Made available in DSpace on 2016-12-23T13:55:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Solange Alves Vinhas.pdf: 4494197 bytes, checksum: c05b3a06ae983246a835977f36eb32e3 (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / Background: Based on the hypothesis that genetic variability of Mycobacterium tuberculosis (MTB) could influence virulence and immunopathology we analyzed genetic profiles of different MTB strains in order to detect relatedness between genetic diversity and presence of cavity (disease severity). Methods: We conducted a retrospective molecular study in Vitória ES, based on TB strains (2003 to 2006, n = 214) from patients with pulmonary cavitary and non-cavitary TB using IS6110-RFLP, Spoligotyping and MIRU-VNTR methodologies. RESULTS: Initially, we compared the association of the demographic and clinical characteristics of patients with the presence of cavities. After logistic regression the variables that most contributed to explain the model of the disease were smear positive (ORajust = 5.96; IC= 2.58-13.73) and sputum production (ORajust = 4.55; IC= 1.28-16.12), there was no statistically significant association with the remaining variables. The LAM family was the most frequent within the samples of the two groups analyzed, representing 65 (62%) of the isolates in the cavitary group and 40 isolates (38%) of the non-cavitary. After comparing the proportions of LAM and other spoligotyping families there was no statistically significant difference between the groups (p=0.17). In relation to deletions RDRio (p=0.65) and RD174 (p=0.65) there were no statistically significant difference between the groups. Amongst the 205 isolates analyzed, 25 (12%) belonging to the non-cavitary group and 43 (21%) belonging to the cavitary group, were grouped in clusters. The statistical analysis of the association of the occurence of clusters with the presence of cavity showed no statistically significant difference between the quantity of clusters and the groups that were analyzed, (p= 0.4). Conclusion: The genotipic profile for the isolates from patients with cavitary and non-cavitary disease was determined. Our data showed that LAM9 was the most frequent among the strains between cavitary and noncavitary groups, corroborating findings that this family is the most frequent in Brasil. There were no statistical differences that could show association among the variables analyzed related to presence of cavity or disease severity / Introdução: Baseado na hipótese de que a variabilidade genética de Mycobacterium tuberculosis (MTB) pode influenciar a virulência e a gravidade da doença os perfis genéticos de isolados clínicos de MTB foram avaliados para detectar associação entre diversidade genética e gravidade da doença. Objetivos: Analisar características genéticas de isolados de MTB e verificar sua possível associação com a gravidade da TB pulmonar. Métodos: Estudo retrospectivo, caso controle, conduzido em Vitória-ES, utilizando isolados de MTB (2003 a 2006, n=214) de pacientes com TB pulmonar, cavitária (127) e não cavitária (87). Realizou-se genotipagem por meio de RFLP-IS6110, Spoligotyping, MIRU-VNTR 24 loci, e a análise de deleções e inserções, como RDRio, RD174 utilizando PCR multiplex, bem como a detecção do Ag85C103. Realizou-se análise estatística, para verificação dos padrões de distribuição das variáveis, seguida de análises bivariadas para verificação de associações entre elas, empregando-se os teste exato de Fisher ou Chi-quadrado, ambos com 95% de intervalo de confiança e nível de significância (&#61554;) < 0,05. Resultados: Após a regressão logística, as variáveis que contribuíram no modelo explicativo da doença foram baciloscopia (ORajust = 5,96; IC= 2,58-13,73) e produção de escarro (ORajust = 4,55; IC= 1,28- 16,12). Não houve associação estatisticamente significativa com o restante das variáveis.A família LAM foi a mais frequente entre os dois grupos analisados, representando 65 (62%) dos isolados no grupo cavitário e 40 isolados (38%) do grupo não cavitário. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos em relação à deleção RDRio (p=0,65) e com relação à deleção RD174 (p=0,65). Dentre os 205 isolados analisados, 25 (12%) isolados do grupo não cavitário e 43 (21%) do grupo cavitário, estavam em cluster. não houve diferença estatisticamente significativa entre a quantidade de clusters e os grupos analisados (p= 0,4). Conclusões: Foi determinado o perfil genotípico dos isolados de pacientes com doença pulmonar, cavitária e não cavitária. Não houve associação entre a presença de cavidade e os genótipos encontrados. Não houve associação do genótipo com nenhum dos marcadores moleculares avaliados

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 WalicyranisonPS_DISSERT.pdf: 2780035 bytes, checksum: 20a70f53e533bfb0816b6d9b02b8af32 (MD5) Previous issue date: 2013-06-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Candida albicans is a diploid yeast that in some circumstances may cause oral or oropharyngeal infections. The investigation of natural products is mandatory for the discovery of new targets for antifungal drugs development. This study aimed to determine the genotypes of 48 clinical isolates of C. albicans obtained from the oral cavity of kidney transplant patients from two distinct geographic regions of Brazil. In addition, we investigated three virulence factors in vitro: phospholipase activity, morphogenesis and the ability to evade from polymorphonuclear neutrophils. The expression of these virulence factors in vitro was also investigated in the presence of the crude extract of Eugenia uniflora. The genotype A was the most prevalent (30 isolates; 62.5%), followed by genotype C (15 isolates; 31.5%) and genotype B (3 isolates; 6.25%). When microsatellite technique with primer M13 was applied, 80% of the isolates from the South were placed within the same cluster. All Genotype C