Este trabalho visa investigar a resposta sorológica para glicolipoproteína (GLP) de leptospiras com a finalidade de padronizar o uso deste antígeno em testes sorológicos para o diagnóstico da leptospirose humana. Dentre as proteínas envolvidas na patogenicidade das leptospiras, a GLP ainda não foi estudada quanto a imunogenicidade e quanto ao seu emprego como antígeno na detecção de anticorpos específicos. Assim, dot-ELISA para detecção de anticorpos IgG e IgM, com o emprego de GLP de leptospiras patogênica e não patogênica, foi padronizado. Foram testadas amostras pareadas de soros de 90 pacientes com leptospirose confirmada sorologicamente por MAT, sendo as primeiras amostras colhidas na fase aguda da doença e as segundas amostras após 10 a 15 dias. Foram testadas também amostras únicas de 30 pacientes de diferentes patologias, que apresentaram resultados negativos no MAT, pertencentes ao grupo controle. A detecção de anticorpos IgG não mostrou resultados satisfatórios, tendo sido, o seu estudo, descontinuado. Os resultados do dot-ELISA IgM mostraram sensibilidade de 100% nas amostras colhidas após soroconversão no MAT e a precocidade de detecção foi demonstrada pela alta positividade nas amostras colhidas na fase aguda da doença (76,6% para dot-ELISA com antígeno de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni e 90% com antígeno de Leptospira biflexa sorovar Patoc). A especificidade foi alta (96,6%), porém o dot-ELISA utilizando ambos os antígenos apresentou 3,3% de resultados falso-positivos. Este estudo demonstrou a importância da resposta imune humoral ao antígeno GLP de leptospiras. A utilização da GLP, no teste dot-ELISA para detecção de anticorpos IgM permitiu realizar o diagnóstico sorológico de forma simples, rápida e com alta eficiência diagnóstica. / The aim of this work was the study of serologic response against leptospira glycolipoprotein (GLP) for the purpose of standardizing its use as an antigen on serological tests to diagnose human leptospirosis. Among the proteins involved in the pathogenicity, GLP is yet to be studied regarding its immunogenicity and its use as an antigen in the detection of specific antibodies. That led to our standardization of dot-ELISA for detecting IgG and IgM antibodies, using GLP extracted from either pathogenic Leptospira interrogans serovar Copenhageni or nonpathogenic Leptospira biflexa serovar Patoc. Paired serum samples were taken from 90 patients with serologically confirmed leptospirosis, by MAT, with the first samples collected on the disease\'s acute phase and the second samples after a period of 10 to 15 days. We also tested single samples taken from 30 patients with other diseases, MAT negative, belonging to the control group. Detection rates for IgG antibodies were unsatisfactory, so the study for that use was discontinued. The dot-ELISA IgM results yielded 100% sensitivity on the samples taken after MAT seroconversion. The early detection pattern was evidenced by the high positivity rate on the samples taken during the disease\'s acute phase (76,6% dot-ELISA using Leptospira interrogans serovar Copenhageni antigen and 90% using Leptospira biflexa sorovar Patoc antigen). Specificity rates were high (96.6%), although a 3.3% rate of false-positive results was observed for dot-ELISA using both antigens. The present study revealed the importance of the humoral immune response against the GLP antigen. The use of GLP, on the dot-ELISA test for IgM antibodies afforded a simple, quick and effective diagnosis.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) em indivíduos de Londrina e regiões circunvizinhas. Amostras de doadores de sangue e de indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV) foram analisadas pela metodologia de enzimaimunoensaio de micropartículas (MEIA), obtendo-se a freqüência de positividade para anticorpos anti-HCV de 0,8% e de 20,2%, respectivamente. Um conjunto de 185 amostras soropositivas para anti-HCV pelo MEIA foi submetido a outros testes laboratoriais, para avaliação da correlação entre os diferentes métodos empregados. Apenas 79% destas amostras apresentaram resultado reagente em um segundo teste imunoenzimático (ELISA) empregado, sendo que a maior proporção de resultados discordantes ocorreu entre