Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-17T14:24:05Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoGenotipagemNorovirus.pdf: 1697028 bytes, checksum: 20d2d9ece28dd27e87f347b93ca6a6cf (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-10-30T13:49:14Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoGenotipagemNorovirus.pdf: 1697028 bytes, checksum: 20d2d9ece28dd27e87f347b93ca6a6cf (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-30T13:49:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_DeteccaoGenotipagemNorovirus.pdf: 1697028 bytes, checksum: 20d2d9ece28dd27e87f347b93ca6a6cf (MD5) Previous issue date: 2014 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / Os vírus entéricos eliminados pelas fezes de indivíduos infectados se dispersam nos ambientes aquáticos por meio do lançamento de esgoto. Dentre esses vírus os norovírus (NoV) são atualmente considerados a principal causa de surtos de gastrenterite mundialmente, decorrentes da ingestão de água e alimentos contaminados, como também estão associados a hospitalizações. O objetivo dessa pesquisa foi detectar e caracterizar parcialmente os NoV humanos (genogrupos I e II) em diferentes tipos de água e esgoto bruto da Região Metropolitana de Belém. O estudo envolveu águas superficiais de baía (Ver-o-Peso), rio (Porto do Açaí), igarapé (Tucunduba) e dois mananciais (Bolonha e Água Preta), como também água tratada (ETA-Bolonha) e esgoto bruto (EEE-UNA), coletadas mensalmente ao longo de dois anos. Essas águas e esgoto (2 litros) foram inicialmente concentradas em membranas filtrantes obtendo-se um volume final de 2mL. O ácido nucléico foi extraído pelo método da sílica e submetido à reação de semi nested RT-PCR (reação em cadeia mediada pela Polimerase precedida de transcrição reversa) utilizando iniciadores específicos para NoV GI e GII. O cDNA obtido após transcrição reversa foi utilizado para pesquisa de GI/GII também por TaqMan® PCR em tempo real. As amostras positivas por ambas as metodologias moleculares foram analisadas para a região 5’-terminal da ORF2 por nested (GI) e semi nested (GII) com o intuito de obter amplicon para identificação das cepas circulantes, sendo posteriormente purificados com uso de kit comercial e submetidos a caracterização molecular em sequenciador automático. As sequências obtidas foram editadas, alinhadas e comparadas com outras depositadas no banco de genes (GenBank - NCBI) e no site NoV genotyping tool. No período de novembro de 2008 a outubro de 2010, 168 amostras de água e esgoto foram coletadas e analisadas quanto a presença de NoV, obtendo-se positividade de 33,9% (57/168), das quais 21,1% (12/57) foram positivas somente por TaqMan® PCR em tempo real, 19,3% (11/57) por semi nested e 59,6% (34/57) por ambas. Considerando as duas metodologias utilizadas, nos casos positivos, GI (82,5% -47/57) foi mais frequente do que GII (79,0% - 45/57). Porém, na maioria das amostras houve coexistência dos dois genogrupos (61,4% - 35/57), principalmente nas amostras do igarapé Tucunduba e EEE-UNA, considerados os locais mais contaminados por NoV. Por outro lado, na ETA-Bolonha esse agente não foi encontrado. Das 57 amostras positivas por TaqMan® PCR em tempo real e/ou semi nested RT-PCR, 53 foram retestadas para a região 5’-terminal da ORF2, uma vez que quatro apresentaram quantidade insuficiente de material que permitisse uma nova análise, assim em 47,2% (25/53) o genoma de NoV foi detectado, das quais 12% (3/25) pertenciam ao GI, 24% (6/25) ao GII e 64% (16/25) para ambos. Os genótipos mais frequentes de GI e GII foram respectivamente GI.8 (n=8) e GII.4 (n=12), porém outros genótipos foram observados com menor incidência como GII.6 (n=3), GII.9 (n=2), GII.12 (n=1), GII.14 (n=1), GI.1 (n=1) e GI.4 (n=2). Devido a baixa qualidade das sequências obtidas oito amostras não puderam ser genotipadas para GI e três para GII. Das 96 amostras com concentração de coliformes termotolerantes acima do recomendado, 34 (35,4%) também foram positivas para NoV. Aumento na condutividade e sólidos totais dissolvidos foi observado nos materiais do Ver-o-Peso e igarapé Tucunduba, assim como a turbidez foi nitidamente mais elevada nesses locais e no Porto do Açaí. No período menos chuvoso (julho a novembro) houve uma tendência no aumento da positividade para NoV, e nos meses de maior pluviosidade (dezembro a junho) notou-se um decréscimo na incidência desse agente. Os resultados obtidos no presente estudo apontam a circulação de NoV GI e GII nos ambientes aquáticos de Belém, revelando a degradação que estes corpos hídricos vêm sofrendo como consequência da precariedade ou ausência de saneamento na nossa cidade, permitindo a permanência nesses ecossistemas, juntamente com seus efluentes, de patógenos causadores de doenças. / Enteric viruses excreted in feces from infected individuals dispersed in aquatic environments by sewage discharge. Among these viruses, the norovirus (NoV) is actually considered the main cause of gastroenteritis outbreaks worldwide, resulting from the ingestion of contaminated food and water as well as is also associated with hospitalizations. This research aimed to detect and partially characterize the human NoV (GI/GII) in different water matrices and in untreated sewage from Metropolitan Region of Belem. The study involved superficial waters from bay (Ver-o-Peso), river (Acai’s Port), stream (Tucunduba) and two lakes (Bolonha and Agua Preta), as well as treated water (WTP-Bolonha) and untreated sewage (SLP-UNA), monthly collected over two years . The water and sewage (2 liters) were initially concentrated on filtering membranes to obtain a final volume of 2 mL. The nucleic acid was extracted by silica method and submitted to semi nested RT-PCR (reverse transcription Polymerase chain reaction) using NoV GI and GII specific primers. The cDNA obtained after reverse transcription was also used to investigate the GI/GII by TaqMan® real time PCR. The positive samples for both molecular methods were analyzed for 5’end ORF2 by nested (for GI) and semi nested (for GII) in order to obtain amplicon for identification of circulating strains, being further purified using a commercial kit and submitted to molecular characterization in the automated sequencer. The obtained sequences were edited, aligned and compared to others available in gene bank (NCBI) and in the site NoV genotyping tool. In the period of November 2008 to October 2010, 168 water and sewage samples were collected and analyzed for NoV presence, obtaining a positivity of 33.9% (57/168) of which 21.1% (12/57) were positive only by TaqMan® real time PCR, 19.3% (11/57) only by semi nested and 59.6% (34/57) for both. Considering the two methodologies used, in the positive cases GI (82.5% - 47/57) was most frequent than GII (79.0% - 45/57). However, in most samples there was coexistence of the two genogroups (61.4% - 35/57), mainly in the Tucunduba and SLP-UNA samples, considered the most NoV contaminated sites. On the other hand, in WTP-Bolonha this agent was not found. Of 57 positive samples by TaqMan® real time PCR and/or semi nested RT-PCR, 53 were retested for 5’end ORF2, since four samples showed insufficient quantity of material which allowed a new analyze, so, in 47.2% (25/53) the NoV genome was detected, of these 12% (3/25) belonging to GI, 24% (6/25) to GII and 64% (16/25) for both. The most frequent GI and GII genotypes were GI.8 (n=8) and GII.4 (n=12), respectively, but others genotypes were also observed with lower incidence as GII.6 (n=3), GII.9 (n=2), GII.12 (n=1), GII.14 (n=1), GI.1 (n=1) and GI.4 (n=2). Due to low quality of sequences obtained, eight samples could not be genotyped for GI and three for GII. Of 96 samples with concentration of thermotolerant coliforms above the recommended, 34 (35.4%) were also NoV positive. Increase on conductivity and total dissolved solids was observed in materials from Ver-o-Peso and Tucunduba, as well as the turbidity was notably higher in these places and the Acai’s Port. In the less rainy period (July to November) there was a trend in positivity increasing for NoV, and in the highest rainfall (December to June) a decrease in the incidence of this agent was noted. The results obtained in the present study indicate the circulation of NoV GI and GII in aquatic environments in Belem, revealing the degradation that these water bodies have suffered, as a result of poverty or lack of sanitation in our city, allowing the permanence of pathogens in these ecosystems, along with its effluents.

