INTRODUÇÃO: A frequência de Candida parapsilosistem apresentado considerável aumento em UTIs neonatais. Embora a taxa de resistência dessa espécie aos azólicos seja baixa, recentemente têm sido relatados surtos de candidemia por isolados resistentes. A capacidade de adesão e formação de biofilme por essa espécie confere maior potencial patogênico e resistência aos antifúngicos. Portanto, a vigilância epidemiológica, tanto da resistência aos antifúngicos como da virulência dos isolados, é fundamental para o controle e prevenção das infecções e surtoshospitalares. A técnica de MALDI-TOF MS pode ser uma ferramenta útil para realizar análises proteômicas das células planctônicas e sésseis de Candida parapsilosis,e identificar possíveis alvos terapêuticos ou biomarcadores, específicos do biofilme. MÉTODOS: Isolados clínicos do complexo Candida parapsilosis de dois hospitais universitários públicos brasileiros, foram submetidos à identificação por RAPD, RFLP e MALDI-TOF MS e aos testes de suscetibilidade aos antifúngicos. Ensaios de formação de biofilme foram realizados para quantificar a biomassa, a atividade metabólica e ainda, avaliar atividade in vitrodos antifúngicos contra as células sésseis dos isolados com alta formação de biofilme. A análise proteômica por MALDI-TOF MS das células planctônicas e sésseis dos isolados com alta formação de biofilme, foi realizada nas plataformas VITEK-MS(TM) e Microflex(TM). Isolados de Candida parapsilosis (sensu stricto) foram genotipados por PFGE e análise de microssatélites. Os genótipos foram correlacionados com dadosclínicos, para investigar a ocorrência de um surto em CTI adulto, e as sequências do gene ERG11dos isolados não suscetíveis aos azólicos (NSA) foram analisadas. RESULTADOS: Foram obtidos 38 isolados do complexo Candida parapsilosis, sendo Candida parapsilosis(sensu stricto) a espécie de maior frequência, superando 80% em ambos os hospitais, seguida de C. orthopsilosis e C. metapsilosis. Embora todos os isolados tenham sido suscetíveis à anfotericina B ( < 2 mg/L) e apresentado suscetibilidade intermediária à anidulafungina, caspofungina e micafungina ( > 0,002 mg/L), elevada frequência de não suscetibilidade (resistência ou suscetibilidade intermediária) ao fluconazol e voriconazol foi observada entre isolados de um dos hospitais. Alta formação de biofilme foi observada apenas entre os isolados da espécie Candida parapsilosis(sensu stricto). Por outro lado, a maioria dos isolados NSA, apresentou baixa formação de biofilme e baixa atividade metabólica. Apenas anfotericina B apresentou atividade contra os biofilmes de Candida parapsilosis. As duas plataformas de MALDI-TOF MS conseguiram diferenciar os perfis proteômicos das células planctônicas e sésseis dos isolados. A genotipagem de Candida parapsilosis(sensu stricto) revelou a persistência de isolados clonais NSA e a mutação A395T no gene ERG11foi identificada exclusivamente entre os isolados resistentes ao azólicos. O uso de corticosteroide foi associado, estatisticamente, com a ocorrência de isolados clonais NSA. CONCLUSÕES: Candida parapsilosis (sensu stricto) se mantém como a principal espécie do complexo em infecções sanguíneas. Isolados resistentes aos azólicos, com mutações no gene ERG11, ocorreram nos dois hospitais avaliados. A correlação dos genótipos com os dados clínicos evidenciou a ocorrência de um surto envolvendo isolados clonais NSA, com associação estatisticamente significativa, ao uso prévio de corticosteroides. Candida parapsilosis (sensu stricto) foi a única espécie que apresentou alta formação de biofilme, o qual demonstrou elevada resistência às equinocandinas. As duas plataformas de MALDI-TOF MS, diferenciaram os perfis proteômicos, das células planctônicas e sésseis de Candida parapsilosis, demonstrando o potencial emprego dessa tecnologia na identificação de possíveis alvos terapêuticos ou biomarcadores, específicos de biofilmes / INTRODUCTION: The frequency of Candida parapsilosis isolates has increased considerably in neonatal ICUs. Although resistance to azoles is usually low in this species, candidemia outbreaks by resistant isolates have been recently reported. Theability of adhesion and biofilm formation by this species confers higher pathogenic potential and resistance to antifungal agents. Therefore, establishment of profiles of antifungal susceptibility and virulence, besides the epidemiological surveillance ofC. parapsilosisisolates are essential for the control and prevention of nosocomial infections and outbreaks. The MALDI-TOF MS technique can be a useful tool to perform proteomic analyzes of the planktonic and sessile cells of Candida parapsilosis, identifying possible biofilm-specific therapeutic targets or biomarkers. METHODS: Candida parapsilosisclinical isolates from two Brazilian public university hospitals were identified by RAPD, RFLP and MALDI-TOF MS and submitted to antifungal susceptibility tests. Biofilm formation assays were carried out to quantify the biomass and metabolic activity, and to evaluate the in vitroactivity of antifungal drugs against the sessile cells of the isolates with high biofilm formation. Proteomic analysis of the planktonic and sessile cells of the isolates with high biofilm formation was performed in two MALDI-TOF MS platforms, VITEK-MS(TM) and Microflex(TM). Candida parapsilosis(sensu stricto) isolates were genotyped by PFGE and microsatellite analysis. The genotypes were correlated with clinical data to investigate the occurrence of an outbreak in the adult ICU andERG11gene sequences from non-susceptible to azoles (NSA) isolates were also analyzed. RESULTS: 38 clinical isolates of the Candida parapsilosiscomplex were obtained, with Candida parapsilosis(sensu stricto) being the most frequent species (exceeding 80% in both hospitals), followed by C. orthopsilosisand C. metapsilosis. Although all isolates were susceptible to amphotericin B ( < 2 mg/L) and showed intermediate susceptibility to anidulafungin, caspofungin e micafungin ( > 0,002 mg/L), high frequency of non-susceptibility (resistance or intermediate susceptibility) to fluconazole and voriconazole was observed among isolates from one of the hospitals. High biofilm formation was only observed among isolates of the Candida parapsilosis. (sensu stricto) species. On the other hand, most of the NSA isolates presented low biofilm formation and low metabolic activity. Only amphotericin B showed activity against Candida parapsilosisbiofilms. The two MALDI-TOF MS platforms were able to differentiate the proteomic profiles of planktonic and sessile cells of isolates. Candida parapsilosis(sensu stricto) genotyping revealed the persistence of clonal NSA isolates. The A395T mutation in the ERG11gene was identified exclusively among azole resistant isolates. The use of corticosteroid was statistically associated with the occurrence of clonal NSA isolates. CONCLUSIONS: Candida parapsilosis(sensu stricto) remains the main species of the complex in bloodstream infections. Azole-resistant isolates with mutations in the ERG11gene are emerging in the two hospitals evaluated. Additionally, the correlation between the genotypes and the clinical data showed the occurrence of an outbreak involving isolates resistant to azoles, with a statistically significant association with previous use of corticosteroids. Candida parapsilosis(sensu stricto) was the only species that presented high biofilm formation and resistance against echinocandins. The two MALDI-TOF MS platforms differentiated the proteomic profiles of the planktonic and sessile cells of Candida parapsilosis, demonstrating the potential use of this technology to identify possible biofilm-specific therapeutic targets or biomarkers

