Introduction: Colonization of the anogenital tract of pregnant women by Group B Streptococcus (GBS) is the main risk factor for early-onset neonatal sepsis. Identification of maternal colonization allows antimicrobial prophylaxis and prevention of vertical transmission. Objectives: To identify the genetic diversity and phenotypic characteristics of GBS using molecular biology techniques and culture in specific medium, and the epidemiological aspects of pregnant women colonized by this bacterium. Methods: It was performed a cross-sectional study, anogenital samples of 316 pregnant women were collected between 35 and 37 weeks and submited to culture in specific medium, antimicrobial susceptibility test, multiplex PCR, multi locus sequence typing (MLST) and multi locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA). The epidemiological aspects of colonized and non-colonized pregnant women were also investigated. Results: It was obtained a prevalence of 36.4% by culture and 38.6% by PCR. Multiplex PCR had sensitivity of 100%, specificity of 96.5%, positive predictive value of 94.3% and negative predictive value of 100%. The most common serotypes were Ia, V, II and III. Resistance genes were identified in 34 samples. Sensitivity to penicillin was universal, 24.3% presented resistance to erythromycin and 14.8% to clindamycin. Evaluating the epidemiological variables, there were no differences between the colonized and non-colonized pregnant women. Diversity index and number of genotypes found by MLST was 0.608 and 6, and by MLVA was 0.840 and 15, respectively. Conclusion: We found a high prevalence of maternal GBS colonization, with serotype distribution similar to the Americas region. Multiplex PCR was more accurate than culture, and maternal epidemiological variables showed no difference when evaluating presence or absence of bacterial colonization, its serotypes and antimicrobial resistance. MLVA showed a higher discrimination capacity among the unrelated strains than MLST. / Submitted by Otto Henrique May Feuerschuette (otto.feurschuette@unisul.br) on 2018-04-26T00:54:22Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) OTTO TESE CORRIGIDA PÓS BANCA (1).pdf FINAL.pdf: 3081595 bytes, checksum: afad5beba2687558aafe2f1705d36e01 (MD5) / Approved for entry into archive by Silvane Cauz (silvane.cauz@unisul.br) on 2018-04-26T12:14:53Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) OTTO TESE CORRIGIDA PÓS BANCA (1).pdf FINAL.pdf: 3081595 bytes, checksum: afad5beba2687558aafe2f1705d36e01 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-26T12:14:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) OTTO TESE CORRIGIDA PÓS BANCA (1).pdf FINAL.pdf: 3081595 bytes, checksum: afad5beba2687558aafe2f1705d36e01 (MD5) Previous issue date: 2018 / Introdução: A colonização do trato anogenital de gestantes pelo Estreptococo do grupo B (EGB) é o fator de risco primário para a sepse neonatal precoce. A identificação da colonização materna permite a profilaxia antimicrobiana e prevenção da transmissão vertical. Objetivos: Identificar a diversidade genética e as características fenotípicas do EGB utilizando-se técnicas de biologia molecular e cultura em meio específico, e avaliar os aspectos epidemiológicos de gestantes colonizadas por essa bactéria Métodos: Foi realizado um estudo transversal com 316 amostras anogenitais de gestantes entre 35 e 37 semanas para realização de cultura em meio específico, teste de sensibilidade aos antimicrobianos, PCR multiplex, multi locus sequence typing (MLST) e multi locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA). Pesquisou-se também os aspectos epidemiológicos dessas gestantes. Resultados: Foi encontrada prevalência de 36,4% pela cultura e 38,6% pela PCR. A PCR multiplex apresentou sensibilidade de 100%, especificidade de 96,5%, valor preditivo positivo de 94,3% e valor preditivo negativo de 100%. Os sorotipos mais encontrados foram Ia, V, II e III. Os genes de resistência foram identificados em 34 amostras. A sensibilidade à penicilina foi universal, 24,3% apresentaram resistência à eritromicina e 14,8% à clindamicina. Avaliando-se as variáveis epidemiológicas, não se identificaram diferenças entre as gestantes colonizadas e não colonizadas. O índice de diversidade e o número de genogrupos encontrados pelo MLST foi 0,608 e 6, e pela MLVA foi 0,840 e 15, respectivamente Conclusão: Constatou-se uma alta prevalência de colonização materna, com distribuição dos sorotipos semelhante à região das Américas. A PCR multiplex foi mais acurada que a cultura, e as variáveis epidemiológicas maternas não apresentaram diferença significativa ao avaliar-se a presença ou não de colonização bacteriana, seus sorotipos e a resistência aos antimicrobianos. A MLVA apresentou uma capacidade de discriminação entre as cepas não relacionadas maior do que a MLST

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O Cryptosporidium é um parasito coccídeo reconhecido por causar diarréia em humanos e animais em todo o mundo. O gênero compreende pelo menos 20 espécies confirmadas, sendo o C. hominis e C. parvum as principais espécies causadoras de criptosporidiose em humanos. Ferramentas moleculares têm sido desenvolvidas para detectar e diferenciar espécies/genótipos e subgenótipos de Cryptosporidium. O objetivo do trabalho foi avaliar a heterogeidade molecular de Cryptosporidium sp. obtidos de amostras clínicas provenientes dos municípios do Rio de Janeiro e de Salvador, através da PCR em tempo real e seqüenciamento automático. Foram analisadas 85 amostras, distribuídas em 3 grupos distintos, sendo 45 delas do município do Rio de Janeiro e 40 amostras provenientes de Salvador, Bahia. Todas as amostras foram positivas para Cryptosporidium sp. pelo método de coloração de Kinyoun a frio. O ensaio da PCR em tempo real combinou uma reação multiplex para a detecção do gênero Cryptosporidium e da espécie C. parvum e uma reação simples para a detecção de C. hominis. Na detecção do gênero Cryptosporidium foram utilizados par de primers e uma sonda TaqMan desenhados a partir do alinhamento de seqüências conservadas do gene 18S rRNA de várias espécies de Cryptosporidium disponíveis no GenBank. Para a detecção das espécies C. parvum e C. hominis foram