As lesões periapicais são induzidas por uma infecção crônica da polpa dental. Antígenos microbianos estimulam a resposta imune específica e inespecífica nos tecidos apicais. Como consequência desse processo, diante da incapacidade das defesas do hospedeiro para erradicar a infecção, uma lesão periapical é formada, com o objetivo de restringir a invasão microbiana. O desenvolvimento da periodontite apical crônica depende de uma fina regulação da ativação dos linfócitos. A ativação das células T requer dois sinais, um mediado pelo complexo TCR, após o reconhecimento do antígeno, e o outro mediado pela interação dos receptores coestimulatórios. CD28 é um receptor coestimulatório, enquanto CTLA-4 e PD-1 induzem um sinal inibitório para a ativação de células T. Para compreender o envolvimento de células T na periodontite apical crônica, avaliamos a presença destas células na lesão periapical e os fatores coestimulatórios, citocinas e espécies reativas do oxigênio que estas células estariam produzindo. As amostras analisadas foram de tecido gengival para o grupo controle (n = 20) e lesões periapicais para o grupo com periodontite apical crônica (n = 20). Quanto ao perfil celular das lesões periapicais, os resultados mostraram que linfócitos T (59,3 ± 3,7%) foram as células predominantes, sendo a subpopulação CD4+ (72,7 ± 3,4%) a mais encontrada. A seguir, verificou-se a expressão de moléculas de superfície em células T. Observou-se que a expressão de CD28 (0,5 ± 0,5%) foi significativamente mais baixa em amostras de lesões periapicais que no grupo controle principalmente para linfócito T CD8+. Já CTLA-4 foi identificado em altos níveis para pacientes com periodontite apical tanto para CD3+CD4+ (86,1 ± 2,6%) quanto para CD3+CD8+ (59,8 ± 8,6%). PD-1 (73,5 ± 5,6%) e PD-L1 (59,8 ± 8,6%) apresentaram alta positividade para CD3+CD4+. Esses resultados indicaram um possível envolvimento da via de sinalização de PD-1 e PD-L1 na modulação da resposta de células T de pacientes com periodontite apical crônica. A dosagem de citocinas revelou alta positividade para todas as citocinas investigadas (TGF-; TNF-; IFN- e IL-10). Óxido Nítrico e mieloperoxidase produzidas por neutrófilos e responsáveis pela degradação tecidual também foram detectadas em altas doses nas amostras de pacientes com periodontite apical. O conhecimento sobre o papel das moléculas coestimulatórias na imunopatogênese da periodontite apical crônica servirá de base para o direcionamento de novas estratégias de prevenção, assim como o desenvolvimento de novos procedimentos terapêuticos. / Periapical lesions are induced by the chronic infection of dental pulp. Microbial antigens stimulate both non-specific and specific immune response in periapical tissue. As a consequence of these processes and the inability of host defense mechanisms to eradicate infection, chronic periapical lesion are formed, with the aim of restricting microbial invasion. Negative co-stimulatory signals mediated via cell surface molecules such as cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4 (CTLA-4) and programmed death-1 (PD-1) play a critical role in down- modulation immune responses and maintaining peripheral tolerance. Both CTLA-4 and PD-1 are induced on actived T cell, and these are involved in the immunophatogenesis of periapical lesions. Inhibitory signals mediated via molecules such as programmed-death-1 (PD-1) play a critical role in down-modulating immune responses and maintaining peripheral tolerance. We investigated the involvement of cytokines and PD-1 engagement in mediating the T cell activation in chronic periapical diseases. Gingival samples from healthy individuals (n= 20) and patients with chronic periapical periodontitis (n= 20) were collected and used for the subsequent assays. The leukocytes in the lesion site were evaluated using flow cytometry. The production of cytokines interferon-gamma (IFN-), interleukin (IL)-10, tumor necrosis factor-alpha (TNF-) and transforming growth factor-beta (TGF-) was evaluated by ELISA. We observed a significant increase in the total number of leukocytes from periapical lesions as compared with healthy group. Our results for the composition of infiltrating cell in periapical lesion showed that the predominant cells were lymphocytes T (59,3 ± 3,7%) and contained a higher proportion of CD4+ cells (72,7 ± 3,4%). T cells from patients with periapical lesions expressed significantly higher levels of PD-1 (73,5 ± 5,6%) and PD-L1 (59,8 ± 8,6%). The levels of CTLA-4 were higher in CD3+CD4+ (86,1± 2,6%) and CD3+ CD8+ (59,8 ± 8,6%) cells, but in contrast the expression of CD28 was lower than control group. In addition, CD4+ and CD8+ T cells expressing PD-1 accumulate in lesions with chronic periapical periodontitis. Moreover, PD-L1 expression was intense in macrophage from patients. Our data clearly showed that lesions samples contained elevated amounts of TGF-, IL-10, TNF- and IFN- when compared with healthy gingival tissue from control individuals. These data show that PD-1 and CTLA-4 engagement could be involved in the modulation of T cells activation in patients with chronic periapical periodontitis.

A Paracoccidioidomicose é micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis, endêmico na América Latina, especialmente Brasil. Para melhor avaliarmos a resposta imune celular frente a diferentes componentes do fungo, como gp43, considerada o antígeno imunodominante de P. brasiliensis, filtrado de cultura livre de gp43 (Filtrado), e gp43 tratada com metaperiodato (meta), utilizamos os ensaios de linfoproliferação e ELISA para detecção das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e IFN-. Os resultados com relação à gp43 corroboram dados da literatura e de nosso laboratório demonstrando que gp43 é o antígeno imunodominante do fungo e pode estar envolvido no mecanismo de anergia dos linfócitos T de pacientes com a micose ativa. Com o Filtrado observamos respostas linfoproliferativas positivas, porém menores que com gp43, também evidenciando a anergia de linfócitos T de pacientes, e a indução de IL-10 em células de controles curados, podendo representar assim um mecanismo de imunossupressão. Com relação à meta, esta não induziu resposta linfoproliferativa nem a síntese de citocinas, sugerindo não ser um antígeno apropriado para esse tipo de avaliação. / Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis, endemic in latin América, specially Brazil. To better understand the cellular immune responses to different components of the yeast, such as gp43, considered the immunodominant antigen, a culture filtrate free of gp43 (CF), and gp43 treated with metaperiodate, we used lymphoproliferative assays and ELISA to detect the cytokines IL-4, IL-10, IL-12 e IFN-. The results with gp43 were consistent with the literature and previous with data from our Laboratory showing that gp43 is the immunodominant antigen of P. brasiliensis and is likely involved with the anergy of T-cells from patients. With CF we observed positive, but weaker, proliferative responses. It also evidenced the T-cell anergy of patients and the preferential induction of IL-10 in cells from cured controls. The latter can represent a mechanism of anergy induction. With meta, we observed that neither induce proliferative responses nor cytokine secretion, being apparently an inappropriate antigen for use in cellular immunoassays.