INTRODUÇÃO: A determinação do genótipo RHD fetal no plasma materno é um teste de diagnóstico pré-natal não invasivo oferecido a gestantes RhD negativo que apresentam potencial de sensibilização e/ou Doença Hemolítica Perinatal. Atualmente, este exame é realizado de rotina em diversos países, mas não no Brasil. A Clínica Obstétrica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) oferece atendimento terciário a gestantes RhD negativo, com monitorização dos títulos de anticorpos irregulares, administração da imunoglobulina anti-D e/ou terapêutica fetal, quando necessários. OBJETIVO: Avaliar a acurácia do teste semiautomatizado para determinação do genótipo RHD fetal no plasma materno. METODOLOGIA: Foram coletadas prospectivamente amostras de sangue de 220 gestantes RhD negativo, com idade gestacional entre 8-28 semanas. O plasma foi obtido em no máximo 2 horas após a coleta, e uma alíquota de 1 mL foi submetida à extração de ácidos nucléicos no equipamento automatizado MagNA Pure Compact (Roche), empregando o kit Large Volume. O DNA extraído foi submetido a PCR em tempo real (Step One Plus - Applied Biosystems), usando o protocolo do grupo SAFE, que tem como alvos os éxons 5 e 7 do gene RHD. RESULTADOS: Ocorreu exclusão de 35 amostras devido a problemas pré-analíticos, aborto ou desconhecimento do fenótipo do recém-nascido. Entre as 185 amostras analisadas, 130 (70,2%) foram genotipadas como RHD+ e 55 (29,8%) RHD-. Os resultados obtidos foram comparados com a fenotipagem do cordão umbilical, e houve concordância completa (100%). Sete amostras exibiram amplificação exclusiva para o éxon 7. Essas amostras foram submetidas aos protocolos em PCR convencional, e PCR em tempo real específico para o pseudogene RHD. Ambos os ensaios apresentaram os mesmos resultados: cinco positivos e dois negativos. Nesses mesmos 7 casos, após extração da camada de leucócitos materna, os protocolos foram repetidos, e o resultado confirmou que cinco mães eram RHD. As duas amostras com resultado negativo foram submetidas ao protocolo Multiplex, envolvendo os éxons 3-9 do gene RHD, com resultados negativos, confirmando que as mães são verdadeiramente RHD- portanto o sinal do éxon 7 é provindo dos fetos que são D variantes. CONCLUSÃO: O método para a determinação do RHD fetal no plasma materno descrito demonstrou ser rápido, de fácil execução, alta precisão e reprodutível, além de indicar possíveis variantes RHD em nossa população / BACKGROUND: Fetal RHD genotype determination in maternal plasma is a noninvasive prenatal diagnostic test performed in RhD negative pregnant women at risk of alloimmunization and/or Hemolytic Disease of Fetus and Newborn. Currently, this test is routinely performed in many countries but not in Brazil. The Department of Obstetrics at Hospital das Clínicas, São Paulo University Medical School provides tertiary antenatal care for RhD negative pregnant women including anti-D immunoglobulin administration, antibody levels monitoring and intrauterine treatment if necessary. AIMS: To validate the accuracy of a semi-automated test for fetal RHD genotype determination in maternal plasma. METHODS: Two-hundred and twenty blood samples were prospectively collected between 8 and 28 weeks of gestational age. Plasma processing was performed within 2 hours after blood collection, and nucleic acids were extracted from 1mL aliquots with an automated extraction platform (MagNA Pure Compact Roche) and the Large Volume kit. RHD gene exons 5 and 7 were amplified with real-time PCR (Step One Plus - Applied Biosystems) using the SAFE group protocol. RESULTS: Thirty-five samples were excluded due to pre-analytical problems, miscarriage and missing follow-up. In the remaining 185 samples, 130 (70.2%) were genotyped as RhD+ and 55 (29.8%) RhD-. Comparison with umbilical cord blood group phenotype showed 100% concordance. Seven samples showed amplification for exon 7 only. These were further investigated with conventional and real-time PCR with an specific protocol for RHD? pseudogene: 5 were positive and 2, negative. In these 7 cases, maternal buffy-coat DNA analysis also confirmed that 5 women were RHD?. In the remaining 2 cases, a multiplex protocol directed at RHD gene exons 3-9 confirmed that both mothers were truly RhD negative so exon 7 signal comes from the fetuses, further found to harbor D variants. CONCLUSION: The present study demonstrates that fetal RHD determination in maternal plasma is a fast, easy-to-perform and reproducible technique with high accuracy in our population. Moreover, it helps in the identification of possible RHD variants in our population

O genótipo e a carga parasitária constituem dois dos principais fatores associados à patogênese na toxoplasmose congênita. Na Europa e nos EUA, o genótipo II é o mais prevalente em infecções congênitas, enquanto que na América do Sul existem evidências apontando uma maior frequência de genótipos atípicos ou recombinantes, associados a casos mais graves. A carga parasitária também parece atuar como fator de risco independente associado ao prognóstico fetal. Os objetivos do estudo foram padronizar uma amplificação quantitativa (qPCR) com iniciadores do gene B1 para avaliar a carga parasitária; determinar o genótipo parasitário por multiplex-nested-PCR-RFLP dos marcadores 5\'-SAG2, 3\'-SAG2, SAG3 e GRA6, seguido de sequenciamento para confirmação da RFLP e análise de mutações; e verificar se existiria associação entre a carga parasitária e os genótipos parasitários nas mesmas gestações. Foram analisadas 76 amostras de líquido amniótico de gestações com toxoplasmose e 31 amostras controle. A qPCR apresentou LOD de 10 parasitos/mL, detectou as 76 amostras de estudo e nenhum controle. As cargas parasitárias variaram de 222 a 808.328 parasitos/mL. Houve duas amostras com valores acima de 104 parasitos/mL, apesar de todas as gestantes serem tratadas. Na genotipagem, SAG3 amplificou 55 amostras (54 tipo III e uma tipo II); 5\' e 3\'-SAG2 amplificaram 54 amostras (todas tipo I), e GRA6, amplificou 20 amostras (todas tipo III). A única amostra com genótipo parasitário SAG3-tipo II foi a que apresentou mais mutações (n=4), carga parasitária de 958 parasitos/mL, porém o recém-nascido