doadores de sangue. O mesmo ocorreu na pesquisa do RNA viral, onde 111 (67%) das 166 amostras analisadas apresentaram resultado positivo, sendo que a positividade foi maior entre indivíduos HIV soropositivos e pacientes com hepatite crônica do que entre os doadores de sangue. Quinze amostras foram submetidas ao immunoblot (IB), tendo-se obtido resultados positivos neste teste apenas nas amostras reagentes nos dois métodos imunoenzimáticos utilizados. Também pudemos verificar um grande número de amostras com resultado indeterminado no IB, inclusive entre amostras que eram negativas no segundo teste sorológico. Embora a amostragem fosse pequena, com apenas 61 amostras analisadas, a genotipagem do HCV revelou que os genótipos circulantes em nossa região são o tipo 1 (77,1%), seguido do tipo 3 (21,3%) e o tipo 2 (1,6%). Finalmente, avaliamos alguns fatores de risco associados à infecção pelo HCV, sendo que o principal fator de risco encontrado em indivíduos co-infectados pelo HIV/HCV foi o uso de drogas injetáveis, e em indivíduos sem infecção pelo HIV foi a transfusão sangüínea. O presente estudo contribuiu para a avaliação do perfil da infecção pelo HCV em indivíduos da nossa população, permitindo inclusive verificar a distribuição dos genótipos do HCV nesta região. / The objective of this work was to evaluate hepatitis C virus (HCV) infection in individuals of Londrina, Paraná State, Brazil, and adjacent areas. Samples of blood donors and individuals infected with Human Immunodeficiency virus (HIV) were analyzed by microparticle enzyme immunoassay (MEIA). Anti-HCV antibody frequency was 0.8% in blood donors, and 20.2% in HIV patients. A group of 185 anti-HCV positive samples by MEIA was submitted to other laboratorial tests, in order to access the correlation among different methods used. Only 79% of samples were reactive by a second antibody-screening test (enzime-linked immunosorbent assay - ELISA), and a great proportion of discordant results was verified among blood donors. The same happened at HCV-RNA detection by polymerase chain reaction (PCR), where 111/166 (67%) of samples showed positive results, which was greater among HIV positive individuals and patients with chronic hepatitis than among blood donors. Only 15 samples were submitted to immunoblot (IB): positive results were obtained only at samples which were also reactive by the two antibody-screening tests used. We could also verify a great number of anti-HCV indeterminate results by IB, which also happened among samples tested negative by the second serologic assay. Although the small number of samples used in genotype determination of HCV, only 61, our data revealed that the circulating genotypes in our region are type 1 (77.1%), followed by type 3 (21.3%) and type 2 (1.6%). Finally, we evaluated some risk factors associated to HCV infection, and we found that intravenous drug use was the most common risk factor among patients HIV/HCV co-infected, while blood transfusion was the most important risk factor in the group without HIV infection. The present study contributed to the evaluation of HCV infection in our population, so that the distribution of HCV genotypes in the region could be accessed.

Baseado nos algoritmos de hidrofilicidade e flexibilidade obtidos pelo uso do \"software\" ProtScale, acessível no endereço http://au.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl, foram selecionados sete peptídeos, potencialmente antigênicos, das proteínas de Schistosoma mansoni, entre elas, catepsina B (Sm 31), \"heat shock protein\" de 70 kDa (HSPSm-70), \"cathodic circulating antigen\" (CCA), e uma seqüência da fase de leitura aberta do clone ET03. Estes peptídeos, produzidos por síntese química, foram denominados P1, P2, P3, P4, P5, P6 e P7. Em seguida, os peptídeos foram testados isoladamente contra \"pool\" de soros humanos positivos e negativos. Após vários testes, os peptídeos P1, P2, P3, P6 e P7, que apresentaram imunorreatividade quando ensaiados por método imunoenzimático, foram usados na padronização de um método imunoenzimático de ELISA, utilizando placas Costar 3590, que passou a ser denominado ELISA-Peptídeo (ELISA-Pp). Este método foi avaliado empregando-se 192 amostras de soro, divididas em quatro grupos: (A) 23 amostras de