Orientador: Paulo Câmara Marques Pereira / Resumo: A doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi), ainda é considerada como um problema de saúde pública em muitos países da América Latina. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, estima-se que entre seis a sete milhões de pessoas no mundo estejam infectadas. Indivíduos na fase crônica da doença podem ser classificados como assintomáticos ou sintomáticos (estes, desenvolvendo as formas clínicas cardíaca, digestiva ou mista). Os assintomáticos correspondem a 70% dos indivíduos nessa fase e, embora apresentem sorologia positiva para anticorpos anti T-cruzi, não desenvolvem manifestações clínicas da doença. O motivo pelo qual alguns pacientes permanecem assintomáticos, e outros desenvolvem sintomas severos, ainda é desconhecido. Fatores genéticos do hospedeiro são bastante relevantes e podem explicar a heterogeneidade encontrada em pacientes que vivem com a doença em áreas endêmicas. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) no gene TNF-α (rs1800629) e ACAT-1 (rs1044925) em indivíduos com DC crônica e verificar se os mesmos estão relacionados com a susceptibilidade para manifestação de formas clínicas sintomáticas com uso da técnica PCR-RFLP. Foram genotipadas 124 amostras para o gene TNF-α e 135 para o gene ACAT-1. Foi observada associação significativa da presença do alelo A do gene TNF- α em indivíduos sintomáticos em relação aos assintomáticos (p = 0,045). Também houve associação si... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chagas disease (CD), caused by the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is still considered a public health problem in many Latin America countries. According to the World Health Organization, it is estimated that between six and seven million people worldwide are infected. Disease’s chronic phase individuals may be classified as asymptomatic or symptomatic (these, developing as clinical cardiac, digestive or mixed forms). Asymptomatic individuals account for 70% of the patients at this stage and, although they have positive serology for anti-T-cruzi antibodies, they do not develop it’s clinical manifestations. The reason why some patients remain asymptomatic, and others develop severe symptoms, is still unknown. Host’s genetic factors are quite relevant and may explain the heterogeneity found in patients living with the disease in endemic areas. The objective of this study was to evaluate SNPs in the TNF-α (rs1800629) and ACAT-1 (rs1044925) genes in individuals with chronic CD and to verify if the polymorphisms are related to the susceptibility to manifestation of symptomatic clinical forms using the PCR-RFLP technique. Were genotyped 124 samples for the TNF-α gene and 135 for the ACAT-1 gene. Significant association for the presence of the A allele of the TNF-α gene was observed for symptomatic individuals in relation to the asymptomatic ones (p = 0.045). There was also a significant association between the G allele (p = 0.008) and the GG genotype (p = 0.001) of the TNF-... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-05-14T13:46:13Z No. of bitstreams: 1 diogo_a_tschoeke_ioc_bcs_0001_2010.pdf: 39185036 bytes, checksum: e20b3df10a81fb78c2e226162dfdd94c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-14T13:46:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 diogo_a_tschoeke_ioc_bcs_0001_2010.pdf: 39185036 bytes, checksum: e20b3df10a81fb78c2e226162dfdd94c (MD5) Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Este trabalho teve com objetivo o desenvolvimento e a validação/aplicação de um sistema integrado de genotipagem de protozoários, utilizando uma abordagem multidisciplinar envolvendo, PCR multiplex e análise bioinformática envolvendo evolução e filogenia molecular. Para isso, trinta e seis genes ortólogos universal (UOG) foram identificados e usados como marcadores para genotipagem de protozoários parasitas, a nível inter-específico. Temos extraído os dados genéticos de genes ortólogos universal selecionado. Para isso, estamos utilizando sequências de grupos ortólogos (COG e KOG). O COG é composto de genes ortólogos individuais ou grupos de ortólogos de parálogos de 3 ou mais linhagens filogenéticas. Os COG de interesse selecionados estão envolvidos processo de tradução protéica, categoria J do COG, e estes genes foram selecionados porque eles estão presentes em todos os organismos estudados até agora, o que facilita a montagem de um sistema integrado de protozoários patogênicos. As sequências desses genes foram obtidos a partir do banco de dados GenBank. Seqüências de espécies de Eimeria tenella, Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, Trypanosoma brucei, T. cruzi, T. vivax, Plasmodium falciparum e P. vivax foram obtidas e armazenadas localmente. Estas sequências nucleotídicas foram traduzidas em proteínas, e então validadas usando a ferramenta COGnitor/KOGnitor, que mostra a sequência selecionada pertence ao respectivo COG de interesse. Após essa validação, as sequências foram utilizadas nos alinhamentos e construção de iniciadores que foram usados para gerar fragmentos gênicos amplificados por PCR. Os programas para a construção dos iniciadores foram: Mafft para a construção de alinhamentos múltiplos de cada COG, JalView para visualizá-los e o programa Primer3 para o desenho dos iniciadores. Todo o processo foi realizado por um pipeline de integração destes programas escritos em linguagem de programação Perl. Após o processo automatizado de validação, alinhamento e construção dos iniciadores, realizamos uma análise final dos iniciadores, considerando suas características e da região de pareamento. Quando necessário, definiu-se manualmente a degeneração da posição dos nucleotídeos que contem a variação. Criamos 33 pares de iniciadores, que foram utilizados para a amplificação destes genes via PCR. As reações de amplificação da PCR fora bem-sucedida em 19 UOG nas espécies Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, L. mexicana, T. cruzi, T. vivax e Plasmodium vivax, utilizando-se iniciadores com posições degeneradas. Para genotipagem das seqüências geradas pela PCR, foi utilizado o programa Phred que realizou a leitura dos cromatogramas com qualidade por base, Phred ≥ 15, e o programa Blast foi utilizado para a caracterização das sequências geradas, estas duas etapas foram realizadas em pipeline de anotação que está disponível através de um website. As árvores filogenéticas foram geradas com o método de máxima verossimilhança utilizando o pipeline ARPA, e revelou que a metodologia apresenta potencial para ser utilizado na genotipagem destes organismos e os genes da metionil-tRNA