foi assintomático. Houve diferença do número de amostras amplificadas por SAG3, e 5\' e 3\'-SAG2 em relação a GRA6 (McNemar, p<0,001). Os sequenciamentos confirmaram 100% dos resultados de RFLP, e foram encontradas 24 amostras com e 52 sem mutações, não existindo diferenças entre as cargas parasitárias dos dois grupos (Mann-Whitney, p= 0,085). Mais de uma mutação foi observada em cinco amostras. Foram detectadas 37 mutações no estudo: 26 heterozigotas/sinônimas e 11 homozigotas/sinônimas, não havendo regiões hot spot. Quanto à correlação clínico-laboratorial, dos 76 recém-nascidos, todos apresentaram IgM positiva ao nascimento, e 75 eram assintomáticos. O único recém-nascido sintomático apresentava tríade de Sabin e uma das duas cargas parasitárias mais elevadas do estudo (309.574 parasitos/mL), porém o genótipo não foi discriminante e não havia mutações. A outra amostra com carga parasitária acima de 104 parasitos/mL pertencia a recém-nascido assintomático, com genótipo não discriminante, e sem mutações. O estudo concluiu que a técnica de Real Time PCR (qPCR) foi padronizada com sucesso, usando os iniciadores B22 e B23 do gene B1 do parasito, podendo ser empregada na rotina diagnóstica. Além disso, foi possível realizar a genotipagem das amostras incluídas no estudo, com melhor desempenho de SAG3 e 5\' e 3\'-SAG2. O sequenciamento confirmou a confiabilidade da técnica de RFLP, e encontrou frequência elevada de mutações, todas sinônimas, sem regiões hot spot, e aparentemente sem associação com a carga parasitária. Houve elevada variabilidade das cargas parasitárias, porém grande homogeneidade dos genótipos parasitários, não tendo sido observada associação entre a carga parasitária e os genótipos de T. gondii no estudo. / The genotype and the parasite load are two of the main factors associated with pathogenesis in congenital toxoplasmosis. In Europe and the USA, genotype II is the most prevalent in congenital infections, while in South America there is evidence pointing to a higher frequency of atypical or recombinant genotypes associated with more severe cases. The parasite load also appears to act as an independent risk factor associated with fetal prognosis. The study objectives were to standardize a quantitative amplification (qPCR) with B1 gene primers to assess the parasite load; determine the genotype by multiplex-nested-PCR-RFLP of 5\' and 3\'-SAG2, SAG3 and GRA6 markers, followed by sequencing to confirm RFLP and analyze mutations, verifying whether there is association between parasite load and parasite genotypes in the same pregnancies. We analyzed 76 amniotic fluid samples from pregnancies with toxoplasmosis and 31 controls. The qPCR presented LOD of 10 parasites/mL, detected the 76 study samples and no control. Parasite loads ranged from 222 to 808,328 parasites/mL. There were two samples with values above 104 parasites/mL, despite all pregnant women be treated. In genotyping, SAG3 amplified 55 samples (54 type III and 1 type II); 5 \'and 3\'-SAG2 amplified 54 samples (all type I); and GRA6, amplified 20 samples (all type III). The only sample with genotype SAG3-type II showed the highest number of mutations (n=4), parasite load of 958 parasites/mL, but the newborn was asymptomatic. There were differences in the number of samples amplified by SAG3, and 5 \'and 3\'-SAG2 over GRA6 (McNemar test, p <0.001). Sequencing confirmed 100% of the RFLP results; and found 24 samples with and 52 without mutations, with no difference between the parasite load of these two groups (Mann-Whitney, p= 0.085). More than one mutation was observed in five samples. A total of 37 mutations were detected in this study: 26 heterozygotes/synonymous and 11 homozygous/synonyms, with no hot spot regions. Regarding the clinical-laboratory correlation, among the 76 newborns, all showed positive IgM at birth, and 75 were asymptomatic. The only symptomatic newborn presented the Sabin\'s triad and one of the two higher parasite loads in the study (309,574 parasites/mL). However, the genotype was not discriminant and no mutations were detected. The other sample with parasite load above 104 parasites/mL belonged to an asymptomatic newborn with a non-discriminating genotype, and no mutations. The study concluded that the Real Time PCR (qPCR) was successfully developed with primers B22 and B23 of the parasite B1 gene, and can be used in routine practice. Moreover, it was possible to perform the samples genotyping, with better performance of SAG3 and 5 \'and 3\'-SAG2. Sequencing results confirmed the RFLP reliability, and found a high frequency of mutations, all synonymous, with no hot spot regions, and apparently not associated with the parasite load. There was a high variability in parasite load, however great homogeneity of parasite genotypes, with no association between the parasite load and T. gondii genotypes in the study.

Neste estudo, geramos ensaios de espectrometria de massa para detecção de 111 mutações nos genes RET, BRAF, NRAS, HRAS, KRAS, PIK3CA e AKT1 e avaliamos inúmeras linhagens celulares e tumores tiroidianos. Mostramos que as mutações dos genes BRAF e RAS refletem prognósticos distintos e que as mutações BRAF são altamente prevalentes em câncer metastático. Mutações dos genes PIK3CA e AKT1, esta última sendo reportada pela primeira vez no câncer de tiróide, são relativamente frequentes neste câncer. Avaliamos ainda a função do microRNA let-7 neste câncer. Mostramos que a ativação do rearranjo RET/PTC3 em células de tiróide PCCl3 reduz a expressão de let-7. Além disso, a transfecção deste microRNA em células TPC-1, que apresentam o rearranjo RET/PTC1, inibe a fosforilação de ERK, o crescimento celular e modula a expressão de genes do ciclo celular e diferenciação. Estes dados contribuem na aplicação de terapias dirigidas a efetores das vias PI3K e MAPK no câncer de tiróide, além de salientar o envolvimento do miRNA let-7 como um gene supressor tumoral nesta doença. / In this study, we designed an assay panel for genotyping 111 mutations by mass spectrometry in RET, BRAF, NRAS, HRAS, KRAS, PIK3CA, AKT1 and other related genes in many thyroid cancer cell lines and tumors. We show that patients with BRAF and RAS mutations have distinct prognosis and that BRAF mutations are highly prevalent in metastatic thyroid cancers. Mutations of PIK3CA and AKT1, the latter not previously described in this disease, are comparatively frequent in thyroid cancers. In addition, we evaluated the role of let-7 microRNA in this cancer. We show that RET/PTC3 activation in PCCl3 thyroid cells reduces let-7 expression. Moreover, transfection of let-7 in TPC-1 cells, which harbor RET/PTC1 rearrangement, inhibits MAPK activation, reduces cell growth and modulates the expression of cell cycle and differentiation genes. These findings may contribute to the design of therapies directed at MAPK and PI3K effectors and to highlight the function of let-7 as tumor suppressor gene in thyroid cancer.