Copy number variation (CNV) is an important polymorphism that is associated with a wide range of traits in human, wild and livestock species. In chicken, an important source of animal protein and a developmental model organism, CNV is associated with several phenotypes and evolutionary footprints. However, identification and characterization of CNV inheritance on chicken genome lacks further investigation. We screened CNVs in chicken using two distinct populations with known pedigree. In 826 broilers we identified 25,819 CNVs (4,299 deletions and 21,520 duplications) of which 21,077 were inherited, 201 showed no inheritance and 4,541 were classified as de novo CNVs. In 514 F2 animals (layer and broiler cross) we identified 21,796 CNVs (2,254 deletions and 19,543 duplications) of which 18,230 were inherited, 587 not inherited and 2,979 were classified as de novo CNVs. After a strict filtering step to remove potential false positives and negative CNVs, only 220 (4.84%) and 430 (14.43%) de novo CNVs remained in the broiler and F2 populations, respectively. A total of 33.11% (50 out of 151) of the inherited CNVs identified in ten animals were validated by sequencing data. From the validated CNVs, 64% had more than 80% of their size (bp) validated. A total of 59% and 48.8% were classified as novel CNVs regions (CNVRs) in the broiler and F2, respectively. Considering the Bonferroni-corrected p-values for multiple testing and statistically significant p-values ≤ 0.01, we found two CNV segments significantly associated with breast weight, one with breast weight yield, six with breast meat weight, 18 CNV segments with breast meat yield, four with breast filet weight and two with breast yield. These CNV segments that were significantly associated overlapped with 181 protein-coding genes. The CNVseg 300, that was associated with all traits and encompass six CNVRs, overlapped a total of 26 protein-coding genes. Among these genes, the gene MYL1 (Myosin Light Chain 1) is expressed in the fast skeletal muscle fibers, and the genes MLPH (Melanophilin), PRLH (Prolactin Releasing Hormone) and RAB17 (Member RAS Oncogene Family), that were associated with the lavender phenotype (feather blue-grey color) and regulation of homeothermy and the metabolism. The present study improves our knowledge about CNV in the chicken genome and provides insight in the distribution and of different classes of CNVs, i.e. inherited and de novo CNVs, in two experimental chicken populations. In addition, the genome-wide association analyses were the first performed on broiler population with breast muscle traits, that are important characteristics for poultry production. The GWAS results allow us to understand the probably relationship between some genes and CNVRs that are significantly associated with breast muscle traits. / A variação de número de cópias (CNV) é um polimorfismo importante que está associado a uma ampla gama de características em seres humanos, espécies selvagens e domésticas. Em frango, que é uma importante fonte de proteína e considerado um modelo biológico, CNVs foram associados a vários fenótipos e passos evolutivos. No entanto, nenhum estudo foi realizado para a identificação e caracterização da herança da CNV no genoma da galinha. Identificamos as CNVs no genoma da galinha usando duas populações experimentais e com pedigree conhecido: uma população de frangos de corte e uma F2. Em 826 frangos de corte, identificamos 25.819 CNVs (4.299 deleções e 21.520 duplicações), dos quais 21.077 foram herdados, 201 não foram herdados e 4.541 foram CNVs denominados de novo. Em 514 animais F2, identificamos 21.796 CNVs (2.254 deleções e 19.543 duplicações) das quais 18.230 foram herdadas, 587 não foram herdadas e 2.979 foram de novo CNVs. Após a etapa de filtragem nos de novo CNVs, apenas 220 (4,84%) e 430 (14,43%) permaneceram nas populações de frango de corte e F2, respectivamente. Um total de 33,11% (50 de 151) das CNV identificadas por dados de genotipagem em dez animais foram validados por dados de sequenciamento. Dos validados, 64% tinham mais de 80% do tamanho (pb) validados. Um total de 59% e 48,8% foram classificados como novas regiões de CNVs (CNVRs) nas populações de frango de corte e F2, respectivamente. Considerando os p-values corrigidos por Bonferroni para testes múltiplos e estatisticamente significativos (≤ 0,01), encontramos dois segmentos de CNV significativamente associados ao peso do peito, um ao rendimento de peso de peito, seis ao peso de carne de peito, 18 ao rendimento de carne de peito, quatro ao peso de filé de peito e dois ao rendimento do filé de peito. Esses segmentos de CNV significativamente associados estão sobrepostos com 181 genes codificadores de proteínas. O CNVseg 300, que foi associado a todas as características e abrange seis CNVRs, foram sobrepostos a um total de 26 genes codificadores de proteínas. Entre estes genes, o gene MYL1 (Myosin Light Chain 1) é expresso nas fibras rápidas do músculo esquelético, e os genes MLPH (Melanophilin), PRLH (Prolactin Releasing Hormone) e RAB17 (Member RAS Oncogene Family), que foram anteiromente associados ao fenótipo de cor azul acinzentado de penas e à regulação da homeotermia e do metabolismo. O presente estudo melhora o conhecimento sobre CNVs no genoma de frango, especialmente sobre a distribuição de CNV herdadas, não herdadas e de novo, em duas populações experimentais de frango. Além disso, a associação genômica foi a primeira realizada na população de frangos de corte com características do músculo do peito, que são muito importantes para a avicultura. Os resultados do GWAS nos permitem compreender a provável relação entre alguns genes e CNVRs que foram significativamente associados às características do músculo do peito.