strains were grouped together within two different clusters. Genotype C was considered more resistant to PMNs attack than genotypes A and B. Strains isolated from the South of Brazil showed higher ability to combat PMNs phagocytosis. We found a high rate of genotype C strains isolated from the oral cavity of this group of patients. The crude extract of E. uniflora inhibited proper hypha formation and phagocytosis by PMNs, but had no significant effect on phospholipase activity. This study characterized oral C. albicans strains isolated from kidney transplant recipients and will contribute for the better understanding of the pathogenesis and alternative therapeutics for oral candidiasis / Candida albicans ? uma levedura dipl?ide que em certas circunst?ncias pode causar infec??es da cavidade oral e da orofaringe. A investiga??o de produtos naturais ? fundamental para a descoberta de novos alvos para o desenvolvimento de drogas antif?ngicas. Este estudo objetivou determinar os gen?tipos de 48 isolados cl?nicos de C. albicans obtidos da cavidade oral de pacientes transplantados renais de duas distintas regi?es geogr?ficas do Brasil. Al?m disso, foram investigados tr?s fatores de virul?ncia in vitro: atividade de fosfolipase, morfog?nese e a capacidade de escapar do ataque de neutr?filos polimorfonucleares. A express?o destes fatores de virul?ncia tamb?m foi investigada na presen?a do extrato bruto de Eugenia uniflora. O gen?tipo A foi o mais prevalente (30 isolados; 62,5%), seguido do gen?tipo C (15 isolados; 31,5%) e do gen?tipo B (3 isolados; 6,25%). Quando a t?cnica do microssat?lite com o primer M13 foi empregada, 80% dos isolados da regi?o Sul foram agrupados no mesmo cluster. Todos os isolados do gen?tipo C foram agrupados juntos em dois diferentes clusters bem definidos. Isolados do gen?tipo C foram considerados mais resistentes ? a??o de PMNs do que os dos gen?tipos A e B. As cepas isoladas do Sul do Brasil demonstraram maior habilidade em combater a fagocitose por PMNs. Encontrou-se uma alta taxa de isolados do gen?tipo C da cavidade oral deste grupo de pacientes. O extrato bruto de E. uniflora inibiu a forma??o de hifa e fagocitose por PMNs, mas n?o apresentou efeito significativo na atividade de fosfolipase. Este estudo caracterizou isolados cl?nicos de C. albicans da cavidade oral de pacientes transplantados renais, contribuindo para um melhor entendimento da patog?nese e terap?utica alternativa para a candid?ase oral

INTRODUÇÃO: Aproximadamente 170 milhões de pessoas são portadores de hepatite C crônica, sendo esta atualmente a principal causa de transplantes hepáticos no mundo. Os pacientes com hepatite crônica C são atualmente tratados com interferon e ribavirina (IFN/RBV). Estudos de associação do genoma associaram à resposta ao tratamento com IFN/RBV a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) nas proximidades do gene da Interleucina 28B, que codifica a interferona-?. OBJETIVOS: Padronizar nova metodologia de baixo custo e menor tempo de execução para a genotipagem do polimorfismo rs12979860. Investigar a frequência do polimorfismo rs12979860, em uma coorte de pacientes com hepatite crônica C e sua associação com a resposta ao tratamento no Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo. MÉTODOS: A genotipagem foi realizada, por novo método diagnóstico, PCR multiplex CTPP (confronto de dois pares de iniciadores) e validado através de sequenciamento direto e PCR em tempo real. Um estudo retrospectivo foi realizado em 248 portadores de hepatite C crônica, tratados com interferon e ribavirina; 138 portadores de hepatite C crônica, virgens de tratamento e 240 doadores de sangue. Foi analisado o DNA, dados clínicos e demográficos, juntamente com dados sobre a resposta ao tratamento. RESULTADOS: O método de PCR CTPP foi padronizado e mostrou-se mais rápido e de menor custo comparado ao sequenciamento e PCR em tempo real. Pacientes com resposta virológica sustentada (RVS) apresentaram uma frequência de 33/61 (54,1%) para o genótipo C/C, de 21/61 (34,4%) para o genótipo C/T e 7/61 (11,5%) para o genótipo T/T. Pacientes que não tiveram RVS (Não RVS) apresentam uma frequência de 44/185 (23,8%) para o genótipo C/C, de 102/185 (55,1%) para o genótipo C/T e de 39/185 (21,1%) para o genótipo T/T. Os Não RVS estão associados ao genótipo C/T (p=0,002) e ao genótipo T/T (p=0,001) quanto comparados com o grupo de RVS. CONCLUSÕES: Esta dissertação descreve um método inovador, rápido e de baixo custo, o PCR CTPP, que detecta o polimorfismo rs12979860. O ensaio é internamente controlado e não requer a utilização de endonucleases de restrição ou equipamento especial. O polimorfismo rs12979860 é um preditor significativo da resposta ao tratamento com IFN/RBV em pacientes com infecção crônica pelo vírus da hepatite C. A genotipagem deste, em conjunto com os indicadores já existentes, pode identificar prováveis não respondedores ao tratamento / INTRODUCTION: Approximately 170 million people are chronic carriers of hepatitis C virus (HCV). Chronic HCV patients are currently treated with pegylated interferon and ribavirin (PEG- IFN/RBV). A genome-wide association with PEG-IFN/RBV treatment response and a single nucleotide polymorphism (rs12979860) has been identified near the interleukin 28B gene that encodes interferon-?