sintetase e Seril-tRNA sintetase mostraram boa resolução para a genotipagem inter-específicas de tripanosomatídeos. / The aim of this work is to develop and validate an integrated genotyping system for protozoan parasites, using a multidisciplinary approach involving, multiplex PCR, and bioinformatics analysis involving molecular evolution and phylogeny. For this, thirty three universal orthologous genes (UOG) has been identified [1] and used as markers for genotyping parasitic protozoan at the intraspecific level. We have mined genomic data of universal orthologous genes selected. For this, we are using sequences of orthologous groups (COGs and KOGs). The COG's consists of individual orthologous genes or orthologous groups of paralogous of 3 or more phylogenetic lineages. The selected COGs of interest are involved protein translation process, category J of the COG and these genes are selected because they are present in all organisms studied so far, facilitating the assembly of an integrated system for the pathogenic protozoa. Note that all these genes are part of the process of protein translation. The sequences of these genes were obtained from GenBank database. Sequences of species, Eimeria tenella, Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, Trypanosoma brucei, T. cruzi, T. vivax, Plasmodium falciparum and P. vivax were obtained and locally stored. Nucleotide sequences were translated into proteins. So, they are validated using the Blast similarity tool and the database as the COG itself, which shows the sequence selected belongs to the respective COG. After this validation, the sequences were used in alignments and construction of primers that are used to generate amplicons by PCR. The programs for the primer construction were: Mafft for construction of multiple alignments of each COG, JalView to view them and the program Primer3Plus [6] for the design of primers. The whole process was performed by a pipeline integrating these programs written in Perl [7] programming language. After the automated process of validation, alignment and construction of the primers, we perform a final analysis of the primers manually, which gives its characteristics and the annealing region. When necessary, we manually define the degeneration of nucleotide position containing variations. We have designed 33 primer pairs, and these primers were designed and used for PCR amplification. The reactions of PCR amplification was successful for 19 UOG in species: Leishmania major, L. braziliensis, L. infantum, L. mexicana, T. cruzi, T. vivax and Plasmodium vivax, using primers with degenerate positions. For genotyping the sequences generates by PCR amplification was used the program Phred for reading chromatograms file with quality ≥ 15, and Blast to the characterization of sequences generated, this two steps was make with a pipeline and is available through a website. The phylogenetic trees was generated with methods of maximum likelihood using the pipeline ARPA, and revealed that the methodology has potential to be used in genotyping of these organisms, and genes of methionyl-tRNA synthetase, seryl- tRNA synthetase showed good resolution for the inter-specific genotyping of trypanosomatids.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:55:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese Bete atual 3 maio 2006.pdf: 1008546 bytes, checksum: 47a15ef84c9d3ffd6d4e5ae6595331a5 (MD5) Previous issue date: 2006-05-26 / Embora os protocolos de prevenção da transmissão vertical do HIV-1 atualmente preconizados venham contribuindo para a redução da infecção na população pediátrica nos países desenvolvidos, um grande número de crianças continua sendo infectado pelo HIV em países em desenvolvimento. Dados sobre a infecção nesta população ainda são escassos. Neste trabalho, realizamos um levantamento do perfil genotípico do HIV em uma coorte de crianças infectadas pelo HIV-1 no Setor de Infectologia/AIDS Pediátrico do Centro de Referência do Hospital Infantil Nossa Senhora da Glória - Vitória / ES Os dados aqui apresentados demonstram que a prevalência e o nível de mutações de resistência às drogas foram mais evidentes no grupo de pacientes recebendo terapia com ARVs quando comparados ao grupo de pacientes virgem de tratamento, corroborando com o conceito de ação da pressão seletiva na emergência de cepas virais resistentes. Mutações de resistência primária aos ARVs não foram encontradas na grande maioria das crianças não tratadas (Grupo A), sustentando a hipótese que a transmissão vertical ocorreu a partir de mães que não tinham consciência do seu status sorológico e conseqüentemente não faziam uso de antiretrovirais. Neste grupo foi encontrado uma maior prevalência de mutações acessórias não conferindo resistência aos ARVs. A supressão máxima da replicação viral continua ser a principal meta a ser atingida pela terapia visando prevenir a emergência de cepas resistentes. Infelizmente, em 20-50% dos pacientes que iniciam HAART essa supressão viral sustentada não é atingida e podendo ser ainda maior em pacientes em esquemas de tratamentos seqüenciais. Embora, muitos fatores possam ser associados com falha virológica, incluindo baixa aderência, farmacocinética dos ARVs e regimes de tratamento sub-ótimos, a emergência de variantes virais resistentes aos ARVs tem sido a principal causa de falha de tratamento. O desenvolvimento de resistência aos ARVs tem um maior impacto no tratamento destas crianças por poder levar ao aparecimento de resistência cruzada, limitando opções futuras. A grande maioria das crianças no Grupo B já estavam em tratamento com ARVs há mais de 7 anos, sendo que alguns já haviam passado pela fase de monoterapia com AZT, depois terapia dupla e hoje se encontram no seu 2º, 3º e até mesmo 4º esquema de HAART. Estes fatos podem explicar a dificuldade de supressão da replicação viral e a conseqüente falha no tratamento encontrada nesta população. Os dados aqui apresentados enfatizam a importância de identificarmos o momento apropriado para o início da terapia com ARVs, bem como a escolha mais adequada da combinação de ARVs que leve à supressão da replicação viral de forma efetiva, sem deixarmos de considerar a importância da adesão ao esquema terapêutico por parte dos responsáveis legais por estas crianças. / Although existing protocols to prevent HIV-1 vertical transmission have contributed to reduce infection within the pediatric population in developed countries, a significant large number of children is still been infected vertically in undeveloped countries. Data regarding the latter population is still scarce. The HIV genotypic profile of a cohort of HIV-1 infected