utilizados primers e sondas específicos obtidos a partir de seqüências de cada espécie disponíveis no GenBank. A detecção do gênero Cryptosporidium através da sonda 18S rRNA, na reação duplex, foi visualizada em 63 de 85 amostras totais. Destas, a sonda TaqMan específica para C. parvum detectou 6 amostras e a sonda TaqMan específica para C. hominis detectou 42 amostras. Quinze amostras não puderam ser detectadas pelas sondas C. hominis ou C. parvum. Nos ensaios da PCR para o gene 18S, 31 amostras foram positivas e 27 delas sequenciadas. As análises filogenéticas confirmaram a presença de C. hominis, C. parvum e C. felis nas amostras estudadas. Na análise da topologia da árvore filogenética obtida por Neighbor Joining, observou-se-se que as sequências obtidas neste estudo se agruparam com espécies do gênero Cryptosporidium já descritas, com 99% ou 100% de similaridade. Conclui-se que os dois métodos utilizados são importantes ferramentas para o diagnóstico da criptosporidiose e diferenciação de C. hominis e C. parvum em investigações epidemiológicas, assim como avaliação da heterogeneidade molecular de Cryptosporidium sp / Cryptosporidium is a coccidia parasite known to cause diarrhea in humans and animals worldwide. The genus comprises at least 20 confirmed species, with C. hominis and C.parvum major species that cause cryptosporidiosis in humans. Molecular tools have been developed to detect and differentiate Cryptosporidium at the species/genotypes and subtype levels. The objective of this study was to evaluate the molecular heterogeneity of Cryptosporidium sp. clinical samples obtained from Rio de Janeiro and Salvador (Bahia), through real-time PCR and automatic sequencing. We analyzed 85 samples, distributed in three distinct groups, 45 of them in the city of Rio de Janeiro and 40 samples from Salvador. All samples were positive for Cryptosporidium sp. by modified Kinyoun acid-fast staining technique. The real-time PCR procedure combined a duplex reaction for the detection of Cryptosporidium species and C. parvum and a simple reaction for the detection of C. hominis. The detection of the genus Cryptosporidium have been used a pair of primers and TaqMan probe designed from the alignment of conserved sequences of the 18S rRNA gene of several species of Cryptosporidium available in GenBank. For the detection of species C. parvum and C. hominis were used specific primers and probes derived from sequences of each species available in the GenBank. Detection of Cryptosporidium sp. by 18S rRNA probe, in the duplex reaction, was visualized in 63 of 85 total samples. Of these, the C. parvum TaqMan probe detected 6 samples and the C. hominis TaqMan probe detected 42 samples. Fifteen samples could not be detected by C. hominis or C. parvum probes. In the 18S PCR assays, 31 samples were positive and 27 of them sequenced. Phylogenetic analysis confirmed the presence of C. hominis, C. parvum and C. felis. The analysis of the phylogenetic tree obtained by Neighbor Joining showed that the sequences obtained in this study were grouped with Cryptosporidium species described in the GenBank, with 99% or 100% similarity. Both methods are important tools for the diagnosis of cryptosporidiosis and differentiation of C. hominis and C. parvum in epidemiological investigations, as well as evaluation of Cryptosporidium sp. molecular heterogeneity

A Enfuvirtida(ENF), único inibidor de fusão disponível, representa uma opção interessante aos pacientes com infecção pelo HIV quando utilizada em combinação com outros antirretrovirais, principalmente no tratamento de multiexperimentados com falha virológica e poucas opções terapêuticas. Sua eficácia já comprovada em ensaios clínicos esbarra nas barreiras impostas por sua administração parenteral. Impulsionado por estes dados, avaliamos durante 48 semanas a resposta virológica, a evolução de células T CD4 a possível resistência primária a ENF e o impacto para a adesão do uso subcutâneo da droga em dez pacientes que fazem acompanhamento ambulatorial no Hospital Universitário Pedro Ernesto e que tinham história de mais de dez anos de infecção pelo HIV e uso de ENF no seu esquema terapêutico sugerido por teste de resistência. Todos os pacientes alcançaram ao final do seguimento sucesso terapêutico, mantendo carga viral não detectada, e um incremento médio significativo de linfócitos T CD4. Em relação a uma possível resistência primária, em nenhum dos testes, genotipagem da glicoproteína 41, foi visualizado mutações naturais que pudessem diminuir a ação da ENF. Sobre o manejo do medicamento, preparo e aplicação, observamos que é imprescindível um apoio multidisciplinar para que não haja descontinuação na sua utilização / Enfuvirtide (ENF) is the only fusion inhibitor available. It is an interesting option for patients with HIV infection when used in combination with other antiretroviral drugs, especially in the treatment of multi-experienced patients with virological failure and few therapeutic options. Its effectiveness confirmed in clinical trials finds the barriers in its parenteral administration. Using these data, we evaluated, for 48 weeks, the virological response, evolution of CD4 T cells, the possible primary resistance to ENF and the impact to the subcutaneous use of the drug in ten patients undergoing outpatient monitoring at Hospital Universitário Pedro Ernesto with a history of more than ten years of HIV infection and use of ENF in their therapy, as suggested by resistance testing. All patients have successfully completed the therapy by the end of follow-up with an undetected viral load and a significant average increase of CD4 T lymphocytes. As for a possible primary resistance, neither the genotyping nor the glycoprotein 41 revealed natural mutations that could diminish the effect of ENF. Concerning the management, preparation and application of the drug, we found that a multidisciplinary support is essential to avoid that the drug be discontinued