INTRODUÇÃO: A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é uma doença sistêmica granulomatosa, endêmica em toda América Latina. Estudos anteriores no modelo experimental e em humanos relacionaram a resposta imune tipo Th1 à proteção, com imunodepressão antígenoespecífica transitória nas formas aguda e crônica, e recuperação após cura clínica. As células dendríticas de origem mielóide (DCs) são as mais potentes apresentadoras de antigeno, sendo capazes de induzir resposta Th1 em linfócitos T, porém seu papel na PCM humana ainda não foi descrito. OBJETIVO: Investigar as características in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM. MÉTODOS: DCs de pacientes com PCM ativa (AP) e tratada (TP), e de indivíduos sadios (CO) foram geradas a partir de monócitos do sangue periférico aderidos ao plástico e tratados com IL-4 e GM-CSF. Após 6 dias, as DC diferenciadas (CD11c+, CD1a+, CD14-) foram ativadas com TNF- (DC+TNF) ou deixadas sem estímulo (nDC) por 48 horas. As moléculas de superfície CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 e DCSIGN das DCs foram analisadas por citometria de fluxo e as citocinas IL-10, IL- 12p40 e CCL18 foram dosadas nos sobrenadantes das culturas por ELISA. As DCs de TP e CO também foram geradas a partir de monócitos obtidos por seleção positiva em coluna magnética (micropérolas) e comparadas às células obtidas pelo método de aderência. Os sobrenadantes das DCs de TP foram utilizados como estímulo das DCs de CO e as moléculas de superfície e a secreção de citocinas foram analisadas novamente. RESULTADOS: As DCs dos grupos AP e TP apresentaram expressão de CD11c e CD1a similar à observada nas DCs de CO. No grupo TP, foi observada maior expressão de HLA-DR, CD86 e DC-SIGN nas nDC e HLA-DR e CD86 nas DC+TNF que nos grupos AP e CO que, por sua vez, apresentaram percentual de DCs positivas e a expressão dessas moléculas similares. As nDC do grupo AP secretaram significantemente menos IL-10 que as DCs de CO, sendo que a ativação com TNF- reduziu a produção dessa citocina em todos os grupos. O efeito oposto foi observado na secreção de IL-12p40, sendo que as DC+TNF do grupo TP apresentaram os maiores níveis dessa citocina. Tanto nDC quanto DC+TNF do grupo AP secretaram mais CCL18 que as correspondentes do grupo TP. Os sobrenadantes de TP tiveram pouco ou nenhum efeito sobre as DCs de CO. CONCLUSÕES: DCs derivadas de monócitos do sangue periférico de pacientes com PCM podem ser diferenciadas e ativadas in vitro com TNF-a, expressando as moléculas de superfície características. DCs de pacientes com PCM tratada tem alta expressão de HLA-DR, CD86 e DCSIGN e secreção aumentada de IL-12p40, e DCs de pacientes com a doença ativa apresentam expressão de moléculas similar às de DCs de indivíduos sadios. DCs obtidas por aderência de monócitos resultaram em maior freqüência de DCs CD86+, com maior secreção de IL-12p40 que células obtidas por micropérolas em amostras de indivíduos sadios e de pacientes tratados. Neste trabalho demonstrou-se a plasticidade in vitro de DCs derivadas de monócitos de pacientes com PCM, revelando o potencial dessas células na geração de uma resposta imune protetora / INTRODUCTION: Paracoccidioidomycosis (PCM) is caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, being a granulomatous systemic disease, endemic in Latin America. Previous studies on experimental and human PCM have established the relation between Th1 immune response and protection, antigenspecific transitory immunodepression in acute and chronic forms and recovery after clinical treatment. Myeloid dendritic cells (DCs) are the most potent antigen presenting cells, capable of inducing Th1 response on T lymphocytes. Their role on human PCM has not yet been described. OBJECTIVE: To investigate in vitro characteristics of monocyte-derived DCs from PCM patients. METHODS: DCs from active (AP) and treated PCM (TP) and from healthy individuals (CO) were generated from plastic adhered monocytes treated with IL-4 and GM-CSF. After 6 days, differentiated DCs (CD11c+, CD1a+, CD14-) were activated with TNF- (DC+TNF) or untreated (nDC) for 48 hours. Surface molecules CD11c, CD1a, HLA-DR, CD86, CD80 and DC-SIGN were analyzed by flow citometry and cytokines IL-10, IL- 12p40 and CCL18 were assayed on cultures supernatants by ELISA. DCs from the TP and the CO groups were also generated from positive selection of monocytes on magnetic column (microbeads) and compared to adhered monocyte-derived DCs. DC from the CO group were stimulated with supernatants from the TP cultures followed by flow cytometric analysis of surface molecules and production of cytokines. RESULTS: DCs from the AP and the TP groups showed similar expression of CD11c and CD1a in comparison to the CO group. On the TP group, nDC showed higher expression of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and DC+TNF of HLA-DR and CD86 than the AP and the CO groups which had similar percentage of positive cells and expression of these molecules. nDC from the AP group showed significantly lower levels of IL-10 than the CO group and decreased levels of this cytokine were observed with TNF- activation. The opposite effect was observed on IL-12p40 production in which DC+TNF from the TP group showed the highest levels. Both nDC and DC+TNF from the AP group had increased levels of CCL18 compared to the TP cells. Supernatants from TP had little or no effect on DCs from the CO group. CONCLUSIONS: Peripheral blood monocyte-derived DCs from patients with PCM can be differentiated and activated with TNF- in vitro with expression of typical molecules. DCs from patients with treated PCM showed up-regulation of HLA-DR, CD86 and DC-SIGN and the highest production of IL-12p40. DCs from patients with active PCM had similar expression of these molecules compared to control group. Adherence of monocytes resulted in higher frequency of CD86+ DCs with upregulation of IL-12p40 than microbeads positive selection method on samples from healthy donors and treated patients. This study demonstrated the in vitro plasticity of monocyte-derived DCs from patients with PCM, revealing the potential of these cells in generating a protective immune response