INTRODUÇÃO: A frequência de Candida parapsilosistem apresentado considerável aumento em UTIs neonatais. Embora a taxa de resistência dessa espécie aos azólicos seja baixa, recentemente têm sido relatados surtos de candidemia por isolados resistentes. A capacidade de adesão e formação de biofilme por essa espécie confere maior potencial patogênico e resistência aos antifúngicos. Portanto, a vigilância epidemiológica, tanto da resistência aos antifúngicos como da virulência dos isolados, é fundamental para o controle e prevenção das infecções e surtoshospitalares. A técnica de MALDI-TOF MS pode ser uma ferramenta útil para realizar análises proteômicas das células planctônicas e sésseis de Candida parapsilosis,e identificar possíveis alvos terapêuticos ou biomarcadores, específicos do biofilme. MÉTODOS: Isolados clínicos do complexo Candida parapsilosis de dois hospitais universitários públicos brasileiros, foram submetidos à identificação por RAPD, RFLP e MALDI-TOF MS e aos testes de suscetibilidade aos antifúngicos. Ensaios de formação de biofilme foram realizados para quantificar a biomassa, a atividade metabólica e ainda, avaliar atividade in vitrodos antifúngicos contra as células sésseis dos isolados com alta formação de biofilme. A análise proteômica por MALDI-TOF MS das células planctônicas e sésseis dos isolados com alta formação de biofilme, foi realizada nas plataformas VITEK-MS(TM) e Microflex(TM). Isolados de Candida parapsilosis (sensu stricto) foram genotipados por PFGE e análise de microssatélites. Os genótipos foram correlacionados com dadosclínicos, para investigar a ocorrência de um surto em CTI adulto, e as sequências do gene ERG11dos isolados não suscetíveis aos azólicos (NSA) foram analisadas. RESULTADOS: Foram obtidos 38 isolados do complexo Candida parapsilosis, sendo Candida parapsilosis(sensu stricto) a espécie de maior frequência, superando 80% em ambos os hospitais, seguida de C. orthopsilosis e C. metapsilosis. Embora todos os isolados tenham sido suscetíveis à anfotericina B ( < 2 mg/L) e apresentado suscetibilidade intermediária à anidulafungina, caspofungina e micafungina ( > 0,002 mg/L), elevada frequência de não suscetibilidade (resistência ou suscetibilidade intermediária) ao fluconazol e voriconazol foi observada entre isolados de um dos hospitais. Alta formação de biofilme foi observada apenas entre os isolados da espécie Candida parapsilosis(sensu stricto). Por outro lado, a maioria dos isolados NSA, apresentou baixa formação de biofilme e baixa atividade metabólica. Apenas anfotericina B apresentou atividade contra os biofilmes de Candida parapsilosis. As duas plataformas de MALDI-TOF MS conseguiram diferenciar os perfis proteômicos das células planctônicas e sésseis dos isolados. A genotipagem de Candida parapsilosis(sensu stricto) revelou a persistência de isolados clonais NSA e a mutação A395T no gene ERG11foi identificada exclusivamente entre os isolados resistentes ao azólicos. O uso de corticosteroide foi associado, estatisticamente, com a ocorrência de isolados clonais NSA. CONCLUSÕES: Candida parapsilosis (sensu stricto) se mantém como a principal espécie do complexo em infecções sanguíneas. Isolados resistentes aos azólicos, com mutações no gene ERG11, ocorreram nos dois hospitais avaliados. A correlação dos genótipos com os dados clínicos evidenciou a ocorrência de um surto envolvendo isolados clonais NSA, com associação estatisticamente significativa, ao uso prévio de corticosteroides. Candida parapsilosis (sensu stricto) foi a única espécie que apresentou alta formação de biofilme, o qual demonstrou elevada resistência às equinocandinas. As duas plataformas de MALDI-TOF MS, diferenciaram os perfis proteômicos, das células planctônicas e sésseis de Candida parapsilosis, demonstrando o potencial emprego dessa tecnologia na identificação de possíveis alvos terapêuticos ou biomarcadores, específicos de biofilmes / INTRODUCTION: The frequency of Candida parapsilosis isolates has increased considerably in neonatal ICUs. Although resistance to azoles is usually low in this species, candidemia outbreaks by resistant isolates have been recently reported. Theability of adhesion and biofilm formation by this species confers higher pathogenic potential and resistance to antifungal agents. Therefore, establishment of profiles of antifungal susceptibility and virulence, besides the epidemiological surveillance ofC. parapsilosisisolates are essential for the control and prevention of nosocomial infections and outbreaks. The MALDI-TOF MS technique can be a useful tool to perform proteomic analyzes of the planktonic and sessile cells of Candida parapsilosis, identifying possible biofilm-specific therapeutic targets or biomarkers. METHODS: Candida parapsilosisclinical isolates from two Brazilian public university hospitals were identified by RAPD, RFLP and MALDI-TOF MS and submitted to antifungal susceptibility tests. Biofilm formation assays were carried out to quantify the biomass and metabolic activity, and to evaluate the in vitroactivity of antifungal drugs against the sessile cells of the isolates with high biofilm formation. Proteomic analysis of the planktonic and sessile cells of the isolates with high biofilm formation was performed in two MALDI-TOF MS platforms, VITEK-MS(TM) and Microflex(TM). Candida parapsilosis(sensu stricto) isolates were genotyped by PFGE and microsatellite analysis. The genotypes were correlated with clinical data to investigate the occurrence of an outbreak in the adult ICU andERG11gene sequences from non-susceptible to azoles (NSA) isolates were also analyzed. RESULTS: 38 clinical isolates of the Candida parapsilosiscomplex were obtained, with Candida parapsilosis(sensu stricto) being the most frequent species (exceeding 80% in both hospitals), followed by C. orthopsilosisand C. metapsilosis. Although all isolates were susceptible to amphotericin B ( < 2 mg/L) and showed intermediate susceptibility to anidulafungin, caspofungin e micafungin ( > 0,002 mg/L), high frequency of non-susceptibility (resistance or intermediate susceptibility) to fluconazole and voriconazole was observed among isolates from one of the hospitals. High