-3. AIM: Describe an innovative, fast, and low-cost multiplex polymerase chain reaction with confronting two-pair primers that detects the rs12979860 polymorphism. Investigate the frequency of polymorphism rs12979860, among patients with chronic hepatitis C and association with to response treatment at the Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo. METHODS: Genotyping was performed by new diagnostic method, multiplex PCR CTPP (confronting two-pairprimers) and validated by direct sequencing and real time PCR. Retrospective study was conductedin 248 patients with hepatitis C chronic treated with interferon and ribavirin, 138 patients with chronic hepatitis C treatment-naïve and 240 blood donors. We analyzed DNA, clinical and demographic data, along with data onthe response to treatment. RESULTS AND CONCLUSIONS: The CTPP method was standardized and proved faster and lower cost compared to sequencing andreal time PCR. Patients with sustained virologic response (SVR) showed a frequency of 33/61 (54.1%) for the genotype C/C of 21/61 (34.4%) for the genotype C/T and 7/61 (11.5%) for genotype T/T. Patients with out sustained virologic response (Non SVR) have a frequency of 44/185 (23.8%) for the genotype C/C,102/185 (55.1%) for the genotype C/T and 39/185 (21.1%) for genotype T/T.The Non SVR are associated with genotype C/T (p = 0.002) and T/T genotype (p= 0.001) as compared with the group of SVR. Today, the IL28B genotyping is recomended by in the American Association for the Study of Liver Diseases and the European Association for the Study of the Liver guidelines. As a result, physicians should consider testing IL28B in patients with hepatitis C; however, the implementation of routine genotyping has been halted in tertiary care hospitals because of the need for molecular biology tools that are expensive and highly complex. The CTPP multiplex assay described here detects in a single reaction the genotypes C/C, C/T, and T/T. This method allows rapid genotyping of the polymorphism rs12979860, which is reproducible in minimally equipped laboratories; it does not require any special equipment and is a relatively low-cost procedure. The PCR-CTPP method can be used for large testing arrays and is also suitable for genotyping a small number of samples

O genótipo e a carga parasitária constituem dois dos principais fatores associados à patogênese na toxoplasmose congênita. Na Europa e nos EUA, o genótipo II é o mais prevalente em infecções congênitas, enquanto que na América do Sul existem evidências apontando uma maior frequência de genótipos atípicos ou recombinantes, associados a casos mais graves. A carga parasitária também parece atuar como fator de risco independente associado ao prognóstico fetal. Os objetivos do estudo foram padronizar uma amplificação quantitativa (qPCR) com iniciadores do gene B1 para avaliar a carga parasitária; determinar o genótipo parasitário por multiplex-nested-PCR-RFLP dos marcadores 5\'-SAG2, 3\'-SAG2, SAG3 e GRA6, seguido de sequenciamento para confirmação da RFLP e análise de mutações; e verificar se existiria associação entre a carga parasitária e os genótipos parasitários nas mesmas gestações. Foram analisadas 76 amostras de líquido amniótico de gestações com toxoplasmose e 31 amostras controle. A qPCR apresentou LOD de 10 parasitos/mL, detectou as 76 amostras de estudo e nenhum controle. As cargas parasitárias variaram de 222 a 808.328 parasitos/mL. Houve duas amostras com valores acima de 104 parasitos/mL, apesar de todas as gestantes serem tratadas. Na genotipagem, SAG3 amplificou 55 amostras (54 tipo III e uma tipo II); 5\' e 3\'-SAG2 amplificaram 54 amostras (todas tipo I), e GRA6, amplificou 20 amostras (todas tipo III). A única amostra com genótipo parasitário SAG3-tipo II foi a que apresentou mais mutações (n=4), carga parasitária de 958 parasitos/mL, porém o recém-nascido foi assintomático. Houve diferença do número de amostras amplificadas por SAG3, e 5\' e 3\'-SAG2 em relação a GRA6 (McNemar, p<0,001). Os sequenciamentos confirmaram 100% dos resultados de RFLP, e foram encontradas 24 amostras com e 52 sem mutações, não existindo diferenças entre as cargas parasitárias dos dois grupos (Mann-Whitney, p= 0,085). Mais de uma mutação foi observada em cinco amostras. Foram detectadas 37 mutações no estudo: 26 heterozigotas/sinônimas e 11 homozigotas/sinônimas, não havendo regiões hot spot. Quanto à correlação clínico-laboratorial, dos 76 recém-nascidos, todos apresentaram IgM positiva ao nascimento, e 75 eram assintomáticos. O único recém-nascido sintomático apresentava tríade de Sabin e uma das duas cargas parasitárias mais elevadas do estudo (309.574 parasitos/mL), porém o genótipo não foi discriminante e não havia mutações. A outra amostra com carga parasitária acima de 104 parasitos/mL pertencia a recém-nascido assintomático, com genótipo não discriminante, e sem mutações. O estudo concluiu que a técnica de Real Time PCR (qPCR) foi padronizada com sucesso, usando os iniciadores B22 e B23 do gene B1 do parasito, podendo ser empregada na rotina diagnóstica. Além disso, foi possível realizar a genotipagem das amostras incluídas no estudo, com melhor desempenho de SAG3 e 5\' e 3\'-SAG2. O sequenciamento confirmou a confiabilidade da técnica de RFLP, e encontrou frequência elevada de mutações, todas sinônimas, sem regiões hot spot, e aparentemente sem associação com a carga parasitária. Houve elevada variabilidade das cargas parasitárias, porém grande homogeneidade dos genótipos parasitários, não tendo sido observada associação entre a carga parasitária e os genótipos de T. gondii no estudo. / The genotype and the parasite load are two of the main factors associated with pathogenesis in congenital toxoplasmosis. In Europe and the USA, genotype II is the most prevalent in congenital infections, while in South America there is evidence pointing to a higher frequency of atypical or recombinant genotypes associated with more severe cases. The parasite load also appears to act as an independent risk factor associated with fetal prognosis. The study objectives were to standardize a quantitative amplification (qPCR) with B1 gene primers to assess the parasite load; determine the genotype by multiplex-nested-PCR-RFLP of 5\' and 3\'-SAG2, SAG3 and GRA6 markers, followed by sequencing to confirm RFLP and analyze mutations, verifying whether there is association between parasite load and parasite genotypes in the same pregnancies. We analyzed 76 amniotic fluid samples from pregnancies with toxoplasmosis and 31 