Estima-se que a prevalência global da população mundial com hepatite C é de 3%. Pouco se sabe sobre a resposta ao tratamento com respeito à resistência viral. Algumas mutações no fragmento de 109 aminoácidos da NS5B são associadas com resistência ao interferon (IFN) e ribavirina (RBV). Estudos moleculares e clínicos identificaram fatores associados com o hospedeiro e vírus relacionados associada com a resposta ao tratamento, tal como o gene que codifica a IL-28B. Este estudo foi dividido em duas fases, cujos objetivos foram caracterizar a frequência de mutações que conferem resistência ao HCV e avaliar a relevância das mutações em pacientes Respondedores (R) ou Não Respondedores (NR) ao tratamento e caracterizar geneticamente as populações sobre polimorfismos genéticos nos SNPs da IL-28B em relação ao prognóstico da resposta ao tratamento. As amostras dos pacientes foram submetidas a testes de genotipagem e carga viral. As sequências geradas foram comparadas no BLAST e no banco de dados Los Alamos HCV. Realizamos o alinhamento das sequências homólogas e as mutações identificadas. Com base no genótipo e carga viral determinamos a classificação dos pacientes de acordo com a resposta à terapia. O DNA genômico foi isolado a partir de sangue periférico para a realização da tipagem de SNPs de IL-28B. A metodologia utilizada foi de PCR em tempo real utilizando sondas TaqMan SNP específico. A análise dos dados foi realizada utilizando GraphPad Prism com qui-quadrado, risco relativo (RR), Odds Ratio (OR) e intervalo de confiança de 95%, com um nível de significância de P <0,05. Foi encontrado na primeira fase deste estudo uma taxa significativa mutações associadas ao tratamento nas amostras estudadas. A prevalência de mutações associadas à resistência ao IFN e RBV bem como a novos medicamentos antivirais localizados no fragmento de 109 aminoácidos da NS5B foi examinado em 69 indivíduos infectados naïve no Rio de Janeiro, Brasil. Na segunda fase, as mutações foram clinicamente relevantes. Desde então, procuramos observar as diferenças entre melhor ou pior prognóstico de acordo com a imunogenética que mostrou diferenciação entre os grupos R e NR ao tratamento em relação ao prognóstico da resposta terapêutica. Quando as diferenças entre as sequências da NS5B e a resposta ao tratamento foram consideradas verificou-se que associada a mutação R254K, estava a C316N que poderia conduzir a uma não resposta à terapia no genótipo 1b. Os nossos dados também suportaram forte associação de IL-28B rs12979860, com elevada probabilidade de resposta à terapia de IFN + RBV. Nossos dados evidenciam a presença de pacientes virgens de tratamento que abrigam mutações de resistência previamente descritas na literatura. A análise dos fatores preditores de resposta virológica mostrou que a predição de boa resposta ou não ao tratamento e ainda da progressão da doença é dependente de uma importante interação entre a genética viral e a do hospedeiro. Fato este importante para que no momento de avaliação de diagnóstico e conduta terapêutica, o médico possa tomar medidas apropriadas para o tratamento de cada paciente individualmente independentemente do genótipo do HCV em questão. / It is estimated that the overall prevalence of the average world population with hepatitis C is 3%. Little is known about the treatment response with respect to viral resistance. Some mutations in the 109-aminoacid fragment of NS5B are associated to Interferon (IFN) and Ribavirin (RBV) resistance. Molecular and clinical studies have identified factors associated with the host and related viruses associated with response to treatment, as the gene encoding IL-28B. This study was divided into two phases whose objectives were to characterize the frequency of mutations conferring resistance to HCV viral evaluating the relevance of these in Responders (R) or Non-Responders (NR) patients to treatment and to characterize genetically the populations regarding genetic polymorphisms SNPs IL-28B in relation to prognosis of response to treatment for HCV. Patient samples were subjected to tests for genotyping and viral load. The sequences generated were compared in the BLAST and the Los Alamos database HCV. We conducted the alignment of homologous sequences and mutations identified. Based on virological parameters genotype and viral load determined the classification of patients according to response to therapy. Genomic DNA was isolated from peripheral blood for carrying out the typing of SNPs of IL-28B. The methodology used was real-time PCR using TaqMan probes specific SNPs. Data analysis was performed using GraphPad Prism with chi-square, relative risk (RR), Odds Ratio (OR) and confidence interval of 95% with a significance level of P <0.05. To study these biological parameters we associated the responsive patients, non-responders, the viral load, genotype, and IL-28B polymorphism to treatment outcome. We found in the first phase of this study a significant rate of treatment-associated mutations in the samples studied. The prevalence of mutations associated to resistance to interferon and ribavirin (IFN/RBV) as well new antiviral drugs located in the 109 aminoacid fragment of NS5B was examined in 69 Hepatitis C Virus drug naïve (HCV)-infected individuals in Rio de Janeiro, Brazil. In the second phase, the mutations revealed clinically relevant from the gene in question. Since then, we seek to observe the differences between better or worse prognosis according to immunogenetic showed that differentiation between the immunogenetics of the groups R and NR to treatment in relation to prognosis of therapeutic response. When the differences between the NS5B sequences at baseline and the treatment response were considered we found that R254K associated with C316N mutations could lead to a non-response to IFN-RBV therapy in genotype 1b. Our data also strong support the association of rs12979860 IL-28B polymorphism with high probability of response to IFN + RBV therapy. Our data highlight the presence of HCV genotypes from drug naïve patients harboring resistance mutations previously described in literature. The analysis of predictors virologic response demonstrated that the prediction of better or worse therapy response and further the disease progression is dependent of a significant interaction between viral and host genetics. This fact is important for diagnosis evaluation and clinical therapeutic, the medico can take appropriate measures to treat each individual patient irrespective of the genotype of HCV in question.