children attending to the Infectious Disease/Pediatric AIDS Ward of the Children s Hospital Nossa Senhora da Glória - Vitória / ES was evaluated in the present work. Our data demonstrated that both the prevalence and the level of genotypic resistance mutations were more evident among patients receiving HAART therapy (Group B) when compared to treatment naive patients (Group A), which supports the previous data showing the key role of antiretroviral (ARV) drugs selective pressure on the emergence of resistant virus isolates. Antiretroviral primary resistance mutations were not found in the great majority of treatment naive children, supporting the hypothesis that vertical transmission occurred from mother that didn t know their serological status and were not under treatment with ARV, the highest prevalence of viral polymorphism non-related to ARV resistance was found in this group. The main goal of ARV therapy is to achieve total suppression of viral replication, in order to prevent the emergence of ARV resistant strain. Unfortunately, in 20-50% of patients initiating HAART this total suppression is not achieved, this failure rate may be even higher among patients in sequential treatment regimens. Although several factors could be associated with treatment failure, such as non-compliance, ARV pharmacokinetics and inadequate treatment regimens, the emergence of ARV resistant viral mutants is still the main responsible for treatment failure. The development of ARV resistance has a greater impact among pediatric patients due to the fact that it may lead to cross-resistance, which may limit the use of other ARV later on. Most of the children in Group B were under treatment with ARV for more than 7 years, including some that received AZT monotherapy, than double therapy and today are in their 2nd, 3rd or even 4th HAART regimen. This fact may explain the difficulty in achieving total suppression of viral replication and consequently the high frequency of treatment failure found among patients in this group. Data presented here emphasize the importance of the correct timing for beginning ARV therapy, as well as the correct choice of ARV to achieve viral replication suppression efficiently, without forgetting the importance of patient compliance to the therapeutic regimen enforced by the legal guardians of these children.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Saick Genotipos Rotavirus.pdf: 1758385 bytes, checksum: 51837cea2c3389401234f70c01e946ff (MD5) Previous issue date: 2007-09-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Os rotavirus do grupo A (RVA) são uma das principais causas de diarréia aguda em crianças até cinco anos tanto em países desenvolvidos como em desenvolvimento. O virion possui genoma constituído por 11 segmentos de RNAdf, contido por um triplo capsídeo concêntrico, cujo padrão de migração após eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) permite a classificação em grupos (A-G) e em perfis longo, curto e super-curto. O capsídeo externo é formado pelas proteínas VP4 e VP7, cujos genes formam a base do sistema de classificação em genótipos P e G, respectivamente. O conhecimento dos genótipos de RVA em uma determinada área geográfica é essencial para o estabelecimento e o monitoramento de estratégias preventivas. Considerando a carência de estudo de genotipagem no Espírito Santo, esta pesquisa se propôs: i) determinar os genótipos de RVA obtidos de crianças com diarréia aguda, residentes na Região Metropolitana de Vitória - ES, provenientes do Pronto Socorro do Hospital Infantil Nossa Senhora da Glória (PS-HINSG) (80/253), entre fevereiro de 2003 e junho de 2004 e; ii) determinar a freqüência e os genótipos de RVA em crianças atendidas na emergência (n=5) ou hospitalizadas (n=63) na pediatria do Hospital CIAS-UNIMED, entre julho de 2004 e novembro de 2006. RNAdf viral foi extraído a partir de suspensão fecal, através do método de guanidina-sílica. EGPA foi realizado nas amostras do CIAS/UNIMED para detecção de RVs e determinação do perfil eletroforético. DNA complementar foi sintetizado por transcrição reversa utilizando o iniciador randômico pdN6 TM. PCR foi realizado utilizando um par de iniciadores consenso para VP4 (4con2/4con3) ou para VP7 (9con1/9con2) e os produtos foram utilizados na Multiplex semi-nested PCR com iniciadores específicos para G e P (G1-G5, G9, P[4], P[6], P[8], P[9]). Das cepas de RVA do PS-HINSG, observou-se os genótipos G1P[8] (83,6%), G9P[8] (7,5%), G1P[4] (2,5%), G1P[6] (1,3%), G4P[6] (1,3%) e G?P[8] (3,8%). Das amostras obtidas no CIAS/UNIMED, 20,6% (14/68) foram positivas para RVA, quatro e dez com perfis curto e longo, respectivamente. Destas cepas, foram observados os genótipos G9P[8] (50%), G2P[4] (28,7%), G2P[8], G1P[8] e G?P[8] (7,1%, cada). Nenhuma infecção mista foi observada em ambos hospitais. Estes dados revelam: i) G1P[8] e G9P[8], genótipos prevalentes no PS-HINSG e no CIAS/UNIMED, espectivamente; ii) G9P[8], detectado no final do período de coleta das amostras do PS-HINSG, sugere flutuação temporal na circulação; iii) G2P[4], encontrado somente em 2006 nas crianças hospitalizadas. Os resultados obtidos sugerem que a vacina Rotarix® utilizada no Brasil poderá ser eficiente em reduzir o número de casos e a gravidade da doença na região do estudo. Entretanto, destaca-se o surgimento do genótipo G2 para o qual a vacina apresenta menor proteção, reforçando a necessidade de vigilância contínua dos genótipos circulantes como monitoramento da eficácia da vacina. / Group A rotaviruses (RVA) are a major cause of acute diarrhea in children up to 5 years in both developing and developed countries. The virion consists of 11 double-stranded RNA (dsRNA) genome enclosed in a triple-shelled capsid, which migration pattern in polyacrilamide gel eletrophoresis (PAGE) permit the classification in groups (A-G) and in long, short and super-short profiles. The outer shell is composed by VP4 and VP7 proteins which genes form the basis of the classification system in P and G genotypes, respectively. The knowledge about RVA genotypes distribution is essential for the establishment and the monitoring of preventive strategies. Considering the lack of these studies in Espírito Santo State, this investigation proposed: i) to determine RVA genotypes obtained from children with acute diarrhea, resident in Metropolitan region of Vitória - ES, from the Emergency Room at Hospital Infantil Nossa Senhora da Glória (HINSG) (80/253), collected between February 2003 and June 2004 and; ii) to determine the frequency and RVA genotypes in children attended at Emergency (n=5) or hospitalized (n=63) from Pediatric Setor