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cinaradecassiabrandaodemattos_tese.pdf: 2369764 bytes, checksum: d694ab0e38db337b769ea1ace729b6e3 (MD5) Previous issue date: 2012-04-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / T. gondii is an obligate intracellular parasite and cosmopolitan, whose infection congenital or acquired, results in different forms of toxoplasmosis. The clinical manifestations of this disease are nonspecific and variable. Its diagnosis essentially laboratory is aimed at pregnant women, neonates, patients with immunodeficiencies, patients with eye injury and even normal individuals. Serological methods are often used in the characterization of IgM and IgG anti-T.gondii, but those of nature of molecular favoring genetic characterization of the strains isolated from biological samples. Objectives: The overall objective of this thesis was to investigate the infection by T.gondii in the northwestern region of São Paulo state. Its specific objectives were: 1. to characterize infection in pregnant women, newborns and people with eye diseases 2. to evaluate the applicability of the method of PCR inperipheral blood sample in patients with eye diseases 3. to identify the strains from peripheral blood samples. Casuisitc and Methods: epidemiological data and samples of peripheral blood from patients treated in Outpatient Clinic of High Risk Pregnancy and Retinopathy were collected and analyzed for infection by T. gondii using serological methods (ELISA) and molecular (cnPCR and qPCR). Results: among 574 women with mean age equal to 27.2 ± 6.5, 62% (345/556) showed positive for IgG and 3.4% (n = 19/556) for IgM. In 87 mother-newborn pairs, 64.4% (n = 58) were reactive for anti-T. gondii and 2.3% (n = 2), IgM, 92.9% (52/56) had IgG avidity greater than or equal to 30%. Among 184 patients with different eye diseases, 26% (n = 49) had ocular toxoplasmosis, all reagents for IgG. The PCR (qPCR and cnPCR) applied to the analysis of peripheral blood showed sensitivity and specificity equal to 40.8% and 100%, respectively. Five patients with ocular toxoplasmosis were shown to be infected by the strain toxoDB # 65. Conclusion: The results show that the prevalence of infection with T. gondii in pregnant women, neonates and patients with eye diseases is high in the northwertern region of São Paulo state, and to estimate the rates of congenital infection in the region. In addition to describing the first time the ocular toxoplasmosis in the region, this study reinforces the importance of cnPCR and qPCR methods for the characterization of infection and laboratory strains toxoDB # 65 from peripheral blood samples of patients with chronic infection. / T. gondii é um parasito intracelular obrigatório e cosmopolita, cuja infecção de natureza congênita ou adquirida, resulta nas diferentes formas de toxoplasmose. A manifestação clínica desta doença é inespecífica e variável. Seu diagnóstico, essencialmente laboratorial, é direcionado a gestantes, neonatos, portadores de imunodeficiências, portadores de lesão ocular e mesmo indivíduos normais. Métodos sorológicos são frequentemente utilizados na caracterização de anticorpos IgM e IgG anti-T. gondii, porém aqueles de natureza molecular favorecem a caracterização gênica das cepas em isolados de amostras biológicas. Objetivos: O objetivo geral desta tese foi investigar a infecção por T. gondii na região Noroeste Paulista. Seus objetivos específicos foram: 1. caracterizar a infecção em gestantes, neonatos e indivíduos com doenças oculares; 2. avaliar a aplicabilidade do método de PCR em amostra de sangue periférico em pacientes com doenças oculares; 3. identificar as cepas a partir de amostras de sangue periférico. Casuísitca e Métodos: dados epidemiológicos e amostras de sangue periférico de pacientes atendidos em Ambulatório de Gestação de Alto Risco e Retinopatia foram coletadas e analisadas quanto à infecção por T. gondii por métodos sorológicos (ELISA) e moleculares (cnPCR e qPCR). Resultados: entre 574 gestantes com média de idade igual a 27,2±6,5, 62% (345/556) mostraram-se reagentes para IgG e 3,4% (n=19/556), para IgM. Em 87 pares mãe-bebê, 64,4% (n=58) foram reagentes para anti-T. gondii e 2,3% (n=2), para IgM; 92,9% (52/56) apresentaram IgG com avidez maior ou igual a 30%. Dentre 184 pacientes com diferentes doenças oculares, 26% (n=49) apresentaram toxoplasmose ocular, todos reagentes para IgG. O método PCR (cnPCR e qPCR) aplicado à análise do sangue periférico apresentou sensibilidade e especificidade iguais a 40,8% e 100%, respectivamente. Cinco pacientes com toxoplasmose ocular mostraram-se infectados pela cepa toxoDB#65. Conclusão: Os resultados demonstram que a prevalência de infecção por T. gondii em gestantes, neonatos e pacientes com doenças oculares é elevada na região Noroeste paulista, e permitem estimar os índices de infecção congênita na região. Além de descrever pela primeira vez a toxoplasmose ocular na região, este estudo reforça a importância dos métodos cnPCR e qPCR na caracterização laboratorial da infecção e da cepas toxoDB #65 a partir de amostras de sangue periférico de pacientes com infecção crônica.