Submitted by Onia Arantes Albuquerque (onia.ufg@gmail.com) on 2018-10-29T15:12:10Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Priscila Magalhães da Veiga Jardim - 2018.pdf: 5590591 bytes, checksum: 41e09cc42da35c440c865965aaafae81 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Rejected by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com), reason: Olhe as palavras-chaves, elas devem iniciar com letras maiúsculas. on 2018-10-30T11:15:40Z (GMT) / Submitted by Onia Arantes Albuquerque (onia.ufg@gmail.com) on 2018-10-30T12:28:06Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Priscila Magalhães da Veiga Jardim - 2018.pdf: 5590591 bytes, checksum: 41e09cc42da35c440c865965aaafae81 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-10-30T13:40:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Priscila Magalhães da Veiga Jardim - 2018.pdf: 5590591 bytes, checksum: 41e09cc42da35c440c865965aaafae81 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-30T13:40:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Priscila Magalhães da Veiga Jardim - 2018.pdf: 5590591 bytes, checksum: 41e09cc42da35c440c865965aaafae81 (MD5) Previous issue date: 2018-07-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Sugarcane is an important culture quite relevant to the Brazilian economy. The production is growing as well as a cultivated area is increasing every year. The genome of this culture is still deficient due to complications such as high ploidy and the big genome that presents. Among the different genetic characterization studies, the development of genetic maps is important for providing information about the genome structure of a species. In addition, it can help develop the techniques of interpretation and use of genetic information. They provide more understanding of how genetic information is organized in the genome of sugarcane supplying a lack in the basic element in this culture. The maps constructed for sugarcane, so far, not shown saturated. This work was obtained a map for sugarcane using SNP markers based on genotyping-by-sequencing technology in next-generation sequencing using the target sequencing strategy (RAPiD-Seq). For obtaining the map, 103 clones RB97327 and RB72454 were used. Probes were designed based on sequence similarity using the sorghum genome as a reference. The construction of the binding groups, considering as a binding criterion of a recombination fraction equal 0.20; allowed the identification of 249 binding groups for the biparental population with 1: 1 segregation. A total of 20555 polymorphic were scored in the analysis. The sum of the average sizes of homeologia groups identified, using the sorghum genome as a reference, was 3964.68 cM for the female parent and 3797.05 cM for the male parent. / A cana-de-açúcar é uma cultura de importância bastante relevante para a economia brasileira. A produção de cana-de-açúcar no Brasil é crescente assim como a área cultivada vem aumentando a cada ano. A compreensão do genoma da cana-de-açúcar ainda é deficiente devido a complicações como alta ploidia e o grande genoma que a cultura apresenta. Dentre os diferentes estudos de caracterização genética, o desenvolvimento de mapas genéticos é importante por fornecer informações acerca da estrutura do genoma de uma espécie. Além disso, pode auxiliar no desenvolvimento das técnicas de interpretação e uso da informação genética. Eles possibilitam a compreensão mais abrangente da organização da informação genética no genoma da cana-de-açúcar suprindo uma carência do estudo básico sobre essa cultura. Os mapas construídos para cana-de-açúcar, até agora, não se mostraram completos. Neste trabalho foi obtido um mapa de ligação para cana-de-açúcar utilizando marcadores SNPs baseados na tecnologia de genotipagem por sequenciamento de nova geração utilizando a estratégia de target sequencing (RAPiD-Seq). Para a obtenção do mapa foram utilizados 103 genótipos obtidos do cruzamento entre os clones RB97327 e RB72454. Foram desenhadas sondas baseadas em sequenciamento de semelhança utilizando o genoma de sorgo como referência. A construção dos grupos de ligação, considerando-se como critério de ligação uma fração de recombinação de 0,20; permitiu a identificação de 249 grupos de ligação para a população biparental com segregação 1:1. Foram consideradas 20555 marcas polimórficas nas análises de construção do mapa de ligação. A soma dos tamanhos médios dos grupos de homeologia identificados, utilizando-se o genoma de sorgo como referência, foi de 3964,68 cM para o genitor feminino e de 3797,05 cM para o genitor masculino.

A infecção por Toxoplasma gondii, em hospedeiros imunocompetentes, resulta no desenvolvimento de anticorpos específicos e resposta imune celular que, frequentemente, induzem imunidade protetora e duradoura, prevenindo reinfecção. Entretanto, casos de toxoplasmose congênita em mulheres imunocompetentes em fase crônica de infecção indicam a possibilidade de reinfecção em humanos. Em modelos experimentais, reinfecção por T.gondii já foi descrita em casos de infecção por cepa de genótipo distinto ao da infecção primária e por cepas recombinantes, porém os estudos envolvendo genótipos clonais, em modelo murino, restringem-se à utilização de cepas do genótipo II na infecção primária, com desafio subsequente por cepas do mesmo genótipo, ou dos genótipos I e III, com ausência de informações sobre as cepas do tipo III, que correspondem ao genótipo de maior frequência e distribuição mundial. Procuramos explorar vários modelos de infecção sequencial com cepas clonais dos tipos I, II e III, buscando dados mais consistentes para compreensão dos seguintes questionamentos: (i) A infecção primária por um genótipo de T.gondii é capaz de proteger o hospedeiro da reinfecção por genótipo distinto? (ii) A imunidade induzida pela infecção primária pode prevenir a progressão da infecção causada pela cepa secundária, impedindo doença aguda e mortalidade dos animais? (iii) A imunidade da infecção primária previne a colonização do cérebro por cistos teciduais da cepa secundária? Nossos dados mostram que a imunidade induzida pela infecção primária por cepas clonais de T.gondii não protege o hospedeiro da reinfecção por cepa de genótipo distinto, já que foram detectados anticorpos contra as cepas das infecções primária e secundária em todos os modelos propostos. Somente a imunidade induzida pela infecção primária por cepa do tipo III foi capaz de prevenir a progressão da infecção secundária causada pelas cepas do tipo I e do tipo II, impedindo a mortalidade e colonização do cérebro dos animais por cistos teciduais da cepa secundária. Esses achados são extremamente importantes para auxiliar estudos vacinais e terapêuticos da toxoplasmose. / Toxoplasma gondii infection in immunocompetent hosts results in the development of specific antibodies and cellular immune responses that often induce protective and lifelong immunity, preventing reinfection. However, cases of congenital toxoplasmosis in immunocompetent women at a chronic phase of infection indicate the possibility of reinfection in humans. In experimental models, reinfection by T.gondii has been described in cases of infection by genotype distinct from that of primary infection and by recombinant strains, but studies involving clonal genotypes in the murine model are restricted to the use of type II genotype in primary infection, with subsequent challenge by strains of the same genotype, or genotypes I and III, without information about type III strains, which correspond to the genotype with the highest frequency and worldwide distribution. We explore several models of sequential infection with clonal strains of types I, II and III, looking for more consistent data to understand the following questions: (i) Primary infection by a T.gondii genotype is able to protect the host from reinfection by different genotype? (ii) Does the immunity induced by the primary infection prevent the progression of infection caused by the secondary strain, preventing acute disease and animal mortality? (iii) Does the immunity of primary infection prevent colonization of the brain by tissue cysts of the secondary strain? Our data show that the immunity induced by primary infection by T.gondii clonal strains does not protect the host from reinfection by a distinct genotype strain, since antibodies against the strains of primary and secondary infections were detected in all proposed models. Only the immunity induced by the primary infection by type III strain was able to prevent the progression of the secondary infection caused by type I and type II strains, preventing the mortality and colonization of the brains of the animals by tissue cysts of the secondary strain. These findings are extremely important to support vaccine and therapeutic studies of toxoplasmosis.