of CIAS/UNIMED hospital, between July 2004 and November 2006. dsRNA were extracted from fecal suspensions by guanidine-silica procedure. PAGE was performed in CIAS/UNIMED samples for rotaviruses detection and eletropherotype determination. Complementary DNA was obtained by reverse transcription with pdN6 TM random primer. PCR were done with a pair of consensus primers for VP4 (4con2/4con3) or VP7 (9con1/9con2) and the products were submitted to Multiplex semi-nested PCR with specific primers for the G and P types (G1-G5, G9, P[4], P[6], P[8], P[9]). RVA genotypes observed from HINSG were G1P[8] (83.6%), G9P[8] (7.5%), G1P[4] (2.5%), G1[6] (1.3%), G4P[6] (1.3%) and G?P[8] (3.8%). Among samples stools from CIAS/UNIMED, 20.6% (14/68) were RVA positive, four and ten with short and long eletropherotypes, respectively. The following genotypes were observed: G9P[8] (50%), G2P[4] (28.7%), G2P[8], G1P[8] and G?P[8] (7%, each). No mixed infection was observed in both hospitals. These data reveal: i) G1P[8] and G9P[8] were the most common genotypes from HISNG and CIAS/UNIMED, respectively; ii) G9P[8] was detected in the end of the samples obtainment, suggesting temporal fluctuation on genotype circulation; iii) G2P[4] was found only in 2006 from hospitalized children. The results suggest that RotarixTM vaccine used in Brazil may efficiently reduce the severity and the number of RVA cases in the region studied. However, it must be emphasize the emergence of G2 type for which the vaccine shows lower protection, reforcing the need of continuous surveillance of RVA genotypes as vaccine efficacy monitoring.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao - Cynthia.pdf: 1641533 bytes, checksum: 56ac8be8ae2e1e0e55c011b99fe0d3aa (MD5) Previous issue date: 2009-03-20 / Rapidly growing mycobacteria (RGM) can cause a wide spectrum of disseminated or localized diseases, especially pulmonary, skin, or soft tissue infections. In last years infections due to contaminated materials and invasive procedures have been also increasingly reported. Recent outbreaks of infections affecting more than 1000 patients submitted to different invasive procedures in Brazil underscores this issue. Of the RGM, members of the M. chelonae - M. abscessus group are the most pathogenic and antimicrobial resistant. Even with multiple drug combinations, multiresistant RGM infections may be difficult to cure. In this study we describe the molecular identification, typing and in vitro susceptibilities to antimicrobial agents of RGM involved in recent infections in Brazil. The study was carried out in two groups of RGM isolates: one group recovered from different outbreaks (75 isolates) and a second group recovered from sporadic infections (10 isolates). hsp65 and rpoB gene sequencing was used for discrimination between species of M. chelonae - M. abscessus group and pulsed field gel electrophoresis (PFGE) was used to evaluate possible clonal relatedness and diversity among the isolates. Broth microdilution MICs of 15 antimicrobial agents were determined for these clinical isolates. Three species were identified in RGM outbreaks: M. massiliense from video assisted surgeries; M. bolletii from mesotherapy and M. abscessus from liposuction and mammaplasty. Molecular typing by PFGE demonstrated the clonal relatedness within M. massiliense isolates and within M. abscessus isolates. Mesotherapy and pulmonary isolates presented different PFGE patterns. Our results showed that the isolates drug resistance does not differed markedly by PFGE pattern. The resistance rates of these isolates to the currently available agents were high. The majority of M. massiliense isolates was susceptible to clarithromycin, amikacin and tigecyclin, whereas M. bolletii and M. abscessus isolates were susceptible only to amikacin and tigecyclin and moderately susceptible to cefoxitin. In conclusion, despite in vitro drug sensitivity tests limitations, the results provided may be sufficient to guide clinicians in selecting appropriate therapy for RGM infections. / Micobactérias de crescimento rápido (MCR) podem causar um amplo espectro de doenças, desde infecções cutâneas superficiais até doenças disseminadas graves. Relatos de infecções adquiridas devido ao uso de materiais contaminados e a procedimentos cirúrgicos invasivos têm aumentado nos últimos anos. Os surtos ocorridos recentemente no Brasil e que afetaram mais de 1000 pacientes comprovam este fato. Entre as espécies de MCR, aquelas pertencentes ao grupo M. chelonae - M. abscessus são as mais patogênicas e resistentes aos antimicrobianos. Mesmo em vigência de poliquimioterapia, pacientes portadores de infecções causadas por MCR podem não obter cura clínica. Neste estudo, identificamos espécies de MCR envolvidas em surtos e infecções esporádicas no Brasil no período de 2004 a 2008 e analisamos seus perfis genotípicos e de sensibilidade a antimicrobianos. Para isso, realizamos o estudo em dois grupos de MCR: o primeiro constituído por isolados relacionados a surtos (75 isolados) e o segundo por isolados não relacionados a surtos (10 isolados). O seqüenciamento dos genes hsp65 e rpoB foi utilizado para diferenciar entre as espécies do grupo M. chelonae - M. abscessus e a eletroforese em campo pulsátil (PFGE) para avaliar possíveis semelhanças entre os perfis genotípicos. A determinação das concentrações inibitórias mínimas (MIC) de 15 antimicrobianos frente aos isolados de MCR foi determinado pelo método de microdiluição em caldo. A partir dos testes realizados, foram identificadas 3 espécies de MCR relacionadas a surtos: M. massiliense, relacionado a videocirurgias; M. bolletii relacionado a mesoterapia; e M. abscessus, relacionado a cirurgias estéticas. A análise genotípica por PFGE desses isolados permitiu demonstrar ou comprovar a relação clonal entre os isolados de M. massiliense e entre os isolados de M. abscessus. Porém, os isolados provenientes de mesoterapia e infecções esporádicas apresentaram diferentes perfis genotípicos. As espécies analisadas, independentemente de sua origem (surto ou infecção esporádica) apresentaram uma ampla resistência in vitro aos antimicrobianos. Isolados de M. massiliense só apresentaram sensibilidade in vitro à claritromicina, amicacina e tigeciclina, enquanto os isolados de M. bolletii e M. abscessus foram sensíveis somente à amicacina e tigeciclina e moderadamente sensíveis à cefoxitina. Em conclusão, a análise ampla dos perfis genotípicos e, sobretudo de resistência, como efetuado neste trabalho, mesmo com as limitações próprias de um critério fenotípico in vitro, pode auxiliar o médico na fundamentação do esquema terapêutico.