Submitted by Cleide Dantas (cleidedantas@ufpa.br) on 2014-02-07T12:40:29Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_EstudoEpidemiologicoAmebiase.pdf: 672147 bytes, checksum: c79be901d2d8e5217f47c8d1f43d0318 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva(arosa@ufpa.br) on 2014-02-07T15:11:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_EstudoEpidemiologicoAmebiase.pdf: 672147 bytes, checksum: c79be901d2d8e5217f47c8d1f43d0318 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-07T15:11:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Tese_EstudoEpidemiologicoAmebiase.pdf: 672147 bytes, checksum: c79be901d2d8e5217f47c8d1f43d0318 (MD5) Previous issue date: 2005 / CESUPA - Centro Universitário do Pará / A epidemiologia da amebíase está sendo reavaliada desde que a E. histolytica (patogênica) foi considerada espécie distinta de E. dispar (não patogênica). Neste estudo, investigou-se a freqüência da amebíase em uma amostra de residentes do Pará por diferentes técnicas de diagnóstico e avaliou-se a patogenia do parasito. Os participantes (n = 845) forneceram material fecal e destes, 191 foram entrevistados quanto aos sintomas de diarréia, cólicas intestinais, constipação, náuseas e vômito. Foram também analisados 8 exsudatos de pacientes com suspeita de amebíase hepática. As amostras foram observadas sob microscopia de luz e a confirmação de E. histolytica feita a partir da pesquisa de antígenos. Um total de 98 amostras fecais e todos os exsudatos foram semeados em meio Pavlova para isolamento e posterior caracterização bioquímica e molecular (identificação de espécie e genotipagem). Isolados de outras regiões do Brasil foram também genotipados. A positividade obtida foi de 29,35% (248/845) e não houve correlação com a faixa etária. A microscopia revelou baixa sensibilidade (45,26%; 74/334), porém elevada especificidade (87,03%; 260/334) quando comparada ao ELISA. Houve relação significativa (OR 4,4026) entre a presença de sintomas e a positividade no ELISA, sendo a diarréia (58,82%) e a cólica intestinal (58,82%) os sintomas mais relatados. Nenhum exsudato foi positivo no exame a fresco, porém 7 foram positivos no ELISA. Obteve-se 22 isolados de material fecal e a caracterização da HE foi possível em 13, dos quais 7 E. histolytica e 6 E. dispar. O DNA de 22 isolados e dos exsudatos foram testados para identificação molecular de espécie e genotipagem. Do total, 16 cultivos (9 cepas mistas, 4 E. dispar e 3 E. histolytica) e 5 exsudatos (todos E. histolytica) amplificaram na PCR. A genotipagem identificou adicional positividade para E. histolytica em um exsudato e revelou diferentes polimorfismos de comprimento para o locus 1-2 de E. histolytica e E. dispar do Pará e de outras regiões do Brasil e um caso de co-infecção por diferentes genótipos de E. dispar. Nossos resultados revelam que a amebíase invasiva é um importante problema de saúde pública em nossa população e grande variedade de genótipos de E. histolytica contribuem para a doença no Brasil. / The amebiasis epidemiology had been evaluated since the E. histolytica (pathogenic) was differentiated from E. dispar (non-pathogenic). In this study, it had investigated the amebiasis frequency in residents from Pará using different diagnostic techniques and evaluated the parasite pathogenesis. All participants (n = 845) had given their fecal material and from them, 191 were asked about the symptoms of diarrhea, abdomen pain, constipation, nausea and vomit. We had also analyzed 8 liver exudates from patients suspected of hepatic amebiasis. All samples were examined by microscopy and the E. histolytica confirmation was done by antigen detection (E. histolytica Test. TechLab). Of the total, 98 fecal samples and all exudates were cultured in Pavlova medium for parasite isolation and biochemical characterization and molecular (species identification and genotyping of the locus 1-2). Strains from other Brazil regions were also genotyped. The positive rate for E. histolytica found was 29.35% (248/845) and there was no correlation with age. The sensitivity of the microscopy method was low (45.26% - 74/334) and the specificity high (87.03% - 260/334) when compared to the ELISA test. The correlation between presence of symptoms and ELISA positive results was significant (OR 4.4026) with the diarrhea and abdominal pain being the most reported. None of the exudate samples was positive under the microscopy, but 7 of them were ELISA positive. We had success in culturing only 22 fecal samples. The characterization of HE was possible only for 13 isolates, from which, 7 were E. histolytica and 6 E. dispar. The DNA of the 22 isolates and all exudates were tested by PCR for the species identification and genotyping. Of the total, 16 strains (9 mixed, 4 E. dispar and 3 E. histolytica) and 5 exudate had amplified at the PCR. The genotyping had identified additional positivity for E. histolytica in one exudate and showed different length polymorphisms for the locus 1-2 de E. histolytica and E. dispar of Pará and other Brazil regions and one case of co-infection by different genotypes of the E. dispar. Our results had showed that the invasive amebiasis is an important public health problem within the Amazonian population and that the high genotype variability of E. histolytica contribute for the maintenance of this disease in Brazil.

A Enfuvirtida(ENF), único inibidor de fusão disponível, representa uma opção interessante aos pacientes com infecção pelo HIV quando utilizada em combinação com outros antirretrovirais, principalmente no tratamento de multiexperimentados com falha virológica e poucas opções terapêuticas. Sua eficácia já comprovada em ensaios clínicos esbarra nas barreiras impostas por sua administração parenteral. Impulsionado por estes dados, avaliamos durante 48 semanas a resposta virológica, a evolução de células T CD4 a possível resistência primária a ENF e o impacto para a adesão do uso subcutâneo da droga em dez pacientes que fazem acompanhamento ambulatorial no Hospital Universitário Pedro Ernesto e que tinham história de mais de dez anos de infecção pelo HIV e uso de ENF no seu esquema terapêutico sugerido por teste de resistência. Todos os pacientes alcançaram ao final do seguimento sucesso terapêutico, mantendo carga viral não detectada, e um incremento médio significativo de linfócitos T CD4. Em relação a uma possível resistência primária, em nenhum dos testes, genotipagem da glicoproteína 41, foi visualizado mutações naturais que pudessem diminuir a ação da ENF. Sobre o manejo do medicamento, preparo e aplicação, observamos que é imprescindível um apoio multidisciplinar para que não haja descontinuação na sua utilização / Enfuvirtide (ENF) is the only fusion inhibitor available. It is an interesting option for patients with HIV infection when used in combination with other antiretroviral drugs, especially in the treatment of multi-experienced patients with virological failure and few therapeutic options. Its effectiveness confirmed in clinical trials finds the barriers in its parenteral administration. Using these data, we evaluated, for 48 weeks, the virological response, evolution of CD4 T cells, the possible primary resistance to ENF and the impact to the subcutaneous use of the drug in ten patients undergoing outpatient monitoring at Hospital Universitário Pedro Ernesto with a history of more than ten years of HIV infection and use of ENF in their therapy, as suggested by resistance testing. All patients have successfully completed the therapy by the end of follow-up with an undetected viral load and a significant average increase of CD4 T lymphocytes. As for a possible primary resistance, neither the genotyping nor the glycoprotein 41 revealed natural mutations that could diminish the effect of ENF. Concerning the management, preparation and application of the drug, we found that a multidisciplinary support is essential to avoid that the drug be discontinued

