Orientador: Lilian Maria de Castilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T03:42:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_DaianeCobianchida_M.pdf: 4109266 bytes, checksum: 1d98746f4512e5faa380195b1b0b9c99 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A genotipagem de grupos sanguíneos em larga escala pela técnica de "microarray" tem se mostrado importante para doadores e pacientes, pois permite a determinação simultânea de múltiplos alelos que codificam antígenos de grupos sanguíneos e pode contribuir para a seleção mais exata de unidades de sangue compatíveis para pacientes politransfundidos. Neste trabalho, avaliamos a utilização da genotipagem em larga escala em 283 amostras de DNA de pacientes falciformes e, em 504 amostras de DNA de doadores de sangue pela plataforma HEA BeadChipTM na seleção de doadores fenótipo compatíveis em 4 níveis de compatibilidade de antígenos de grupos sanguíneos. Com o auxílio de um software e considerando que todos os doadores eram do grupo sanguíneo O, fomos capazes de encontrar um número significativo de doadores de sangue antígeno-negativo para pacientes aloimunizados e não aloimunizados quando buscamos por compatibilidade Nível 1 (ABO, D e um aloanticorpo) e Nível 2 (ABO, D, C, c, E, e, K1). Em Nível 1 encontramos uma média de 482 doadores compatíveis e em Nível 2 uma média de 237 doadores compatíveis. Entretanto, a média de doadores compatíveis Nível 3 (ABO, D, C, c, E, e, K1, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, Dia) foi de 75 e, Nível 4 (ABO, D, C, c, E, e, K1, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, Dia, Lua, Lub, M, N, Doa, Dob, Hy, Joa, k, Jsb) foi de 31. Além disto, realizamos compatibilidade genética para 35 pacientes com as amostras de DNA dos pacientes e das unidades de sangue compatibilizadas para eles por técnicas sorológicas. Vinte e hum pacientes apresentaram discrepâncias para vários antígenos entre o seu perfil antigênico e as unidades de sangue sorológicamente compatibilizadas para eles, o que demonstra que as técnicas moleculares são superiores às técnicas sorológicas na identificação de unidades de sangue compatíveis para estes pacientes / Abstract: DNA arrays, with their high-throughput capability are particularly suited for mass screening donors because they permit the simultaneous determination of multiple alleles encoding RBC antigens and can facilitate the provision of more extensively matched blood for patients. Based on this we evaluated the usefulness of DNA array technology to provide a means to precisely genotype match donor blood units to the antigen-negative type of patients with SCD. We searched for compatible units for 283 SCD patients performing extended human erythrocyte antigen (xHEA) typing on the patient samples and on 504 donor samples. The degree of matching was determined at 4 increasingly stringent levels of compatibility. Using a special software, we were able to find 482 compatible donors for Level 1 (ABO, D and 1 Antibody) , 237 for Level 2 (ABO, D, C, c, E, e, K1), 75 for Level 3 (ABO, D, C, c, E, e, K1, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, Dia) and 31 for Level 4 (ABO, D, C, c, E, e, K1, Fya, Fyb, Jka, Jkb, S, s, Dia, Lua, Lub, M, N, Doa, Dob, Hy, Joa, k, Jsb). We also investigated antigen-match RBC units with 35 recipients using blood group genotypes at the 4 levels of matching stringency. Units selected were serologically matched to the patients based on their ABO, Rh and K phenotypes and presence of antibody (ies). Twenty-one from 35 SCD patients presented discrepancies or mismatches for multiple antigens between their xHEA antigen profile and the blood units antigen profile serologically matched for them. According to these results we were able to find a better match for the patients in our extended HEA (xHEA)-typed units, and in the majority of cases the degree of matching was enhanced and the patients benefit to receive the transfusions as shown by better in vivo RBCs survival. DNA array based blood grouping typing of donors and patients showed to be a cost-effective procedure and has demonstrated improvements in SCD patients care facilitating their transfusion support and preventing the alloimmunization and hemolytic transfusion reactions / Mestrado / Ciencias Medicas / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Maria Luiza Moretti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T06:00:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Menezes_DulcineaBlum_D.pdf: 1620753 bytes, checksum: 0d62ea2ae59bfb2f69d0243a4b9e4be5 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A inserção de cateter venoso central (CVC) representa um importante risco para as infecções sistêmicas nosocomiais, e para estas infecções, Staphylococcus epidermidis é o patógeno mais importante. Com o objetivo de analisar os perfis de DNA genômico, detectar a presença e expressão de gene responsável pela produção de biofilme e estudar a dinâmica da colonização, cepas de S. epidermidis obtidas de episódios de isolamento deste microrganismo em culturas microbiológicas de ponta de CVC e/ou hemoculturas foram comparadas com cepas coletadas da microbiota do paciente hospitalizado no Hospital das Clínicas da UNICAMP. Este estudo também objetivou analisar os procedimentos médico-hospitalares intervencionais destes pacientes. Pacientes com culturas microbiológicas de ponta de CVC (>15 UFC) e/ou hemoculturas positivas para S. epidermidis foram selecionados para a coleta de microbiota presente na pele e mucosa nasal, através de coleta local com zaragatoas umedecidas. As cepas de S. epidermidis foram analisadas através do método de PFGE; teste de sensibilidade a antimicrobianos; detecção da presença do gene ica, através da técnica de PCR e detecção de biofilme, através do método CRA. Fizeram parte deste estudo 247 cepas obtidas de 12 pacientes selecionados em 18 episódios estudados. Foram encontrados 26 distintos perfis genotípicos e 4 perfis fortemente relacionados. Em 10 episódios o mesmo perfil genotípico de DNA foi detectado simultaneamente em cepas clínicas e de microbiota, onde 6 destes episódios ocorreram quando o período de implantação da CVC foi superior a 15 dias. Nos 7 episódios em que não houve concordância entre os perfis genotípico de DNA em cepas clínicas e de microbiota, 5 destes episódios ocorreram igualmente em período inferior a 15 dias, não havendo diferença estatística entre os grupos. Por PFGE foram identificados 6 perfis genotípicos predominantes nas cepas de microbiota. Estes perfis representaram 68% (132/193) das cepas de microbiota, e um destes perfis se mostrou prevalente (77/193) nas cepas de microbiota. Em 10 episódios (8 pacientes), o perfil genotípico prevalente foi identificado compondo a microbiota. Foi comprovado, por comparação da diversidade dos perfis genotípicos, que durante o período de hospitalização o perfil geral da microbiota sofre mudanças de um perfil de diversidade genotípica policlonal para um perfil de diversidade oligoclonal, com predominância de um perfil genotípico. A mudança de diversidade genotípica foi relacionando a administração prévia de ciprofloxacina. As cepas com perfis genotípicos predominantes não apresentaram maior prevalência da presença do gene ica, em relação às cepas não predominantes, o que não foi justificado que cepas potencialmente produtoras de biofilme se sobrepusessem em relação às cepas desprovidas deste gene. Oito dos 12 pacientes apresentaram concomitante ou posterior infecção por bacilos Gram negativos, destes 2 foram a óbito por septicemia. De acordo com os resultados, nós concluímos que pacientes submetidos a longos períodos de hospitalização são colonizados por microbiota de diversidade