A doença de Chagas é caracterizada por um amplo espectro de manifestações clínicas, que vão desde a ausência de sintomas à doença grave com comprometimento cardíaco e/ou digestivo. A influência do parasito, Trypanosoma cruzi (T. cruzi), agente etiológico da doença, nessas apresentações clínicas têm sido largamente estudada, não se tendo demonstrado o papel da diversidade genética de populações de T. cruzi na determinação das diferentes formas clínicas em humanos. Este trabalho teve como objetivos: a) geral: analisar as características moleculares de T. cruzi em pacientes com doença de Chagas com e sem imunodepressão (infecção por HIV e transplante de órgãos com e sem reativação); b) específicos: 1. Analisar comparativamente isolados do parasito quanto à distribuição em DTU; 2. Relacionar os resultados obtidos pela análise molecular do gene ND7 com a forma clínica e origem; 3. Avaliar por LSSP-PCR a variabilidade da sequência do kDNA de T. cruzi diretamente de amostras biológicas assim como em isolados de T. cruzi obtidos pelos exames de hemocultura/xenodiagnóstico; 4. Comparar os padrões polimórficos obtidos por LSSP-PCR em amostras repetidas de um mesmo paciente no mesmo sítio ou distintos sítios biológicos. Foram incluídos, após aprovação do protocolo na CAPPesq e mediante assinatura de TCLE, 106 pacientes com doença de Chagas crônica ou com imunossupressão, provenientes dos ambulatórios e enfermarias do HCFMUSP, além de 75 indivíduos controle, com provas sorológicas e moleculares negativas. Foram analisadas 187 amostras isoladas de hemocultura/xenodiagnóstico e 236 diretamente de amostras sanguíneas de pacientes. Os seguintes grupos foram constituídos: Agudo-AG, Crônico-CR, Crônico Imunodeprimido-CRI (doenças autoimunes/neoplasias), Coinfecção-CO (infecção por HIV/T.cruzi), Coinfecção-CO/RE (infecção por HIV/T.cruzi e reativação da doença de Chagas), Transplantado-TX, Transplantado-TX/RE (Transplantado com reativação da doença de Chagas). Foram identificados DTU TcI, TcV, TcVI e em maior número TcII, por ensaios de tipagem molecular do parasito, com distribuição estatisticamente significantemente de acordo com a naturalidade dos pacientes (P=0,013). Quanto ao gene ND7, observou-se que a banda de ~900 bp ocorreu em 83,0% das amostras das regiões norte, nordeste, centro-oeste e Bolívia e a de ~400pb em 54% das amostras nas regiões sul e sudeste brasileiras sendo esta diferença estatisticamente significante (P < 0,001). A comparação dos perfis observados por LSSP-PCR a partir de amostras extraídas diretamente do sangue e de isolados obtidos de hemocultura/xenodiagnóstico mostrou maior variabilidade em amostras sanguíneas, confirmada pelo dendrograma. Adicionalmente, o estudo de amostras repetidas do mesmo paciente permitiu confirmar a maior variabilidade nas amostras diretamente extraídas do sangue, com mudança dos padrões durante e após o tratamento com reaparecimento de perfis antigos não presentes no período prétratamento imediato, além de presença de perfis diferentes em distintos sítios biológicos do mesmo paciente. O encontro de DTU diferentes de TcII nos grupos CR/CRI e AG enfatiza a necessidade de atentar para a diferença em limiares de reatividade segundo DTU na análise da parasitemia por PCRq (quantitativa), conforme registrado na literatura. Os dados observados por LSSP-PCR acrescentam informações adicionais não revelados por tipagem molecular, representando novos desafios para o entendimento da relação hospedeiro-parasito em pacientes com doença de Chagas sem e com imunossupressão, ao lado de fatores como nível de parasitemia e pressão seletiva de medicamentos antiparasitários e imunossupressores / Chagas\' disease is characterized by a broad spectrum of clinical manifestations, ranging from asymptomatic cases to severe cardiovascular and/or gastrointestinal involvement. The clinical presentations are thought to be determined primarily by genetic diversity of populations of Trypanosoma cruzi (T. cruzi), but no correlation was clearly demonstrated yet. This study aimed to: a) general: to analyze the molecular characteristics of T. cruzi in patients with Chagas\' disease with and without immunosuppression (HIV infection and organ transplantation with or without reactivation); b) specifics: 1.To analyze comparatively isolates from the parasite as for the distribution in DTU; 2. To describe the results obtained by molecular analysis of gene ND7 in relationship with the clinical form and origin; 3. To assess by LSSP-PCR the variability of the sequence of the T. cruzi kDNA directly from biological samples, as well as in T. cruzi isolates obtained by examination of blood culture/xenodiagnosis; 4. To compare the polymorphic patterns obtained by LSSP-PCR in repeated samples of the same patient on the same site or different biological sites. After approval of the protocol in CAPPesq and by signing an informed consent, 106 patients with chronic Chagas disease or immunosuppression, from the HCFMUSP\'s clinics and wards, and 75 control subjects with negative serological and molecular tests were included. They were analyzed 187 isolated samples from blood culture/xenodiagnosis and 236 directly from blood samples of patients. The following groups were formed: Acute-AC, Chronic-CR, Chronic immunocompromised-CRI (autoimmune diseases/ neoplasms), Coinfection-CO (HIV/T. cruzi infection), Coinfection-CO/RE (HIV/T. cruzi and reactivation of Chagas disease), Transplantation-TX, Transplantation-TX/RE (Transplantation/ with reactivation of Chagas\' disease). DTU TcI, TcV, TcVI and higher TcII number were identified for molecular typing assays of the parasite and the distribution of DTU was statistically significant according to patient´s naturality (P=0.013). As for ND7 gene, was