Estima-se que a prevalência global da população mundial com hepatite C é de 3%. Pouco se sabe sobre a resposta ao tratamento com respeito à resistência viral. Algumas mutações no fragmento de 109 aminoácidos da NS5B são associadas com resistência ao interferon (IFN) e ribavirina (RBV). Estudos moleculares e clínicos identificaram fatores associados com o hospedeiro e vírus relacionados associada com a resposta ao tratamento, tal como o gene que codifica a IL-28B. Este estudo foi dividido em duas fases, cujos objetivos foram caracterizar a frequência de mutações que conferem resistência ao HCV e avaliar a relevância das mutações em pacientes Respondedores (R) ou Não Respondedores (NR) ao tratamento e caracterizar geneticamente as populações sobre polimorfismos genéticos nos SNPs da IL-28B em relação ao prognóstico da resposta ao tratamento. As amostras dos pacientes foram submetidas a testes de genotipagem e carga viral. As sequências geradas foram comparadas no BLAST e no banco de dados Los Alamos HCV. Realizamos o alinhamento das sequências homólogas e as mutações identificadas. Com base no genótipo e carga viral determinamos a classificação dos pacientes de acordo com a resposta à terapia. O DNA genômico foi isolado a partir de sangue periférico para a realização da tipagem de SNPs de IL-28B. A metodologia utilizada foi de PCR em tempo real utilizando sondas TaqMan SNP específico. A análise dos dados foi realizada utilizando GraphPad Prism com qui-quadrado, risco relativo (RR), Odds Ratio (OR) e intervalo de confiança de 95%, com um nível de significância de P <0,05. Foi encontrado na primeira fase deste estudo uma taxa significativa mutações associadas ao tratamento nas amostras estudadas. A prevalência de mutações associadas à resistência ao IFN e RBV bem como a novos medicamentos antivirais localizados no fragmento de 109 aminoácidos da NS5B foi examinado em 69 indivíduos infectados naïve no Rio de Janeiro, Brasil. Na segunda fase, as mutações foram clinicamente relevantes. Desde então, procuramos observar as diferenças entre melhor ou pior prognóstico de acordo com a imunogenética que mostrou diferenciação entre os grupos R e NR ao tratamento em relação ao prognóstico da resposta terapêutica. Quando as diferenças entre as sequências da NS5B e a resposta ao tratamento foram consideradas verificou-se que associada a mutação R254K, estava a C316N que poderia conduzir a uma não resposta à terapia no genótipo 1b. Os nossos dados também suportaram forte associação de IL-28B rs12979860, com elevada probabilidade de resposta à terapia de IFN + RBV. Nossos dados evidenciam a presença de pacientes virgens de tratamento que abrigam mutações de resistência previamente descritas na literatura. A análise dos fatores preditores de resposta virológica mostrou que a predição de boa resposta ou não ao tratamento e ainda da progressão da doença é dependente de uma importante interação entre a genética viral e a do hospedeiro. Fato este importante para que no momento de avaliação de diagnóstico e conduta terapêutica, o médico possa tomar medidas apropriadas para o tratamento de cada paciente individualmente independentemente do genótipo do HCV em questão. / It is estimated that the overall prevalence of the average world population with hepatitis C is 3%. Little is known about the treatment response with respect to viral resistance. Some mutations in the 109-aminoacid fragment of NS5B are associated to Interferon (IFN) and Ribavirin (RBV) resistance. Molecular and clinical studies have identified factors associated with the host and related viruses associated with response to treatment, as the gene encoding IL-28B. This study was divided into two phases whose objectives were to characterize the frequency of mutations conferring resistance to HCV viral evaluating the relevance of these in Responders (R) or Non-Responders (NR) patients to treatment and to characterize genetically the populations regarding genetic polymorphisms SNPs IL-28B in relation to prognosis of response to treatment for HCV. Patient samples were subjected to tests for genotyping and viral load. The sequences generated were compared in the BLAST and the Los Alamos database HCV. We conducted the alignment of homologous sequences and mutations identified. Based on virological parameters genotype and viral load determined the classification of patients according to response to therapy. Genomic DNA was isolated from peripheral blood for carrying out the typing of SNPs of IL-28B. The methodology used was real-time PCR using TaqMan probes specific SNPs. Data analysis was performed using GraphPad Prism with chi-square, relative risk (RR), Odds Ratio (OR) and confidence interval of 95% with a significance level of P <0.05. To study these biological parameters we associated the responsive patients, non-responders, the viral load, genotype, and IL-28B polymorphism to treatment outcome. We found in the first phase of this study a significant rate of treatment-associated mutations in the samples studied. The prevalence of mutations associated to resistance to interferon and ribavirin (IFN/RBV) as well new antiviral drugs located in the 109 aminoacid fragment of NS5B was examined in 69 Hepatitis C Virus drug naïve (HCV)-infected individuals in Rio de Janeiro, Brazil. In the second phase, the mutations revealed clinically relevant from the gene in question. Since then, we seek to observe the differences between better or worse prognosis according to immunogenetic showed that differentiation between the immunogenetics of the groups R and NR to treatment in relation to prognosis of therapeutic response. When the differences between the NS5B sequences at baseline and the treatment response were considered we found that R254K associated with C316N mutations could lead to a non-response to IFN-RBV therapy in genotype 1b. Our data also strong support the association of rs12979860 IL-28B polymorphism with high probability of response to IFN + RBV therapy. Our data highlight the presence of HCV genotypes from drug naïve patients harboring resistance mutations previously described in literature. The analysis of predictors virologic response demonstrated that the prediction of better or worse therapy response and further the disease progression is dependent of a significant interaction between viral and host genetics. This fact is important for diagnosis evaluation and clinical therapeutic, the medico can take appropriate measures to treat each individual patient irrespective of the genotype of HCV in question.