oligoclonal de S. epidermidis e a colonização ou infecção de CVC por destas cepas, potencialmente produtoras de biofilme em contato com a corrente sanguínea, pode ser uma oportunidade para infecções posteriores por outros microrganismos devido a potencial produção de biofilme inerente a S. epidermidis / Abstract: Central vascular catheters (CVC) represent an important risk for nosocomial bloodstream infections and Staphylococcus epidermidis is the most important pathogen of these systemic infections. To analyze the genomic DNA profiles, to detect the presence and expression of the responsible gene for biofilm production and to study the colonization dynamic, S. epidermidis strains isolated from tip CVC and blood positive cultures were compared with the strains isolated from skin and nasal swab in patients hospitalized in a tertiary care university hospital, the Hospital das Clínicas of UNICAMP. It was analyzed the previous medical care proceedings that the same patients underwent. Patients with microbiologic cultures for S. epidermidis from blood and/or catheter tip (>15 CFU) were selected to have swabs from skin and nasal. S. epidermidis were typed using PFGE, antibiotic susceptibility testing, presence of ica gene detection, by PCR, and biofilm detection, by Congo red method, were performed. Twelve patients with 18 episodes of colonization or catheter-related infection were included in this study and 247 strains were analyzed. It was found 26 distinct genotypic profiles and 4 strongly related genotypic profiles. In 10 episodes, the same DNA profile was detected in clinical and in microbiota strains, 6 of them occurred when the period of catheter implantation were higher than 15 days. In 7 episodes, there was not concordance among genotypic profiles from clinical and microbiota strain, and 5 of them occurred when the period of catheter implantation were lower than 15 days, too. It was not found statistic difference between the groups. PFGE identified six predominant genotypic profiles that were present in 68 % (132/193) of microbiota strain, and one of them was prevalently present (77/193). The prevalent genotypic profile was found compounding the microbiota in 10 episodes (8 patients). It was proofed, by comparison of the diversity of genotypic profiles, that during the hospitalization period the microbiota general profile changes from the diversified genotypic profile (polyclonal) to a poorly diversified genotypic profile (oligoclonal), with a predominant genotypic profile. It found was related with the previous ciprofloxacin administration. The predominant DNA profiles strains did not presented higher prevalence according to the presence of ica gene when comparing to non predominant strains, what it was not justified that potentially biofilm producers can superpose over non ica strains. Eight of 12 patients presented concomitant or posterior infection by negative Gram rots, whose 2 were to obit by sepsis. According to the results, we concluded that patients with long-term hospitalization were previously colonized by oligoclonal-diversified microbiota S. epidermidis and CVC colonization or infection by this agent, potentially biofilm producer present at bloodstream can be an opportunity to other microorganism posterior infections, due to potential biofilm production inherent to S. epidermidis / Doutorado / Ciencias Medicas / Doutor em Clínica Médica

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-07T12:10:47Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova Costa - 2006.pdf: 1500361 bytes, checksum: 3401843db66da8f77a90a41b7a08f826 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-07T12:14:51Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova Costa - 2006.pdf: 1500361 bytes, checksum: 3401843db66da8f77a90a41b7a08f826 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-07T12:14:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Cesar Augusto Sam Tiago Vilanova Costa - 2006.pdf: 1500361 bytes, checksum: 3401843db66da8f77a90a41b7a08f826 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2006-09-29 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Hypo pharynx is the under region of pharynx and serves both respiratory and digestive tract, acting as a passageway to air and food. It’s composed by squamous nonkeratinized epithelial tissue. Statistical studies indicates that 85 to 90% of neoplasies rush pyriform sinus and are characterized by fast dissemination and metastization. Epidemiological trends of hypo pharynx cancer in Goiania on period 1998 to 2003 analyzing data derived from Cancer Registry of Association for Cancer Combat of Goias, shows that the relative survival rate for men diagnosed with hypo pharynx cancer was 38% past 60 months while women presented a survival rate of 100%. Surgery was the treatments that present fewer rates (34%) and chemotherapy was associated to the most survival rate (54%). Patients that use tobacco presented a survival rate of 43% while non-tabagists present a rate of 60% of surviving. Relative survival rate for patients diagnosed with hypo pharynx tumor was 38% and estimated censure for 5 years was just 5%. Survival rate was extremely decreased due to 45% of cases were diagnosed in advanced stages of disease. It is important to point out that preventive campaign is important to evade the increasing of these pathologies that are related to behavior of tabagism and etilism. Present study also evaluates cytogenetically individuals diagnosed with hypo pharynx cancer. Cytogenetic analysis of exfoliated cells is largely used to evaluate cytotoxic and genotoxic alterations on people exposed to potentially mutagens. A number of 36 individuals were analyzed, representing case group, and 36 healthy individuals composed control group. Data was collected and analysis was performed to estimate main nuclear alterations. Standard protocols were adopted to collect and counting cells. Micronuclei test was used to determinate the frequency of cytotoxic and genotoxic alterations. Besides than micronuclei others alterations like broken-eggs, binucleated cells and piknotic nuclei are good markers of cell alterations because they are resulted from cytotoxic events frequently related to occupational exposure. Behaviors like tabagism, etilism and exposition time were also investigated to correlate cells alterations. The correlation between micronuclei frequencies of case and control group test doesn’t show statistic difference. Broken egg and binucleated cells were the most observed anomalies on case group and showed up significant statistic difference (p=0.03). Results indicates a high grade of cytotoxic anomalies on individuals with hypo pharynx cancer, specially in tabagists and chronic etilists individuals, behaviors that are correlated to induct and promote tumors in susceptible people due their capabilities to affect cell cycle. Studies about relationship between Human Papillomavirus (HPV) and cancer development are performed since 80’s. Although the correlation of HPV and cervical cancer are well established, the possible role of HPV and head and neck cancer are still unclear. Among controversial factors of HPV and carcinogenesis of squamous epithelial cells, there is a viral incidence that oscillates from 0 to almost 100% on studies that includes a myriad of viral genome detect methods, such Blotting and PCR. Importance of HPV infection and epithelial carcinogenesis is related to capabilities of High risk HPV 16 and 18 to promote cell alterations, by tumor suppressor proteins inactivation, tumor suppressor genes blockage and insertions of HPV oncogenes. On present study, HPV detection and typing was performed on tumors derived from hypo pharynx of 24 