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-06-28T14:37:59Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_FABIANA_LETICIA_DIGITAL.pdf: 2539644 bytes, checksum: ffb2ea48912cab654c0a8e8bdc397ac2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T14:37:59Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_FABIANA_LETICIA_DIGITAL.pdf: 2539644 bytes, checksum: ffb2ea48912cab654c0a8e8bdc397ac2 (MD5) Previous issue date: 2014-08-27 / FACEPE / O contato prévio com o leite de mães esquistossomóticas induziu, em camundongos adultos, potencialização da produção de anticorpos e aumento da capacidade de apresentação de antígeno pelos linfócitos B, em resposta ao antígeno heterólogo ovalbumina (OVA). Considerando a imunização com OVA um modelo vacinal, as reações inflamatórias e a produção de anticorpos em resposta a esse antígeno são importantes para o desenvolvimento de uma imunidade satisfatória do hospedeiro. Nesse sentido, as células Th1 e Th17 são importantes fatores para o desenvolvimento dessas respostas. Dessa forma, os camundongos deficientes na produção de IL-12/IL-23 (12p40 knockout-KO) são predispostos a desenvolverem uma resposta Th2 polarizada, tornando-se menos responsivos às vacinações. Diante disso, o presente trabalho investigou o efeito da amamentação em mães infectadas pelo Schistosoma mansoni sobre as imunidades humoral e celular de camundongos adultos C57BL/6 12p40 KO, em resposta ao modelo vacinal acima citado. Foram avaliados: a cinética das reações de hipersensibilidade in vivo; os níveis plasmáticos das imunoglobulinas IgG1 e IgG2a; a produção das citocinas IFN-γ, IL-17, IL-5, IL-6, IL-10 e TGF- pelas células esplênicas e a reação inflamatória provocada no coxim plantar. Para isso, camundongos machos, deficientes na produção de IL-12 e IL-23 (IL-12p40 KO) e camundongos selvagens (wild-type/WT) foram divididos nos seguintes grupos: camundongos IL-12p40 KO amamentados em mães infectadas (AI IL-12p40 KO); camundongos IL-12p40 KO amamentados em mães sem infecção (NANI IL-12p40 KO); camundongos selvagens amamentados em mães infectadas (AI WT) e camundongos selvagens amamentados em mães sem infecção (NANI WT). Cinquenta por cento dos animais de cada grupo foram imunizados com OVA em adjuvante. Os outros 50% porcento restantes permaneceram sem imunização. No grupo AI WT houve aumentado de produção de IgG2a, IL-5, TGF-β e IL-6, com baixos níveis de IL-17, em comparação ao NANI WT. Nos animais AI IL-12p40 KO, a produção de IgG2a, IL-5 e TGF-β foi mais alta do que o grupo NANI IL-12p40 KO e similar ao grupo AI WT, mas a produção de IL-6 foi mais baixa. O grupo AI WT mostrou intenso infiltrado inflamatório de eosinófilos na reação de hipersensibilidade tardia (RHT), com acentuado edema em comparação com o edema menos intenso e infiltrado inflamatório de neutrófilos do grupo NANI WT. Os animais NANI IL-12p40 KO e AI IL-12p40 KO não apresentam RHT, porém a reação inflamatória no AI IL-12p40 KO foi menos intensa que nos NANI IL-12p40 KO. Em conclusão, o contato com antígenos do parasito, através da amamentação, induziu, no descendente adulto, uma melhor resposta de anticorpo neutralizante, mesmo diante da deficiência na produção de IL-12e IL-23. Nesta condição, embora tenha havido uma notável produção de IL-5, a lactação em mães infectadas atenuou a reação inflamatória, provavelmente através da regulação cruzada entre TGF-β e IL-6, modulando, desta forma, o status de hiperativação desses animais. / The previous contact with mothers milk schistosomiasis induced in adult mice enhancement of antibody production and increased antigen presentation capacity by B lymphocytes in response to the heterologous antigen ovalbumin (OA). Considering immunization with OA one vaccine model, inflammatory reactions and antibody production in response to antigen are important for the development of a suitable host immunity. In this sense, the Th1 and Th17 cells are important factors for the development of these responses. Thus, mice deficient in IL-12/IL-23 (12p40 knockout-KO) are likely to develop a polarized Th2 response, making it less responsive to vaccination. Therefore, the present study investigated the effect of breastfeeding in mothers infected with Schistosoma mansoni on the humoral and cellular adult C57BL/6 12p40 KO in response to vaccination model mentioned above. Were evaluated: the kinetics of in vivo hypersensitivity reactions; plasma levels of IgG1 and IgG2a immunoglobulins; the production of the cytokines IFN-γ, IL-17, IL-5, IL-6, IL-10 and TGF-β by spleen cells and the inflammatory reaction induced in the footpad. To this end, male mice deficient in IL-12 and IL-23 (IL-12p40 KO) and wild-type mice (Wild-type/WT) were divided into the following groups: IL-12p40 KO mice suckled by infected mothers (IL-12p40 KO- SIM); IL-12p40 KO mice suckled by uninfected mothers (IL-12p40 KO); Wild-type mice suckled by infected mothers (SIM) and wild-type mice suckled by uninfected mothers (CONTROL). Fifty percent of animals in each group were immunized with OA in adjuvant. The other 50% remaining percent remained without immunization. In the SIM group was increased production of IgG2a, IL-5, TGF-β and IL-6, IL-17 with low levels compared to CONTROL. In animals IL-12p40 KO-SIM the production of IgG2a, IL-5 and TGF-β was higher than the IL-12p40 KO similar to group SIM, but IL-6 production was lower. The SIM group showed intense inflammatory infiltrate of eosinophils in the delayed hypersensitivity reaction (DTH), with severe edema compared with the less intense edema and inflammatory infiltration of neutrophils CONTROL group. The animals IL-12p40 KO and IL-12p40KO-SIM not have DTH, but the inflammatory reaction in the IL-12p40KO-SIM was less intense than in IL-12p40 KO. In conclusion, contact with parasite antigens, through breastfeeding, induced in adult offspring, better neutralizing antibody response, despite the deficiency in the production of IL-12 and IL-23. In this condition, though there has been a remarkable IL-5 production in lactating mothers infected with attenuated inflammatory response, probably via cross regulation between TGF-β and IL-6 modulate thereby the status of hyperactivation of these animals.