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cynara Oliveira Possamai.pdf: 3245812 bytes, checksum: 7de0caeadb98d478a083db43020f22f8 (MD5) Previous issue date: 2012-08-28 / O gênero Acanthamoeba compreende protozoários anfizóicos que estão presentes nos mais diversos ambientes, podendo causar no homem doenças graves, como a ceratite amebiana e a encefalite amebiana granulomatosa. Os fatores envolvidos na patogenicidade de Acanthamoeba não são inteiramente conhecidos, por isso, alguns marcadores vêm sendo investigados na tentativa de identificar linhagens capazes de causar infecção. O objetivo deste trabalho foi investigar a ocorrência de Acanthamoeba em amostras clínicas e ambientais, bem como caracterizar os isolados obtidos por parâmetros morfológicos, genotipagem e avaliação do potencial patogênico. Foram coletadas amostras de raspado de córnea de pacientes com suspeita de ceratite amebiana e amostras ambientais provenientes de poeira, solo, piscina, água potável, água de inundação e água do mar da região metropolitana de Vitória-ES. Todas as amostras foram cultivadas em meio ágar soja. Além da cultura, as amostras de raspado de córnea também foram coletadas em salina de Page e submetidas a uma reação de semi-nested PCR. Culturas positivas para Acanthamoeba, identificadas com base na morfologia dos cistos e trofozoítos, foram selecionadas, clonadas e classificadas nos grupos morfológicos I, II ou III. A genotipagem dos isolados foi realizada a partir do sequenciamento parcial do gene 18S rDNA e o potencial patogênico das culturas clonadas foi avaliado por meio de ensaios de termotolerância e osmotolerância. Foram cultivadas em ágar 90 amostras ambientais, 16 de raspado de córnea e nove de lentes de contato (LC). Dessas, 38 (33 ambientais, quatro clínicas e uma de LC) foram positivas para Acanthamoeba, sendo obtidos 28 clones (24 ambientais, três clínicos e um de LC). Dentre eles, 26 apresentaram características morfológicas do grupo II, um do grupo I (solo) e um clone (água potável) não foi classificado de acordo com os parâmetros morfológicos de classificação. Quatro casos de ceratite amebiana foram confirmados somente por diagnóstico molecular. Todos os isolados clínicos, o de LC e a maioria dos isolados ambientais sequenciados foram classificados como pertencentes ao genótipo T4. Dentre os isolados ambientais, dois foram agrupados no genótipo T11 (piscina) e um no T1 (poeira). Todos os isolados clonados submetidos aos ensaios de termotolerância apresentaram crescimento a 28ºC e a 37ºC. Em contrapartida, nenhum isolado cresceu a 42ºC. Nos testes de osmotolerância, todos os isolados se desenvolveram a 0,1M e a 0,5M de manitol e a maioria deles cresceu à concentração de 1,0M. Os resultados deste estudo pioneiro no Espírito Santo confirmam a predominância do grupo morfológico II e do genótipo T4 em isolados clínicos e ambientais de Acanthamoeba e relata pela primeira vez no Brasil o isolamento de Acanthamoeba pertencente ao genótipo T1. Este trabalho demonstra também a presença de isolados potencialmente patogênicos no ambiente, inclusive em amostras de água de inundação e de água do mar, o que pode representar um fator de risco para o desenvolvimento de infecções causadas por Acanthamoeba. Além disso, a metodologia desenvolvida neste estudo poderá ser utilizada para um diagnóstico mais rápido, sensível e específico de ceratite por Acanthamoeba / The genus Acanthamoeba comprises amphizoic protozoa with a wide environment distribution. They can cause serious diseases in humans, such as amoebic keratitis and granulomatous amoebic encephalitis. Thus, the factors involved in the pathogenicity of Acanthamoeba are being investigated as major interests to identify strains able to cause infection. The aim of this study was to investigate the occurrence of Acanthamoeba both in clinical and environmental samples, characterize the isolates by morphological parameters, genotyping and also evaluate the pathogenic potential. Clinical samples were collected from patients with a suspicious diagnosis of amoebic keratitis throughout corneal scrapings. Environmental samples were collected from dust, soil, swimming pool, tap, sea, and flood waters in Vitoria metropolitan regions, Espirito Santo State, Brazil. All samples were cultured on soy agar. Samples from corneal scrapings were also collected in Page saline and subjected to a reaction of semi-nested PCR. Positive cultures for Acanthamoeba, previously identified based on the cysts and trophozoites morphology, were selected, cloned and classified into morphological groups I, II or III. Genotyping of isolates was performed by partially sequencing the 18S rDNA gene while the pathogenic potential of cloned cultures was assessed by thermo and osmotolerance assays. From all samples cultured on agar, 90 were from environmental sources, 16 from corneal scrapings and nine from contact lenses (CL). Of these, 38 (33 from environmental samples, four from clinical samples and one from CL sample) were positive for Acanthamoeba. Among the 38 positive isolates, 28 were successfully cloned (24 from environmental isolates, three from clinical isolates and one from CL isolate). Twenty six cloned samples showed morphological characteristics of group II, one of group I (soil) and one (tap water) could not be classified according to morphological parameters. Four cases of amoebic keratitis could only be confirmed by molecular diagnosis. All clinical, CL and most of the environmental isolates sequenced were classified as T4 genotype. Among the environmental isolates, two were grouped in genotype T11 (pool) and one in T1 (dust). All cloned isolates subjected to the thermotolerance assay grew at 28 ºC and 37 ºC. The same result was observed in osmotolerance tests at 0.1M and 0.5M mannitol. Neverthless, while most of the cloned isolates were able to grow at 1.0M mannitol, none of the isolates were able to grow at 42 ºC. The present study confirms the predominance of morphological group II and genotype T4 in clinical and environmental isolates of Acanthamoeba in Espirito Santo State and first time reports the T1 genotype isolation of Acanthamoeba in Brazil. This work also demonstrates the presence of potentially pathogenic isolates at the environment, including samples of flood and sea waters, which may represent a risk factor for the development of infections caused by Acanthamoeba. Furthermore, the methodology used in this study could be used for a fast, sensitive and specific diagnosis of Acanthamoeba keratitis