controls. The qPCR presented LOD of 10 parasites/mL, detected the 76 study samples and no control. Parasite loads ranged from 222 to 808,328 parasites/mL. There were two samples with values above 104 parasites/mL, despite all pregnant women be treated. In genotyping, SAG3 amplified 55 samples (54 type III and 1 type II); 5 \'and 3\'-SAG2 amplified 54 samples (all type I); and GRA6, amplified 20 samples (all type III). The only sample with genotype SAG3-type II showed the highest number of mutations (n=4), parasite load of 958 parasites/mL, but the newborn was asymptomatic. There were differences in the number of samples amplified by SAG3, and 5 \'and 3\'-SAG2 over GRA6 (McNemar test, p <0.001). Sequencing confirmed 100% of the RFLP results; and found 24 samples with and 52 without mutations, with no difference between the parasite load of these two groups (Mann-Whitney, p= 0.085). More than one mutation was observed in five samples. A total of 37 mutations were detected in this study: 26 heterozygotes/synonymous and 11 homozygous/synonyms, with no hot spot regions. Regarding the clinical-laboratory correlation, among the 76 newborns, all showed positive IgM at birth, and 75 were asymptomatic. The only symptomatic newborn presented the Sabin\'s triad and one of the two higher parasite loads in the study (309,574 parasites/mL). However, the genotype was not discriminant and no mutations were detected. The other sample with parasite load above 104 parasites/mL belonged to an asymptomatic newborn with a non-discriminating genotype, and no mutations. The study concluded that the Real Time PCR (qPCR) was successfully developed with primers B22 and B23 of the parasite B1 gene, and can be used in routine practice. Moreover, it was possible to perform the samples genotyping, with better performance of SAG3 and 5 \'and 3\'-SAG2. Sequencing results confirmed the RFLP reliability, and found a high frequency of mutations, all synonymous, with no hot spot regions, and apparently not associated with the parasite load. There was a high variability in parasite load, however great homogeneity of parasite genotypes, with no association between the parasite load and T. gondii genotypes in the study.

Neste estudo, geramos ensaios de espectrometria de massa para detecção de 111 mutações nos genes RET, BRAF, NRAS, HRAS, KRAS, PIK3CA e AKT1 e avaliamos inúmeras linhagens celulares e tumores tiroidianos. Mostramos que as mutações dos genes BRAF e RAS refletem prognósticos distintos e que as mutações BRAF são altamente prevalentes em câncer metastático. Mutações dos genes PIK3CA e AKT1, esta última sendo reportada pela primeira vez no câncer de tiróide, são relativamente frequentes neste câncer. Avaliamos ainda a função do microRNA let-7 neste câncer. Mostramos que a ativação do rearranjo RET/PTC3 em células de tiróide PCCl3 reduz a expressão de let-7. Além disso, a transfecção deste microRNA em células TPC-1, que apresentam o rearranjo RET/PTC1, inibe a fosforilação de ERK, o crescimento celular e modula a expressão de genes do ciclo celular e diferenciação. Estes dados contribuem na aplicação de terapias dirigidas a efetores das vias PI3K e MAPK no câncer de tiróide, além de salientar o envolvimento do miRNA let-7 como um gene supressor tumoral nesta doença. / In this study, we designed an assay panel for genotyping 111 mutations by mass spectrometry in RET, BRAF, NRAS, HRAS, KRAS, PIK3CA, AKT1 and other related genes in many thyroid cancer cell lines and tumors. We show that patients with BRAF and RAS mutations have distinct prognosis and that BRAF mutations are highly prevalent in metastatic thyroid cancers. Mutations of PIK3CA and AKT1, the latter not previously described in this disease, are comparatively frequent in thyroid cancers. In addition, we evaluated the role of let-7 microRNA in this cancer. We show that RET/PTC3 activation in PCCl3 thyroid cells reduces let-7 expression. Moreover, transfection of let-7 in TPC-1 cells, which harbor RET/PTC1 rearrangement, inhibits MAPK activation, reduces cell growth and modulates the expression of cell cycle and differentiation genes. These findings may contribute to the design of therapies directed at MAPK and PI3K effectors and to highlight the function of let-7 as tumor suppressor gene in thyroid cancer.

Introdução: estudos com Enfuvirtida (ENF) mostraram que mutações na HR1 da gp41 levam à resistência primária de cepas em pacientes sem tratamento prévio com inibidores de fusão (Derdeyn et al., 2000; Rimsky et. al., 1998; Sista et. al., 2002). Outros, que o uso contínuo de HAART leva à falha virológica (Shafer et. al., 1998; Shafer & Vuitton, 1999). Para a melhor escolha terapêutica recomenda-se usar a Genotipagem do HIV1 (Ministério da Saúde, 2008b; Perez-Elias et. al., 2003; Shafer et. al., 2001). Objetivos: avaliar o perfil de resistência do HIV1 ao ENF pelo sequenciamento da HR1 da gp41 em pacientes sob HAART, sem uso de inibidor de fusão. Realizar fenotipagem virtual da pol do HIV1 em trinta e duas cepas com resistência aos NRTI, NtRTI , NNRTI e PI para verificar indicação do ENF. Métodos: investigamos 877 prontuários de pacientes do CRT-DST/AIDS entre 5/2002 a 7/2005 e verificamos que 92 que haviam realizado o Teste de Genotipagem do HIV1 em nosso laboratório, sem tratamento prévio com inibidores de entrada poderiam participar do nosso estudo. O primeiro grupo, com 60 pacientes apresentou cepas sensíveis à pelo menos um antirretroviral (ARV) e o segundo com 32 cujas cepas apresentaram resistência parcial e completa às drogas. A região HR1/HR2 da gp41 foi seqüenciada com o kit Big Dye Terminator vs. 3.1. Alinhamos as seqüências e as comparamos com HXB2 através do programa BioEdit vs.7.0.9.0. As mutações de resistência ao ENF foram determinadas pelo algoritmo Francês (ANRS) e pelo da Universidade de Stanford. Submetemos as sequências ao Virtual Phenotype Assay (Virco, Bélgica) para obtermos a Fenotipagem