Foram selecionados aleatoriamente 38 cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi oriundos de Araçatuba, São Paulo, área endêmica para leishmaniose visceral, e os quais foram distribuídos em dois grupos: o primeiro com 24 cães sintomáticos e, o outro, composto por 14 animais assintomáticos. Correlacionou-se a caracterização clínica (assintomáticos ou sintomáticos) com os: potencial em infectar o inseto vetor, padrão inflamatório da pele, perfil de imunidade celular e parasitismo tegumentar desses cães. Quanto ao número de formas amastigotas/mm2 no tegumento, não houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos (p = 0,1584), sendo que a densidade de parasitos na pele mostrou uma correlação positiva moderada com os títulos de anticorpos anti-Leishmania (p = 0,042). Quanto à infectividade ao vetor, evidenciada pelo xenodiagnóstico, 16 (66,7%) cães sintomáticos e 13 (93%) assintomáticos foram capazes em transmitir Leishmania aos flebotomíneos, dentre estes, respectivamente, seis (37,5%) e oito (61,5%) animais não apresentavam parasitismo cutâneo, embora todos, de ambos os grupos, tenham sido positivos quando da pesquisa de parasitos no linfonodo poplíteo. Observou-se um maior percentual de transmissibilidade para o vetor a partir de cães assintomáticos (p = 0,0494). As alterações histológicas cutâneas foram similares em ambos os grupos e se caracterizaram, de modo geral, por um infiltrado inflamatório, ora focal ora difuso, na derme, constituído, principalmente, por células mononucleares (macrófagos, linfócitos e plasmócitos), variando de discreto a intenso. Quanto à caracterização da resposta imune celular no tegumento dos animais, somente a densidade (células/mm2) de células iNOS+ foi significantemente maior na derme dos cães sintomáticos quando comparado aos assintomáticos (p = 0,0368). Observou-se correlação positiva moderada entre a densidade de parasitos na pele e a densidade de macrófagos (p = 0,031), de células T CD4+ (p = 0,015) e CD8+ (p = 0,023), e, também, naquela de células iNOS+ relativamente a de células T CD3+ (p = 0,005), CD4+ (p = 0,001) e CD8+ (p = 0,0001). Verificou-se, ainda, correlação negativa moderada com o número de manifestações clínicas e/ou gravidade da enfermidade (p = 0,028), confirmando, assim, maior transmissibilidade de parasitos ao vetor, a partir de animais assintomáticos, demonstrando-se, dessa forma, que tais cães são fontes de infecção em potencial para insetos vetores em áreas endêmicas para leishmaniose visceral canina. / Thirty-eight dogs naturally infected by Leishmania (Leishmania) infantum chagasi were randomly selected from Araçatuba of São Paulo state (Brazil), an endemic area for visceral leishmaniasis. The subjects were distributed into two groups: the first comprising 24 symptomatic dogs and the second consisting of 14 asymptomatic dogs. Possible correlations of clinical characterization (in both symptomatic and asymptomatic subjects) with potential to infect the insect vector, skin inflammatory pattern, cutaneous cellular immunity profile and cutaneous parasitism were investigated. Regarding to the number of cutaneous leishmania amastigotes/mm2, there was not a significant difference between the groups (p = 0.1584); density of skin parasites showed a moderate positive correlation with anti-Leishmania antibody titers (p = 0.042). Concerning to the infectivity to the insect vector, as evidenced by xenodiagnosis, 16 (66.7%) symptomatic and 13 (93%) asymptomatic dogs were able to transmit Leishmania to phlebotomines. Among these, six (37.5%) and eight (61.5%) dogs, respectivelly, did not show cutaneous parasitism, although all participant dogs were found positive when searching for parasites in the popliteal lymph nodes. Asymptomatic dogs showed higher transmissibility to the vector than symptomatic ones (p = 0.0494). Histological features in the skin were similar in both groups and were generally characterized by an inflammatory infiltrate, either diffuse or focal, in the dermis, mainly consisted of mononuclear cells (macrophages, lymphocytes and plasma cells), varying from mild to intense. Concerning characterization of the cutaneous cellular immune response, only iNOS+ cells density (cells/mm2) was significantly higher in the dermis of the symptomatic dogs compared to the asymptomatic ones (p = 0.0368). Moderate positive correlation between the cutaneous parasites density and the macrophages density (p = 0.031), the CD4+ T cells (p = 0.015) and CD8+ T cells (p = 0.023) were observed. Furthermore, density of iNOS+ cells in relation to CD3+ T cells (p = 0.005), CD4+ T cells (p = 0.001) and CD8+ T cells (p = 0.0001) were found positively correlated at a moderate level. It was also found a moderate negative correlation between cutaneous parasites density and the number of clinical signs and/or disease severity (p = 0.028), confirming grater parasites transmission to the vector from asymptomatic animals. It was therefore demonstrated that these dogs are potential sources of infection to insect vectors in endemic areas for canine visceral leishmaniasis.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-02-01T14:39:07Z No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-02-01T14:39:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-02-01T14:40:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-01T14:40:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reprodução Não Autorizada.pdf: 47716 bytes, checksum: 0353d988c60b584cfc9978721c498a11 (MD5) Previous issue date: 2012-04-30 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leprosy is an infectious disease characterized by different clinical forms that are associated with the type of immune response against Mycobacterium leprae. Polymorphisms present in the first intron of IFN- may have an important role in the regulation of the immune response, which could have functional consequences for gene transcription. Later studies identified the present of five polymorphisms in the IL12RB2 promoter region, this polymorphisms will may transcriptional factor suppress IL12R2 expression affect the development of cellular immune response. In the present study we investigated a possible association of the +874 T/A SNP and IFN-, microsatellite and polymorphisms present in the IL12RB2 promoter region associated with susceptibility to leprosy or with development of clinical forms in patients from brazilian Legal Amazon states. Nucleotide sequencing was performed with samples from 118 leprosy patients and 114 controls subjects, as well as immunophenotyping of CD4 +, CD8 + and CD69 + T cells by flow cytometry. Between leprosy patients and controls subjects, as well as between PB and MB patients were no observed significant differences among the studied genotypes in the polymorphisms of IL12RB2 studies. The polymorphisms -1035, -1023 and -464 present an absolute correlation (p<0.0001) having a combination of a same genotype in this positions. The microsatellite encoding 16 CA repeats was significantly associated with PB compared to MB patients (p = 0.019), being individuals homozygous for the +874 A allele present IFN- and the mean level of CD4 + and CD69 + T cells were higher. Our data suggest that polymorphisms present in the first intron of IFN- and of the IL12RB2 promoter region are not associated with susceptibility to leprosy, nevertheless, the +874 A/A genotype and microsatellite encoding 16 CA repeats may be related to a higher cellular immune response in patients and are