Submitted by Thaysa Buss Carvalho (thata_carv@hotmail.com) on 2018-03-06T20:09:50Z No. of bitstreams: 1 Dissertação (versão final - Pós).pdf: 3710550 bytes, checksum: bab583912c5fbf652bf225a988df911b (MD5) / Approved for entry into archive by ROSANGELA APARECIDA LOBO null (rosangelalobo@btu.unesp.br) on 2018-03-08T18:01:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carvalho_tb_me_bot.pdf: 3710550 bytes, checksum: bab583912c5fbf652bf225a988df911b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-08T18:01:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carvalho_tb_me_bot.pdf: 3710550 bytes, checksum: bab583912c5fbf652bf225a988df911b (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A doença de Chagas (DC), causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi (T. cruzi), ainda é considerada como um problema de saúde pública em muitos países da América Latina. De acordo com a Organização Mundial da Saúde, estima-se que entre seis a sete milhões de pessoas no mundo estejam infectadas. Indivíduos na fase crônica da doença podem ser classificados como assintomáticos ou sintomáticos (estes, desenvolvendo as formas clínicas cardíaca, digestiva ou mista). Os assintomáticos correspondem a 70% dos indivíduos nessa fase e, embora apresentem sorologia positiva para anticorpos anti T-cruzi, não desenvolvem manifestações clínicas da doença. O motivo pelo qual alguns pacientes permanecem assintomáticos, e outros desenvolvem sintomas severos, ainda é desconhecido. Fatores genéticos do hospedeiro são bastante relevantes e podem explicar a heterogeneidade encontrada em pacientes que vivem com a doença em áreas endêmicas. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) no gene TNF-α (rs1800629) e ACAT-1 (rs1044925) em indivíduos com DC crônica e verificar se os mesmos estão relacionados com a susceptibilidade para manifestação de formas clínicas sintomáticas com uso da técnica PCR-RFLP. Foram genotipadas 124 amostras para o gene TNF-α e 135 para o gene ACAT-1. Foi observada associação significativa da presença do alelo A do gene TNF- α em indivíduos sintomáticos em relação aos assintomáticos (p = 0,045). Também houve associação significativa entre o alelo G (p = 0,008) e o genótipo GG (p = 0,001) do gene TNF-α e os genótipos AA (p = 0,047) e AC (p = 0,016) do gene ACAT-1 nos indivíduos assintomáticos em relação aos sintomáticos. Nossos resultados sugerem que a presença do alelo A do gene TNF-α possa estar relacionada com a presença de manifestações clínicas sintomáticas na fase crônica da doença e o alelo G, bem como, genótipo GG possam estar associados com ausência de sintomas clínicos em indivíduos nessa fase. A respeito do SNP do gene ACAT-1, nossos dados sugerem efeito protetor dos genótipos AA e AC segundo apresentação de sintomas da doença na fase crônica, o que representa dado inédito em chagásicos. / Chagas disease (CD), caused by the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi), is still considered a public health problem in many Latin America countries. According to the World Health Organization, it is estimated that between six and seven million people worldwide are infected. Disease’s chronic phase individuals may be classified as asymptomatic or symptomatic (these, developing as clinical cardiac, digestive or mixed forms). Asymptomatic individuals account for 70% of the patients at this stage and, although they have positive serology for anti-T-cruzi antibodies, they do not develop it’s clinical manifestations. The reason why some patients remain asymptomatic, and others develop severe symptoms, is still unknown. Host’s genetic factors are quite relevant and may explain the heterogeneity found in patients living with the disease in endemic areas. The objective of this study was to evaluate SNPs in the TNF-α (rs1800629) and ACAT-1 (rs1044925) genes in individuals with chronic CD and to verify if the polymorphisms are related to the susceptibility to manifestation of symptomatic clinical forms using the PCR-RFLP technique. Were genotyped 124 samples for the TNF-α gene and 135 for the ACAT-1 gene. Significant association for the presence of the A allele of the TNF-α gene was observed for symptomatic individuals in relation to the asymptomatic ones (p = 0.045). There was also a significant association between the G allele (p = 0.008) and the GG genotype (p = 0.001) of the TNF-α gene and the AA (p = 0.047) and AC (p = 0.016) genotypes of the ACAT-1 gene for asymptomatic patients. Our results suggests that the presence of the TNF-α gene A allele may be related to the presence of symptomatic clinical manifestations in the chronic phase of the disease and the G allele as well as the GG genotype may be associated with absence of clinical symptoms in individuals at this stage. Regarding the ACAT-1 gene SNP, our data suggests a protective effect of AA and AC genotypes according to the to the presentation of chronic disease symptoms, which is an unprecedented finding in chagasic patients. / CAPES: 1578310

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA13MA101.pdf: 699148 bytes, checksum: 49c5f8f78753d18ac0c7b049d5052f86 (MD5) Previous issue date: 2013-02-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Toxoplasmosis is a widely-distributed zoonosis that can infect warm-blooded animals, including birds and humans. Chickens, as well as other birds, can be considered indicators of environmental contamination. Toxoplasma gondii has a distinct clonal populational structure of three lineages (I, II and III) with high recombination, resulting in wide genotypic diversity in Brazil. Recent studies have demonstrated the importance of T. gondii genotyping regard the relationship between genotypes and distinct clinical signs in hosts. This study aimed to isolate and characterize T. gondii isolates from chickens (Gallus gallus) naturally infected in the state of Santa Catarina. Serum samples from 133 fowls raised in free-range conditions were analyzed by Immunofluorescence Assay (IFA ≥ 1:16) to detect IgG antibodies to T. gondii. Brain and heart tissues from 30 seropositives (IFA) chickens were used to isolate the parasite (bioassay in mice). The isolates were subjected to genotypic characterization by PCR-RFLP using 12 genetic markers (SAG1, 5 -3 SAG2, alt.SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, Apico and CS3). The results were classified according to the genotypes present in ToxoDB (http://toxodb.org/toxo/). Among 133 chicken serum samples analyzed, 84 (63.16%) were positive, with antibody titers ranging from 1:16 to 1:1024. Eleven isolates were obtained in the assay (Ck 3, Ck 32, Ck 35, Ck 56, Ck 63, Ck 89, Ck 102, Ck 103, Ck 125, Ck 127 and Ck 128). Genotyping revealed six genotypes, three of them were classified as #26, #53 and #120 and three were not previously described, denominated