observed that the band of ~ 900 bp was prevalent in 83% of the samples in the North, Northeast, Midwest regions and Bolivia and the band of ~400bp occurred in 54% of the samples of Brazilian\' South and Southeast regions, this distribution was statistically significant (P < 0.001). The comparison between the profiles observed by LSSP-PCR from samples taken directly from blood and isolates obtained from blood culture/xenodiagnosis showed greater variability in blood samples, confirmed by dendrogram. Additionally, the study of repeated samples from the same patient allowed to confirm the greater variability in blood samples taken directly, with changing patterns during and after the treatment with reappearance of old profiles not present in the immediate pre-treatment period, and the presence of different profiles at different biological sites in the same patient. The presence of other DTUs than TcII in chronic and chronic immunosuppressed patients and AC groups emphasizes the need to pay attention to the different reactivity thresholds for the various DTU in the analysis of parasitaemia by PCRq (quantitative), according to the data registered in the literature. The results observed by LSSP-PCR add further information not revealed by molecular typing, representing new challenges for the understanding of the host-parasite relationship in patients with Chagas\' disease with and without immunosuppression, alongside factors such as level of parasitaemia and selective pressure of antiparasitic drugs and immunosuppressive

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Among methodologies for marker discovery and high-throughput genotyping, GBS (Genotyping by Sequencing) points out by its low cost and speed at which samples can be analyzed. The aim of this work was to identify, by GBS, the polymorphism from SNP markers within 283 upland accessions from Embrapa Rice Core Collection (ERiCC) and associate them to yield under drought stress. After filtering the raw data of predetermined stringent parameters, 285.379 SNP were identified in the 12 rice chromosomes. For the association mapping, molecular and phenotypic data were combined for the identification of SNP associated to drought, aiming the subsequent development of a marker set for MAS besides the identification of genes for genetic engineering. The analysis identified 48 SNP associated with the evaluated traits, 13 associated to drought susceptibility index (DSI) and 35 to yield under drought stress. Among the 48 SNP, 35 was anchored in 31 rice genes. Seven genes, out of the 31, possessed SNP associated to DSI, and the other 24 genes to yield under drought stress. These genes may be evaluated to be effectively employed for MAS. If the overexpression of such genes provides an enhanced drought tolerance, they may be used in the development of tolerant rice cultivars. / A seca é um fator ambiental que limita a produção das culturas, como a do arroz de terras altas (Oryza sativa L.). O conhecimento de fatores envolvidos na tolerância à deficiência hídrica e das respostas das plantas a esse estresse podem fornecer subsídios aos programas de melhoramento para o desenvolvimento de cultivares tolerantes, e, consequentemente, com uma maior produtividade sob essas condições. O mapeamento associativo, ou análise de associação, tem sido aplicado com sucesso em plantas, sendo utilizado primeiramente na identificação de genes associados a caracteres de importância econômica, e posteriormente, na implementação de seleção assistida por marcadores (SAM). Tecnologias de sequenciamento de nova geração (NGS) têm sido recentemente utilizadas em projetos de sequenciamento e resequenciamento para identificar, validar e avaliar um grande número de SNPs, os quais podem ser utilizados em estudos de mapeamento associativo. Dentre os métodos desenvolvidos para a descoberta de marcadores moleculares e genotipagem de alto desempenho, destaca-se pela rapidez e baixo custo a genotipagem por sequenciamento (GBS). Esse trabalho objetivou detectar, via GBS, o polimorfismo de marcadores SNPs em 283 acessos de arroz de terras altas componentes da CNAE (Coleção Nuclear de Arroz da Embrapa) e associá-los à produtividade sob déficit hídrico. Após a filtragem dos dados brutos de acordo com parâmetros de estringência pré-definidos, foram contabilizados 285.379 SNPs distribuídos ao longo dos 12 cromossomos do arroz. As informações moleculares foram integradas aos dados fenotípicos derivados do experimento de avaliação de produtividade e Índice de Suscetibilidade à Seca (ISS), conduzido no ano de 2010 em Porangatu (GO) em ambiente com e sem deficiência hídrica, para possibilitar a análise de mapeamento associativo, e com isso, detectar marcadores SNPs relacionados à tolerância à seca e oportunizar o desenvolvimento de um conjunto de marcadores úteis para a seleção assistida para esse caráter, assim como genes para estudos de engenharia genética do arroz. Através da análise de associação, foram detectados 48 SNPs relacionados com os caracteres avaliados, dentre os quais 13 foram relacionados ao ISS e 35 à produtividade em condição de déficit hídrico. Dentre os 48 SNPs, foram identificados 35 SNPs ancorados em 31 genes de arroz. Dentre os genes identificados, sete deles continham SNPs associados ao ISS, enquanto que os restantes 24 genes continham SNPs associados à produtividade dos acessos em ambiente com deficiência hídrica. Esses genes podem ser avaliados para serem efetivamente utilizados na seleção assistida por marcadores. Adicionalmente, esses genes podem ser superexpressos para avaliar sua capacidade de aumentar a tolerância à seca, e em caso positivo, gerar cultivares comerciais de arroz geneticamente modificadas mais tolerantes a esse estresse.