consistently more frequently detected in PB patients. / A hanseníase é uma doença infecciosa caracterizada por apresentar diferentes formas clínicas que estão associadas com o tipo de resposta imune ao Mycobacterium leprae. Polimorfismos genéticos presentes no primeiro íntron de IFN- podem apresentar importante papel na regulação da resposta imune, podendo resultar em consequências funcionais na transcrição do gene. Estudos anteriores identificaram a presença de cinco polimorfismos na região promotora de IL12RB2, sendo que estes polimorfismos poderiam suprimir fatores de transcrição na expressão de IL12R2, afetando o desenvolvimento da resposta imune celular. No presente estudo investigamos uma possível associação do SNP +874, do microssatélite de IFN- e de polimorfismos presentes na região promotora de IL12RB2 com a susceptibilidade à hanseníase ou com desenvolvimento das formas clínicas em pacientes dos Estados da Amazônia Legal brasileira. O sequenciamento nucleotídico foi realizado em 118 pacientes com hanseníase e 114 indivíduos controles, assim como a imunofenotipagem de células T CD4 +, CD8 + e CD69 + pela citometria de fluxo. Entre pacientes com hanseníase e indivíduos controles, assim como entre pacientes PB e MB não foram observadas diferenças significativas entre os genótipos estudados nos polimorfismos de IL12RB2. Os polimorfismos - 1035, -1023 e -464 apresentam uma correlação absoluta (p<0,0001) havendo combinação de um mesmo genótipo nas respectivas posições. O microssatélite com 16 repetições foi significativamente associado com pacientes PB quando comparado aos pacientes MB (p = 0,019). Indivíduos homozigóticos ao alelo +874 A apresentaram maiores níveis de IFN- e maior média de células T CD4 + e CD69 +. Nossos dados sugerem que polimorfismos presentes no primeiro íntron de IFN- e da região promotora de IL12RB2 não estão associados com a susceptibilidade à hanseníase. No entanto, o genótipo +874 A/A e 16 repetições de CA de IFN- podem estar relacionados à alta resposta imune celular observada nestes pacientes, sendo também mais frequentemente encontrados em pacientes PB.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-12-27T11:53:11Z No. of bitstreams: 2 Tese - Emerith Mayra Hungria Pinto - 2016.pdf: 2353103 bytes, checksum: b1bbe820e4f67491cf8298bcd67dc8b5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-12-27T11:57:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Emerith Mayra Hungria Pinto - 2016.pdf: 2353103 bytes, checksum: b1bbe820e4f67491cf8298bcd67dc8b5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-27T11:57:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Emerith Mayra Hungria Pinto - 2016.pdf: 2353103 bytes, checksum: b1bbe820e4f67491cf8298bcd67dc8b5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-11-11 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / This thesis concerns two immunologic issues which are relevant for leprosy control activities: laboratory diagnosis of paucibacillary leprosy/PB and evaluation of the prognostic value of Mycobacterium leprae specific serology for leprosy reactions. Immunodiagnostic laboratory tests for PB leprosy (PB) depend on cellular immunity and these tests and this study evaluated a whole blood assay/WBA prototype using antigen combinations in PB and multibacillary leprosy patients (MB) and controls from two Brazilian endemic regions (Goiânia/GO and Fortaleza/CE). The M. leprae specific cellular immunity was evaluated by WBA using heparinized tubes containing different antigen combinations: 46f+LID-1 and ML0276+LID-1; controls: PBS, PHA, MLCS-M. leprae cell sonicate, PPD. After 24 hours incubation (37°C, 5% CO₂) plasma was collected and ELISA used to detect IFNγ (QuantiFERON/Qiagen, cut-off: 50pg/mL) and CXCL10 (Sigma-Aldrich®, St. Louis, Missouri, USA, cut-off: 500 pg/mL). Newly diagnosed, untreated leprosy patients (MB, n=30, PB, n=38) and controls (27 household contacts/HHC, 61 endemic controls/EC) were tested. The new platform in tube validated previous IFNγ results obtained in culture plates. Production of IFNγ to 46f+LID-1 was detected in 84% PB patients, 55% HHC; for ML0276+LID-1: 71% PB, 55% HHC. For both antigen combinations, the IFNγ response of PB leprosy patients differed from the EC (p<0.0001), however the response in PB leprosy and HHC was similar (p>0.05). Studies in tuberculosis/TB have shown that the CXCL10 response differentiate individuals with active TB from those with latent Mycobacterium tuberculosis infection. In leprosy, CXCL10 levels did not differentiate PB leprosy from HHC. Despite this limitation, our results show that WBA in tube could be a supplementary tool in assessing M. leprae infection rates and evaluating the impact of control measures. The application of leprosy serology as a predictor for the occurrence of leprosy reactions observed during clinical monitoring post treatment was evaluated by ELISA tests to detect M. leprae-specific antibodies, IgM anti PGL-I, IgG anti LID-1 and IgM and IgG anti ND-O-LID. Serum samples from 452 patients were tested and these patients participated of Clinical Trial for Uniform Multidrug Therapy Regimen for Leprosy Patients in Brazil/U-MDT/CT-B who were clinically monitored for more than six years post treatment for the development of leprosy reactions. Serological tests were performed in samples collected in untreated patients at diagnosis (baseline) and the results were analyzed taking into account the clinical outcome post treatment (reaction and reaction-free). Reactional patients (RR and ENL) had higher seropositivity rates and optical density/OD medians for PGL-I, LID-1 and ND-O-LID compared to reaction-free patients (p<0.0001). In leprosy, both the development of reactions and the serologic response are strongly influenced by the patients’ bacillary index (BI) and a positive correlation was found between both the BI and the proportion of reactional patients and the antibody levels. Negative BI group: 10% reactional patients, intermediary BI (>0<3): 50% reactional patients, high BI (>=3): 66% reactional patients. The serological results stratified according to the BI showed: in BI negative patients higher anti-PGL-I levels in RR patients compared to reaction-free ones (p=0.014); group IB> 0<3: reactional patients (RR) showed higher anti-PGL-I (p=0.014) and anti-LID-1 (p=0.035) antibody levels compared to reaction-free patients; group IB => 3: patients who developed ENL showed higher levels of anti-LID-1 antibodies (p=0.028) when compared with reaction-free ones. The accuracy of a serological test to predict the occurrence of leprosy reactions as determined by ROC curve showed that only anti-PGL-I serology provided limited value to predict RR (area-under-the-curve/AUC=0.702). The anti-PGL-I serology showed low sensitivity for RR prognosis, indicating the need to identify other plasma biomarkers for prediction of RR. In patients who developed ENL during follow-up was observed high positivity in the anti-LID-1 serology at diagnosis indicating the potential application of serology in the identification of patients at higher risk of developing ENL. / Esta tese aborda dois temas imunológicos importantes para o controle da hanseníase: diagnóstico laboratorial da hanseníase paucibacilar/ PB e valor prognóstico da sorologia específica para Mycobacterium leprae para reações hansênicas. O diagnóstico laboratorial da hanseníase PB se baseia em testes que avaliam a imunidade celular e este estudo avaliou um protótipo de ensaio de sangue