NEO 1, NEO 2 e NEO 3. In two isolates it was not possible to amplify all markers, but the 18S rRNA PCR-RFLP was performed for differentiation of other apicomplexans (Neospora spp. and Sarcocystis spp.) and it was confirmed as T. gondii. The present study confirms the high genetic diversity of the parasite observed in Brazil and this is the first mapping of genotypes obtained from naturally infected chickens in the state of Santa Catarina / A toxoplasmose é uma zoonose de ampla distribuição geográfica, que acomete animais homeotérmicos, incluindo as aves e o ser humano. Galinhas, assim como outras aves, são consideradas indicadoras de contaminação ambiental. Toxoplasma gondii possui uma estrutura populacional altamente clonal, constituída por três linhagens, designadas I, II e III com alta frequência de recombinação, o que resulta na grande diversidade genotípica observada no Brasil. Estudos recentes têm demonstrado a importância da genotipagem dos isolados de T. gondii considerando a relação de diferentes genótipos com as distintas patologias observadas nos hospedeiros. A realização do presente trabalho teve como objetivo isolar e caracterizar genotipicamente T. gondii de galinhas (Gallus gallus) naturalmente infectadas do estado de Santa Catarina. Soros de 133 aves criadas extensivamente foram analisados pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI ≥1:16) para detecção de anticorpos IgG contra T. gondii. Para o isolamento do parasito (bioensaio em camundongos) foram utilizados coração e cérebro de 30 aves soropositivas na RIFI. Os isolados obtidos foram submetidos à caracterização genotípica por meio da PCR-RFLP utilizando 12 marcadores genéticos (SAG1, 5 -3 SAG2, alt.SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, c22-8, c29-2, L358, PK1, Apico e CS3). Os resultados obtidos foram classificados de acordo com os genótipos presentes no ToxoDB (http://toxodb.org/toxo/). Das 133 amostras de soros de galinhas analisadas, 84 (63,16%) foram positivas, com títulos de anticorpos variando de 1:16 a 1:1024. No bioensaio foram obtidos 11 isolados (Ck 3, Ck 32, Ck 35, Ck 56, Ck 63, Ck 89, Ck 102, Ck 103, Ck 125, Ck 127 e Ck 128). Pela análise genotípica revelou-se a presença de seis genótipos, três dos quais classificados como #26, #53 e #120 e três não descritos anteriormente, denominados NEO 1, NEO 2 e NEO 3. Em dois isolados não foi possível amplificar todos os marcadores, entretanto foi realizada a 18S rDNA PCR-RFLP, para diferenciar de outros apicomplexas (Neospora spp. e Sarcocystis spp.), e que confirmou estes como T. gondii. O presente trabalho ratifica a ampla diversidade genética do parasito verificada no Brasil sendo este o primeiro mapeamento dos genótipos do protozoário, a partir de galinhas naturalmente infectadas, que ocorrem no estado de Santa Catarina

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:16:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MarianaAPM_DISSERT.pdf: 2606420 bytes, checksum: 97be52d447dc533f85354f32faddd0ad (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 / Funda??o de Apoio ? Pesquisa do Estado do Rio Grande do Norte / Vulvovaginal candidiasis (VVC) is one of the most common causes of vaginitis and affects about 75% of women of reproductive age. The majority of cases (80 to 90%) are due to C. albicans, the most virulent species of the genus Candida. Virulence attributes are scarcely investigated and the source of infection remains uncertain. Objective: This study aimed to evaluate the virulence factors and genotypes of clinical isolates of C. albicans sequentially obtained from the anus and vagina of patients with sporadic and recurrent VVC. Materials and methods: We analyzed 62 clinical isolates of C. albicans (36 vaginal and 26 anal strains). Direct examination of vaginal and anal samples and colony forming units (CFU) counts were performed. Yeasts were identified using the chromogenic media CHROMagar Candida? and by classical methodology, and phenotypically characterized regarding to virulence factors, including the ability to adhere to epithelial cells, proteinase activity, morphogenesis and biofilm formation. The genotypes of the strains were investigated with ABC genotyping, microsatellite genotyping with primer M13 and RAPD. Results: We found 100% agreement between direct examination and culture of vaginal samples. Filamentous forms were present in most of the samples of vaginal secretion, which presented CFU counts significantly higher than the samples of anal secretion. There was no statistically significant difference between virulence factors of infecting vaginal isolates and those presented by colonizing anal isolates; as well as for the comparison of the vaginal isolates from patients with different clinical conditions (sporadic or recurrent VVC). There was a decrease in the ability to adhere to HBEC, morphogenesis and biofilm formation of the vaginal isolates during the progress of infection. There was an association between the ability to express different virulence factors and the clinical manifestations presented by the patients. Genotype A was the most prevalent (93.6%), followed by genotype C (6.4%). We found maintenance of the same ABC genotype and greater prevalence of microevolution for the vaginal strains of C. albicans sequentially obtained. Vaginal and anal isolates of C. albicans obtained simultaneously from the same patient presented the same ABC genotype and high genetic relatedness. Conclusion: It is noteworthy that the proliferation of yeast and bud-to-hypha transition are important for the establishment of CVV. The expression of virulence factors is important for the pathogenesis of VVC, although it does not seem to be determinant in the transition from colonization to infection or to the installation of recurrent condition. Genotype A seems to be dominant over the others in both vaginal and anal isolates of patients with VVC. The most common scenario was microevolution of the strains of C. albicans in the vaginal environment. It is suggested that the anal reservoir constituted a possible source of vaginal infection, in most cases assessed / Candid?ase vulvovaginal (CVV) ? uma das causas mais comuns de vaginite e acomete cerca de 75% das mulheres em idade reprodutiva, sendo a maioria dos casos (80 a 90%) devido ? C. albicans, esp?cie mais virulenta do g?nero. Atributos de virul?ncia em CVV s?o pouco investigados, bem como a fonte da infec??o permanece incerta. Objetivo: Este trabalho teve por finalidade avaliar os fatores de virul?ncia e gen?tipos de isolados cl?nicos de C. albicans sequencialmente obtidos do ?nus e da vagina de pacientes com CVV espor?dica e