soro, coletadas de pacientes residentes no Nordeste do Brasil, portadores de esquistossomose aguda, com ovos de S. mansoni nas fezes; (B) 30 amostras de soro, coletadas de pacientes residentes no Norte do Brasil, portadores de esquistossomose crônica, com ovos de S. mansoni nas fezes; (C) 39 amostras de soro, coletadas de indivíduos residentes no Norte do Brasil, portadores de outras parasitoses, mas não esquistossomose; (D) 100 amostras de soro, coletadas de indivíduos residentes em Campinas-SP, negativos pelo exame coproparasitológico. Os resultados obtidos foram analisados comparativamente com os encontrados por outras metodologias imunodiagnósticas: reação de imunofluorescência indireta para detecção de anticorpos IgM contra tubo digestivo de verme (RIF-IgM), método imunoenzimático para detecção de anticorpos IgM contra antígenos polissacarídeos (ELISA-IgM) ou anticorpos IgG contra extrato total de vermes (ELISA-IgG). A sensibilidade do ELISA-Pp foi de 86,6%, quando avaliado frente a soros de pacientes que apresentaram ovos de S. mansoni nas fezes e de 79,3%, considerando como esquistossomótico aqueles pacientes com sorologia positiva pelos métodos de RIFI-IgM e ELISA-IgM. A especificidade do ELISA-Pp foi de 94,2% e 94,7%, respectivamente, considerando como grupo controle, não esquistossomótico, indivíduos com resultado de exame parasitológico de fezes negativo para ovos de S. mansoni ou indivíduos com sorologia negativa pelo ELISA-IgM e RIFI-IgM. O valor preditivo positivo apresentado pelo ELISA-Pp foi de 85,2% enquanto para os outros métodos sorológicos variou de 63,4% a 78,6%. O valor preditivo negativo do ELISA-Pp foi em média 3% inferior aos obtidos pelos outros métodos sorológicos. Comparando-se os resultados obtidos pelo ELISA-Pp com os dos outros métodos sorológicos, melhor concordância foi demonstrada com os resultados do ELISA-IgM (Índice Kappa=0,75). Os índices de reatividade para detecção de anticorpos IgG e IgM foram significantemente maiores (P < 0,05) nos pacientes com esquistossomose aguda (grupo A) do que crônica (grupo B). No presente estudo, ELISA-Pp demonstrou bom desempenho (eficácia diagnóstica = 81,0%), entretanto novos estudos são necessários para avaliação de sua aplicabilidade em inquéritos soroepidemiológicos. / Based on algorithms of hidrophilicity and flexibility, obtained by the use of the ProtScale software, disposable at the site http://au.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl, seven potentially antigenic peptides were selected from different Schistosoma mansoni proteins: cathepsin B (Sm31), heat shock protein (SmHSP-70), cathodic circulating antigen (CCA) and the polypeptidic sequence of the open reading frame (ORF) of the ET-03 clone. The peptides were produced by chemical synthesis and denominated as P1, P2, P3, P4, P5, P6 and P7. These were independently tested against two pools of human sera, one positive and one negative for schistosomiasis. The peptides P1, P2, P3, P6 and P7, that presented better reactivity when assayed by an immunoenzymatic method, were chosen to be used as antigen for the standardization of an ELISA method, by utilizing Costar 3590 micro plates, and it was called Peptide-ELISA (Pp-ELISA). This method was evaluated on 192 serum samples, divided in four groups: (A) 23 samples from patients with acute schistosomiasis and positive for S. mansoni eggs in fecal examination, who were living in a Brazilian Northeast state; (B) 30 samples from patients with chronic schistosomiasis and positive for S. mansoni eggs, who were living in a Brazilian North state; (C) 39 samples from individuals with other parasite infection, but no schistosomiasis, living in a Brazilian North state; (D) 100 samples from clinically healthy individuals who presented negative results for coproparasitologic method, living in Campinas, São Paulo State. The serological data obtained by Pp-ELISA were comparatively analyzed with the results obtained by other immunodiagnostic methods: immunofluorescence test for detection of IgM antibodies against gut associated antigens (IgM-IFT); ELISA for detection of IgM antibodies against gut associated polysaccharide antigens (IgM-ELISA) or for detection of IgG antibodies against worm crude antigens (IgG-ELISA). The sensitivity of