total/EST com combinações antigênicas do M. leprae em pacientes multibacilares-MB e PB e controles de duas regiões endêmicas (Goiânia/GO e Fortaleza/CE). A avaliação da imunidade celular específica se baseou em EST em tubos heparinizados contendo diferentes combinações de antígenos do M. leprae: 46f+LID-1 e ML0276+LID-1; controles: PBS, PHA, MLCS-M. leprae cell sonicate, PPD. Após 24 horas de cultura (37ºC, 5% CO₂), o plasma foi coletado e ELISA utilizado para mensurar IFNγ (QuantiFERON/Qiagen, cut-off: 50pg/mL) e CXCL10 (Sigma-Aldrich®, St. Louis, Missouri, USA, cut-off: 500 pg/mL). Pacientes com hanseníase, recém diagnosticados, não tratados (30 MB, 38 PB) e controles (27 contatos domiciliares/CD, 61 controles saudáveis/CS) foram avaliados. A nova plataforma de tubos foi validada demonstrando produção de IFNγ similar a obtida em placas de cultura. A produção específica de IFNγ para a combinação 46f+LID-1 foi: 84% pacientes PB, 55% CD; para ML0276+LID-1: 71% PB, 55% CD. Para ambas as combinações antigênicas a resposta de IFNγ em pacientes PB diferiu da obtida para os CS (p<0,0001), contudo foi similar em pacientes PB e CD (p>0,05). Estudos em tuberculose/TB mostraram que a produção de CXCL10 discrimina indivíduos com TB ativa daqueles com infecção latente pelo Mycobacterium tuberculosis. Avaliamos na hanseníase se a produção de CXCL10 é capaz de diferenciar pacientes PB/infecção ativa de CD com infecção “latente”, assintomática. Nossos resultados mostraram produção de CXCL10 induzida por combinações antigênicas do M. leprae, entretanto sem diferenciar resposta de infecção ativa em PB de infecção assintomática em CD. Apesar desta limitação, nossos resultados mostram que o EST em tubo poderia ser uma ferramenta para avaliar as taxas de infecção PB pelo M. leprae e o impacto das medidas de controle. A aplicabilidade da sorologia específica para hanseníase como ferramenta preditora de reações hansênicas foi avaliada por ELISA para detectar anticorpos para específicos do M. leprae, IgM anti PGL-I, IgG anti LID-1 e IgM e IgG anti ND-O-LID Utilizamos amostras de soro de 452 pacientes que participaram do Ensaio Clínico para Avaliação da Eficácia de um Esquema Único de Multidrogaterapia em pacientes com hanseníase no Brasil (U-MDT/ CT-BR) que foram monitorados por mais de 6 anos após o tratamento quanto ao desenvolvimento de reações. Resultados da sorologia realizada em amostras coletadas ao diagnóstico, antes do início da terapia (baseline) foram analisados segundo os desfechos clínicos (ocorrência ou não de reações hansênicas). Independente do tipo de reação (reação reversa/RR ou eritema nodoso hansênico/ENH), pacientes reacionais apresentaram maior soropositividade e medianas de D.O para PGL-I, LID-1 e ND-O-LID comparados com pacientes não reacionais (p<0,0001). Na hanseníase o desenvolvimento de reações e a soropositividade são fortemente influenciadas pelo índice bacilar (IB) do paciente. Nossos resultados corroboram este paradigma mostrando associação positiva do IB tanto com a proporção de pacientes reacionais como com os níveis de anticorpos. Grupo de pacientes com IB negativo: 10% reação, IB intermediário (IB>0<3) 50% reacionais e IB >3, 66% de pacientes reacionais. Os resultados da sorologia, estratificados de acordo com o IB mostrou no grupo com IB negativo que pacientes que desenvolveram RR apresentaram maiores níveis de anticorpos anti PGL-I comparados com pacientes não reacionais (p=0,014); Grupo com IB>0<3: pacientes reacionais (RR) apresentaram maiores níveis de anticorpos para PGL-I (p=0,014) e LID-1 (p=0,035) comparados com pacientes não reacionais; Grupo IB=>3: pacientes que desenvolveram ENH apresentaram maiores níveis de anticorpos anti LID-1 comparados com pacientes não reacionais (p=0,028). De acordo com resultados da curva ROC para avaliar a acurácia de um teste sorológico para prever o desenvolvimento de reações durante o monitoramento, a sorologia anti PGL-I apresentou limitado valor para prever o desenvolvimento futuro de RR (área sob a curva/AUC=0,702). A sorologia para LID-1 mostrou capacidade de prever o desenvolvimento de ENH (AUC= 0,85). A sorologia anti-PGL-I apresentou baixa sensibilidade para prognóstico da RR, indicando a necessidade da identificação outros biomarcadores plasmáticos para predição da RR. Já em pacientes que desenvolveram ENH durante o seguimento apresentaram alta positividade na sorologia anti LID-1 ao diagnóstico, indicando a potencial aplicação da sorologia na identificação de pacientes com maior risco de desenvolver ENH.

Orientadores: Maria Marluce dos Santos Vilela, Marcos Tadeu Nolasco da Silva / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T23:17:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mazzola_TaisNitsch_D.pdf: 5322017 bytes, checksum: e684a35934a223e0ea20110ed186af8d (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Este estudo teve como objetivo analisar se há associação entre a viremia plasmática do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) e a resposta imunológica adaptativa de crianças e adolescentes com infecção vertical pelo HIV-1 em uso de terapia antirretroviral combinada (TARVc). Os pacientes foram recrutados no Ambulatório de Imunodeficiência Secundária Pediátrica do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas e no Centro de Orientação e Apoio Sorológico (COAS), em Jundiaí, ambos no estado de São Paulo, Brasil. Constituíram-se dois grupos de pacientes: a) com controle virológico sustentado por mais de um ano (Carga viral - CV < limite de detecção de 50 cópias de RNA viral/mL, pelo método de Branched-DNA); e b) com CV > 1000 cópias/mL. Crianças e adolescentes saudáveis participaram como controles. Foram realizadas, por citometria de fluxo, imunofenotipagens de linfócitos T CD4+, T CD8+, B total e de memória e a proliferação de linfócitos T em culturas de células mononucleadas do sangue periférico estimuladas com HIV-1 inativado por aldritiol-2. A concentração de citocinas IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-?, IFN-?, TNF-? e TGF-?1 no sobrenadante destas culturas foi analisada com Cytometric Bead Array e Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Também foram dosados imunoglobulinas por nefelometria; anticorpos anti-hepatite B e anti-rubéola por Chemiluminescent Microparticle Immunoassay e anti-tétano e anti-difteria por Toxin Binding Inhibiton test. Empregaram-se os testes estatísticos de Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, exato de Fisher, Comparações Múltiplas Não Paramétricas e Correlação de Spearman, sendo o nível de significância de p < 0,05. Não houve diferença na contagem de linfócitos T CD8+, B total e de memória entre os grupos de pacientes. O número de linfócitos T CD4+ estava reduzido no grupo virêmico no momento da avaliação da resposta vacinal. Observaram-se maiores valores absolutos de linfócitos B de memória nos pacientes com CV indetectável (CVI) de menor idade à introdução de TARVc. A concentração de IgM e IgG foi superior nos pacientes virêmicos em relação aos com CVI e controles. Pacientes com CVI tiveram maior nível de IgA que os controles. Os pacientes com CVI apresentaram maior proliferação de linfócitos T e produção de IL-2 e IFN-? HIV-1 específicas em relação aos virêmicos. A proliferação e produção de IFN-? e IL-2 se correlacionaram com a duração da TARVc bem-sucedida no controle da viremia. Em pacientes virêmicos, a concentração de IFN-? correlacionou-se inversamente à CV e a proliferação foi menor nos que iniciaram