recorrente. Material e m?todos: Foram analisados 62 isolados cl?nicos de C. albicans (36 isolados vaginais e 26 isolados anais). Realizou-se o exame direto das amostras de secre??o vaginal e anal e contagem de unidades formadoras de col?nia (UFC); as leveduras foram identificadas por meio cromog?nico CHROMagar Candida? e por metodologia cl?ssica e caracterizadas fenotipicamente quanto a fatores de virul?ncia, incluindo a capacidade de ader?ncia a CEBH, a atividade de proteinase, a morfog?nese e a forma??o de biofilme. Para a avalia??o da variabilidade genot?pica, empregou-se a t?cnica de genotipagem ABC, al?m da genotipagem por microssat?lites e RAPD. Resultados: Verificou-se 100% de concord?ncia entre o exame direto e a cultura de amostras vaginais, observando-se a presen?a de formas filamentosas na maioria das amostras de secre??o vaginal, as quais apresentaram contagem de UFC significativamente superior ?quela apresentada pelas amostras de secre??o anal. N?o se observou diferen?a estatisticamente significativa quando se comparou os fatores de virul?ncia dos isolados vaginais infectantes com aqueles apresentados pelos isolados anais colonizantes; bem como comparando-se os isolados vaginais de C. albicans obtidos de grupos de pacientes com diferentes condi??es cl?nicas (CVV espor?dica e com CVVR). Observa-se uma tend?ncia ? diminui??o da capacidade de ader?ncia, morfog?nese e forma??o de biofilme do isolado vaginal infectante ao longo do tempo e sugere-se associa??o entre a capacidade de expressar os diferentes fatores de virul?ncia estudados e as manifesta??es cl?nicas apresentadas pelas pacientes. O gen?tipo A foi o mais prevalente (93,6%), seguido do gen?tipo C (6,4%). Houve manuten??o do mesmo gen?tipo ABC e maior preval?ncia de microevolu??o das cepas vaginais de C. albicans obtidas sequencialmente, bem como se observou o mesmo gen?tipo ABC e alta similaridade gen?tica entre isolados vaginais e anais de C. albicans obtidos simultaneamente da mesma paciente. Conclus?o: Ressalta-se que a prolifera??o da levedura e a transi??o levedura-hifa s?o importantes no estabelecimento da CVV. A express?o dos fatores de virul?ncia ? importante na patog?nese de CVV, contudo n?o parece ser determinante na transi??o de coloniza??o para infec??o nem na instala??o de quadro recorrente de CVV. O gen?tipo A demonstra ser dominante em rela??o aos demais tanto em isolados vaginais quanto em isolados anais de pacientes com CVV. Verifica-se a ocorr?ncia de microevolu??o das cepas de C. albicans no ambiente vaginal como cen?rio mais comum. Sugere-se que o reservat?rio anal constituiu uma poss?vel fonte da infec??o vaginal, na grande maioria dos casos avaliados

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_daniela_fernandes_ramos.pdf: 1004504 bytes, checksum: d8fd2e285277928c8af06e08c3527471 (MD5) Previous issue date: 2012-11-30 / Bovine tuberculosis (BTB) caused by Mycobacterium bovis is an infectious disease of zoonotic which mainly affects cattle and buffaloes, and cause economic losses in the production of meat and milk in many countries. In Brazil, the official rates are at 1.3% of the national herd infected, corresponding to approximately 2.5 million animals. To contribute to the control of BTB, many molecular techniques have been developed in order to differentiate isolates and establish epidemiological correlations between them. Among these techniques, the most used are the Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP), Polymorphic Guanine-cytosine-Rich Sequence [1], Spoligotyping [2], Mycobacterial Interspersed Repetitive Units - Variable Number of Tandem Repeat (MIRU-VNTR) and Exact Tandem Repeat [3]. The spoligotyping and MIRU-VNTR are today considered standard methods of molecular techniques for typing of M. bovis. Both are based on PCR techniques that evaluate polymorphism in the number of repeat sequences present in the genome. Taking into account that the molecular characterization enables to increase our knowledge on the epidemiology of M. bovis and in tuberculosis control, this study aimed at the molecular characterization of isolates of M. bovis in the north and south of the Brazil, by isolating agent, identification of M. bovis by amplification of the region RD7 Multiplex PCR and genotyping using the techniques of spoligotyping, MIRU-VNTR and ETR. Nine-nine lymph nodes were collected from beef cattle in the north of the region and 162 dairy cattle in southern Brazil, and only 10 samples were positive for M. bovis in the north and 85 in the south region. Through analysis of molecular combination of spoligotyping and VNTR was possible to identify different genotypic patterns in the regions studied demonstrating the genetic diversity of M. bovis in our country. / A tuberculose bovina (BTB) causada pelo Mycobacterium bovis é uma doença infecto-contagiosa de caráter zoonótico que acomete principalmente bovinos e bubalinos, e causa prejuízos econômicos na produção de carne e leite em muitos países. No Brasil, os índices oficiais estão em 1,3% do rebanho nacional infectado, correspondendo a, aproximadamente, 2,5 milhões de animais. Visando contribuir para o controle da BTB, muitas técnicas moleculares vêm sendo desenvolvidas com o objetivo de diferenciar isolados e estabelecer correlações epidemiológicas entre eles. Dentre essas técnicas, as mais usadas são o Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP), Polymorphic Guanine-cytosine-Rich Sequence [1], Spoligotyping [2], Mycobacterial Interspersed Repetitive Units - Variable Number of Tandem Repeat (MIRU-VNTR) e Exact Tandem Repeat [3]. O spoligotyping e MIRU-VNTR são, hoje, considerados métodos padrões de técnicas moleculares para tipagem de M. bovis. Ambas são técnicas baseadas em PCR que avaliam o polimorfismo do número de sequências repetidas presentes no genoma. Levando em conta que a caracterização molecular possibilita aumentar nosso conhecimento na epidemiologia do M. bovis e no controle da tuberculose, este trabalho teve como objetivo a caracterização molecular de isolados de M. bovis da região norte e sul do Brasil, através do isolamento do agente, identificação de M. bovis pela amplificação da região RD7 por PCR Multiplex e genotipagem usando as técnicas de spoligotyping, MIRU-VNTR e ETR. Foram coletadas 99 linfonodos de bovinos de corte da região norte e 162 de bovinos de leite da região sul do Brasil, sendo que apenas 10 amostras foram positivas para M. bovis no norte e 85 na região sul. Através da análise molecular da combinação de spoligotyping e VNTR foi possível identificar diferentes padrões genotípicos nas regiões estudas demonstrando a diversidade genética de M. bovis no nosso país.