patients diagnosed with cancer (CID-O: C12,0 to C13,9). All samples was submitted to PCR with generic primers MY09/11 and GP05/06, as specific primers to HPV 6, 11, 16, 18, 33, 35, 45 and 58. Results shows that on 9 of 24 samples, HPV were detected by generic primers (a rate of 37,5%) and HPV types 16, 18 and 45 were identified, with a sample presenting coinfection of HPV 16 and 18. / A hipofaringe, região inferior da faringe, também chamada de laringofaringe ou faringolaríngea, serve aos sistemas respiratório e digestivo, funcionando como passagem para o ar e os alimentos. É composta de tecido epitelial escamoso estratificado não-queratinizado, com grande quantidade de glândulas seromucosas. As estatísticas mostram que entre 85 e 90% dos cânceres que acometem a hipofaringe são carcinomas espino-celulares. A lesão inicial no seio piriforme apresenta-se macroscopicamente sob o aspecto de um nódulo ou úlcera, tendo como característica principal, a rápida disseminação pela submucosa. Atualmente, com a associação de cirurgias radicais e radioterapia pós-peratória aumentou-se o controle locorregional destes tumores, contudo, a sobrevida global não sofreu alterações em decorrência das metástases à distância, o que não representa uma falha no tratamento realizado e sim uma evolução natural devido à característica invasiva desse tipo de neoplasia. Os tumores malignos de hipofaringe não são freqüentes, representando entre 5 a 10% das neoplasias das vias aerodigestivas superiores e apenas 0,5 % de todos os cânceres. Porém, do conjunto das neoplasias malignas da região da cabeça e pescoço, tumores de hipofaringe apresentam o pior prognóstico. A avaliação das tendências epidemiológicas apresentadas pelo câncer de hipofaringe em Goiânia no período de 1998 a 2003, analisando os dados disponíveis pelo Registro de Câncer de Base Populacional da Associação de Combate ao Câncer em Goiás, mostrou uma sobrevida relativa dos pacientes do sexo masculino diagnosticados com câncer de hipofaringe foi de 38% após 60 meses de segmento, enquanto que para o feminino apresentou-se uma sobrevida máxima de 100%, com todas as pacientes curadas. Dentre os tratamentos realizados, a cirurgia apresentou a menor taxa de sobrevida (34%) ao passo que para a quimioterapia foi associada uma sobrevida de 54%. A sobrevida dos pacientes tabagistas (43%) se mostrou muito inferior à dos indivíduos que não eram tabagistas (60%). Em fim, ao longo de cinco anos de segmento deste estudo, a taxa de sobrevida relativa para portadores de tumores malignos da hipofaringe foi de aproximadamente 38%, estimada para cinco anos com uma censura de apenas 5%. A taxa de sobrevida relativa é diminuída uma vez que cerca de 45% dos casos, o diagnóstico é feito tardiamente. O presente estudo também avaliou as alterações citogenéticas nucleares de pacientes portadores de câncer na região da hipofaringe. Foram analisados 36 indivíduos do grupo de casos, constituído de pacientes diagnosticados com tumores de hipofaringe, e 36 indivíduos saudáveis do grupo controle. Para obtenção dos dados foram considerados hábitos de consumo como tabagismo e etilismo e principalmente o tempo de exposição. Foram contadas 5000 células por indivíduo e as freqüências de micronúcleo, binucleadas, broken eggs e demais aberrações nucleares, foram calculadas para ambos os grupos. A freqüência de micronúcleo mostrada entre o grupo controle e o de casos não apresentaram diferença estatística. Porém, foi observado, por parte do grupo de casos, um grande número de células com broken eggs e binucleadas. Tais resultados demonstraram diferença estatística (p = 0,03). A binucleação e a formação de dois núcleos em forma de broken egg sugere que agentes como o tabaco e o alcoolismo crônico podem estar relacionados com a indução e progressão de tumores em pessoas susceptíveis, devido à capacidade desses mutágenos afetarem o ciclo celular. Dentre os fatores que geram controvérsias, podemos destacar o achado freqüente de variados tipos de HPV em mucosa oral normal, numa incidência que varia de 0% a quase 100% em diversos estudos, com numerosos métodos de identificação, incluindo entre eles um método altamente sensível, a PCR. A importância da infecção pelo HPV na carcinogênese de células epiteliais é suportada pela capacidade dos HPVs de alto risco, principalmente os tipos 16 e 18, de imortalizar os queratinócitos orais, quando em análise in vitro. O processo de imortalização pode envolver a desativação de proteínas supressoras de tumores pré-formadas pelas oncoproteínas virais, o bloqueio da transcrição de genes supressores de tumores como resultado da inserção do oncogene do HPV, ou a estimulação da transcrição do oncogene celular pela inserção de seqüências ativadoras de transcrição derivadas do próprio genoma do HPV. No presente estudo, o grupo amostral foi constituído de 24 pacientes diagnosticados com carcinoma de hipofaringe. Os casos foram obtidos do Registro de Câncer de Base Populacional de Goiânia/GO da Associação de Combate ao Câncer em Goiás. Todos os pacientes considerados foram diagnosticados como carcinomas de hipofaringe (CID-O: C12.0 a C13.9). Todas as amostras foram submetidas a uma PCR com os primers genéricos MY09/11 e GP05/06 para detecção em amplo espectro do genoma de HPV. Posteriormente, utilizou-se a mesma abordagem, com os primers tipo-específico para HPVs 6, 11, 16, 18, 33, 35, 45 e 58. Em 9 das 24 amostras utilizadas, foi observada amplificação com os primers genéricos, identificando-se o genoma de HPV em 37,5% (6/24) dos casos. Em 67% (6/9) das amostras, o genoma viral foi detectado por MY09/11 e em 33% (3/9) pelos primers GP05/06. As amostras positivas foram então submetidas a uma segunda PCR para a genotipagem dos HPVs, tendo sido observados os tipos 16, 18 e 45. Os tipos virais mais associados ao câncer da hipofaringe, no presente estudo, foram os HPV 16 e 18, presente em 6 amostras e o HPV45, encontrado em 1 amostra. Em um paciente foi observada a co-infecção de tipos virais de HPVs 16 e 18. Contudo, mesmo diante de tantas pesquisas realizadas, há muito para ser explorado, apesar de uma hipótese possível para a carcinogênese ser a interação sinérgica de carcinógenos químicos, virais, oncogenes e genes supressores de tumores.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Bruna Coelho Carvalho.pdf: 623511 bytes, checksum: 1b8b7e76b1e1a914d834251448a49ea4 (MD5) Previous issue date: 2011-02-21 / Regional differences in the molecular epidemiology of HIV-1 have been reported in Brazil, where there is scarce publication about the epidemic in north region. Despite the large number of antiretroviral drugs (ARV) belonging to nucleoside and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NRTI and NNRTI) and protease inhibitors (PI) classes, the selection of resistance-associated mutations may compromise the therapeutic efficacy. Primary resistance mutations, present prior to ARV use, occur mainly due to the transmission of resistant virus. This study describes the prevalence and profile of primary resistance mutations to ARV and the molecular epidemiology of HIV-1 in ARV naive patients from Tocantins State. For HIV-1 genotyping of the entire protease gene (PR) and 750 bp of reverse transcriptase (RT) gene, plasma RNA was extracted, reverse transcribed into cDNA) and used as the target for nested polymerase chain reaction (K1/K2 and F2/DP10 primers) and fragments were sequenced (kit DYEnamic ET Dye Terminator, GE Healthcare; ABI Prism 3130). The sequences were edited by the Staden Package software. Primary drug resistance was analyzed using the Calibrated Population Resistance (CPR) tool employing the Stanford Surveillance Drug Resistance Mutation (SDRM). The susceptibility profile