Pp-ELISA was of 86,6%, considering as schistossomiasis patients only the ones who presented S. mansoni eggs in stool examination, and 79,3%, when a serological criterion was used for definition of schistosomiaisis patients, with positive results for both IgM-IFT and IgM-ELISA. The specificity of the Pp-ELISA was respectively 94,2% or 94,7%, considering as control group, without schistosomiasis, S. mansoni egg negative individuals in stool examination or serologically negative individuals by both tests, IgM-IFT and IgM-ELISA. The positive predictive value for Pp-ELISA was 85,2%, while for the other serologic methods varied from 63,4% to 78,6%. The negative predictive value for Pp-ELISA was as a rule 3% lower than the indices obtained for other serologic methods. When the results of Pp-ELISA were compared with the ones obtained by other serologic methods, better concordance was demonstrated with IgM-ELISA (Kappa indice = 0,75). The reactivity indices for detection of IgG and IgM antibodies were significantly higher (P < 0,05) in acute (group A) than chronic schistosomiasis patients (group B). In this study the Pp-ELISA presented a good performance (Diagnostic efficacy = 81,0%), however further studies must be necessary for evaluation of its applicability on seroepidemiologic surveys.

A prova sorológica de referência na leptospirose ainda é a soroaglutinação microscópica (SAM). Devido à complexidade desta prova avaliamos alguns testes rápidos para triagem dos anticorpos anti-leptospiras na fase aguda da infecção. Na década de 80, uma hemaglutinação passiva, utilizando frações polissacarídicas de leptospiras, foi considerada apropriada ao diagnóstico precoce, porém esta preparação antigênica incluía muitos “antígenos comuns” reconhecidos por anticorpos de 4% dos indivíduos normais. Um novo ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) utilizando uma suspensão de antígenos imunodominantes, resistentes à proteinase K, foi padronizado e avaliado quanto ao seu valor diagnóstico. Com 89,9% de sensibilidade e 97,4% de especificidade, esta técnica, referida como PK-ELISA, satisfaz os requisitos necessários para as provas de triagem da leptospirose humana. No entanto, em virtude de alguns reagentes usados nesta preparação antigênica serem importados e muito instáveis, foi proposta a introdução de novos métodos empregando-se anticorpos monoclonais. Em um “Acordo de Pesquisa Cooperativa” entre o Instituto Adolfo Lutz e o Laboratório Fleury foram produzidos hibridomas contra leptospiras. Dois deles foram selecionados para dar continuidade ao estudo: um, secretando anticorpos monoclonais (AcM) para um epítopo detectado em 16 de 23 sorovares do gênero Leptospira mais freqüentes em nosso meio (clone A12P4), e outro específico a somente um sorogrupo patogênico, icterohaemorragiae (clone H7P1). O AcM A12P4, uma imunoglobulina G2B (IgG2B), reagiu com epítopo presente nos componentes de pesos moleculares (PM) de 16-18 kDa dos lisados de leptospiras das cepas RGA e M-20, quando separados na eletroforese em gel de poliacrilamida, e com componentes de PM de 75-84kDa dos sorovares copenhageni e canicola. Por sua vez, o AcM H7P1, uma imunoglobulina G, reagiu com um epítopo comum a várias frações de PM acima de 21 kDa da cepa RGA e com componentes de PM de 21-22 kDa e de 75-82 kDa da cepa M-20. Os monoclonais foram empregados em provas imunoenzimáticas para a detecção de anticorpos específicos em amostras séricas pareadas coletadas de 52 pacientes com leptospirose, e do grupo controle que incluiu amostras séricas de 57 pacientes com outras doenças consideradas no diagnóstico diferencial, e de 68 indivíduos normais. Estas provas, no entanto, não foram satisfatórias. Finalmente, um novo ELISA foi desenvolvido no presente estudo que utiliza a suspensão de antígenos “AgMc”, purificados por cromatografia de afinidade utilizando a Sepharose 4B ativada com CNBr acoplada aos anticorpos monoclonais descritos acima. Os resultados obtidos com esta prova foram comparados aos obtidos com outros testes disponíveis em nosso meio, como a SAM e o ELISA clássico (ELISA c). Este novo método, o “ELISA AgMc”, com 80,70 % e 83,33 % de sensibilidade e especifidade, respectivamente, em relação à SAM; valores preditivos positivo e negativo de 69,70% e 