Virtual. Os subtipos da HR1/HR2 da gp41 e do pol foram determinados por análises filogenéticas e os recombinantes, pelo Simplot v 3.5.1. Resultados: 89(97%) amostras foram seqüenciadas, 2 (2%) não amplificaram e 1 (1%) não tinha material suficiente. Destas, 82 (92%) eram do subtipo B, 6(7%) do F1 e 1(1%), do BF na gp41. No pol, 80(87%) eram B, 4(4%) eram F e 7(8%), eram FB. Três (3%) apresentaram resistência primária ao ENF, determinada pela N42D (1%), N43H (1%) e L44M (1%). Dez amostras tinham os polimorfismos Q39R(10%), N42H(10%), N42R(10%), N42N/S(10%) e N42S(60%). Na HR2, as mutações N126N/K, N126K/Q/E, E137E/K, E137K e S138S/A estavam presentes em 26% das cepas. Apesar das cepas apresentarem resistência aos ARV pelo teste de genotipagem, a fenotipagem virtual mostrou que 10% dos ARV ainda atuavam sobre elas, enquanto que 75% delas apresentaram resistência parcial e 15%, completa às drogas. Conclusão: nosso estudo sugere a introdução do teste de genotipagem da HR1/HR2 da gp41 antes de indicar do ENF em pacientes com falha terapêutica e que a Fenotipagem Virtual pode ser usada para a escolha do melhor esquema antirretroviral que permita uma supressão viral sustentada. / Background: studies using Enfuvirtide (ENF) have showed that mutations in the HR1 (gp41) have been associated with primary resistance in strains of the patients without previous treatment with fusion inhibitors. (Rimsky et. al.,1998; Derdeyn et al.,2000, Sista et. al.,2002). The widespread use of HAART may achieve maximal suppression of the viral load, but the viral rebound may occur, leading to virologic failure (Shafer et. al.,1998; Shafer & Vuitton,1999). To optimize therapeutic choices it is recommended to use the HIV1 Genotypic Assay. Objective: to evaluate the resistance profile in the HR1 in patients submitted to HAART, but naïve entry inhibitors. To make the Virtual Phenotypic Assay in the pol of the HIV1 strains isolated of the 32 patients with resistance to the antiretroviral (ARV) and to verify the possibility of using the ENF. Methods: we investigated 877 handbook patients of the CRT-DST/AIDS from May/2002 to July/2005. We identified 92 naïve patients to entry inhibitors included in our cohort to do genotypic assay; they were included in our research. The first group was composed by 60 persons with sensible strains to only one ARV. The second, with 32 presented strains with resistance to all ARV. HR1/HR2 was sequenced (ABIPrism BigDye Terminator vs 3.1). Bioedit Software vs.7.0.9.0 was used to compare sequences with the HIVHXB2. The resistance mutations to ENF were analyzed using French ANRS and Stanford HIV Drug Resistance Algorithm. The results by Virtual Phenotype Assay of 32 patients that presented regimen failure by Genotypic Assay predicted HIV phenotypic resistance. Subtype analysis were did by Phylogeny and the recombinants strains results, confirmed by Simplot v.3.5.1. Results: 89(97%) out of 92 samples were sequenced. Two of them (2%) could not be amplified and one (1%) we did not have enough material to use. In the HR1/HR2 82(92%) of the samples were typed as B, 6(7%), as F and 1(1%) as FB. In the pol 80(87%) were classified as B, 4(4%), as F and 7(8%) as FB. According to algorithms used, 3(3%) out of 89 ENF naïve patients presented complete resistance to this drug. One virus harbored the N42D mutation (1%), another, the N43H(1%) and the other one the L44M(1%). In 10 samples we observed the polymorphisms Q39R(1%), N42H(1%), N42R(1%), N42N/S(1%) and N42S(7%). In the HR2 domain the substitutions N126N/K, N126K/Q/E, E137E/K, E137K and S138S/A were present in 26% of the samples. Although strains presented resistance to the ARV by Genotypic Assay, in the Virtual Phenotypic Assay we verified that 10% of the drugs had some effect upon them. 75% of the strains presented partial and 15% completed resistance to ARV. Conclusion: it is important to introduce the HR1/HR2 genotyping test to verify resistance mutations to ENF before indicating this drug to patients with virologic failure. The virtual phenotypic assay can be used to select the better combination therapy to obtain viral suppression sustained response.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_talita_tejada.pdf: 1229434 bytes, checksum: 00aa0198737634a5ddf797dd569f628f (MD5) Previous issue date: 2013-02-04 / Salmonella is one of the main causative agents of foodborne diseases, and chicken-based products play a prominent role in this context, serving as vehicles to the microorganism. The present study aimed to provide data on the Salmonella spread in the poultry chain, check the occurrence of Salmonella and its different serotypes isolated from chicken stool, chicken products and human stool, as well as to verify the similarity between DNA profiles of Samonella isolated. Literature on the occurrence of Salmonella in the poultry chain was reviewed; parallel to it, a project in which 600 samples (200 chicken meat, 200 chicken stool and 200 human stool samples) were analyzed for Salmonella presence was developed. DNA profiles of isolated strains were obtained by PFGE and REP-PCR. The microorganism was isolated from 16 samples, 8 (8/200 4%) from chicken products, 4 of which (4/200 2%) from chicken stool and 4 (4/200 2%) from human stool. Salmonella serotype Schwarzengrund was found to prevail both in chicken meat and chicken stool, followed by serotype Mbandaka, whereas serotype Panama prevailed in humans. Strains with indistinguishable genotypes were found to be present both in chicken stool and chicken products, suggesting that the chicken contamination on the farm remained in the processed product. In humans, the isolated strains were indistinguishable between one another, suggesting an outbreak occurrence; however, the isolated serotypes in humans were not the same as those in chickens, which is probably related to different contamination sources. / Salmonella é um dos principais