O gênero Yersinia pertence à família Enterobacteriaceae e compreende 17 espécies. Y. pestis, Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica são reconhecidamente patógenos de humanos e animais. Y. pestis cause a peste. Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica são agentes causadores, sobretudo, de gastroenterites transmitidas por água e alimentos. As demais 14 espécies são, usualmente, consideradas não-patogênicas, com exceção de Y. ruckeri sorogrupo O:1 que causa infecções em peixes. Nas últimas décadas, a tipagem molecular tornou-se uma importante ferramenta nos estudos filogenéticos de numerosos micro-organismos e o desenvolvimento de sistemas de tipagem rápidos e baratos pode facilitar os estudos epidemiológicos de infecções bacterianas. No presente estudo objetivou-se desenvolver um método de genotipagem de Yersinia spp. baseado em high-resolution melting analysis (HRMA) para diferenciar os single-nucleotide polymorphisms (SNPs) presentes nas sequências dos genes 16S rRNA, glnA, gyrB, hsp60 e recA e aplicá-lo na tipagem de 40 linhagens de Y. pseudotuberculosis e 50 linhagens de Y. enterocolitica, bem como separar por HRMA as espécies Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica. Os SNPs foram determinados nas sequências dos loci acima citados a partir de um conjunto de 119 linhagens de Yersinia spp. depositadas no GenBank/EMBL/DDBJ. Foram encontrados nas sequências dos genes analisados de Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. bercovieri, Y. rohdei, Y. intermedia, Y. mollaretii e Y. ruckeri 10, 10, 9, 6, 4, 1 e 1 SNPs, respectivamente. Nenhum SNP foi encontrado nas sequências analisadas de Y. pestis e um grande número de SNPs foi encontrado nas sequências analisadas de Y. frederiksenii, Y. kristensenii e Y. massiliensis, o que impossibilitou a genotipagem dessas espécies por HRMA. As demais espécies não foram analisadas. Foram desenhados pares de primers para flanquear os SNPs encontrados em cada espécie de Yersinia testada. Usando um conjunto de primers espécie-específicos, a diversidade genética de cada espécie de Yersinia foi determinada por HRMA e a análise filogenética foi baseada na sequência concatenada composta pelos nucleotídeos identificados em cada fragmento analisado. O agrupamento foi realizado com o software BioNumerics usando o método UPGMA com 1.000 replicatas de bootstrap. A árvore filogenética ii construída para Y. pseudotuberculosis agrupou as linhagens em clusters bio-sorogrupo específicos. As linhagens do bio-sorogrupo 1/O:1 foram agrupadas em um cluster e as linhagens do bio-sorogrupo 2/O:3 em outro. A árvore filogenética construída para Y. enterocolitica agrupou as linhagens em três grupos. As linhagens altamente patogênicas, do biotipo 1B, foram agrupadas em um cluster, as linhagens de média patogenicidade, dos biotipos 2, 3, 4 e 5, foram agrupadas em um segundo cluster e as linhagens consideradas nãopatogênicas, do biotipo 1A, foram agrupadas em um terceiro cluster. O agrupamento encontrado em Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica foi consistente com o perfil patogênico característico dessas duas espécies. Nenhuma correlação epidemiológica significativa foi encontrada no agrupamento de Y. bercovieri, Y. rohdei, Y. intermedia, Y. mollaretii e Y. ruckeri de acordo com os resultados de HRMA. Ademais, o método de HRMA aqui desenvolvido foi capaz de separar as espécies Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica. O método de HRMA desenvolvido nesse estudo pode ser usado como uma alternativa para a genotipagem e para a diferenciação de Y. pseudotuberculosis de Y. enterocolitica. Esse método também pode complementar os métodos baseados em sequências e facilitar os estudos epidemiológicos dessas duas espécies de Yersinia. / The genus Yersinia belongs to the family Enterobacteriaceae and comprises 17 species. Y. pestis, Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica are well recognized human and animal pathogens. Y. pestis causes plague. Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica are, usually, causative agents of food-waterborne gastroenteritis. The other 14 Yersinia species are considered to be non-pathogenic, with the exception of Y. ruckeri serogroup O:1 which causes infections in fishes. In the last few decades, molecular typing has become an important tool in phylogenetic studies of several microorganisms and the development of fast and inexpensive typing systems can facilitate epidemiological studies of bacterial infections. The present study aimed to develop a method of Yersinia spp. genotyping based on high-resolution melting analysis (HRMA) in order to differentiate the single-nucleotide polymorphisms (SNPs) present in the 16S rRNA, glnA, gyrB, hsp60 and recA sequences and apply it in the typing of 40 Y. pseudotuberculosis strains and 50 Y. enterocolitica strains, as well as, to separate by HRMA the Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica species. The SNPs were determined in the sequences of the aforementioned loci using a set of 119 Yersinia strains deposited in the GenBank/EMBL/DDBJ database. It were found in the gene sequences analyzed of Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. bercovieri, Y. rohdei, Y. intermedia, Y. mollaretii and Y. ruckeri 10, 10, 9, 6, 4, 1 and 1 SNPs, respectively. No SNPs was found in the analyzed sequences of Y. pestis and a large number of SNPs were found in the analyzed sequences of Y. frederiksenii, Y. kristensenii and Y. massiliensis what prevented their genotyping by HRMA. The remaining Yersinia species were not analyzed. It was designed primer pairs to flank the SNPs found in each Yersinia species tested. Using a specie-specific set of primers, the genetic diversity of each Yersinia species used was determined by HRMA and the phylogenetic analysis was based on the concatenated sequence composed by the nucleotides identified in each fragment analyzed. Clustering was performed with the software package BioNumerics using UPGMA method and 1,000 bootstrap replicates. The phylogenetic tree constructed for Y. pseudotuberculosis grouped the strains into bio-serogroups specific clusters. The strains of 1/O:1 bio-serogroup were grouped into one cluster and the strains of 2/O:3 bio-serogroup into iv other cluster. The phylogenetic tree constructed for Y. enterocolitica grouped the strains in three clusters. The highly pathogenic strains, of biotype 1B, were grouped into one cluster, the moderate pathogenic strains, of biotypes 2, 3, 4 and 5, were grouped into a second cluster and, the non-pathogenic strains, of biotype 1A, were grouped into a third cluster. The clusterization of Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica were consistent with the pathogenic profile characteristic of these two Yersinia species. No significant epidemiological correlation was found in the grouping of Y. bercovieri, Y. rohdei, Y. intermedia Y. mollaretii and Y. ruckeri according to HRMA results. Moreover, the HRMA-based method develop here was able to separate the Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica species. The HRMA assay developed in this study can be used as an alternative for the genotyping and the differentiation of Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica. This method can also complement sequence-based methods and facilitate epidemiological studies of these two Yersinia species.