90,10% respectivamente e índice de concordância geral de 82,49%, não parece ser um protocolo promissor para o diagnóstico rápido na leptospirose humana. Além disso, tomando-se a SAM como diagnóstico verdadeiro, os resultados obtidos no novo teste, após a conclusão diagnóstica do grupo de pacientes com a leptospirose, mostrou uma discordância significativa. São discutidas as possíveis explicações para os resultados encontrados. / The best serological test for leptospirosis laboratory diagnosis remains the microscopic agglutination test (MAT). Because of the complexity of MAT, we have been developed some rapid screening tests for leptospiral antibodies detection in the acute phase of infection. In the decade of 80, a passive hemagglutination test employing polysaccharide fractions of leptospires was considered appropriate for early diagnosis, but its antigen preparation included “common antigens” recognized by antibodies from 4% of healthy individuals. A new ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) employing proteinase K resistant immunodominant antigens was developed and its potential diagnosis evaluated. This technique, the PK-ELISA, presented 89.9% sensitivity and 97.4% specificity, and satisfied the requeriments needed for serological screening tests of human leptospirosis. However, some of the reagents used in its antigen preparation are imported and very unstable. So, it was proposed, in a “Cooperative Research Accordance” between Instituto Adolfo Lutz and Laboratório Fleury, to try new approaches with monoclonal antibodies. Two hibridomas secreting specific monoclonal antibodies (MAb) were selected: one, against an epitope detected in 16 of 23 members of the genus Leptospira (clone A12P4) and the other, specific to the icterohaemorragiae serogroup (clone H7P1). The MAb A12P4, a G2 (IgG2B) immunoglobulin, reacted with an epitope present in the 16-18 kDa components of icterohaemorragiae serogroup and with the 75-84 kDa components of serovars copenhageni and canicola, after whole-cell lysates of the leptospires were separated by sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis. The MAb H7P1, which is an IgG, reacted with an epitope common to several fractions of molecular weight above 21 kDa of strain RGA and with the 21-22 kDa and the 75-82 kDa components of strain M-20. Both monoclonal antibodies were employed in enzyme immunoassays for detecting specific antibodies in serum samples serially colleted from 52 patients with leptospirosis, and from the control group, which consisted of sera from 57 patients with other diseases included in the differential diagnosis, and from 68 healthy individuals. These tests, however, were not satisfactory. A new ELISA was developed in the present study employing an antigen suspension “AgMc”, purified by affinity chromatography with CNBr-activated Sepharose 4B coupled to the monoclonal antibodies described above. The results obtained with this test were compared to the MAT and to the classical IgM ELISA (ELISA c). The new method, “AgMc ELISA”, presented serological indices, relatively to reference test MAT, of 80.70 % and 83.33 % of sensitivity and specificity, respectively; positive and negative predictive values of 69.70 % and 90.10 %, respectively, and general agreement index of 82.49 %. So, this test was not considered a promising approach to rapid diagnosis of human leptospirosis. Moreover, the proportion of patients diagnosed as having leptospirosis by the “AgMc ELISA” and the MAT differ significantly. The possible explanations for the results obtained are discussed.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_suselaine_de_goes_madeira.pdf: 652203 bytes, checksum: 896583af93cb2ee4488550d558cab177 (MD5) Previous issue date: 2007-12-07 / Tuberculosis, caused by Mycobacterium tuberculosis, is one of the most serious infectious illnesses in the world, being responsible for millions of deaths. Despite the use of the vaccination with M. bovis BCG, the number of new cases remains high. Immunological methods are hampered by the reaction afforded by BCG. Better diagnostic tools should allow detection and treatment of infected patients before they develop active disease. Antigens present in M. tuberculosis but absent from the vaccine strain are