Submitted by Danilo Giorgi Abranches de Andrade null (dgaandrade@fmvz.unesp.br) on 2017-02-23T14:17:39Z No. of bitstreams: 1 dissertacao_danilo_g_a_andrade.pdf: 2560202 bytes, checksum: d847a79e450a463626e2d953a46fcc54 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-03-02T14:45:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 andrade_dga_me_bot.pdf: 2560202 bytes, checksum: d847a79e450a463626e2d953a46fcc54 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-02T14:45:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 andrade_dga_me_bot.pdf: 2560202 bytes, checksum: d847a79e450a463626e2d953a46fcc54 (MD5) Previous issue date: 2017-02-09 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Dermatosparaxia é uma enfermidade autossômica recessiva do tecido conjuntivo caracterizada clinicamente por fragilidade e hiperextensibilidade cutâneas. Estas características impedem que o animal seja mantido no sistema de criação, sendo descartado na maioria dos casos. Descrita em diversas espécies, a dermatosparaxia foi relatada também em algumas raças de ovinos. O polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) c.421G>T no gene ADAMTS2 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type I motif, 2), em homozigose, é responsável pela enfermidade em ovinos da raça White Dorper. Recentemente a doença foi descrita no Brasil, contudo acredita-se que possa ter sido subdiagnosticada, uma vez que a enfermidade já foi descrita em diversos países. O objetivo desta pesquisa foi estimar a frequência alélica do SNP c.421G>T no gene ADAMTS2 em ovinos da raça White Dorper do estado de São Paulo a partir de uma metodologia diagnóstica que utilizasse a reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida do sequenciamento direto da região desse SNP. Neste estudo, foram coletadas amostras de sangue para extração do DNA de 303 ovinos da raça White Dorper. Após a extração do DNA, realizou-se PCR para amplificar a região do SNP e, então, o sequenciamento genético para determinar sua presença no gene ADAMTS2. A frequência alélica do SNP na população estudada foi de 7,8%. Este resultado indica que as medidas de controle devem ser adotadas para prevenir a propagação do SNP c.421G>T no gene ADAMTS2 nos rebanhos de ovinos White Dorper brasileiros. / Dermatosparaxis is an autosomal recessive disorder of the connective tissue; the disorder is clinically characterized by skin fragility and hyperextensibility. These skin defects prevent affected animals from entering the breeding system because they are either discarded or removed from their usual activities. Described in several species, dermatosparaxis has also been reported in some sheep breeds. The single nucleotide polymorphism (SNP) c.421G>T in the ADAMTS2 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type I motif, 2) gene, in homozygosity, is responsible for the disease in White Dorper sheep. Recently the disorder was described in Brazil, however, it might have been underdiagnosed since the disease has already been described in many countries. The aim of this study was to estimate the allelic frequency of SNP c.421G>T in the ADAMTS2 gene in the White Dorper herd of Sao Paulo state, Brazil using a diagnostic methodology with polymerase chain reaction (PCR) and then direct sequencing of the SNP region. In this study, we collected blood DNA samples from 303 White Dorper sheep and performed PCR to amplify the SNP region. The samples were sequenced to determine the presence of the SNP in the ADAMTS2 gene. The allelic frequency of the SNP in the studied population was 7.8%; this finding indicates that control measures should be adopted to prevent the inheritance of SNP c.421G>T in the ADAMTS2 gene in Brazilian White Dorper herds.

Desde os primórdios da agricultura e pecuária, o homem seleciona indivíduos com características desejáveis para reprodução e aumento da proporção de novos indivíduos com tais qualidades. Com o conhecimento da estrutura de DNA e o advento da engenharia genética, a identificação e caracterização de espécies e indivíduos conta com novas tecnologias para auxiliar no desenvolvimento de novas variedades de plantas e animais para diversos fins. Tais tecnologias envolvem procedimentos bioquímicos e físicos cada vez mais apurados que produzem medidas cada vez mais precisas, um exemplo disso são as técnicas que empregam a espectometria de massa para comparar polimorfismos de base única (SNPs). Nas plantas é comum a ocorrência de poliploidia, que consiste na presença de mais de dois cromossomos num mesmo grupo de homologia. A determinação do nível de ploidia é fundamental para a correta genotipagem e por consequência maior eficiência no estudo e aprimoramento genético de plantas. Neste trabalho caracterizamos o fenômeno da poliploidia com modelos probabilísticos de urnas e bolas, propondo um método eficiente e adequado de simulação, assim como uma técnica simples para inferir níveis de ploidia e classificar amostras bialélicas aproveitando características geométricas do problema. Análises de dados simulados e reais provenientes de um experimento de cana-de-açúcar foram realizadas com diferentes medidas de separação entre agrupamentos e diferentes condições experimentais. Para os dados reais, métodos gráficos descritivos evidenciam a corretude e coerência do método proposto, que pode ser generalizado para a genotipagem de locos multialélicos poliplóides. Encerramos o trabalho comparando nossos resultados com a abordagem SuperMASSA [Serang2012] que trouxe excelentes resultados ao problema. Todo código desenvolvido em linguagem R está disponibilizado com o texto. / Since the beginnings of agriculture and livestock, the man selects individuals with desirable characteristics to breed and increase the proportion of new individuals with such qualities. With knowledge of the DNA structure and the advent of genetic engineering, the identification and characterization of individual species can make use of new technologies to help develop new varieties of plants and animals for many purposes. These technologies involve complex biochemical and physical procedures that produce even more accurated measures, like techniques that employ mass spectrometry to compare single nucleotide polymorphisms (SNPs). In plants it is common the occurrence of polyploidy, which is the presence of more than two chromosomes in the same group of homology. The determination of polyploidy level is essential for correct SNPs genotype calling and therefore greater efficiency in the study and genetic improvement of plants. In this work we characterize the phenomenon of poliploidy with probabilistic urns and balls models, proposing an efficient and appropriate method of simulation, as well as a simple technique to infer ploydy levels and classify biallelic samples accurately taking advantage of geometrical characteristics of the problem. Analysis of simulated and real data from an experiment of sugarcane were conducted with different measures of separation between groups and different experimental conditions. For the actual data, descriptive graphical methods show the correctness and consistency of the proposed method, which can be generalized to multi-allelic loci genotyping polyploid. We end our work comparing our results with the SuperMASSA [Serang2012] approach that brought excellent results to the problem. All code developed in language R were provided with the text.