of ARV mutations was analyzed by Stanford HIV Drug Resistance Database (hivdb.stanford.edu). HIV-1 genetic subtypes were identified by REGA HIV-1 and SIMPLOT softwares and by phylogenetic inference. Naïve patients (n=52) were recruited in LACEN/Palmas/TO between 2008-2010. The majority of investigated patients (59.6%) were males and 73.1% reported heterosexual exposure. Primary mutations that confer resistance to ARV were identified in 11.5% (06/52) of the isolates: BRTO08-43: M41L, L210W, T215D (NRTI); BRTO02-83: Y181C (NNRTI); BRTO13-83: D67G, K219E (NRTI); BRTO20-83: V108I, Y181C (NNRTI); BRTO02-66: M46L (PI); e BRTO13-66: V90I, K103N (NNRTI). Isolates with concordant subtypes in PR/RT regions represented 86.5% (45/52): subtype BPRBRT=78.8% (41/52), subtype CPRCRT=5.8% (3/52), subtype F1PRF1RT=1.9%. Isolates with discordant subtypes in PR and RT genes indicating intersubtype recombination represented 13.5% (07/52): BPRF1TR=1.9% (01/52); BPRBF1TR=7.7% (04/52) e CPRCF1TR=3.9% (02/52). Our study among naive patients from Tocantins State describes moderate prevalence of primary resistance to ARV, the predominance of subtype B that co-circulates with subtype C and a significant number of B/F1 and C/F1 recombinant forms. These results indicate the transmission of ARV resistant HIV-1 isolates among patients from a small inland city in north Brazil, where the epidemic is more recent. In this context, it is important to monitor the prevalence of primary drug resistance in order to assess the need and the cost-benefit of the implementation of pre-treatment genotipic tests aiming to optimize the choice of the ARV regimen among naive patients from Tocantins State. / Diferenças regionais na epidemiologia molecular do HIV-1 têm sido descritas no Brasil e publicações sobre a epidemia da região Norte do país são restritas. Apesar do grande número de drogas antirretrovirais (ARV) das classes inibidores nucleosídicos e não-nucleosídicos (INTR e INNTR) da transcriptase reversa e inibidores da protease (IP), mutações associadas à resistência podem comprometer a eficácia terapêutica. Mutações de resistência primária presentes antes do uso de ARV ocorrem principalmente por transmissão de vírus resistentes. Este estudo descreve a prevalência e o perfil de mutações de resistência primária aos ARVs e subtipos do HIV-1 identificados em pacientes virgens de tratamento do estado do Tocantins. A genotipagem do gene completo da protease (PR) e 750pb da transcriptase reversa (TR) do HIV-1 foi feita a partir de RNA plasmático e incluiu retrotranscrição, nested PCR (primers K1/K2 e F2/DP10) e sequenciamento (kit DYEnamic ET Dye Terminator, GE Healthcare; ABI Prism 3130). As sequências foram editadas pelo software Staden Package. A resistência primária foi analisada pela ferramenta de Calibração da População com Resistência (CPR), empregando a ferramenta do Stanford Surveillance Drug Resistance Mutation (SDRM). O perfil de susceptibilidade dos isolados com mutação de resistência aos ARVs foi analisado pelo Stanford HIV Drug Resistance Database (hivdb.stanford.edu). Os subtipos genéticos do HIV-1 foram identificados pelos softwares REGA HIV-1, SIMPLOT e por inferência filogenética. Pacientes virgens de tratamento (n=52) foram recrutados no LACEN/Palmas/TO entre 2008-2010. A maioria dos pacientes estudados (59,6%) era do sexo masculino e 73,1% referiu exposição heterossexual. Mutações que conferem resistência primária aos ARVs foram identificadas em 11,5% (06/52) dos isolados: BRTO08-43: M41L, L210W, T215D (INTR); BRTO02-83: Y181C (INNTR); BRTO13-83: D67G, K219E (INTR); BRTO20-83: V108I, Y181C (INNTR); BRTO02-66: M46L (IP); e BRTO13-66: V90I, K103N (INNTR). Isolados com subtipos concordantes nas regiões PR/TR representaram 86,5% (45/52): subtipo BPRBTR=78,8% (41/52), subtipo CPRCTR=5,8% (03/52), subtipo F1PRF1TR=1,9%. Isolados com subtipos discordantes em PR e TR indicando recombinação intersubtipo representaram 13,5% (07/52): BPRF1TR=1,9% (01/52); BPRBF1TR=7,7% (04/52) e CPRCF1TR=3,9% (02/52). Nosso estudo em pacientes virgens de tratamento do estado do Tocantins identificou prevalência moderada de resistência primária aos ARVs, predomínio do subtipo B que co-circular com o subtipo C e um percentual significativo de formas recombinantes intersubtipos B/F1 e C/F1. Estes dados indicam a transmissão do HIV-1 resistentes a ARVs em pequenos centros urbanos no interior do Brasil, onde a epidemia é mais recente. Neste contexto, o monitoramento da prevalência de resistência primária é importante para avaliar a necessidade e custo-benefício da implantação do teste de genotipagem pré-ARV para otimizar a escolha do esquema ARV em pacientes do estado do Tocantins.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / As infecÃÃes fÃngicas sistÃmicas causadas por leveduras do gÃnero Candida sÃo consideradas micoses oportunistas de alto risco em ambientes hospitalares. Essas infecÃÃes representam importante desafio terapÃutico, em razÃo do surgimento de espÃcies resistentes a antifÃngicos, associados a altos Ãndices de mortalidade. Por esta razÃo, este trabalho objetivou: Verificar a freqÃÃncia de fungemias no Hospital Geral Dr. CÃsar Cals (HGCC) e Hospital Infantil Albert Sabin (HIAS); identificar os agentes etiolÃgicos implicados; determinar o perfil de sensibilidade aos antifÃngicos e avaliar o perfil genotÃpico das espÃcies isoladas de pacientes com quadros de recorrÃncia. Para isso foram recuperadas, de 4 627 hemoculturas, 55 hemoculturas positivas para leveduras do HGCC, e, de 5 316 hemoculturas, 87 positivas para leveduras do HIAS. Destas, 23 do HGCC e 43 pacientes do HIAS que possuÃam histÃrias clÃnicas com dados completos entraram neste estudo. O diagnÃstico micolÃgico foi realizado por meio das caracterÃsticas bioquÃmicas e morfolÃgicas dos agentes etiolÃgicos isolados. O teste de sensibilidade aos antifÃngicos - anfotericina B, fluconazol, itraconazol e cetoconazol - utilizou o mÃtodo de microdiluiÃÃo em caldo, descrito no documento M27-A2 do NCCLS. As tÃcnicas de genotipagem foram realizadas por eletroforese em campo pulsÃtil (PFGE) e amplificaÃÃo aleatÃria do DNA (RAPD). Entre o perÃodo do junho do 2000 a junho do 2002, no HGCC, foram analisadas 4 627 hemoculturas, sendo positivas 1051, das quais 55 (5,2%) foram positivas para leveduras do gÃnero Candida. Em contrapartida, no perÃodo de junho do 2001 a junho do 2002, no HIAS, foram analisadas 5316 hemoculturas, sendo positivas 1520 amostras, das quais 87 (5,72%) foram positivas para leveduras dos gÃneros Candida e Rhodotorula. A principal espÃcie envolvida, dentro do gÃnero Candida, foi a C. parapsilosis com 36% e 42% no HGCC e HIAS, respectivamente. Os principais fatores de risco foram: a antibioticoterapia prÃvia (n=19; 90%), cateter venoso central, nutriÃÃo parenteral, sondagem gÃstrica , ventilaÃÃo mecÃnica, cirurgia e prematuridade. Quanto à resistÃncia a drogas antifÃngicas, foi observado que anfotericina B apresentou um Ãndice de resistÃncia de 4%, fluconazol- 52%, itraconazol- 50% e cetoconazol- 86%. A tÃcnica do PFGE caracterizou um perfil cromossÃmico de 6 bandas para C. parapsilosis e 4 para C. tropicalis. Esta tÃcnica permitiu a diferenciaÃÃo de uma cepa com padrÃo de bandas alterado para o Ãltimo episÃdio do paciente 4. A tÃcnica de RAPD caracterizou um padrÃo de distribuiÃÃo de bandas predominante para C. parapsilosis e foi capaz de caracterizar 4 perfis genÃmicos, indicando re-infecÃÃo em 3 pacientes e 2 perfis genÃmicos foram encontrados para C. tropicalis . Este ensaio demonstra a emergÃncia das Candida nÃo-albicans, especialmente a C. parapsilosis, como principal responsÃvel pelos casos de candidemias em dois hospitais de indicaÃÃo terciÃria de Fortaleza, associado a