Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

L’athérosclérose et ses complications demeurent une des causes majeures de décès dans les pays industrialisés. L’angioplastie coronarienne n’a pas cessé de progresser et atteint de hauts niveaux de réussite technique. Toutefois, des obstacles majeurs au succès à long terme de l'angioplastie persistent (Davies et Hagen, 1994). C’est le cas de la resténose. Plus de 30 à 60% des artères coronariennes ayant subies une angioplastie sont des cas de resténose, survenant durant la première année de la procédure (Kitazume et al, 1995). Plusieurs facteurs de risques menant vers la resténose post-angioplastie ont été relevés (Lau et Sigwart, 1993). L’hyperplasie intimale et le remodelage artériel sont identifiés comme les deux causes responsables de ce processus multifactoriel (Geary et al., 1998). Hypothèse de recherche : Des évidences suggèrent une implication de divers médiateurs vasoactifs et facteurs de croissances dans le processus resténotique. L’angiotensine II et les endothélines se présentent comme des éléments clés dans la prévention et l'atténuation de l'hyperplasie intimale dans les modèles expérimentaux. Objectif : Investiguer les rôles de ces deux familles de médiateurs dans l’hyperplasie intimale afin de mieux comprendre leurs mécanismes d’actions lors de la resténose post-angioplastie. Buts: 1) Vérifier les effets des bloqueurs de l'angiotensine II (antagonistes et inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l’angiotensine II) dans le modèle de la carotide de rat; 2) Vérifier les effets des bloqueurs des endothélines (antagonistes et inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endothéline) dans le modèle de la carotide de rat; 3) Tester les approches ayant montré une efficacité significative dans un nouveau modèle animal d’angioplastie: le modèle de la carotide de furet; 4) Développer de nouveaux outils et de nouvelles approches pharmacologiques (nouveaux composes, combinaisons, et formulations de microsphères); 5) Mettre au point un modèle intégré d’analyse pharmacotoxicologique chronique de moyenne durée chez le rat. Résultats: Les résultats révèlent un rôle des antagonistes du récepteur AT[indice inférieur 1], mais non ceux du récepteur AT[indice inférieur 2], de l'angiotensine II contre l'hyperplasie intimale dans le modèle d’angioplastie par ballonnet chez le rat mais pas chez le furet. L’inhibition limitée à 50% n’est pas améliorée, à dose égale, par une approche locale que procure l’utilisation des microsphères. Quant aux bloqueurs du système des endothélines, ils démontrent une efficacité similaire à atténuer l’hyperplasie intimale à celles des antagonistes de l’angiotensine II, dans le même modèle du rat. Le développement de la méthode d’administration continue a, de plus, permis de valider le prélèvement sanguin et les mesures hémodynamiques de façon chronique. Conclusions : Au moins deux systèmes sont impliqués dans l’hyperplasie intimale chez le rat. L’angiotensine II ne semble pas avoir un rôle dans l’hyperplasie intimale du furet même si ce modèle démontre une hyperplasie intimale bien évidente suite à la dilatation artérielle, telle qu’observée par d’autres équipes chez le porc. Le rat demeure un modèle utile mais limitée quant à l'interprétation et l'extrapolation que l'on peut en faire vers une application clinique, puisqu’une même approche thérapeutique est inefficace chez le furet. Une formulation permettant une action localisée, telle que l'application de microsphères contenant le médicament, n’a pas démontré une efficacité supérieure. Les effets anti-prolifératifs de bloqueurs des endothélines, dissociables de ceux relies aux bloqueurs de I’angiotensine II, suggèrent qu’une approche combinée pourrait mener à une efficacité supérieure contre l’hyperplasie intimale.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'insuffisance rénale chronique (IRC) est associée à une importante morbidité et mortalité cardio-vasculaire, à laquelle participent l'inflammation chronique, le stress oxydant et la dysfonction endothéliale. Les toxines urémiques sont des solutés s'accumulant dans le sérum et les tissus des patients IRC. Parmi elles, les toxines urémiques liées aux protéines sont mal épurées par la dialyse, et ont une toxicité endothéliale démontrée in vitro. Nous avons démontré que l'indoxyl sulfate (IS), une toxine liée aux protéines, induit la production de radicaux oxygénés (ROS) par les cellules endothéliales en culture (HUVEC), par le biais de l'activation de la NADP(H) oxydase, et par une déplétion en glutathion intracellulaire. Ce stress oxydant était induit par des concentrations d'IS rencontrées dans le sérum des patients IRC. Les patients IRC ont un niveau élevé de microparticules endothéliales (MPE), marqueur d'activation et de lésion endothéliale, et un nombre diminué de progéniteurs endothéliaux circulants (PEC), qui représentent les capacités de réparation de l'endothélium lésé. Nous avons souhaité étudier si les toxines urémiques jouaient un rôle dans ce déséquilibre. Chez des patients hémodialysés (HD), nous avons démontré que le nombre de PEC CD34+/CD133+ était inversement corrélé aux taux de 3 toxines urémiques, l'indole-3-acétique acide (IAA, une toxine proche de l'IS) et la ß2 microglobuline. In vitro, l'IAA induit l'apoptose des progéniteurs