needed for this purpose. Therefore, this work has been developed aimed at the characterization of proteins Rv3402, Rv3404 and Rv3405, contained in RD16, missing only region M. bovis BCG Moreau, the strain vaccine used in Brazil, but present in all other strains of BCG and M. Tuberculosis. The genes rv3402, rv3404 and rv3405 were obtained by PCR from M. tuberculosis H37RV and cloned in the vector pENTR/D/Topo (Gateway System Invitrogen) and used to transform Escherichia coli TOP10F. The coding sequence for each gene was then transferred to the expression vector pDEST17, which allows the fusion of the protein with a tail of histidine, facilitating their purification. After extracted and purified, these plasmids were used to transform E. coli BL21 pLysS. The purification of the protein was performed by affinity chromatography using the ÄKTAPrime system (Amersham Biosciences). BALB/c mice were inoculated with purified proteins and serum obtained from these animals was used for characterization of the proteins by ELISA and Western blot. It was possible to demonstrate that the proteins are immunogenic and that they are expressed by M. tuberculosis. The protein contained in the RD16 and evaluated in this study, were quantified in a concentration of 0.5 mg.mL-1 for Rv3402 and Rv3404 and 0.2 mg.mL-1 for Rv3405 and were able to induce a specific and statistically significant humoral immune response in immunized mice, indicating that they can be used for the development of immunodiagnostic tests for tuberculosis, aiming to differentiate individuals vaccinated and infected with the tuberculosis bacillus. / Tuberculose, causada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis, é uma das mais graves doenças infecciosas no mundo, sendo responsável por milhões de mortes. Apesar do uso da vacinação com M. bovis BCG, o número de novos casos continua elevado. Métodos imunológicos para diagnóstico de tuberculose são limitados devido à reação cruzada desencadeada pelo BCG. Novas ferramentas diagnósticas permitiriam a detecção e tratamento de pacientes infectados antes do desenvolvimento da doença ativa, necessitando para isso antígenos presentes em M. tuberculosis, mas ausentes na cepa vacinal. Neste sentido, esse trabalho foi desenvolvido visando à caracterização das proteínas Rv3402, Rv3404 e Rv3405, contidas na RD16, região ausente apenas M. bovis BCG Moreau, a cepa vacinal utilizada no Brasil, mas presente em todas as outras cepas de BCG e em M. tuberculosis. Os genes rv3402, rv3404 e rv3405 foram obtidos por PCR a partir de M. tuberculosis H37RV e clonados no vetor pENTR/D/Topo (Gateway System - Invitrogen) e usados para transformar Escherichia Coli Top10F. A seqüência codificadora de cada gene foi então transferida para o vetor de expressão pDEST17, o qual permite a fusão da proteína com uma cauda de histidina, facilitando a sua purificação. Depois de extraídos e purificados, esses plasmídios foram usados para transformar E. coli BL21 pLysS. A purificação das proteínas foi realizada através de cromatografia de afinidade. Camundongos BALB/c foram imunizados com as proteínas purificadas e o soro obtido destes animais foi utilizado para caracterização das proteínas por Western blot e ELISA. Foi possível demonstrar que as proteínas são imunogênicas e que são expressas por M. tuberculosis. As proteínas contidas na RD16 e avaliadas nesse estudo, foram quantificadas em uma concentração de 0,5 mg.mL-1 para Rv3402 e Rv3404 e 0,2 mg.mL-1 para Rv3405 e foram capazes de induzir uma resposta imune humoral específica e estatisticamente significativa em camundongos imunizados, indicando que podem vir a ser utilizadas para o desenvolvimento de testes de imunodiagnósticos para tuberculose, visando à diferenciação entre indivíduos vacinados e infectados com o bacilo da tuberculose.