uma alta resistÃncia in vitro aos antifÃngicos. A variabilidade genÃtica encontrada nas C. parapsilosis e C. tropicalis, mediante as tÃcnicas do PFGE e RAPD, revelaram quadros de re-infecÃÃo, os quais erguem a possibilidade de que estas sejam decorrentes de uma contaminaÃÃo entre pacientes ou indiretamente, por intermÃdio de trabalhadores da saÃde. / The systemic infections caused by yeasts of the genus Candida are considered opportunist mycoses of high risk in hospital environments. These infections represent important therapeutical challenge, by reason of arising of species resistent to some antifungals, associated with high rate of mortality. Therefore, this work sought: To verify the frequency of fungemias at Dr. CÃsar Cals Hospital and Albert Sabin Children Hospital; identify the etiological agents implicated; determine the sensitivety profile to antifulgal and evaluate the genotypical profile of the species isolated from patients with recurrency. For this, were recuperated from 4627 hemcultures, 55 yeast-positive hemocultures at HGCC and from 5316 hemocultures 87 yeast-positive hemocultures at HIAS. From them, 23 patients at HGCC and from 43 at HIAS that had clinical histories with complet data entered this study. The mycological diagnosis was performed through biochemical and morphological characteristics of the etiological isolated. The test of sensitivety to antifungal- amphotericin B, fluconazole, itraconazole and cetoconazole- utilized the microdilution method in broth, reported in the document M27-A2 of the NCCLS. The genotyping techniques were performed through PFGE (Pulsed Field Gel Electrophresis), RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA analysis). Within the period from june of 2000, to june of 2002 at HGCC, were analysed 4627 hemocultures, being positives 1051, of which 55 (5,2%) were positive for yeast of the genus Candida. On the other hand, in the period from june of 2001 to july of 2002 at HIAS, were analysed 5316 hemocultures, of which 87 (5,72%) were yeast-positive of the genus Candida and Rhodotorula.The main specie involved in the genus Candida, was C. parapsilosis with 36% and 42% of the cases at HGCC and HIAS respectively. The main risk factors associated with candidemia, were: the previous antibiotic therapy, central venous catheter, parenteral nutrition, gastric probe, mechanical ventilation, surgery and prematurity. About the resistance to antifungals drugs was observed that amphotericin B showed a resistance level of 4%, fluconazole-56%, itraconazole-52% and cetoconazole- 86%. The PFGE technique caracterized a cromossomic profile of 6 bands for C. parapsilosis and 4 for C. tropicalis. This technique permited the diferentiation of one cepa with changed pattern of bands for the last episode of the patient 4. The technique of RAPD chacacterized a distribution pattern of predominant bands for C. parapsilosis and was capable of characterize 4 genetical profiles, denoting reinfection in 3 patients and 2 genomic profiles were found for C. tropicalis. This assay shows the emergency of the non- albicans Candida, specially the C. parapsilosis, as main responsible for the cases of candidemia in the two hospitals of tertiary indication of Fortaleza, associated with a high resistance in vitro to antifungals. The genetical variability found in C. parapsilosis and C. tropicalis through the PFGE and RAPD techniques, revealed reinfection pictures, which rises the possibility that these be due to a contamination among patients or indirectly through the healthy workers.

Neospora caninum é um parasito intracelular obrigatório, formador de cistos, que acomete vários animais domésticos e silvestres, tendo maior importância nas espécies canina e bovina, nas quais causa problemas nervosos e reprodutivos. Os canídeos do gênero Canis são os únicos reconhecidos como hospedeiros definitivos do N. caninum até o momento, nos quais ocorre a fase sexuada de multiplicação, resultando na eliminação de oocistos pelas fezes. Toxoplasma gondii também é um coccídio responsável por uma das zoonoses de maior importância e ocorrência em todo o mundo. A fase assexuada de desenvolvimento do T. gondii ocorre nos mamíferos e aves (hospedeiros intermediários) com formação de cistos teciduais e a fase sexuada de desenvolvimento ocorre no intestino delgado dos hospedeiros definitivos, que são os membros da família Felidae. Este estudo teve por objetivo determinar a soroprevalência de anticorpos contra Neospora spp. e T. gondii em equídeos de diferentes regiões do Brasil e o isolamento e caracterização genética destes coccídios em amostras de tecidos de equídeos. A sorologia para T. gondii e Neospora spp. foi realizada em 453 amostras de soros por meio da Reação de Imunofluorescência Indireta com ponto de corte de 50 para Neospora spp e 64 para T. gondii. Deste total, oito (1,75%) amostras (sete de jumentos e um de cavalo) foram positivas para Neospora spp. e 129 (28,47%) amostras (82 jumentos, 32 cavalos e 15 mulas) para T. gondii. Para o isolamento do T. gondii foram realizados 29 bioensaios em camundongos, sendo 19 de animais soropositivos e 10 de pools de tecidos de cavalos soronegativos. Por meio dessa prova biológica, foi possível o isolamento em uma amostra de jumento (Equus asinus) de Mossoró, RN, ocorrendo a morte dos dois únicos camundongos infectados, no 16o e 17o dia pós-inoculação. A caracterização genotípica do isolado foi realizada pela PCR-RFLP utilizando 12 marcadores genotípicos. A genotipagem dessa amostra evidenciou o genótipo #60 TgCkBr220, já isolado em galinha do Arquipélago de Fernando de Noronha, PE, Brasil. O isolamento de Neospora spp em gerbilos não pode ser feito uma vez que não foi possível a obtenção de tecidos dos equídeos soropositivos. / Neospora caninum is an obligate intracellular parasite, forming cysts that affect many domestic and wild animals, having greater importance in canine and bovine species due neurological and reproductive problems. Canids of the genus Canis are recognized as the only definitive hosts of N. caninum until the moment in which sexual phase occurs multiplication, resulting in the elimination of oocysts in the feces. Toxoplasma gondii is also a coccidian parasite responsible for a zoonotic disease of great importance and occurrence around the world. The asexual developmental stage of T. gondii occurs in mammals and birds, the intermediate hosts, resulting in the formation of cysts and the sexual stage occurs in the small intestine of definitive hosts, which are the felids, occurring oocysts formation. This study aimed to determine the seroprevalence of antibodies against Neospora spp. and Toxoplasma gondii in equids from different regions of Brazil and the isolation and genetic characterization of these parasites from equids tissue. Serology for T. gondii and Neospora spp. was performed in 453 serum samples by Immunofluorescence Antibody Test (IFAT). Of this total, eight (1.75%) samples (seven of donkeys and one of horse) were positive to Neospora spp. antibodies and 129 (28.47%) samples (82 donkeys, 32 horses, 15 mules) were T. gondii seropositive. For the isolation of T. gondii, bioassay was performed in mice. A sample of one donkey (Equus asinus) from Mossoró, RN, was obtained with two of the 20 inoculated mouse infected. The mouse died at day 16th and 17th post inoculation. The genotypic characterization of the isolate was performed by PCR-RFLP using 12 genotypic markers. Genotyping showed the genotype #60 TgCkBr220, already described in chickens from Fernando de Noronha, PE, Brazil. Due the impossibility of acquisition of tissue from Neospora spp seropositive equids, isolation of this coccidian by gerbil bioassay was not possible to be done.