CD133+, et cet effet est imbibé par l'ajout d'érythropoïétine (EPO) au milieu de culture. Le sérum urémique induit l'apoptose des PEC. Bien que le nombre des PEC soit diminué chez les patients HD par rapport aux contrôles, leur nombre est positivement corrélé à 2 marqueurs de lésion vasculaire : le nombre de MPE, et la rigidité artérielle évaluée par la vitesse de l'onde de pouls aortique. Cela suggère que les PEC restent mobilisables chez les patients HD, en réponse aux lésions vasculaires, peut-être en partie grâce à leur traitement par EPO. En conclusion, les toxines urémiques participent à la dysfonction endothéliale des patients IRC, en augmentant le stress oxydant endothélial et la libération de MPE, et réduisent les capacités de réparation endothéliale en diminuant la survie des PEC. / Chronic kidney disease (CKD) is associated with dramatically increased cardio-vascular morbidity and mortality. Not only do traditional risk factors explain this accelerated atherosclerosis, but also chronic inflammation, oxidative stress and endothelial dysfunction. Uremic toxins are solutes accumulating in serum and tissues of CKD patients. Among them, protein-bound uremic toxins are poorly removed by haemodialysis (HD), and have shown deleterious effects on cultured endothelial cells (HUVEC). We showed that indoxyl suphate (IS), a protein-bound toxin, induces reactive oxygen species production in HUVEC, through activation of NAD(P)H oxidase, and intracellular glutathione depletion. This induction of oxidative stress was observed for concentrations of IS found in CKD patients. CKD patients exhibit high levels of endothelial microparticles (EMP), a marker of endothelial lesion, and low levels of endothelial progenitor cells (EPC), originating from bone marrow and implied in endothelial repair. We asked whetehr uremic toxins could play a role in this imbalance. In HD patients, we showed that the number of CD34+/CD133+ EPC was inversely correlated with the serum levels of two uremic toxins, indole-3-acetic acid (IAA, a protein-bound uremic toxin close to IS) and ß2microglobulin. In vitro, IAA induced apoptosis of CD133+ cells, unless erythropoietin was added to the medium. Uremic serum induced EPC apoptosis. Although endothelial progenitor cell number was reduced in CKD patients compared to healthy controls, it was positively correlated with two markers of vascular lesion : the number of EMP in serum, and the pulse wave velocity reflecting arterial stifness. This suggests that EPC can be mobilized in the circulation upon vessel injury, in spite of uremic toxicity, and maybe thanks to erythropoietin treatment in HD patients. In conclusion, uremic toxins induce endothelial dysfunction, assessed by increased endothelial oxidative stress and shedding of EMP, and reduce regeneration capacities of endothelium. They are probably key actors in cardio-vascular risk of CKD patients.

RhoH est une petite protéine G de la famille Rho constitutivement activée. Cette protéine, exclusivement exprimée dans les cellules hématopoïétiques, intervient dans le développement du système immunitaire. Elle régule la croissance des cellules souches et des progéniteurs hématopoïétiques, la différenciation des lymphocytes T et la signalisation des récepteurs TCR, BCR et FcεRI présents respectivement à la surface des cellules T, B et des mastocytes. La dérégulation de l’expression du gène RHOH est un facteur de progression tumorale dans certaines leucémies. En effet, l’augmentation de son expression dans la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) et sa répression dans la leucémie à tricholeucocytes (HCL) sont des évènements impliqués dans la progression de ces maladies. La LLC et l’HCL sont deux pathologies affectant des lymphocytes B matures mais, pour cette dernière, les cellules présentent un état de différenciation plus avancé. RhoH module donc différemment les processus de prolifération, de migration et de survie cellulaires selon le stade de maturation des cellules, suggérant que son expression soit finement régulée dans les cellules hématopoïétiques. Au laboratoire, notre équipe a mis en évidence la répression de RHOH dans l’HCL, responsable de la progression de cette maladie. Cette expression anormale est le résultat d’une diminution des transcrits RHOH initiés en amont de l’exon 4. Le même phénomène a également été observé dans la leucémie T de l’adulte (ATL). L’HCL et l’ATL sont deux maladies caractérisées par une prolifération anormale de cellules matures activées de type B (HCL) ou de type T (ATL). Nous avons donc projeté de comprendre les mécanismes moléculaires intervenant dans la régulation physiologique du gène RHOH au cours de l’activation lymphocytaire B et T ; puis de mettre en évidence les évènements responsables de la répression de RHOH dans l’HCL et l’ATL. Notre objectif serait d’y restaurer l’expression de RHOH et ainsi d’essayer de contrecarrer le phénotype leucémique, ceci dans le but de proposer de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques dans ces deux leucémies, dont les traitements sont soit inefficaces (ATL), soit satisfaisants mais associés à des taux de rechutes assez élevés (HCL). Notre projet s’est tout d’abord orienté sur l’étude de la régulation normale du gène RHOH dans les cellules B et T. Nos résultats ont permis de montrer