 15,05% para C. cubensis e 29,86% a 101,13% para Bothyosphaeria sp. Os resultados indicam que os materiais genéticos testados possuem boa fonte de resistência para os dois fitopatógenos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The term canker is used to assign to injuries located in the bark of stems of woody plants that can result in the anelamento of stems and drying of the superior part of the crown and the death of the plant. The best option for the control of the illness is the resistance genetic of the individuals concerning to the used patógeno. The objective of this study the molecular behavior of resistance and mechanisms of clonals of parental and the lineages the eucalyptus concerning the canker caused for Chrysoporthe cubensis and Dothiorella sp. The essays executed in the greenhouse and field. The isolated ones used concerning Chrysoporthe cubensis and Dothiorella sp. being produced in inoculated medium BDA and in the individuals for the method of the disk. The evaluation was concluded 60 days after the inoculation, measuring the area of the injury of each material. For pathogeno C. cubensis inoculated in the parental ones a 6,14 was found average of 3,20 and cm² of area of isolated injury of the trunk caused for the proceeding ones from Piracicaba and Bofete, respectively. The average of the area of the injury for the studied lineages varied of 7,29 cm ² 9,72cm ² for Dothiorella sp. The clonals inoculated C. cubensis were grouped into the categories HS (highly susceptible - 33,34%), MS (moderately susceptible -13,3%), MR (moderately resistant- 6,67%), and HR (highly resistant -46,66%). The clonal tested, with Botryosphaeria sp., verified resistant 91.67%, 5% moderately resistant, 1.67% moderately susceptible and 5,26% susceptible. The phenotypic variation found was from 41,32 to 0,23, inoculated with C. cubensis while Botryosphaeria sp from 0,285 to156,88. The coefficient of variation from 125% to 15,95% for C. cubensis and 29,86% to 101,13% for Botryosphaeria sp. The results indicate that the tested genetic materials possess good source of resistance for the two fitopatógenos tested... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Título original: Uso do galato de hexila como defensivo agrícola no controle da bactéria causadora do cancro cítrico / Orientador: Henrique Ferreira / Banca: Franklin Behlau / Banca: Daiane Cristina Sass / Resumo: A cultura de citros é uma das mais importantes do Brasil, sendo a citricultura brasileira a maior do mundo; ainda assim, a produção nacional sofre com pragas e doenças, como cancro cítrico, que afetam sua produtividade. O cancro cítrico é causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) e tem sido controlado com o uso de estratégias integradas como a eliminação de plantas contaminadas e pulverização de bactericidas cúpricos. O uso de compostos à base de cobre, porém, representa um risco ambiental devido à sua toxicidade e efeito cumulativo, fazendo necessária a investigação de outros compostos com potencial no tratamento fitossanitário contra a doença. Neste estudo avaliamos a atividade bactericida do galato de hexila contra Xac, seu potencial protetivo e curativo no combate ao cancro cítrico, sua fitotoxicidade e predisposição em induzir resistência bacteriana. O composto provocou retardo e diminuição no crescimento populacional de Xac e inibição de seu crescimento in vitro, levando à morte total da população na concentração de 100μg⋅mL-1. A bactéria não foi capaz de desenvolver resistência a Gal-6 ao longo de 31 dias e exibiu taxa de mutantes naturalmente resistentes ao composto menor que 1⋅10-6 para a concentração de 50μg⋅mL-1. A capacidade de germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas de rúcula e tomate não foi alterada por Gal-6. A aspersão de galato de hexila em plantas de laranja doce inoculadas com Xac reduziu em até 35% a incidência de sintomas d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Citrus culture is one of the most important agricultural activities in Brazil, being the country also the biggest producer in the world; nevertheless, this business struggles with pests and diseases, as citrus canker, that affects its profitability. Citrus canker is caused by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac) and is controlled by using integrated strategies such as elimination of contaminated plants and spraying of cupric bactericides. Using products with copper, however, brings an environmental risk, given 8 its toxicity and cumulative effect, making necessary the research of other compounds with potential to be used as a resource in the phytosanitary treatment against the disease. We evaluated hexyl galate's (Gal-6) bactericidal activity versus Xac and its potential in the preventive and curative treatments against the disease, also Gal-6 phytotoxicity and likeliness to induce bacterial resistance. The compound caused delay and decrease in Xac population growth and in vitro growth inhibition, leading to the total death of the population when at 100 μg⋅mL-1. The bacterium was not able to develop resistance to Gal-6 over 31 days and exhibited a rate of naturally-resistant mutants to the compound of less than 1⋅10-6 at the concentration of 50μg⋅mL-1. Seed germination and seedling development of arugula and tomato were not altered by Gal- 6. Spraying orange plants infected by Xac with hexyl gallate reduced the incidence of citrus canker symptoms by up to 35% an... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O objetivo deste trabalho foi o de avaliar o desenvolvimento de portaenxertos de citros Poncirus trifoliata, índices de ataque de cancro cítrico causado por Xanthomonas axonopodis pv. citri e controle dessa doença com pulverizações cúpricas em dois viveiros, um convencional e outro orgânico, artificialmente inoculados, no Centro de Formação da EMATER, situado no município de Montenegro/RS, no Estado do Rio Grande do Sul. Para controle do cancro cítrico foram testadas pulverizações cúpricas em diferentes concentrações e freqüências utilizando-se calda bordalesa no viveiro orgânico e oxicloreto de cobre no viveiro convencional. Foram avaliados: o crescimento do diâmetro do caule dos portaenxertos; a produção de matéria seca da parte aérea e a contagem do número de lesões de cancro cítrico presentes em folhas e ramos. Com os dados obtidos foi possível verificar que os tratamentos cúpricos não controlaram o cancro cítrico; ambos os viveiros, convencional e orgânico proporcionaram desenvolvimento semelhante aos porta-enxertos; e, com pequenas variações, o cancro cítrico se desenvolveu com igual intensidade nos dois viveiros.