Recentemente, estudos de Genome Wide Association (GWA) identificaram uma nova região cromossômica, 18q22, como de susceptibilidade ao Diabetes tipo 1 autoimune (DM1A). Nesta região localiza-se o gene CD226, responsável por codificar uma molécula de adesão leucocitária (CD226) envolvida no processo de adesão celular, diferenciação de células T CD4+ virgens, citotoxicidade induzida por células natural killer (NK) e produção de citocinas. Até o momento, apenas o polimorfismo rs763361 A/G foi relacionado ao diabetes autoimune e pouco é conhecido quanto ao envolvimento de outras variantes do CD226, associadas a outras doenças autoimunes, na patogênese do DM1A. Com o objetivo de definir as variantes polimórficas relacionadas à susceptibilidade ao DM1A, às suas características fenotípicas e outras manifestações de autoimunidade, 532 pacientes diabéticos tipo 1A e 594 controles normais foram envolvidos neste estudo. Inicialmente, em um subgrupo de 106 diabéticos e 102 controles, as regiões codificadoras e flanqueadoras do gene CD226, obtidas do DNA genômico de leucócitos do sangue periférico, foram amplificadas pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase e submetidas à sequenciamento direto. Em uma segunda etapa, os polimorfismos rs763361, rs1788101 e rs727088 foram genotipados pelo ensaio TaqMan nos demais pacientes e controles. Resultados: foram identificadas 12 variantes no gene CD226, sete com frequência acima de 5%. Nenhuma variante nova foi encontrada. A variante rs727088 não estava em equilíbrio de Hardy Weinberg no grupo controle. Os genótipos AA da variante rs763361 e CC do rs727088 foram associados ao risco de DM1A e estavam em desequilíbrio de ligação. O genótipo do haplótipo ACAC, formado pelas variantes de risco, predominou nos pacientes diabéticos. Tanto o genótipo AA do rs763361 como o CC do rs727088 e o genótipo do haplótipo ACAC foram associados com menores valores de peptídeo C em pacientes com até dois anos de duração da doença. Nenhum polimorfismo influiu na presença de autoanticorpos pancreáticos e extra-pancreáticos. Conclusão: O genótipo AA da variante rs763361 do gene CD226 predispõe ao diabetes autoimune na nossa população, assim como a menores valores de Peptídeo C, contribuindo para a maior agressividade da doença. Dados da variante rs727088 devem ser analisados com cautela devido à falta de equilíbrio de Hardy Weinberg no grupo dos controles / Recently, Genome Wide Association (GWA) studies identified a new locus, 18q22, as a canditate to Type 1 A, or immune mediated diabetes (T1AD) susceptibility. This locus harbors the CD226 gene, responsible for encoding the leukocyte adhesion molecule (CD226) involved in cell adhesion, differentiation of naïve CD4+T cells, cytotoxicity induced by natural killer (NK) cells and cytokine production. Although just one single nucleotide polymorphism (SNP) rs763361 A/G had been related to T1AD, little is known about the involvement of new variants of CD226, implicated in other autoimmune disorders, in the pathogenesis of T1AD. In order to identify polymorphic variants related to T1AD susceptibility and their influences in phenotypic characteristics and other manifestations of autoimmunity, 532 type 1A diabetic patients and 594 health controls were enrolled in this study. Initially, in a subset of 106 diabetics and 102 controls, coding and flanking regions of CD226 gene obtained from genomic DNA extraction were amplified by polymerase chain reaction technique and subjected to direct sequencing. In a second step, the polymorphisms rs763361, rs727088 and rs1788101 were genotyped by TaqMan assay in the remaining patients and controls. Results: 12 variants in CD226 gene, seven of them with frequency above 5 % where identified. We did not found new variants. The variant rs727088 was not in Hardy Weinberg equilibrium in the control group. The genotypes AA (OR=1.45; p=0.005) and CC (OR=1.41; p=0.01) related to rs763361 and rs727088 variants respectively, were associated with risk of T1AD. Both predominated in female (p<0.01). Further, these variants were in linkage disequilibrium. The genotype haplotype ACAC formed by the risk variants was more frequent in patients with diabetes (30.5% x 25.6%; OR=1.42; p=0.014). The AA genotype of rs763361, the CC genotype and ACAC genotype haplotype were associated with lower levels of C-peptide in patients with no more than two years of disease course. The presence of pancreatic and extra-pancreatic autoantibodies was not associated with CD226 SNPs. Conclusion: The AA genotype of rs763361 variant of the gene CD226 predisposes to autoimmune diabetes in our population, as well as to lower levels of C-peptide, contributing to the aggressiveness of the disease. It predominated in female. Data of rs727088 variant should be analyzed with caution due to the lack of Hardy Weinberg equilibrium in the control group

Made available in DSpace on 2016-08-19T17:37:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_SULAYNE JANAYNA ARAUJO GUIMARAES.pdf: 2540252 bytes, checksum: 857ace608d3bf1b7e0a27229b8b53d98 (MD5) Previous issue date: 2014-12-03 / FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLÓGICO DO MARANHÃO / The anal squamous cell carcinoma (SCCA) is rare, but its incidence has increased and have often been associated with human papilloma presence virus (HPV). Objective: In order to determine the prevalence of HPV infection in this histological variant, the study analyzed paraffin embedded samples of anal carcinoma in patients treated at the University Hospital of the Federal University of Maranhão (HUUFMA) and Maranhão Institute of Oncology Aldenora Bello (IMOAB) between 2001 and 2011. Methods: samples of anal cancer were included whose histological slides and paraffin blocks contained in patient files diagnosed in the Pathology Services IMOAB and HUUFMA and allowed confirmation of the diagnosis and evaluation of the proposed criteria this work. We collected demographic variables relating to the profile and clinical partner in the medical records and pathological reports of 27 patients. The tissue samples preserved in paraffin blocks were sent for DNA extraction using Qiagen column and Xylene Kit. The β-globin constitutive gene was amplified to certify the integrity of DNA in the samples. Later, there was amplification of HPV DNA by reaction technique Polymerase Chain (PCR) using the primer and SPF10 genotyping by reverse hybridization. Results: Among the patients evaluated, 74.07% were women; and 40.75% of the patients were aged between 42 and 52 years. Risk factors such as smoking (22.22%) and alcohol consumption (11.11%) were recorded in this group. Metastases were detected in 11.11% of cases with two cases of distant metastasis to the liver, rectum and vagina. HPV detection was at 81.48% of the positive samples. HPV16 was detected in 100% of the positive samples. High prevalence of HPV 11 was detected also in 11/27 (40.74%). Multiple infections showed 45.45% (10/22) of prevalence in the sample. Conclusion: Our results provide further evidence in support of the strong association of high-risk HPV infection in the development of anal SCC also highlighting a concern with late diagnosis and the need for monitoring and preventive measures for anal carcinoma. / Introdução: O carcinoma anal de células escamosas (SCCA) é raro, porém sua incidência vem aumentando e têm sido frequentemente associado à presença do papiloma vírus humano (HPV). Objetivo: Com o objetivo de verificar a prevalência da infecção por HPV nessa variante histológica, o estudo analisou amostras parafinadas de carcinoma anal em pacientes atendidos no Hospital Universitário da Universidade Federal do Maranhão (HUUFMA) e no Instituto Maranhense de Oncologia AldenoraBello (IMOAB), entre 2001 e 2011. Método: Foram incluídas amostras de câncer anal cujas lâminas histológicas e blocos parafinados constavam nos arquivos de pacientes diagnosticados nos Serviços de Anatomia Patológica do IMOAB e no HUUFMA e permitiram confirmação do diagnóstico e avaliação dos critérios propostos neste trabalho. Foram coletados variáveis referentes ao perfil sócio demográfico e clinico nos prontuários e nos laudos anatomopatológicos de 27 pacientes. As amostras de tecido conservadas em blocos de parafina foram encaminhadas para extração de DNA usando Xilol e Kit de coluna Qiagen. O gene constitutivo β-globina foi amplificado para atestar a integridade do DNA nas amostras. Posteriormente, realizou-se a amplificação do DNA do HPV pela técnica de Reação em Cadeia da Polymerase (PCR) utilizando o primer SPF10 e genotipagem por hibridização reversa. Resultados:Dentre os pacientes avaliados, 74,07% eram mulheres; e 40,75% dos pacientes estavam na faixa etária entre os 42 e 52 anos. Fatores de risco, como tabagismo (22,22%) e etilismo (11,11%) foram registrados no grupo estudado. Metástases foram detectadas em 11,11% dos casos tendo dois casos de metástase à distância para o fígado, reto e vagina. A detecção de HPV foi positiva em 81,48% das amostras. O HPV16 foi detectado em 100% das amostras positivas. Foi detectada alta prevalência também do HPV11 em 11/27 (40,74%). As infecções múltiplas apresentaram 45,45% (10/22) de prevalência na amostra estudada. Conclusão: Nossos resultados fornecem evidências adicionais em apoio à forte associação da infecção pelo HPV de alto risco no desenvolvimento do CCS anal, destacando também uma preocupação com o diagnóstico tardio e a necessidade de monitoramento e medidas de prevenção para o carcinoma anal.

O papilomavírus humano (HPV) é transmitido principalmente através do contato sexual e a infecção por estes vírus está fortemente associada ao desenvolvimento de tumores do colo do útero, da vulva e do ânus em mulheres, câncer do pênis e do ânus em homens, assim como tumores da cabeça e pescoço em ambos os sexos. Também há estudos em andamento para estimar a proporção de câncer de pele não-melanoma que podem ser atribuíveis às infecções por tipos virais pertencentes aos ramos cutâneos da filogenia do HPV. Os beta- (beta-) HPV vem sendo predominantemente isolados de tecidos cutâneos e sugere-se que façam parte da flora comensal humana. Entretanto, pouco se sabe sobre o papel destes nos sítios de detecção, seja em indivíduos imunosuprimidos como imunocompetentes. A fim de compreender a história natural dos HPV em homens, o Estudo da Infecção por HPV em homens (HIM Study) foi desenhado e conduzido entre 2005 e 2013 no Brasil, México e Estados Unidos (EUA). Em sua primeira triagem de amostras genitais, observou-se que 14,7% eram positivas para HPV, entretanto não correspondia a nenhuma das 37 sondas tipo-específicas para detecção dos principais beta- HPV. Após um protocolo de PCR fazendo uso de iniciadores genéricos, seguido por sequenciamento, observou-se um elevado número de tipos virais cutâneos nessas amostras. Perante isso, os objetivos deste trabalho foram (1) Determinar a prevalência de 43 tipos de beta-HPV em 729 homens participantes do estudo HIM que forneceram amostras anogenitais e orais em mesma visita de seguimento; (2) Identificar fatores demográficos e sexuais independentemente associados com a detecção de DNA destes tipos de HPV nos diferentes sítios anatômicos analisados. Para atingi-los, utilizou-se a metodologia Luminex atualmente bem estabelecida para genotipagem de beta-HPV. Dentre os homens genotipados, 557 (77,7%), 389 (54,3%) e 210 (29,3%) foram positivos para algum tipo de beta-HPV no região genital, do canal anal e da cavidade oral, respectivamente. Os tipos de beta-HPV mais prevalentes foram HPV-21, -22, -24 e -38 em todos os sítios anatômicos. Homens residentes no EUA (OR = 0,55, 95% intervalo de confiança [IC] de 0,38-0,80) e Brasil (OR = 0,49, 95% CI 0,33-0,73) foram significativamente menos propensos a serem detectados com algum beta-HPV no canal anal, comparado aos residentes no México. A idade foi marginalmente associada à maior prevalência de HPV na região do canal anal sendo que de homens mais velhos (31-44 anos, OR = 1,30, 95% CI 0,93-1,82; 45-70 anos, OR = 1,59, 95% CI 0,98-2,58) foram mais propensos a serem positivos para DNA de beta-HPV, comparado a homens mais jovens (18-30 anos). A prevalência de algum beta-HPV na cavidade oral também foi significativamente associada ao país de residência e idade. Fumantes (OR = 0,50, 95% CI 0.32-0.80) foram significativamente menos propensos a serem positivos para beta-HPV na cavidade oral do que os homens que nunca fumaram. A ausência de associação entre a detecção de beta-HPV e comportamentos sexuais específicos sugere o contato digital e auto-inoculação como rotas alternativas de transmissão desses vírus / HPV is primarily transmitted by sexual contact and infection by these viruses is strongly associated with the development of tumors in the cervix, vulva and anus in women, cancer of the penis and anus in men, as well as tumors in the head and neck in both genders. There are also ongoing studies ongoing to estimate the proportion of nonmelanoma skin cancer that may be attributable to infection by viral types from cutaneous branches of the phylogeny of HPV. Human beta papillomaviruses (beta-HPV) have been predominantly isolated from cutaneous tissues, and are thought to be part of the commensal flora. However, the role of beta-HPV detection in these sites is unknown, whether in immunosuppressed or immunocompetent individuals. In order to understand the natural history of HPV in men, the HPV Infection in Men Study (HIM Study) was designed and conducted between 2005 and 2013 in Brazil, Mexico and the United States (US). In a first screening of genital samples, it was observed that 14.7% were positive for HPV, but did not correspond to neither 37 type-specific probes for detection of major ?-HPVs. After a PCR protocol using of generic primers followed by sequencing, we observed a large number of cutaneous HPV types in these samples. For this reason, the objectives of this study were (1) To determine the prevalence of 43 types of beta-HPV in 729 male participants of the HIM study provided anogenital and oral samples in the same follow-up visit; (2) To identify demographic and sexual factors independently associated with DNA detection of these types of HPV in different anatomical sites analyzed. To achieve these objectives we used the currently well-established Luminex methodology for beta-HPV genotyping. Overall, 557 (77.7%), 389 (54.3%) and 210 (29.3%) men were positive for any beta-HPV type at the genital, anal canal and oral cavity, respectively. The most prevalent beta-HPV types were HPV-21, -22, -24 and -38 within all anatomic sites. Men from the US (OR= 0.55, 95% Confidence Interval [CI] 0.38-0.80) and Brazil (OR=0.49, 95% CI 0.33-0.73) were significantly less likely to have any beta-HPV at the anal canal than men from Mexico. Age was marginally associated with anal HPV prevalence with older men (31-44 years, OR=1.30, 95% CI 0.93-1.82; 45-70 years, OR=1.59, 95% CI 0.98-2.58) being more likely to have any beta-HPV at the anal canal compared to younger men (18-30 years). Prevalence of any beta-HPV at the oral cavity was also significantly associated with country of origin and age. Current (OR=0.50, 95% CI 0.32-0.80) smokers were significantly less likely to have beta-HPV at the oral cavity than men that never smoked. Lack of associations between beta- HPV detection and specific sexual behaviors suggests digital contact and autoinoculation as surrogate routes of transmission of these viruses