agentes causadores de doenças transmitidas por alimentos e os produtos a base de frango tem destaque importante neste contexto, podendo servir de veículo desse micro-organismo. O presente trabalho teve como objetivo apresentar dados quanto à propagação de Salmonella na cadeia avícola, verificar a ocorrência de Salmonella e de suas diferentes sorotipos isoladas de fezes de frango, produtos de frango e fezes humanas, bem como para verificar a similaridade entre os perfis de DNA de Salmonella isolados no extremo sul do Brasil. Foi realizada uma revisão bibliográfica discorrendo sobre Salmonella na cadeia aviária e paralelamente foi desenvolvido um projeto, no qual foram analisadas 600 amostras (200 de carne de frango, 200 de fezes de frango e 200 de fezes de humanos), quanto à presença de Salmonella. Os perfis de DNA das cepas isoladas foram obtidos em PFGE e REP-PCR. O micro-organismo foi isolado de 16 amostras, sendo 8 (8/200 4%) de produtos de frango, 4 (4/200 2%) de fezes de frango e 4 (4/200 2%) de fezes de humanos. Observou-se que, tanto em carne de frango como fezes de frango, o sorotipo predominante foi Schwazengrund, seguido de Mbandaka. Em humanos, predominou S. Panama. Foi constatado que de cepas com genótipos indistinguíveis estavam presentes tanto em fezes de frango como produtos de frango, sugerindo que a contaminação do frango no aviário permaneceu no produto processado. Em humanos, as cepas isoladas foram indistinguíveis entre si sugerindo que tenha ocorrido um surto, no entanto, os sorotipos isolados não foram os mesmos dos isolados de frango, o que sugere outra fonte de contaminação.

Tripanossomas de mamíferos constituem um dos grupos mais complexos da família Trypanosomatidae, abrangendo parasitas com ciclos de vida e estruturas populacionais heterogêneos. De acordo com a diversidade, filogenias baseadas em genes SSUrDNA e gGAPDH segregaram estes parasitas em 4 Clados principais: T. brucei, T. cruzi, T. theileri e T. lewisi. Catepsinas L e B (CATL e CATB), as principais atividades proteolíticas dos tripanossomas, participam não apenas na degradação de proteínas como também em eventos biológicos como diferenciação, invasão celular, virulência e evasão do sistema imune. Comparamos os perfis proteolíticos de enzimas CATL em tripanossomas patogênicos e não patogênicos e também isolamos e sequenciamos os domínios catalíticos dos genes CATL e CATB em diversas espécies dos principais clados. Os resultados provaram a utilidade destes marcadores no diagnóstico e genotipagem de T. cruzi, T. rangeli, T. theileri e T. congolense, assim como na construção de filogenias robustas da família Trypanosomatidae, congruentes com os marcadores tradicionais. / Trypanosomes of mammals comprise one of the most complex groups of the family Trypanosomatidae, including parasites with heterogeneous life cycles and population structures. According to such diversity, phylogenetic analyzes based on SSUrDNA and gGAPDH genes segregate these parasites in 4 major clades: T. brucei, T. cruzi, T. lewisi and T. theileri. Cathepsins L and B (CATL and CATB), the main proteolytic activities of trypanosomes, are not only involved in protein degradation but also in biological events such as cell differentiation, cell invasion, virulence, and evasion from the immune system. We comparatively analysed the CATL proteolytic profiles in pathogenic and non-pathogenic trypanosomes, and isolated and sequenced the catalytic domains of CATB and CATL genes in several species of the major clades. Our results demonstrated the usefulness of both markers in the diagnosis and genotyping of T. cruzi, T. rangeli, T. congolense and T. theileri as well as in the construction of robust phylogenies of the family Trypanosomatidae, congruent with traditional markers.

Tripanossomas de mamíferos constituem um dos grupos mais complexos da família Trypanosomatidae, abrangendo parasitas com ciclos de vida e estruturas populacionais heterogêneos. De acordo com a diversidade, filogenias baseadas em genes SSUrDNA e gGAPDH segregaram estes parasitas em 4 Clados principais: T. brucei, T. cruzi, T. theileri e T. lewisi. Catepsinas L e B (CATL e CATB), as principais atividades proteolíticas dos tripanossomas, participam não apenas na degradação de proteínas como também em eventos biológicos como diferenciação, invasão celular, virulência e evasão do sistema imune. Comparamos os perfis proteolíticos de enzimas CATL em tripanossomas patogênicos e não patogênicos e também isolamos e sequenciamos os domínios catalíticos dos genes CATL e CATB em diversas espécies dos principais clados. Os resultados provaram a utilidade destes marcadores no diagnóstico e genotipagem de T. cruzi, T. rangeli, T. theileri e T. congolense, assim como na construção de filogenias robustas da família Trypanosomatidae, congruentes com os marcadores tradicionais. / Trypanosomes of mammals comprise one of the most complex groups of the family Trypanosomatidae, including parasites with heterogeneous life cycles and population structures. According to such diversity, phylogenetic analyzes based on SSUrDNA and gGAPDH genes segregate these parasites in 4 major clades: T. brucei, T. cruzi, T. lewisi and T. theileri. Cathepsins L and B (CATL and CATB), the main proteolytic activities of trypanosomes, are not only involved in protein degradation but also in biological events such as cell differentiation, cell invasion, virulence, and evasion from the immune system. We comparatively analysed the CATL proteolytic profiles in pathogenic and non-pathogenic trypanosomes, and isolated and sequenced the catalytic domains of CATB and CATL genes in several species of the major clades. Our results demonstrated the usefulness of both markers in the diagnosis and genotyping of T. cruzi, T. rangeli, T. congolense and T. theileri as well as in the construction of robust phylogenies of the family Trypanosomatidae, congruent with traditional markers.