biofilm formation was only observed among isolates of the Candida parapsilosis. (sensu stricto) species. On the other hand, most of the NSA isolates presented low biofilm formation and low metabolic activity. Only amphotericin B showed activity against Candida parapsilosisbiofilms. The two MALDI-TOF MS platforms were able to differentiate the proteomic profiles of planktonic and sessile cells of isolates. Candida parapsilosis(sensu stricto) genotyping revealed the persistence of clonal NSA isolates. The A395T mutation in the ERG11gene was identified exclusively among azole resistant isolates. The use of corticosteroid was statistically associated with the occurrence of clonal NSA isolates. CONCLUSIONS: Candida parapsilosis(sensu stricto) remains the main species of the complex in bloodstream infections. Azole-resistant isolates with mutations in the ERG11gene are emerging in the two hospitals evaluated. Additionally, the correlation between the genotypes and the clinical data showed the occurrence of an outbreak involving isolates resistant to azoles, with a statistically significant association with previous use of corticosteroids. Candida parapsilosis(sensu stricto) was the only species that presented high biofilm formation and resistance against echinocandins. The two MALDI-TOF MS platforms differentiated the proteomic profiles of the planktonic and sessile cells of Candida parapsilosis, demonstrating the potential use of this technology to identify possible biofilm-specific therapeutic targets or biomarkers

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-10-18T15:08:54Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PrevalenciaVariabilidadeGenotipica.pdf: 1636799 bytes, checksum: 6bc83b2eaa373bb9dc5c14d10a80cbc0 (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-11-08T14:41:08Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PrevalenciaVariabilidadeGenotipica.pdf: 1636799 bytes, checksum: 6bc83b2eaa373bb9dc5c14d10a80cbc0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-08T14:41:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_PrevalenciaVariabilidadeGenotipica.pdf: 1636799 bytes, checksum: 6bc83b2eaa373bb9dc5c14d10a80cbc0 (MD5) Previous issue date: 2015 / A infecção por Chlamydia trachomatis é a Infecção Sexualmente Transmissível (IST) bacteriana mais prevalente no mundo, podendo ser assintomática em até 80% dos casos, e associa-se às complicações tardias. As jovens universitárias fazem parte de uma demanda diferenciada da população por apresentarem alto grau de escolaridade. Objetivo foi verificar a prevalência e a variabilidade dos genótipos de C. trachomatis em infecção cervical das estudantes de universidade pública do estado do Pará, Brasil, e avaliar a associação deste às respectivas características socio-comportamentais e de queixas ginecológicas. Foram incluídas 438 estudantes universitárias entre setembro de 2012 a outubro de 2014 e as amostras endocervicais foram obtidas durante exame ginecológico. Realizou-se a técnica de fenol-clorofórmio para a extração de DNA total da amostra de secreção cervical, e para a detecção de C. trachomatis, utilizou-se a Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) do tipo seminested-PCR para amplificação de 224pb do gene omp1. Para a identificação dos genótipos, realizou-se uma Nested-PCR, para a amplificação de 990pb do gene omp1, no qual, foi purificada e submetida ao sequenciador ABI3130, posteriormente as sequencias nucleotídicas foram comparadas com as depositadas no GenBank. A prevalência da infecção cervical por C. trachomatis foi de 12,5% (IC: 95% ±5,89) e os genótipos identificados foram o genótipo J(36,3%), seguido dos genótipos D (18,2%), E (18,2%), F (18,2%) e Ia (9,1%). Não houve associação significativa para a idade, início da vida sexual, número de parceiros, se usam preservativo camisinha, presença de queixas ginecológicas e de genótipos encontrados na população de estudo. Embora a prevalência encontrada apresentar-se alta entre as estudantes universitárias, a falta de significância estatística pode ser devido ao número amostral pequeno e/ou consequência de respostas socialmente aceitáveis. Esforços sejam feitos para que a ampliação do rastreio da infecção por C. trachomatis em populações restritas. / Infection with Chlamydia trachomatis is a Sexually Transmitted Infection (STI) more prevalent bacterial in the world and can be asymptomatic in up to 80% of cases and is associated with late complications. The university students are part of a differentiated demand of the population for their high level of education. Objective was to assess the prevalence and variability of the genotypes of C. trachomatis in cervical infection of public university students in the state of Pará, Brazil, and to evaluate the association of the respective socio-behavioral characteristics and gynecological complaints. They included 438 college students from September 2012 to October 2014 and cervical samples were obtained during gynecological examination. It was performed phenol-chloroform technique for extracting total DNA from the sample cervical secretion, and for the detection of C. trachomatis used the Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR-seminested the type for amplification 224pb gene omp1. For the identification of genotypes, we carried out a nested PCR for the amplification of the gene omp1 990pb, which was purified and subjected to ABI3130 sequencer, then the nucleotide sequences were compared with GenBank. The prevalence of cervical infection by C. trachomatis was 12.5% (CI: 95% ± 5.89) and genotypes were identified J genotype (36.3%), followed by D genotypes (18.2%) E (18.2%), F (18.2%) and la (9.1%). There was no significant association for age, first sexual intercourse, number of partners, and condoms are used, the presence of gynecological complaints and genotypes found in the study population. Although the prevalence found present itself high among university students, the lack of statistical significance may be due to small sample size and/or result in socially acceptable answers. Efforts are made to trace the expansion of C. trachomatis infection in restricted populations.