Orientador: Alessandro de Mello Varani / Coorientador: Rafael Marini Ferreira / Banca: Henrique Ferreira / Banca: Daniel Guariz Pinheiro / Resumo: Xanthomonas citri subsp. citri 306 (XccA) é o agente causal do cancro cítrico (CC), doença endêmica que afeta a citricultura. Durante a interação patógeno-hospedeiro o sistema de secreção tipo três (SST3) codificado pela XccA age na translocação de efetores e no estabelecimento da doença. A montagem do aparato de SST3 depende da síntese, remodelagem e degradação da parede celular bacteriana, sendo este processo realizado pela ação enzimática de transglicosilases líticas de mureína (LTs). XccA codifica diversas LTs, porém, pouco é conhecido sobre a diversidade de famílias e relação com a virulência. Dentre as LTs com provável relação com a virulência, duas ORFs parálogas presentes no cromossomo e plasmídeo pXAC64, respectivamente; são genes passageiros do TnXax1, um transposon da família Tn3, relacionado a evolução e emergência da patogenicidade nas Xanthomonadales. Portanto, este estudo objetivou elucidar o provável papel e diversidade das LTs presentes no genoma de XccA, caracterizando funcionalmente as LTs presentes em TnXax1 pela técnica de mutação sítio dirigida. Foram identificadas no genoma de XccA 13 LTs, sendo 12 pertencentes às famílias: 1A, 1B, 1C, 1D, 1F, 1G, 3A, 3B (2 cópias), 5A e 6A, e uma não classificada. A LT não classificada, é exclusiva do gênero Xanthomonas e relacionada à família 3B, porém contém um domínio adicional relacionado ao metabolismo de carboidratos. As LTs classificadas em famílias apresentam provável função relacionada com a remodelagem da par... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Xanthomonas citri subsp. citri 306 (XccA) is a causal agent of type A citrus canker (CC), one of the most devastating citriculture diseases. Type 3 Secretion Systems (T3SS) play a fundamental role in XccA pathogenicity. T3SS components are embedded in the bacterial inner and outer membrane and act as a channel for injection of effector proteins directly into the plant host cell cytosol. T3SS assembly and installation relies on bacterial cell wall synthesis, remodeling and degradation. Murein lytic transglycosylases (LT) are important in this process and are responsible for peptidoglycan cleavage and its remodeling. Information about the XccA LT arsenal is scarce: little is known about family diversity, their exact role and their connection to virulence in this bacterium. Among the LTs with probable relation to virulence, two paralogue ORFs (one in chromosome, one in pXAC64 plasmid) are passenger genes of the Tn3 family transposon TnXax1, known to play a significant role for evolution and emergence of pathogenicity in Xanthomonadales. This study addresses LT diversity in the XccA genome and examines the role of plasmid and chromosomal TnXax1 LT passenger genes using site-directed deletion mutagenesis and functional characterization. We identified 13 XccA LTs: 12 belong to families 1A, 1B, 1C, 1D (2 copies), 1F, 1G, 3A, 3B (2 copies), 5A, 6A and one which is non-categorized. This noncategorized gene, is exclusive to the Xanthomonas genus and related to the 3B family but contain... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:25:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-06-22Bitstream added on 2014-06-13T18:53:21Z : No. of bitstreams: 1 sumares_jap_me_arafcf.pdf: 902012 bytes, checksum: 885db9e62dd6f2315568900f3dbc8407 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O cancro cítrico asiático, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), é uma das doenças mais importantes dos Citrus e de ocorrência mundial. Esta doença constitui um grande risco para a citricultura brasileira uma vez que os sintomas podem diminuir o valor de mercado das frutas, e, por vezes, até impedir a sua comercialização. Neste trabalho determinamos a influência da temperatura no crescimento e fisiologia de Xac, com especial atenção à temperatura da morte bacteriana e sua influência sobre a competência infecciosa da bactéria. Descobrimos que a taxa de crescimento de Xac é de forma geral influenciada por altas temperaturas. Notamos uma diminuição do crescimento quando bactérias foram submetidas a temperaturas superiores àquela considerada ótima para cultivo controlado (30 ºC). Bactérias expostas a temperaturas de até 37 ºC foram perfeitamente competentes para infectar o hospedeiro citros, além de recobrarem perfil de crescimento padrão quando retornadas a temperatura de 30 ºC. Tratamentos com temperaturas superiores a 40 ºC promovem alterações fisiológicas irreversíveis e acima de 42 ºC não foi possível resgatar células capazes de induzir sintomas de cancro cítrico, sendo, pois, designadas temperatura de morte. Temperaturas diferentes de 30 ºC promoveram aumento de tamanho celular, sugestivo de perturbação de processos essenciais de replicação/segregação cromossômica e/ou divisão celular. Para investigar a influência do tratamento térmico em tais processos, submetemos linhagens