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-11T10:12:07Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maly de Albuquerque - 2016.pdf: 6439993 bytes, checksum: ac49fa77e013cea8bc3ea3be9901914b (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-01-11T10:14:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maly de Albuquerque - 2016.pdf: 6439993 bytes, checksum: ac49fa77e013cea8bc3ea3be9901914b (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-11T10:14:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Maly de Albuquerque - 2016.pdf: 6439993 bytes, checksum: ac49fa77e013cea8bc3ea3be9901914b (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-12-20 / Objective: The aims of this study were to detect and identify drug resistance mutations through genotyping related to antiretroviral (ARV) resistance in children and adolescents infected with HIV-1 and with therapeutic failure. Methods: This was a descriptive study based on a retrospective cohort of HIV-infected children and adolescents diagnosed between 1992 and 2013. The pattern of ARV resistance mutations was analyzed in 65 children and adolescents, in therapeutic failure and followed up in a reference pediatric infectious disease clinic since diagnosis. A total of 92 genotypic resistance tests were carried out from 2003 to 2015. Genotypic tests were collected at the Central Laboratory (LACEN) and performed by the RENAGENO laboratory. For the interpretation of resistance the ARV algorithm was used (RENAGENO’s algorithm version 13th, 2015) and the Stanford’s algorithm (Stanford HIV drug resistance database, 2015). The study protocol’s was approved by the ethics committee of the HC / UFG and HDT / SES. Statistical analysis was performed with the software Microsoft Excel version 2010 and Statistical Package for the Social Sciences (SPSS®) 20.0 for Windows. Descriptive and inferential analyzes (t-Student and U-Mann-Whitney tests) were performed, considering the level of significance at 5%. Results: The sample consisted of 65 children and adolescents, with median age at diagnosis of 29.2 months (range from 2 months to 120 months); the majority was female (36/65). A total of 64 (98.5%) patients acquired HIV vertical transmission. Approximately 55% of the patients presented with severe immunosuppression at diagnosis of HIV, and 33% belonged to class B or C, according to the CDC-1994 clinical and immunological classification. The median baseline CD4 lymphocyte count was 921 cells/mm3. HIV viral load, before starting HAART, showed a median of 678,998 copies (log 5.83). At the time of first genotyping, CD4 ranged from 1 to 2940 cells/mm3, with a median of 608 cells/mm3, with a median of 40,548 copies/mL (log 4,60). Most mutations were found in the NRTI class (98.5%), followed by NNRTI (75.4%) and PI (44.6%). The most frequent mutations in the NRTI class were T215 codons (83.1%), with prevalence of T215YF (69.2%), M184V (69.3%), and M41L (52.3%). The most observed mutations in the NNRTI class were K103N / S (40.0%), 190A / S (30.8%), 101E / P / Q (23.1%). Mutations associated with resistance in protease occurred mainly in codons 54, 82 and 46, with rates of 35.4%; 32.3%; 27.7%; respectively. Resistance to more than one class occurred in 41.5%, 12.3% and 35.4% with the combination of NRTIs and NRTIs, ITRN + IP / r, and with the three NRTI + NRTI + IP classes respectively. After rescue therapy, approximately 90% of the patients analyzed had viral suppression, with HIV viral RNA levels below the detection limits (<50 or 40 copies) after 24 weeks of change in the combined antiretroviral regimen (P <0.001). Immunological response resulted in benefit, with significant elevation in CD4 + T cell count (P <0.001). Conclusions: Our study provided relevant information on the results of the genotypic resistance test after failure of long-term ARV therapy in children and adolescents infected with HIV. There were high mutation rates in all antiretroviral classes tested. Rescue therapy guided by the genotypic test provided high rates of viral suppression. Thus, the genotype test emphasizes the possibility of adequately composing an ARV regimen, with a high genetic barrier, using the new drugs and new classes of ARV drugs, with the objective of avoiding the therapeutic failure after rescue and preventing the accumulation of other mutations related to drug resistance. / Objetivo: Analisar, por meio do teste genotípico, o perfil de mutações aos antirretrovirais em crianças e adolescentes infectados pelo HIV-1 com falha terapêutica. Métodos: Trata-se de um estudo descritivo, de uma coorte retrospectiva de crianças e adolescentes infectados pelo HIV, diagnosticadas entre 1992 e 2013. Foi analisado o padrão de mutações de resistência aos antirretrovirais (ARV) em 65 crianças e adolescentes, em falha terapêutica e acompanhados no ambulatório de infectologia pediátrica do HDT desde o diagnóstico. Foram avaliados 92 testes de resistência genotípica realizados no período de 2003 a 2015. Os testes genotípicos foram coletados no Laboratório Central (LACEN) e executados pelo laboratório da RENAGENO, através do Programa Nacional DST e Aids do Ministério da Saúde. Para a interpretação de resistência aos ARV foram utilizados o algoritmo Brasileiro (RENAGENO - Algoritmo versão 13, 2015) e o algoritmo The Stanford University HIV Drug Resistance Database (Stanford HIV drug resistance database, 2015). O trabalho foi aprovado pelo comitê de ética do HC/UFG e do HDT/SES. A análise estatística foi realizada com os softwares Microsoft Excel versão 2010 e Statistical Package for the Social Sciences (SPSS®) 20.0 para Windows. Análises descritivas e inferenciais (testes t-Student e U-Mann-Whitney) foram realizadas, considerando o nível de significância em 5%. Resultados: A amostra foi constituída por 65 crianças e adolescentes, com mediana de idade ao diagnóstico de 29,2 meses (variação de 2 meses a 120 meses); a maioria era do sexo feminino (36/65). Um total de 64 (98,5%) pacientes adquiriu a infecção por transmissão vertical. Aproximadamente 55% dos pacientes apresentavam imunossupressão grave ao diagnóstico de HIV, e 33% pertenciam a classe B ou C, conforme a classificação clínica e imunológica do CDC-1994. A mediana de contagem basal de linfócitos CD4 foi 921 células/mm3. A carga viral do HIV, antes do início da TARV, demonstrou mediana de 678.998 cópias/mL (log 5,83). No momento da coleta do teste de genotipagem, o valor do CD4 variou de 1 a 2940 células/mm3, com mediana de 608 células/mm3, sendo que a carga viral teve mediana de 40.548 cópias/mL (log 4,60). Foram encontradas mais frequentemente mutações na classe de ITRN (98,46%), seguida pela ITRNN (75,4%) e IP (44,6%). As mutações mais frequentes na classe de ITRN foram nos códons T215 (83,1%), com prevalência da T215YF (69,2%), M184V (69,3%), M41L (52,3%). As mutações mais observadas na classe dos ITRNN foram K103N/S (40,0%), 190A/S (30,8%), 101E/P/Q (23,1%). As mutações associadas à resistência na protease ocorreram principalmente nos códons 54, 82 e 46, apresentando taxas de 35,4%, 32,3% e 27,7%, respectivamente. A resistência a mais de uma classe ocorreu em 41,5%, 12,3% e 35,4% com a associação de ITRN + ITRNN, ITRN + IP/r e nas três classes ITRN + ITRNN + IP, respectivamente. Após a terapia de resgate, observou-se que aproximadamente 90% dos pacientes analisados atingiram supressão viral, com níveis de RNA viral do HIV abaixo do limites de detecção (<50 ou 40 cópias) após 24 semanas da mudança do esquema antirretroviral combinado (cARV) (P<0,001). A resposta imunológica resultou em benefício, com elevação na contagem de células T CD4+ (P<0,001). Conclusões: Este estudo forneceu informações relevantes nos resultados do teste genotípico de resistência após falha de terapia ARV a longo prazo em crianças e adolescentes infectados perinatalmente pelo HIV. Houve elevada taxa de mutação em todas as classes de antirretrovirais analizadas. A terapia de resgate guiada pelo teste genotípico proporcionou elevadas taxas de supressão viral. Dessa forma, a realização do teste genotípico reforça a possibilidade de compor adequadamente um regime ARV, com alta barreira genética, utilizando as novas drogas e novas classes de drogas ARV, para evitar a falha terapêutica após o resgate e prevenir acúmulo de outras mutações de resistência às drogas.