INTRODUÇÃO: A determinação do genótipo RHD fetal no plasma materno é um teste de diagnóstico pré-natal não invasivo oferecido a gestantes RhD negativo que apresentam potencial de sensibilização e/ou Doença Hemolítica Perinatal. Atualmente, este exame é realizado de rotina em diversos países, mas não no Brasil. A Clínica Obstétrica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HCFMUSP) oferece atendimento terciário a gestantes RhD negativo, com monitorização dos títulos de anticorpos irregulares, administração da imunoglobulina anti-D e/ou terapêutica fetal, quando necessários. OBJETIVO: Avaliar a acurácia do teste semiautomatizado para determinação do genótipo RHD fetal no plasma materno. METODOLOGIA: Foram coletadas prospectivamente amostras de sangue de 220 gestantes RhD negativo, com idade gestacional entre 8-28 semanas. O plasma foi obtido em no máximo 2 horas após a coleta, e uma alíquota de 1 mL foi submetida à extração de ácidos nucléicos no equipamento automatizado MagNA Pure Compact (Roche), empregando o kit Large Volume. O DNA extraído foi submetido a PCR em tempo real (Step One Plus - Applied Biosystems), usando o protocolo do grupo SAFE, que tem como alvos os éxons 5 e 7 do gene RHD. RESULTADOS: Ocorreu exclusão de 35 amostras devido a problemas pré-analíticos, aborto ou desconhecimento do fenótipo do recém-nascido. Entre as 185 amostras analisadas, 130 (70,2%) foram genotipadas como RHD+ e 55 (29,8%) RHD-. Os resultados obtidos foram comparados com a fenotipagem do cordão umbilical, e houve concordância completa (100%). Sete amostras exibiram amplificação exclusiva para o éxon 7. Essas amostras foram submetidas aos protocolos em PCR convencional, e PCR em tempo real específico para o pseudogene RHD. Ambos os ensaios apresentaram os mesmos resultados: cinco positivos e dois negativos. Nesses mesmos 7 casos, após extração da camada de leucócitos materna, os protocolos foram repetidos, e o resultado confirmou que cinco mães eram RHD. As duas amostras com resultado negativo foram submetidas ao protocolo Multiplex, envolvendo os éxons 3-9 do gene RHD, com resultados negativos, confirmando que as mães são verdadeiramente RHD- portanto o sinal do éxon 7 é provindo dos fetos que são D variantes. CONCLUSÃO: O método para a determinação do RHD fetal no plasma materno descrito demonstrou ser rápido, de fácil execução, alta precisão e reprodutível, além de indicar possíveis variantes RHD em nossa população / BACKGROUND: Fetal RHD genotype determination in maternal plasma is a noninvasive prenatal diagnostic test performed in RhD negative pregnant women at risk of alloimmunization and/or Hemolytic Disease of Fetus and Newborn. Currently, this test is routinely performed in many countries but not in Brazil. The Department of Obstetrics at Hospital das Clínicas, São Paulo University Medical School provides tertiary antenatal care for RhD negative pregnant women including anti-D immunoglobulin administration, antibody levels monitoring and intrauterine treatment if necessary. AIMS: To validate the accuracy of a semi-automated test for fetal RHD genotype determination in maternal plasma. METHODS: Two-hundred and twenty blood samples were prospectively collected between 8 and 28 weeks of gestational age. Plasma processing was performed within 2 hours after blood collection, and nucleic acids were extracted from 1mL aliquots with an automated extraction platform (MagNA Pure Compact Roche) and the Large Volume kit. RHD gene exons 5 and 7 were amplified with real-time PCR (Step One Plus - Applied Biosystems) using the SAFE group protocol. RESULTS: Thirty-five samples were excluded due to pre-analytical problems, miscarriage and missing follow-up. In the remaining 185 samples, 130 (70.2%) were genotyped as RhD+ and 55 (29.8%) RhD-. Comparison with umbilical cord blood group phenotype showed 100% concordance. Seven samples showed amplification for exon 7 only. These were further investigated with conventional and real-time PCR with an specific protocol for RHD? pseudogene: 5 were positive and 2, negative. In these 7 cases, maternal buffy-coat DNA analysis also confirmed that 5 women were RHD?. In the remaining 2 cases, a multiplex protocol directed at RHD gene exons 3-9 confirmed that both mothers were truly RhD negative so exon 7 signal comes from the fetuses, further found to harbor D variants. CONCLUSION: The present study demonstrates that fetal RHD determination in maternal plasma is a fast, easy-to-perform and reproducible technique with high accuracy in our population. Moreover, it helps in the identification of possible RHD variants in our population

O feijão comum é uma das principais culturas agrícolas produzidas e consumidas no Brasil e no mundo. Por isso, várias iniciativas de pesquisa buscam dar subsídios ao melhoramento da cultura, que visa a desenvolver cultivares mais produtivos e tolerantes a estresses biótico e ábiótico, além de agregar valor nutricional e tecnológico aos grãos. Nesse cenário, no presente estudo, buscou-se identificar, a partir da abordagem de mapeamento associativo, regiões genômicas envolvidas no controle de caracteres agronômicos e no teor de macro e micronutrientes em grãos de feijão comum. Para tanto, um painel de acessos e linhagens foi (i) genotipado por sequenciamento, cujos dados perdidos foram imputados; (ii) e fenotipados para 5 caracteres agronômicos e para o teor de 13 nutrientes, em duas condições experimentais - campo e casa de vegetação. A partir da informação genotípica, foram investigados (i) a estrutura populacional, (ii) o grau de parentesco e (iii) a extensão do desequilíbrio de ligação (DL). Para as análises fenotípicas, foi utilizada a abordagem de modelos mistos. Finalmente, o mapeamento associativo foi realizado utilizando o modelo FarmCPU. Um total de 35.527 e 9.388 SNPs, com MAF &ge; 0,05, distribuídos ao longo dos 11 cromossomos de P. vulgaris, foi obtido considerando os limites de 80 e 10% de dados perdidos, respectivamente. A análise da estrutura populacional e as estimativas de parentesco permitiram evidenciar a clara distinção entre os acessos oriundos de pools gênicos diferentes. Tais fatores influenciaram fortemente a extensão do DL; portanto, medidas que corrigem para estes vieses foram adotadas e possibilitaram a constatação de que os maiores blocos genômicos em DL estão contidos nas regiões centroméricas e pericentroméricas dos cromossomos. Igualmente, foi detectado DL entre locos de cromossomos diferentes, sugerindo que o processo de melhoramento e o sistema de cruzamento da espécie contribuem para a magnitude do DL em feijão, uma vez que os vieses decorrentes da estrutura populacional e do parentesco foram corrigidos. Considerando os fenótipos avaliados, o painel aqui utilizado apresentou maior variabilidade fenotípica para os caracteres agronômicos \'dias para o florescimento\' (DPF), \'dias para formação do legume\' (DPFL), \'número de legumes por planta\' (NLPP), \'número de sementes por legume\' (NSPL) e \'massa de 100 grãos\' (M100), e para o teor dos nutrientes cobre (Cu), ferro (Fe) e zinco (Zn) presentes nos grãos. A partir do mapeamento