que l’expression du gène RHOH est principalement due à l’activité du promoteur P3 dans les lymphocytes B et T normaux et dans des lignées cellulaires lymphoïdes. Dans les lignées lymphoïdes B, le promoteur P3 a été caractérisé et correspond à la séquence -236/+67, en regard du site d’initiation de la transcription. Nous avons observé une augmentation de son activité suite à l’activation de ces cellules par un analogue du diacylglycérol (DAG), suggérant que des facteurs de transcription comme AP1, complexe formé des membres des familles Jun et Fos, sont impliqués dans la régulation du gène RHOH dans des lignées cellulaires lymphoïdes B. Nos résultats ont également permis de mettre en évidence : d’une part, la fixation de JunD sur le promoteur P3, par immunoprécipitation de la chromatine et son rôle de régulateur négatif dans la transcription de RHOH ; d’autre part, l’importance des membres de la famille Fos dans l’expression de ce gène, dans la lignée lymphoïde B Raji. Dans les lymphocytes T, l’activation des cellules par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 a permis d’observer une variation biphasique de l’expression des transcrits RHOH initiés en amont de l’exon 4, au niveau du promoteur P3 : tout d’abord, une forte augmentation du taux des ARN messagers, reproduite par l’utilisation d’un ionophore pour le calcium, suivie d’une répression, mimée par l’analogue du DAG. / The hematopoietic GTPase RhoH is an atypical family member of the Rho GTPases as it is constitutively active and not regulated through the classical cycling between GTP- and GDP-bound state. A number of studies investigated the role of RhoH in hematopoietic cells. RhoH is associated with regulation of proliferation of hematopoietic stem and progenitors. This protein exhibits essential functions in thymocyte development and TCR, BCR, FcεRI signaling in T, B and mast cells, respectively. Recently, a report provided evidence implicating RhoH overexpression in the initiation and progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL); on the other hand, RhoH underexpression has been implicated in the progression of Hairy Cell Leukemia (HCL). Most data indicate that RhoH is an important regulatory molecule with antagonistic functions in proliferation, adhesion or migration in hematopoietic cells and therefore must be accurately regulated. Previous experiments from our laboratory reported that HCL is characterized by abnormal underexpression of RhoH, corresponding to a decreased level of RHOH mRNA initiated upstream of exon 4. Reconstitution of RhoH expression reduced proliferation, adhesion and migration that is central in HCL pathogenesis. Transcriptional repression of this gene was also observed in another leukemia, Adult T cell Leukemia (ATL). Aimed at identifying new therapeutic targets to combat HCL and ATL, we wanted to examine molecular mechanisms implicated in RhoH underexpression in both diseases. HCL and ATL are chronic lymphoproliferative disorders characterized by proliferation of mature cells with memory B cell or T-helper cell phenotype, respectively. In the first part of our work, we wanted to investigate molecular mechanisms mediating normal RhoH expression in activated B and T cells, as well as induced pathways; in the second part, we tempted to identify transcription factors implicated in RhoH repression in HCL and ATL. Firstly, our work has focused onto physiological expression of RHOH gene in B and T cells. We showed that RHOH gene expression observed in these cells was mostly due to transcriptional activity of P3 promoter, upstream of RHOH exon 4. The promoter was isolated spanning nucleotides -236/+67 relative to the transcription start site, in B cells. B cells stimulation by PMA (Phorbol-12-Myristate-13-Acétate) induced an increase of P3 promoter activity. PMA is a DiacylGlycerol (DAG) analogous. This result suggested that transcription factors related to DAG pathway stimulation, like AP1 (Activator Protein 1), could be responsible for RHOH expression in B cells. We could show that the Jun family member JunD is able to bind to endogenous P3 promoter and can act as a repressor of RHOH expression in a B cell line, Raji. Other Jun family members seemed not to be implicated in this regulation. We also reported that Fos family members are important in RHOH expression. Our results suggest that the transcription factor AP1 could regulate this process in B cells. T cell activation by antibodies directed against CD3 and CD28 induced biphasic kinetics of expression of RHOH mRNA initiated upstream of exon 4. We observed a high increase of RHOH transcript level, mimicked by use of ionomycin, followed by an important decrease, mimicked by use of PMA. RHOH P3 promoter was isolated in a T cell line, Jurkat, then we investigated putative binding sites for transcription factors, which could be implicated in this biphasic event in T cells. Our preliminary results have shown that some potential binding sites for transcription factors related to calcium pathway and inducing RHOH expression are present between nucleotides -236 and -201; also sites for transcription factors induced by DAG pathway and repressing this gene are present between nucleotides -583 and -380.

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Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.