As doenças de veiculação hídrica, sobretudo aquelas causadas por protozoários intestinais, emergiram como um dos principais problemas de saúde pública. Diferentes aspectos são abordados sobre a biologia e a epidemiologia dos principais protozoários parasitas de transmissão hídrica. Cryptosporidium está descrito como um importante parasita associado a casos de surtos de veiculação hídrica e alimentos no mundo. A epidemiologia complexa desse protozóario e o fato de que a maioria das espécies e genótipos não pode ser diferenciada morfologicamente, aumentam o interesse por metodologias sensíveis e rápidas na detecção de espécies responsáveis pela infecção em humanos. Neste estudo foram avaliadas 50 amostras de água bruta superficial, coletadas no Rio São Lourenço da Serra (P1A) e Represa de Guarapiranga (P2A) e 50 de esgoto bruto coletadas em São Lourenço da Serra (P1E) e no poço vertical de Taboão da Serra (P2E) entre os meses de janeiro e dezembro de 2013. O isolamento dos oocistos na água foi realizado pelo Método 1623.1 e as amostras de esgoto bruto por centrifugação, separação imunomagnética (IMS). A caracterização genotípica ocorreu por meio da nested PCR, clonagem e sequenciamento com base no gene 18S rRNA comum a todas as espécies de Cryptosporidium. O ensaio de PCR em tempo real (qPCR) foi avaliado simultaneamente para detecção e quantificação de oocistos nas amostras. De acordo com os resultados obtidos pela nested PCR, Cryptosporidium foi detectado na água bruta superficial em 12 por cento (3/25) no manancial P1A e 16 por cento (4/25) no P2A. No esgoto bruto o parasito foi detectado em 20 por cento (5/25) das amostras no ponto P1E e 24 por cento (6/25) no poço vertical P2E. A qPCR detectou 52 por cento (0,79 a 1,85 oocistos/L) de amostras positivas no manancial P1A e o parasito foi detectado em 64 por cento (0,72 a 1,4 oocistos/L) no manancial P2A. No esgoto bruto 72 por cento das amostras foram positivas tanto no ponto P1E (7 a 655 oocistos/L) como no P2E (5 a 519 oocistos/L). A caracterização molecular permitiu a identificação de C. parvum e C. hominis na água bruta superficial, e C. hominis, C. parvum, e C. muris no esgoto bruto. As espécies do gênero Cryptosporidium identificadas neste estudo apresentam expressiva relevância para o desenvolvimento da doença humana. Neste sentido, as metodologias de concentração e caracterização empregadas nas análises demonstraram no geral, o potencial para aplicação em estudos de vigilância ambiental e foram úteis na diferenciação de espécies patogênicas. A presença de C. muris associada às espécies antroponóticas identificadas auxiliou na investigação de prováveis fontes de contaminação no ambiente confirmando a necessidade da expansão de medidas efetivas para proteção destes mananciais. / Waterborne diseases, especially those caused by intestinal protozoa, have emerged as a major public health problem. Different aspects are addressed on the biology and epidemiology of most waterborne protozoan parasites. Cryptosporidium is described as an important parasite associated with cases of waterborne and food outbreaks in the world. The complex epidemiology of this protozoan, as well as the fact that most species and genotypes cannot be differentiated morphologically, increase the interest for sensitive and rapid methods for the detection of species responsible for infection in humans. In this study, 50 samples of raw surface water were collected from São Lourenço River (P1A) and Guarapiranga Dam (P2A), and 50 samples of raw sewage were collected from São Lourenço da Serra (P1E) and from Taboão da Serras vertical well (P2E), between January and December of 2013. The isolation of oocysts in water was carried out by the USEPA Method 1623.1 and raw sewage samples were processed by centrifugation, immunomagnetic separation (IMS). Genotypic characterization occurred by nested PCR, cloning and sequencing based on 18S rRNA gene, which is common to all Cryptosporidium species. Real time PCR assays (qPCR) were carried out both for detection and quantification of oocysts simultaneously in the samples. According to the results obtained by nested PCR, Cryptosporidium was detected in raw surface water in 12 per cent (3/25) of samples at P1A and in 16 per cent (4/25) at P2A. In raw sewage the parasite was detected in 20 per cent (5/25) of samples at P1E and 24 per cent (6/25) in P2E vertical well. qPCR detected 52 per cent (0.79 to 1.85 oocysts/L) of positive samples at P1A, while the parasite was detected in 64 per cent (0.72 to 1.4 oocysts/L) of samples at P2A water supply. Regarding raw sewage, 72 per cent of samples were positive both at P1E (7 to 655 oocysts/L) and P2E (5 to 519 oocysts/L Molecular characterization allowed the identification of C. parvum and C. hominis in raw surface water, and C. hominis, C. parvum and C. muris in raw sewage. Cryptosporidium species identified herein belong to a group of organisms of significant relevance in waterborne diseases. Therefore, concentration and characterization methodologies applied in our analyses showed to be useful for environmental surveillance studies, as well as they were useful in the differentiation of human pathogens. The presence of C. muris associated to anthroponotic species helped in the investigation of likely contamination sources in the environment, confirming the need of expansion in effective measures to protect these water supplies.