TARV após um ano de idade. A proporção de respondedores para as vacinas de tétano, difteria, rubéola e hepatite B foi similar entre os grupos de pacientes, e aqueles com CVI apresentaram maiores títulos de anti-hepatite B e anti-rubéola. Os controles apresentaram maior número de respondedores para rubéola, hepatite B e difteria e maiores títulos de anti-hepatite B, anti-rubéola e anti-tétano que os pacientes. Concluímos que o controle virológico sustentado em crianças e adolescentes com infecção crônica pelo HIV trouxe benefícios diretos na manutenção das respostas anti-HIV e vacinais e que a administração de TARV precoce contribuiu para melhor resposta celular ao HIV e maior número de linfócitos B de memória / Abstract: The aim of this study was to evaluate if there was an association of Human Immunodeficiency Virus (HIV) plasma viremia and the development of adaptative immune responses from vertically-HIV-1 infected children and adolescents under combination Antirretroviral Therapy (cART). The individuals were recruited at the Pediatric Immunodeficiency Outpatient Unit at the University of Campinas Clinical Hospital (UNICAMP, Campinas) and at the Center for Orientation and Serologic Support (COAS, Jundiaí), in São Paulo State, Brazil. They were separated in two groups, according to HIV RNA plasma viral load (VL): one had sustained undetectable VL (UVL, with VL < 50 copies of RNA/mL) for at least one year before blood collection; the other had VL > 1,000 copies/mL. Healthy children and adolescents participated in the study as controls. Aldrithiol-2-inactivated HIV-1-stimulated peripheral blood mononuclear cells were cultured to evaluate HIV-specific lymphoproliferation by flow cytometry and IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IFN-?, IFN-?, TNF-? and TGF-?1 concentration by Cytometric Bead Array and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. Adaptative immunity was also evaluated with T CD4+, T CD8+, total and memory B cell counts by flow cytometry, immunoglobulin dosage by nephelometry, Chemiluminescent Microparticle Immunoassay to antibodies anti-hepatitis B and anti-rubella and Toxin Binding Inhibiton test to anti-tetanus and anti-diphtheria were carried out to humoral response evaluation. Kruskal-Wallis, Wilcoxon, Mann-Whitney, Fisher's exact, Nonparametric Multiple Comparisons and Spearman Correlation tests were used, with a p value < 0.05. There was no difference in T CD8, total and memory B cell counts between the groups of patients. T CD4 cell numbers were decreased in the viremic group at the time humoral immunity was performed. Greater memory B cell counts were observed among patients with UVL who were younger at cART beginning. IgM and IgG levels were higher in viremic patients in comparison to control and patients with UVL, which had increased levels of IgA in comparison to controls. There was no difference in the proportion of responders for tetanus, diphtheria, rubella and hepatitis B vaccines between the two groups of patients; nevertheless, the group with UVL showed higher titers of anti-hepatitis B, anti-rubella and anti-tetanus than the viremic group. Controls showed higher frequency of responders to diphtheria, rubella and hepatitis B and titers to anti-hepatitis B, anti-rubella and anti-tetanus in comparison to patients. Patients with UVL showed higher HIV-1-specific T lymphocyte proliferation and IL-2 and IFN-? production in comparison to viremic patients. Greater time since the start of successful cART in patients with UVL was associated with higher proliferation and IFN-? and IL-2 levels in cultures with HIV. Among viremic patients, HIV-specific proliferation was lower in individuals who started ART after one year of age, and IFN-? concentration was inversely correlated with VL. We concluded that sustained HIV-1 virologic control was valuable on mounting responses to HIV and vaccines and the early initiation of ART contributed to improved HIV cellular immunity and greater memory B cell counts / Doutorado / Saude da Criança e do Adolescente / Doutora em Ciências

Orientador: Carmen Veríssima Ferreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T21:52:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_SarahAzoubel_M.pdf: 2437444 bytes, checksum: 4bc2e0c3075b4a6b06b01dee15a3fb45 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A resistência à quimioterápicos é um dos principais obstáculos para a terapia do câncer. Na leucemia mielóide crônica (CML) o tratamento é frequentemente ineficiente devido à aquisição de resistência aos quimioterápicos utilizados. Dessa forma, o estudo comparativo de linhagens celulares de CML resistentes e susceptíveis a drogas é de extrema importância para o entendimento dos mecanismos moleculares da resistência e para a evolução de novos protocolos terapêuticos. Um número cada vez maior de evidências indica que os microRNAs apresentam importante papel no processo de carcinogênese e na agressividade tumoral. Nesse trabalho o principal objetivo é melhor esclarecer o papel da maquinaria de processamento de microRNAs no fénotipo MDR (multi-drug resistance), utilizando principalmente as linhagens de CML K562 (susceptível) e Lucena (fenótipo MDR). Nossos resultados revelaram que as células Lucena apresentam altos níveis da endonuclease Dicer e que os microRNAs let-7a e miR-145 são intensamente regulados em relação à K562. Além disso, a linhagem Lucena se tornou mais sensível ao quimioterápico vincristina após o silenciamento de Dicer. Experimentos com outras linhagens celulares mostraram que a resistência frente à cisplatina e doxorrubicina possui correlação significativa com os níveis de Dicer. A identificação de ligantes dessa endonuclease nas linhagens de CML ressalta a possibilidade desta enzima estar cumprindo novos papéis no fenótipo MDR. Entre os ligantes exclusivos da linhagem resistente, estão proteínas envolvidas na promoção de defesa anti-oxidante, proliferação celular e metabolismo de lipídios e hormônios esteróides. De acordo, dados de proteoma das duas linhagens enfatizam a importância do metabolismo lipídico para aquisição da resistência, bem como de um intenso remodelamento do citoesqueleto. Nossos dados reforçam o caráter complexo e multifatorial da resistência à múltiplas drogas, contribuindo para o entendimento do ação de miRNAs e de Dicer nesse processo / Abstract: Drug resistance is one of the main obstacles in cancer therapy. Frequently, the treatment of chronic myelogenous leukemia (CML) becomes inefficient due to the emergence of a resistant population of cancer cells. Therefore, comparative studies of resistant and non-resistant CML cell lines is extremely important to the understanding of molecular mechanisms involved in the acquisition of resistance and also to the evolution of new therapeutic protocols. A growing number of evidence supports an important role for microRNAs in carcinogenesis and tumoral aggressiveness. This study aims to better understand the role of microRNAs and their biosynthetic pathway in the phenotype of multi-drug resistance (MDR) of CML cells. To this purpose we worked with the leukemic cell lines K562 (non-resistant) and Lucena (MDR phenotype). The results obtained revealed that Lucena expresses high levels of Dicer endonuclease and intensely regulates microRNAs let-7a and miR-145 when compared to K562. Also, Dicer silencing in MDR cells enhanced sensitivity to the chemotherapic drug vincristine. Experiments with different cells lines showed that resistance