de Xac com marcação para centrômero e septo bacterianos a tratamentos com diferentes temperaturas, seguindo-se avaliação por microscopia de fluorescência. Tratamento... / Asiatic citrus canker, caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xac), is one of the most important Citrus diseases and occurs worldwide. This disease poses a major risk to the Brazilian citrus industry since the symptoms may decrease the market value of the fruit, and restrict its commercialization. In this work we have determined the influence of temperature on growth and physiology of Xac, with special attention to the temperature of bacterial death and its influence on the bacterial infectious competence. We have found that the growth rate of Xac was generally affected by high temperatures. We have noticed a decrease of bacterial growth when exposed to temperatures higher than that considered optimal for controlled cultivation (30 ºC). Bacteria exposed to temperatures up to 37 ºC were fully competent to infect the citrus host, and regain ability to grow when temperature was returned to 30 ºC. Treatments at temperatures above 40 ºC promote irreversible physiological chances. Above 42 ºC it has not been possible to recover viable cells that could produce symptoms of citrus canker, and therefore, it was designated death temperature. Temperatures different from 30 ºC caused an increase in cell size, suggesting disturbance on essential biological processes, as chromosomal replication/segregation and/or cell division. To investigate the influence of heat treatment in such processes, we have submitted mutant Xac strains, marked for bacterial centromere and septum, to treatments at different temperatures, followed by fluorescence microscopy analysis. Treatment at 37 ° C for 6 hours did not affect... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-01-30Bitstream added on 2014-06-13T18:29:32Z : No. of bitstreams: 1 bortolossi_jc_me_jabo_prot.pdf: 1992127 bytes, checksum: 4589472b07077a15576f670c58a3f88c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O cancro cítrico doença causada pela bactéria gram negativa Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), representa muitos prejuízos para citricultura brasileira e mundial. Em 2002, a Xac teve todo seu genoma seqüenciado. Uma biblioteca de mütantes foi constituída e os mutantes foram analisados por inoculação in planta, deste modo tres mutantes foram selecionados por apresentarem diferenças nos sintomas, quando comparados com a estirpe selvagem Xac. Os genes nocauteados nos mutantes codificam três proteínas diferentes: DGTP pirofosfato tiamina sintase, envolvida na biossíntese de vitamina B 1, a subunidade E da enzima PHA sintase, que atua na síntese de polihidroxialcanoatos. que acumulados na forma de grânulos intracelulares constituem substâncias de reserva da célula, e podem formar biopolímeros e, ainda o terceiro gene nocauteado, que codifica uma proteína hipotética. As curvas de crescimento revelaram que o mutante da DGTP pirofosfohidrolase tiamina sintase não se desenvolve na planta hospedeira. O mutante da PHA sintase cresce menos que a Xac selvagem nos dois primeiros dias de avaliação, já o mutante da proteína hipotética sofre uma fase de declínio a partir do oitavo dia de avaliação experimental. A subunidade E da PHA sintase da Xac, gene codificador desta proteína foi donado em vetor de expressão e a proteína recombinante foi produzida em E.coli na forma solúvel. / The citric canker disease caused for the bacterium gram negative Xantlzomonas axonopodis pv. citri (Xac), presents many damages for Brazilian and world-wide citriculture. In 2002, aiming to know the mechanisms of attack of the disease, the Xac had alI its sequenced genome. A library of mutants was constituted and the mutants had been analyzed by inoculation in plant, three mutants had been isolated for not to show differences in the symptoms when compared with the wild lineage Xac. The mutants codify three different proteins: DGTP pyrophosphate tiamine synthase involved in biosynthesis B 1 vitamin; enzyme PHA synthase subunit E that is involved in the synthesis of polyhydroxyalkanoate, in the intracellular granule f01111, they constitute substances of reserve of the cell an can still to form biopolymer; and hypothetical proteins. The profile of growth of the wild Xac and the mutated Xacs in the three cases of the mutants had been evaluated in order to compare the profile of growth of the bacterial wild and mutant during the infection in citric host. The growth curves showed that the mutant of the DGTP pyrophosphate tiamine synthase does not develop the disease in the host plant. The PHA synthase grows less than the wild Xac in the first days of evaluaction, however the mutant of the hypotetical, shown a decline period for eighth day of the experimental evaluaction. The subunit E the PHA synthase of the Xac, the code gene of this protein was cloned in expression vector and the recombinant protein was produced in E.coli in the soluble form.