INTRODUÇÃO: A hiperplasia adrenal macronodular independente de ACTH (AIMAH) é uma doença rara, caracterizada pela presença de macronódulos funcionantes nas adrenais e por uma produção aumentada, autônoma e sustentada de cortisol. Constitui uma causa incomum de síndrome de Cushing (SC). A forma esporádica da doença parece ser a mais frequente, no entanto, se desconhece a real prevalência de sua forma familial. Apesar de ser uma entidade clínica conhecida há quase 50 anos, o processo fisiopatológico que culminaria com a AIMAH, as alterações genéticas predisponentes e aspectos clínicos, laboratoriais e radiológicos relevantes da doença ainda não foram elucidados de forma clara. O diagnóstico recente de uma grande família portadora da doença viabilizou a realização do presente trabalho. OBJETIVOS: 1) Caracterizar a evolução da AIMAH em sua forma familial, correlacionando as manifestações clínicas, os dados laboratoriais e os achados radiológicos; 2) investigar a possível associação entre a AIMAH e a ocorrência de meningiomas intracranianos; 3) avaliar a atividade metabólica das adrenais hiperplasiadas na AIMAH; 4) definir o padrão de herança genética da doença na família estudada; e 5) mapear regiões cromossômicas e loci potencialmente relacionados à etiologia genética da AIMAH familial. MÉTODOS: 96 membros da família estudada foram inicialmente submetidos a uma avaliação clínica e laboratorial pormenorizada. Em seguida, foram realizados exames de tomografia computadorizada para a caracterização radiológica das adrenais. Exames de ressonância magnética e de tomografia por emissão de pósitrons com fluordesoxiglicose marcada, acoplada à tomografia computadorizada (18F-FDGPET/CT) foram realizados em pacientes com as formas familial e esporádica da doença para, respectivamente, investigar a presença de meningiomas intracranianos e caracterizar a atividade metabólica das adrenais hiperplasiadas. Foram também realizados testes in vivo para a pesquisa de receptores hormonais aberrantes nos pacientes com a forma familial da doença. Em uma outra etapa do estudo, diferentes técnicas de biologia molecular foram empregadas para a investigação da etiologia genética da AIMAH familial. Desta forma, realizou-se: o sequenciamento do gene do receptor do ACTH (MC2R), um estudo de ligação genética utilizando microssatélites específicos, um estudo de ligação genética em escala genômica utilizando polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) e o sequenciamento de genes suspeitos. RESULTADOS: A avaliação dos indivíduos pertencentes à genealogia permitiu o diagnóstico de 15 casos da doença (7 mulheres e 8 homens) em três gerações consecutivas. A AIMAH era transmitida para as gerações subsequentes tanto pelo sexo masculino como feminino e acometia cerca de metade dos irmãos em alguns segmentos da família. A idade média ao diagnóstico da doença foi de 52,8 +-11,3 anos (32 a 74 anos) e cerca de 86% (12/14) desses pacientes apresentavam SC subclínica. As dosagens do cortisol salivar à meia-noite e do cortisol em urina de 24 horas demonstraram baixa sensibilidade (21% e 14%, respectivamente) para o diagnóstico da doença em sua forma familial. O valor do ACTH plasmático encontrava-se baixo ( < 10 pg/mL) em 46% (5/11) dos pacientes doentes. Em cerca de 62% (8/13) dos casos, foi demonstrada uma redução do valor sérico do sulfato de desidroepiandrosterona (SDHEA). Por regressão logística simples, foi observado que a probabilidade (odds ratio) de um indivíduo apresentar a doença na família era maior diante da presença de pletora, após o diagnóstico de diabetes ou pré-diabetes ou diante do relato de ganho ponderal progressivo. O espessamento de ambas as adrenais associado à presença de nódulos bilaterais foi o achado radiológico mais frequente na forma familial da doença. No entanto, em um terço dos pacientes (5/15) foram encontradas alterações radiológicas em somente uma das adrenais. Durante os testes in vivo para pesquisa de receptores hormonais aberrantes, foram observadas, com frequência, respostas distintas entre os indivíduos doentes pertencentes à família. Nos pacientes submetidos ao exame de ressonância magnética, foram demonstradas imagens típicas de meningiomas intracranianos em um terço (5/15) dos casos. No exame 18F-FDG-PET/CT, foi observado um aumento da atividade metabólica das adrenais hiperplasiadas, tanto nos pacientes com SC manifesta como naqueles com a forma subclínica da doença. O estudo molecular permitiu delimitar nos cromossomos 16 e 11 algumas regiões genômicas potencialmente relacionadas à etiologia genética da AIMAH familial. O sequenciamento de alguns genes suspeitos (GPR56, GPR97 e GPR114), localizados nessas regiões, não demonstrou a presença de mutações. CONCLUSÕES: Na genealogia estudada, o padrão de transmissão da AIMAH foi autossômico dominante, e a SC subclínica foi a forma mais frequente de manifestação da doença. O teste de supressão com 1 mg de dexametasona via oral à meia-noite demonstrou ser o exame laboratorial de escolha para a avaliação inicial dos pacientes suspeitos de apresentarem AIMAH familial, em função, sobretudo, da baixa sensibilidade do cortisol salivar à meia-noite e do cortisol urinário para o diagnóstico da doença. Valores normais do ACTH plasmático foram um achado laboratorial frequente na AIMAH familial e valores baixos do SDHEA sérico demonstraram ser um indício relativamente precoce da SC subclínica associada à doença. Diferentes padrões radiológicos foram demonstrados nas tomografias das adrenais dos pacientes com AIMAH familial, não sendo infrequente a presença de assimetria entre as duas glândulas. Os resultados dos testes in vivo para a pesquisa de receptores hormonais aberrantes foram mais condizentes com a hipótese de que a expressão desses receptores seria um epifenômeno do processo fisiopatológico, resultante da proliferação e desdiferenciação celular. Uma alta prevalência de meningiomas intracranianos foi observada nos pacientes com AIMAH, tanto na forma familial da doença como na forma esporádica. Demonstrou-se também, pela primeira vez, que as adrenais na AIMAH podem exibir uma captação aumentada de 