to cisplatin and doxorubicin are correlated to Dicer expression levels. In CML cell lines, the identification of Dicer ligands points to the possibility of alternative roles for this endonuclease in the MDR phenotype. Among the newly found interactors in the resistant cell line are proteins involved in antioxidant defense, proliferation and metabolism of fatty acids and steroids. Accordingly, proteome data from K562 and Lucena cells emphasizes the importance of lipid metabolism and structural remodeling to the resistant phenotype. Overall, our data contributes to the understanding of the role played by microRNAs and Dicer in the complex and multifactorial MDR phenotype / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-04-12T15:05:40Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_MEDICINA TROPICAL_IANA RAFAELA SALES.pdf: 2843724 bytes, checksum: 82befaa22a5a011cd9ceede497871d36 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-12T15:05:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE_MEDICINA TROPICAL_IANA RAFAELA SALES.pdf: 2843724 bytes, checksum: 82befaa22a5a011cd9ceede497871d36 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / CAPEs / A alta prevalência de esquistossomose crônica em gestantes, bem como em mulheres em idade fértil, tem sido amplamente relatada. Esta condição materna é capaz de alterar a resposta imune do descendente em longo prazo. O presente estudo teve o objetivo de avaliar o efeito in vitro do leite materno de mães infectadas pelo Schistosoma mansoni em esplenócitos e caracterizar os peptídeos encontrados nesse leite. Para isso, camundongos fêmeas infectadas ou não, tiveram seu leite coletado no 12º dia após o parto. Os esplenócitos jovens (15 dias) e maduros (6 semanas) foram cultivados com o Leite de Mães Infectadas (LMI) e com Leite de Mães Não Infectadas (LMNI) na presença de estimulador policlonal. Além disso, foram utilizados controles experimentais: Células pulsadas na ausência (BASAL) e apenas com estimulador policlonal (MITÓGENO) e células cultivadas com LMNI adicionado de antígenos solúveis dos ovos do S.mansoni (LMNI+SEA). Posteriormente, os ensaios de citometria de fluxo foram realizados para dupla marcação: Linfócitos T (CD3+ ou CD4+) marcados com CD28, CD154, CTLA4, IL-10 ou FoxP3. Além disso, foram analisadas a expressão de CD80, CD86 e CD40 na superfície de Macrófagos (CD14) e Linfócitos B (CD45R), e ainda a expressão de IL-10 por esse último. Para a análise dos peptídeos presentes no leite materno, um gel unidimensional foi confeccionado e as bandas obtidas no LMI, LMNI+SEA e LMNI foram processados para análise por espectometria de massa. Além disso, foram realizadas análises de antígenos parasitários: SEA e SWAP (antígeno solúvel do verme adulto). Esplenócitos jovens pulsados apenas com o mitógeno apresentaram maior frequência de células CD3+CD28+ e CD45R+IL10+. A adição de LMNI manteve aumento CD3+CD28+ e levou a menor frequência de Tregs, com aumento na expressão de células CD45R+CD40+. Ao ser introduzido o SEA (LMNI+SEA) foi identificada uma menor frequência de células CD3+CD28+ e aumento na expressão de IL-10. O LMI proporcionou menor frequência de linfócitos CTLA4+ e FoxP3+, porém com produção de IL-10 e maior frequência de CD45R+/CD80+. Para os esplenócitos maduros, o LMNI e LMI levaram à menor frequência de células CD3+/CD28+ e maior CD3+/CTLA4+, respectivamente, com aumento sustentado de Treg. Contudo, o LMI diminui a presença de células B IL-10+. A adição do SEA ao LMNI manteve a diminuição de células CD3+CD28+, mas aumentou a frequência de células CD3+/CD154+. O leite de mães esquistossomóticas apresentou peptídeos relacionados à presença do S. mansoni e com variabilidade de função. Destacamos a natureza imunomodulatória dos peptídios aqui identificados (Interleucina 17F, Glutationa s Transferase) que podem atuar na imunidade, seja para antígenos do parasita ou heterólogos, no descendente previamente amamentado. Estes achados enfatizam o caráter dicotômico do leite materno: estimulador em células jovens e tolerogênico em células maduras. Esses achados são relevantes em áreas endêmicas para esquistossomose e reiteram a importância da identificação e caracterização de antígenos parasitários, bem como, uma avaliação do seu papel na interação parasito-hospedeiro no incio da vida. / The high prevalence of chronic schistosomiasis in pregnant women and women of childbearing age has been widely reported. Breastfeeding by mothers with schistosomiasis is capable of altering the long term immune response of offspring. The aim of this study was to undertake an in vitro analysis of the effect of breast milk of mothers with schistosomiasis on young and mature splenocytes and characterize the proteomics in this milk. The milk of female mice infected with Schistosoma mansoni and non-infected female mice was collected on the 12th day postpartum. Young (15 days) and mature (6 weeks) splenocytes were cultivated (24hs) with mitogen (CONTROL), added to the Milk of Infected Mothers (MIM), Milk of Non-Infected Mothers (MNIM) or Milk of Non-Infected Mothers with the addition of soluble egg antigens of parasites (MNIM+SEA), as well as those without in vitro stimulus (BASAL). Double cell labeling was performed for flow cytometry: T Lymphocytes (CD3+ or CD4+) marked with CD28, CD154, CTLA4, IL-10 or FoxP3; Macrophages (CD14) and B Lymphocytes (CD45R) marked with CD80, CD86 or CD40 on the surface and the expression of IL-10 by CD45R+ cells. For analysis of proteomics a one-dimensional gel was made and the bands obtained from MIM, MNIM, MNIM + SEA, were processed for analysis by mass spectrometry. Additionally, the parasite antigens SEA and SWAP (soluble adult worm antigen preparation) were included in the analysis. Young splenocytes pulsed only with mitogen had the greatest CD3+CD28+ and CD45R+IL10+ cell frequency. The addition of MNIM maintained an increase of CD3+CD28+ and produced the lowest frequency of Tregs, with an increase in the expression of CD45R+CD40+ cells. The introduction of SEA (MNIM+SEA) resulted in reduced CD3+CD28+ cell frequency and increased IL-10 expression. MIM resulted in reduced CTLA4+ and FoxP3+ lymphocyte frequency, although there was some IL-10 production and greater CD45R+/CD80+ frequency. MNIM and MIM resulted in the lowest frequency of CD3+/CD28+ and CD3+/CTLA4+ cell frequency, respectively, for mature splenocytes, with a sustained increase of Treg. However, MIM reduced the presence of B IL-10+ cells. The addition of SEA to MNIM maintained a reduction in CD3+CD28+ cells, but increased the frequency of CD3+/CD154+ cells. The breast milk of mothers with schistosomiasis presented peptides related to the presence of S. mansoni and variability of function. The immunomodulatory nature of the peptides identified in the present study (Interleukin 17F, Glutathione-S-Transferase) should be noted, as these can act in the immune process of breastfed offspring, whether for parasite antigens or heterologous antigens. These findings emphasized the dichotomous character of breast milk, which functions as a stimulator in young cells and is tolerogenic in mature cells, yet is capable of improving LB activation. These findings are relevant for areas in which schistosomiasis is endemic and emphasize the importance of the identification and characterization of parasite antigens and the evaluation of their role in parasite-host interaction in the early stages of life, in order to obtain a better understanding of immunoregulatory events.