O conhecimento da diversidade genética e da estrutura populacional das variedades mantidas em bancos de germoplasma é de fundamental importância para sua efetiva utilização em programas de melhoramento. O mapeamento por associação, também conhecido como mapeamento por desequilíbrio de ligação, é um dos principais métodos para relacionar genes e alelos às características de interesse, através da co-segregação de marcadores genéticos polimórficos com os genes envolvidos na variação das características em estudo. O Banco de Germoplasma de Arroz do Departamento de Genética da ESALQ contém 192 acessos japoneses que foram estudados com o objetivo de entender sua diversidade, estruturação genética e determinar a associação genômica de caracteres agronômicos relacionados a produção de grãos. A caracterização molecular foi conduzida através da tecnologia DArT-seq, que gerou dados de marcadores SNPs (single-nucleotide polymorphism) e silico DArTs. Em seguida, após a filtragem, 5.578 SNPs de alta qualidade foram utilizados para calcular as estimativas de diversidade no pacote hierfstat e a estrutura do painel de acessos através da análise discriminante de componentes principais (DAPC), que consiste em determinar existência de cluster em um grupo de genótipos em que não há informação a priori sobre existência de grupos. A diversidade genética nos acessos foi evidenciada pelo valor de heterozigosidade esperada (HS) (0,0279) e a estruturação foi evidenciada pela formação de três subgrupos. O mapeamento associativo foi realizado com o uso do pacote GAPIT, sendo considerados seis caracteres: número de dias para florescimento (NDF), estatura de planta (EP), comprimento da panícula (CP), peso de parcela (PP), massa de mil grãos (MMG) e CICLO, bem como 24.266 marcadores silico DArTs e 1.965 marcadores SNPs. Foram detectadas um total de 113 associações significativas genótipo-fenótipo (P<0,001) quando utilizado marcadores silico DArTs em todas as seis características analisadas e, um total de 21 associações significativas genótipo-fenótipo (P<0,001) quando utilizado marcadores SNPs para apenas quatro das seis características analisadas: EP, CICLO, MMG e PP. Considerando-se os 113 silico DArTs associados significativamente na análise, 90 foram localizados em regiões intergênicas e 23 foram localizados dentro de genes. Enquanto que, dos 21 SNPs significativos, 11 foram localizados em regiões intergênicas e 10 foram localizados dentro de genes. A informação gerada neste estudo foi útil para testar associações ao longo do genoma do arroz. O modelo linear misto (MLM) empregado no mapeamento associativo acredita-se ter conseguido controlar eficientemente os falsos positivos no mapeamento utilizando os marcadores SNPs. As informações geradas neste estudo servem de base para avaliações mais aprofundadas, utilizando o conjunto de marcadores significativos como ponto de partida para determinação dos genes mais importantes para a produtividade em arroz. / The knowledge of the genetic diversity and population structure of varieties maintained in germplasm banks is crucial for their effective use in breeding programs. Association mapping, also known as linkage disequilibrium mapping, is one of the main methods for relating genes and alleles to the characteristics of interest, through the co-segregation of polymorphic genetic markers with the genes involved in the variation of the characteristics under study. The Rice Germplasm Bank of the Department of Genetics of ESALQ contains 192 Japanese accessions that were studied with the purpose of understanding its diversity, genetic structuring and determining the genomic association of agronomic traits related to grain production. The molecular characterization was conducted by DArTseq technology, which generated data of SNPs (single-nucleotide polymorphism) markers and silico DArTs. Then, after filtering, 5,578 high-quality SNPs were used to calculate the diversity estimates in hierfstat package and the accession panel structure through discriminant analysis of principal components (DAPC), which consists of determining the cluster existence in a group of genotypes where there is no a priori information about the existence of groups. The genetic diversity in the accessions was evidenced by the expected heterozygosity value (HS) (0.0279) and the population structure was evidenced by the formation of three clusters. The association mapping was performed using the GAPIT package, considering six characters: number of days for flowering (NDF), plant height (EP), panicle length (CP), plot weight (PP), mass of thousand grains (MMG) and CYCLE, as well as 24.266 silico DArTs markers and 1.965 SNPs markers. We detected a total of 113 significant associations genotype-phenotype (P <0.001) when used silico DArTs markers in all six analyzed characteristics and a total of 21 significant associations genotype-phenotype (P<0.001) when used SNPs markers for only four of the six analyzed characteristics: EP, CYCLE, MMG and PP. Considering the 113 silico DArTs significantly associated in the analysis, 90 were located in intergenic regions and 23 were localized within genes. While of the 21 significant SNPs, 11 were located in intergenic regions and 10 were located within genes. The information generated in this study was useful for testing associations throughout the rice genome. The mixed linear model (MLM) used in association mapping is believed to have been able to efficiently control false positives in the mapping using the SNPs markers. The information generated in this study serves as a basis for further evaluation using the set of significant markers as a starting point for determining the most important genes for rice yield.