18F-FDG no exame de PET/CT, de forma semelhante às metástases e aos carcinomas da glândula. Por fim, foram delimitadas no cromossomo 16 (16p12.1, 16p11.2, 16q12.1, 16q13 e 16q21) e no cromossomo 11 (11q23.1) as principais regiões do genoma suspeitas de estarem ligadas à etiologia genética da AIMAH familial (genoma de referência: NCBI36/hg18) / INTRODUCTION: ACTH-independent macronodular adrenal hyperplasia (AIMAH) is a rare disease characterized by functioning adrenal macronodules and increased, autonomous and sustained cortisol production. This condition is an uncommon cause of Cushing\'s syndrome (CS). While the sporadic form of the disease appears to be the most frequent, the true prevalence of its familial form is unknown. Despite being a known clinical entity for almost 50 years, the pathophysiological process that leads to AIMAH, the predisposing genetic alterations and important clinical, laboratory and radiological aspects of the disease have not been fully clarified. The recent identification of a large group of relatives with familial AIMAH allowed the accomplishment of the present study. OBJECTIVES: The following were the aims of this study: 1) characterize the development of familial AIMAH through correlations between clinical manifestations, laboratory data and radiological findings; 2) investigate the possible association between AIMAH and the occurrence of intracranial meningioma; 3) characterize the metabolic activity of the adrenal glands in this disease; 4) define the inheritance pattern of the disease in the family studied; and 5) map chromosomal regions and loci potentially related to the genetic etiology of familial AIMAH. METHODS: 96 members of the family studied were initially subjected to a detailed clinical and laboratory evaluation. Computed tomography (CT) scans were performed for the radiological characterization of the adrenal glands. Magnetic resonance imaging scans and 18F-fluorodeoxyglucose positron emission tomography/computed tomography (18F-FDG-PET/CT) scans were performed on patients with both forms of the disease (familial and sporadic) to investigate the presence of intracranial meningioma and characterize the metabolic activity of the adrenal glands, respectively. In vivo studies for aberrant hormone receptors were also conducted on those patients with familial AIMAH. In another phase of the study, different molecular biology techniques were employed to investigate the genetic etiology of familial AIMAH. For such, sequencing of the ACTH receptor gene (MC2R), a linkage study using specific microsatellite markers, a single nucleotide polymorphism (SNP)-based genome-wide linkage study and the sequencing of suspect genes were performed. RESULTS: The evaluation of the family revealed the diagnosis of 15 cases of the disease (7 women and 8 men) in three consecutive generations. AIMAH was transmitted to subsequent generations by both genders and half of the siblings were affected in some segments of the family. Mean age at diagnosis was 52.8 +-11.3 years (range: 32 to 74 years) and about 86% (12/14) of the patients exhibited subclinical CS. Both midnight salivary cortisol and 24-hour urinary cortisol demonstrated low sensitivity (21% and 14%, respectively) for the diagnosis of familial AIMAH. Plasma ACTH levels were low ( < 10 pg/ml) in 46% (5/11) of patients with the disease. In about 62% (8/13) of cases, serum dehydroepiandrosterone sulphate (DHEAS) levels were below the normal range. Simple logistic regression models revealed that the probability (odds ratio) of an individual having the disease in the family was greater in the presence of plethora, progressive weight gain or after the diagnosis of diabetes or prediabetes. Adrenal thickening associated with the presence of bilateral nodules was the most common radiological finding in familial AIMAH. However, radiological abnormalities were found in only one of the adrenal glands in one third of the patients (5/15). Throughout the in vivo studies for aberrant hormone receptors, distinct responses were frequently observed among the individuals with familial AIMAH. One third (5/15) of the patients who underwent magnetic resonance imaging scans had typical images of intracranial meningiomas. The 18F-FDG-PET/CT scan revealed increased metabolic activity of the hyperplastic adrenals in patients with both overt and subclinical CS. The molecular studies delimited genomic regions on chromosomes 16 and 11 potentially related to the genetic cause of familial AIMAH. Some suspected genes (GPR56, GPR97 and GPR114), located in these genomic regions, were sequenced, but no mutations were found. CONCLUSIONS: In the extended family studied, AIMAH followed an autosomal dominant pattern of inheritance and subclinical CS was the most common presentation of the disease. The 1 mg overnight dexamethasone suppression test proved to be the screening test of choice for the initial evaluation of patients suspected to have familial AIMAH, due mainly to the low sensitivity of midnight salivary cortisol and 24-hour urinary cortisol as screening tests. A normal level of plasma ACTH was a common laboratory finding in familial AIMAH. Low serum levels of DHEAS proved to be a relatively early finding associated with the subclinical CS determined by the disease. Adrenal CT scans revealed different radiological patterns among patients with familial AIMAH, with a fairly frequent rate of asymmetry between glands. The distinct responses observed throughout the in vivo studies for aberrant hormone receptors, among family members, favor the hypothesis that these receptors may be an epiphenomenon resulting from cell proliferation and dedifferentiation. An increased prevalence of intracranial meningioma was demonstrated in both the familial and sporadic forms of AIMAH. For the first time, it was shown that AIMAH may exhibit increased 18FFDG uptake on the PET/CT scan, similarly to adrenal carcinoma and metastasis. The main genomic regions potentially associated with familial AIMAH were delimited on chromosome 16 (16p12.1, 16p11.2, 16q12.1, 16q13 and 16q21) and chromosome 11 (11q23.1) (reference genome: NCBI36/hg18)