associativo, foram identificados 176 SNPs associados aos caracteres agronômicos e teores de macro e micronutrientes. Destes, 112 estão localizados em regiões gênicas - exons (71), introns (29), 5\'-UTR (5) e 3\'-UTR (7). Logo, tais polimorfismos, principalmente aqueles localizados em exons ou próximos a locos, como o Ppd, tradicionalmente apontado como envolvido no controle de DPF, são fortes candidatos para explicar as alterações fenotípicas observadas. Os demais 64 SNPs estão localizados em regiões inter-gênicas, em porções do cromossomo nas quais a extensão do DL pode chegar a mais de 1 Mb. Portanto, é válido recomendar a investigação da região em DL que flanqueia o SNP na busca de genes associados ao controle da variação fenotípica. / Common bean is an important crop produced and consumed in Brazil and worldwide. Several research initiatives have been set up to implement breeding programs for developing more productive cultivars tolerant to biotic and abiotic stresses, and improving nutritional and technological grain quality. Therefore, the aim of this study was to use association mapping in order to identify the genomic regions controlling agronomic traits and the content of macroand micronutrients in common bean. A panel of accessions and lines was (i) genotyped by sequencing, with imputed missing data; (ii) and phenotyped for five agronomic traits and 13 grain nutrients content under two sets of experimental conditions (field and greenhouse). The genotypic information provided a basis for investigating (i) population structure, (ii) kinship and (iii) the extent of linkage disequilibrium (LD). Mixed models were used for predicting phenotypic means. Finally, association mapping was performed using the FarmCPU model. A total of 35,527 and 9,388 SNPs (MAF &ge; 0.05) distributed over the 11 chromosomes of P. vulgaris was obtained based on two missing data thresholds (80 and 10%). Population structure and kinship analysis highlighted the distinction between accessions from different gene pools. These factors strongly influenced the extent of LD. Measures to correct these biases indicated that the major LD genomic blocks were located within centromeric and pericentomeric regions. In addition, high LD was detected between loci from different chromosomes, suggesting that the breeding process and autogamy also influence LD in common bean, given that the bias resulting from population structure and kinship were corrected. The panel used exhibited high phenotypic variability for the following agronomic traits: \'days to flowering\' (DTF), \'days to pod formation\' (DTPF), \'number of pods per plant\' (NPPP), \'number of seeds per pod\' (NSPP) and \'mass of 100 grains\' (M100); and the following grain nutrient contents: copper (Cu), iron (Fe) and zinc (Zn). A total of 176 SNPs were identified by association mapping, 112 located in gene regions - exons (71), introns (29), 5\'-UTR (5) and 3\'-UTR (7). Such polymorphisms, especially those within exons or near loci as Ppd, traditionally considered to be involved in DTF control, are strong candidates for providing an elucidation of phenotypic variability. The remaining 64 SNPs were located in intergenic regions, in which the DL decays over 1 Mb. It would therefore be worth investigating LD in the region flanking the SNPs for genes associated with phenotypic variation.

INTRODUÇÃO: Aproximadamente 170 milhões de pessoas são portadores de hepatite C crônica, sendo esta atualmente a principal causa de transplantes hepáticos no mundo. Os pacientes com hepatite crônica C são atualmente tratados com interferon e ribavirina (IFN/RBV). Estudos de associação do genoma associaram à resposta ao tratamento com IFN/RBV a um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) nas proximidades do gene da Interleucina 28B, que codifica a interferona-?. OBJETIVOS: Padronizar nova metodologia de baixo custo e menor tempo de execução para a genotipagem do polimorfismo rs12979860. Investigar a frequência do polimorfismo rs12979860, em uma coorte de pacientes com hepatite crônica C e sua associação com a resposta ao tratamento no Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo. MÉTODOS: A genotipagem foi realizada, por novo método diagnóstico, PCR multiplex CTPP (confronto de dois pares de iniciadores) e validado através de sequenciamento direto e PCR em tempo real. Um estudo retrospectivo foi realizado em 248 portadores de hepatite C crônica, tratados com interferon e ribavirina; 138 portadores de hepatite C crônica, virgens de tratamento e 240 doadores de sangue. Foi analisado o DNA, dados clínicos e demográficos, juntamente com dados sobre a resposta ao tratamento. RESULTADOS: O método de PCR CTPP foi padronizado e mostrou-se mais rápido e de menor custo comparado ao sequenciamento e PCR em tempo real. Pacientes com resposta virológica sustentada (RVS) apresentaram uma frequência de 33/61 (54,1%) para o genótipo C/C, de 21/61 (34,4%) para o genótipo C/T e 7/61 (11,5%) para o genótipo T/T. Pacientes que não tiveram RVS (Não RVS) apresentam uma frequência de 44/185 (23,8%) para o genótipo C/C, de 102/185 (55,1%) para o genótipo C/T e de 39/185 (21,1%) para o genótipo T/T. Os Não RVS estão associados ao genótipo C/T (p=0,002) e ao genótipo T/T (p=0,001) quanto comparados com o grupo de RVS. CONCLUSÕES: Esta dissertação descreve um método inovador, rápido e de baixo custo, o PCR CTPP, que detecta o polimorfismo rs12979860. O ensaio é internamente controlado e não requer a utilização de endonucleases de restrição ou equipamento especial. O polimorfismo rs12979860 é um preditor significativo da resposta ao tratamento com IFN/RBV em pacientes com infecção crônica pelo vírus da hepatite C. A genotipagem deste, em conjunto com os indicadores já existentes, pode identificar prováveis não respondedores ao tratamento / INTRODUCTION: Approximately 170 million people are chronic carriers of hepatitis C virus (HCV). Chronic HCV patients are currently treated with pegylated interferon and ribavirin (PEG- IFN/RBV). A genome-wide association with PEG-IFN/RBV treatment response and a single nucleotide polymorphism (rs12979860) has been identified near the interleukin 28B gene that encodes interferon-?