Nesta dissertação, foi proposto o desenvolvimento de uma metodologia molecular por PCR em tempo real (qPCR) utilizando pool de DNA para a detecção de alelos que codificam antígenos importantes do sistema de grupo sanguíneo Diego. Esta ferramenta molecular será útil uma vez que são escassos os reagentes sorológicos para detecção desses antígenos e, quando existem, não permitem uma investigação em larga escala devido à pouca confiabilidade e alto custo. O sistema Diego (DI) possui 22 antígenos, sendo o antígeno Diª mais importante na prática transfusional. Eles são carreados pela proteína da Banda 3 que é proteína mais abundante na s hemácias, com 106 cópias. O antígeno possui uma maior prevalência, em indígenas americanos e asiáticos (6%-52%), já que é considerado um marcador antropológico de ancestrais mongóis; no entanto, a incidência desse antígeno tem aumentado dentre outras populações, como em caucasianos e afrodescendentes, e detectado em doadores de sangue, o que pode resultar em aloimunização de pacientes e dificultando o seu manejo terapêutico. Em contrapartida, a frequência do antígeno Dib em todas as populações é extremamente alta (>99,99%) e encontrar o raro fenótipo Di (a+b-) é ainda mais laborioso do que a busca pelo antígeno Diª. Sabe-se ainda muito pouco sobre a frequência dos antígenos Wrª e Wrb nas diferentes populações, mas estimase que a prevalência seja de 0,01% e >99,99% respectivamente. Foram utilizadas 410 amostras de doadores de sangue e 230 amostras de pacientes para genotipagem em qPCR utilizando pool de DNA para detecção dos alelos DI*01, DI*02, DI*02.03 e DI*02.04. A amplificação individualizada foi realizada quando a reação com pool demonstrou a amplificação de um dos alelos de interesse, DI*01 ou DI*02.03. Procedeu-se também com a clonagem dos alelos após à amplificação com as amostras controle, porém, ocorreu somente a clonagem dos alelos DI*02 e DI*02.03. Os fragmentos clonados apresentaram amplificação excelente e serão utilizados como controle positivo em testes moleculares futuros. Não foi possível a clonagem do DI*01 pelo problema da zigozidade da amostra controle. Houve 100% de concordância entre o resultado da genotipagem e as informações de fenotipagem das amostras controle. O alelo DI*01 ocorreu em 0,6% dos doadores de sangue e 1,7% em afrodescendentes, que corresponde a uma frequência genotípica DI*01/DI*02 de 1,2% e 1,3% respectivamente. Procedeu-se com as análises estatísticas comparativas entre o resultado desta pesquisa e de outras na população brasileira sobre os diferentes genótipos para entender se havia uma diferença estatística considerável. Ainda que a frequência para o genótipo DI*01/DI*02 seja mais baixa em doadores e mais alta em afrodescendentes do que o publicado em outros trabalhos brasileiros, a análise dos dados demonstrou que não havia diferença estatística com a maioria deles. A incidência aumentada do alelo DI*01 na população afrodescendente demonstra o aspecto da miscigenação. Conclui-se que a metodologia proposta funciona e tem aplicabilidade imediata em doadores de sangue e na busca de fenótipos raros. A incidência do alelo para Diª em doadores de sangue está abaixo do que um estudo anterior detectou em Ribeirão Preto (COZAC, 2004), que pode ser explicado pelas diferenças no censo populacional entre os estudos e pela coleta de amostra de universitários (62%). Não foram encontrados os genótipos DI*01/DI*01, DI*02.03/DI*02.03 e DI*02.03/DI*02.04 nas populações estudadas. / This work proposed the development of a molecular methodology by Real Time-PCR (qPCR) using DNA pool for the detection of alleles that encode important antigens of the Diego blood group system. This molecular tool will be useful since the serological reagents for the detection of these antigens are scarce and, when they exist, do not allow a large scale investigation due to the low reliability and high cost. The Diego (DI) system has 22 antigens, the Diª antigen is the most important in transfusion practice. They are carried by the Band 3 protein which is the most abundant protein on the erythroid surface, about 106 copies. The antigen has a higher prevalence in american indians and asians (6%-52%), since it is considered an anthropological marker of Mongolian ancestors; however, the incidence of this antigen has increased among other populations, such as in caucasians and afrodescendants, and detected in blood donors, which may result in alloimmunization of patients and make difficult their therapeutic management. In contrast, the frequency of Dib antigen in all populations is extremely high (>99.99%) and finding the rare phenotype Di (a+b-) is even more laborious than the search for Diª antigen. The frequency of Wrª and Wrb antigens in different populations is not well-known, but it is estimated that the prevalence is 0.01% and >99.99% respectively. 410 blood donor samples and 230 patient samples were used for genotyping in qPCR using DNA pool to detect the alleles DI*01, DI*01, DI*02.03 and DI*02.04. The single amplification was performed when the pool reaction demonstrated the amplification of one of the alleles of interest, DI*01 or DI*02.03. The alleles were also cloned after the control samples amplification. Only the cloning of the DI*02 and DI*02.03 alleles occurred, they presented excellent amplification and will be used as positive controls in future molecular tests, it was not possible to clone DI*01 by the control sample zygosity though. There was 100% agreement between the genotyping results and the phenotype information of the control samples. The DI*01 allele occurred in 0,6% of the blood donors and 1,7% in afrodescendants, which corresponds to a genotypic frequency DI*01/DI*02 of 1,2% and 1,3% in respectively. The comparative statistical analyzes between this research results and others in the Brazilian population on the different genotypes was performed to understand if there was a considerable statistical difference. Although the frequency of the genotype DI*01/DI*02 is lower in donors and higher in afrodescendants than that published in other Brazilian studies, data analysis showed that there was no statistical difference with most of them. The increased incidence of the DI*01 allele in the afrodescendant population demonstrates the aspect of miscegenation. It is concluded in this work that the proposed methodology works and has immediate applicability in the screening of blood donors and search for rare phenotypes. The incidence of the allele encoding Di ª antigen in blood donors is below than previously detected in Ribeirão Preto (COZAC, 2004), which can be explained by the differences in the population census between the studies and by the sample collection of university students (62%). The genotypes DI*01/DI*01, DI*02.03/DI*02.03 and DI*02.03/DI*02.04 were not found in the populations studied.