-3. AIM: Describe an innovative, fast, and low-cost multiplex polymerase chain reaction with confronting two-pair primers that detects the rs12979860 polymorphism. Investigate the frequency of polymorphism rs12979860, among patients with chronic hepatitis C and association with to response treatment at the Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo. METHODS: Genotyping was performed by new diagnostic method, multiplex PCR CTPP (confronting two-pairprimers) and validated by direct sequencing and real time PCR. Retrospective study was conductedin 248 patients with hepatitis C chronic treated with interferon and ribavirin, 138 patients with chronic hepatitis C treatment-naïve and 240 blood donors. We analyzed DNA, clinical and demographic data, along with data onthe response to treatment. RESULTS AND CONCLUSIONS: The CTPP method was standardized and proved faster and lower cost compared to sequencing andreal time PCR. Patients with sustained virologic response (SVR) showed a frequency of 33/61 (54.1%) for the genotype C/C of 21/61 (34.4%) for the genotype C/T and 7/61 (11.5%) for genotype T/T. Patients with out sustained virologic response (Non SVR) have a frequency of 44/185 (23.8%) for the genotype C/C,102/185 (55.1%) for the genotype C/T and 39/185 (21.1%) for genotype T/T.The Non SVR are associated with genotype C/T (p = 0.002) and T/T genotype (p= 0.001) as compared with the group of SVR. Today, the IL28B genotyping is recomended by in the American Association for the Study of Liver Diseases and the European Association for the Study of the Liver guidelines. As a result, physicians should consider testing IL28B in patients with hepatitis C; however, the implementation of routine genotyping has been halted in tertiary care hospitals because of the need for molecular biology tools that are expensive and highly complex. The CTPP multiplex assay described here detects in a single reaction the genotypes C/C, C/T, and T/T. This method allows rapid genotyping of the polymorphism rs12979860, which is reproducible in minimally equipped laboratories; it does not require any special equipment and is a relatively low-cost procedure. The PCR-CTPP method can be used for large testing arrays and is also suitable for genotyping a small number of samples

Introdução: estudos com Enfuvirtida (ENF) mostraram que mutações na HR1 da gp41 levam à resistência primária de cepas em pacientes sem tratamento prévio com inibidores de fusão (Derdeyn et al., 2000; Rimsky et. al., 1998; Sista et. al., 2002). Outros, que o uso contínuo de HAART leva à falha virológica (Shafer et. al., 1998; Shafer & Vuitton, 1999). Para a melhor escolha terapêutica recomenda-se usar a Genotipagem do HIV1 (Ministério da Saúde, 2008b; Perez-Elias et. al., 2003; Shafer et. al., 2001). Objetivos: avaliar o perfil de resistência do HIV1 ao ENF pelo sequenciamento da HR1 da gp41 em pacientes sob HAART, sem uso de inibidor de fusão. Realizar fenotipagem virtual da pol do HIV1 em trinta e duas cepas com resistência aos NRTI, NtRTI , NNRTI e PI para verificar indicação do ENF. Métodos: investigamos 877 prontuários de pacientes do CRT-DST/AIDS entre 5/2002 a 7/2005 e verificamos que 92 que haviam realizado o Teste de Genotipagem do HIV1 em nosso laboratório, sem tratamento prévio com inibidores de entrada poderiam participar do nosso estudo. O primeiro grupo, com 60 pacientes apresentou cepas sensíveis à pelo menos um antirretroviral (ARV) e o segundo com 32 cujas cepas apresentaram resistência parcial e completa às drogas. A região HR1/HR2 da gp41 foi seqüenciada com o kit Big Dye Terminator vs. 3.1. Alinhamos as seqüências e as comparamos com HXB2 através do programa BioEdit vs.7.0.9.0. As mutações de resistência ao ENF foram determinadas pelo algoritmo Francês (ANRS) e pelo da Universidade de Stanford. Submetemos as sequências ao Virtual Phenotype Assay (Virco, Bélgica) para obtermos a Fenotipagem Virtual. Os subtipos da HR1/HR2 da gp41 e do pol foram determinados por análises filogenéticas e os recombinantes, pelo Simplot v 3.5.1. Resultados: 89(97%) amostras foram seqüenciadas, 2 (2%) não amplificaram e 1 (1%) não tinha material suficiente. Destas, 82 (92%) eram do subtipo B, 6(7%) do F1 e 1(1%), do BF na gp41. No pol, 80(87%) eram B, 4(4%) eram F e 7(8%), eram FB. Três (3%) apresentaram resistência primária ao ENF, determinada pela N42D (1%), N43H (1%) e L44M (1%). Dez amostras tinham os polimorfismos Q39R(10%), N42H(10%), N42R(10%), N42N/S(10%) e N42S(60%). Na HR2, as mutações N126N/K, N126K/Q/E, E137E/K, E137K e S138S/A estavam presentes em 26% das cepas. Apesar das cepas apresentarem resistência aos ARV pelo teste de genotipagem, a fenotipagem virtual mostrou que 10% dos ARV ainda atuavam sobre elas, enquanto que 75% delas apresentaram resistência parcial e 15%, completa às drogas. Conclusão: nosso estudo sugere a introdução do teste de genotipagem da HR1/HR2 da gp41 antes de indicar do ENF em pacientes com falha terapêutica e que a Fenotipagem Virtual pode ser usada para a escolha do melhor esquema antirretroviral que permita uma supressão viral sustentada. / Background: studies using Enfuvirtide (ENF) have showed that mutations in the HR1 (gp41) have been associated with primary resistance in strains of the patients without previous treatment with fusion inhibitors. (Rimsky et. al.,1998; Derdeyn et al.,2000, Sista et. al.,2002). The widespread use of HAART may achieve maximal suppression of the viral load, but the viral rebound may occur, leading to virologic failure (Shafer et. al.,1998; Shafer & Vuitton,1999). To optimize therapeutic choices it is recommended to use the HIV1 Genotypic Assay. Objective: to evaluate the resistance profile in the HR1 in patients submitted to HAART, but naïve entry inhibitors. To make the Virtual Phenotypic Assay in the pol of the HIV1 strains isolated of the 32 patients with resistance to the antiretroviral (ARV) and to verify the possibility of using the ENF. Methods: we investigated 877 handbook patients of the CRT-DST/AIDS from May/2002 to July/2005. We identified 92 naïve patients to entry inhibitors included in our cohort to do genotypic assay; they were included in our research. The first group was composed by 60 persons with sensible strains to only one ARV. The second, with 32 presented strains with resistance to all ARV. HR1/HR2 was sequenced (ABIPrism BigDye Terminator vs 3.1). Bioedit Software vs.7.0.9.0 was used to compare sequences with the HIVHXB2. The resistance mutations to ENF were analyzed using French ANRS and Stanford HIV Drug Resistance Algorithm. The results by Virtual Phenotype Assay of 32 patients that presented regimen failure by Genotypic Assay predicted HIV phenotypic resistance. Subtype analysis were did by Phylogeny and the recombinants strains results, confirmed by Simplot v.3.5.1. Results: 89(97%) out of 92 samples were sequenced. Two of them (2%) could not be amplified and one (1%) we did not have enough material to use. In the HR1/HR2 82(92%) of the samples were typed as B, 6(7%), as F and 1(1%) as FB. In the pol 80(87%) were classified as B, 4(4%), as F and 7(8%) as FB. According to algorithms used, 3(3%) out of 89 ENF naïve patients presented complete resistance to this drug. One virus harbored the N42D mutation (1%), another, the N43H(1%) and the other one the L44M(1%). In 10 samples we observed the polymorphisms Q39R(1%), N42H(1%), N42R(1%), N42N/S(1%) and N42S(7%). In the HR2 domain the substitutions N126N/K, N126K/Q/E, E137E/K, E137K and S138S/A were present in 26% of the samples. Although strains presented resistance to the ARV by Genotypic Assay, in the Virtual Phenotypic Assay we verified that 10% of the drugs had some effect upon them. 75% of the strains presented partial and 15% completed resistance to ARV. Conclusion: it is important to introduce the HR1/HR2 genotyping test to verify resistance mutations to ENF before indicating this drug to patients with virologic failure. The virtual phenotypic assay can be used to select the better combination therapy to obtain viral suppression sustained response.