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2017-06-07T14:31:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Ana Muñoz Vianna.pdf: 2420695 bytes, checksum: 23ce0fe8a151274827065f7b3c62e03a (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-06-08T13:00:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Ana Muñoz Vianna.pdf: 2420695 bytes, checksum: 23ce0fe8a151274827065f7b3c62e03a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-08T13:00:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Ana Muñoz Vianna.pdf: 2420695 bytes, checksum: 23ce0fe8a151274827065f7b3c62e03a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / A theileriose, doença endêmica no Brasil, é uma piroplasmose causada pelo protozoário intraeritrocitário, Theileria equi. Provoca perdas associadas tanto a fatores clínicos como a restrição ao trânsito de animais soropositivos. A transmissão de T. equi ocorre principalmente no repasto do carrapato, o qual inocula suas formas infectantes (esporozoítos) nos equídeos, que são os hospedeiros vertebrados. O diagnóstico e a prevenção desta enfermidade se fazem necessários em áreas endêmicas e não endêmicas devido à disseminação dos vetores e do protozoário e de sua alta prevalência. Diferentes plataformas de ELISAs têm sido desenvolvidas com a utilização de antígenos recombinantes. A proteína de superfície de merozoíto EMA-2 é liberada no citoplasma e na membrana do eritrócito, sugerindo ser um dos primeiros antígenos reconhecidos pelo sistema imune. O objetivo desse estudo foi avaliar a proteína EMA-2 de Theileria equi, expressa em Pichia pastoris, como imunobiológico. Após expressão da glicoproteína EMA-2 foi desenvolvido um ELISA indireto. O ELISA demonstrou sensibilidade de 90,9% e especificidade de 83,3% quando comparado ao kit comercial de cELISA. A proteína também demonstrou imunogenicidade ao testarmos soros de camundongos imunizados com EMA-2 recombinante, por imunofluorescência. Sendo a proteína EMA-2 antigênica e imunogênica, poderá ser usada, além dos testes de diagnóstico, como antígeno para o desenvolvimento de vacinas de subunidade. / Theileriosis, endemic disease in Brazil, is a piroplasmosis caused by intra-erythrocytic protozoan, Theileria equi. Causes losses associated with both clinical factors and restriction on the movement of positive animals. Transmission of T. equi occurs mainly during tick feeding which inoculates their infective forms (sporozoites) in horses, which are the vertebrate hosts. The diagnosis and prevention of this disease is needed in endemic and non endemic areas due to the presence of vectors and protozoa. Different ELISAs platforms have been developed using recombinant antigens. EMA-2 is released into the cytoplasm and erythrocyte membrane, suggesting that one of the first antigens recognized by the immune system. The aim of this study was to evaluate the EMA-2 protein of Theileria equi, expressed in Pichia pastoris, as immunobiological. After expression of EMA-2 glycoprotein, an indirect ELISA was developed. The ELISA demonstrated sensitivity of 90.9% and specificity of 83.3% when compared to the commercial kit cELISA. The protein also showed immunogenicity when test the sera of immunized mice with recombinant EMA-2 by immunofluorescence. As the EMA-2 protein antigenic and immunogenic, it may be used diagnostic tests as well as a promising antigen for the development of subunit vaccines.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Human strongyloidiasis is an important intestinal parasitic infection worldwide, 50% of infected individuals are asymptomatic, however it can cause hyper infection and dissemination in immunocompromised hosts leading to death. Early detection of the disease prevents the development of hyper infection and dissemination syndromes, so the use of an efficient diagnostic tool has great importance to identify and control this parasitic disease. Due to the lack of efficiency in parasitological and serological tests currently available to detect human strongyloidiasis it is necessary to improve immunodiagnostic tests using recombinant and synthetic antigens once there are limitations to obtain and use homologous antigens produced from the parasite. The aim of this study was to select using phage display technology Strongyloides stercoralis mimetic peptides ligands to immunoglobulin G from patients with strongyloidiasis. The PhDTM-C7C library was used in the selection process and the DNA of the selected clones was extracted, sequenced and analyzed using bioinformatics tools. ELISA tests were done by using five distinct phage clones, which presented significant similarity with proteins from S. stercoralis, and the two synthetic peptides corresponding to the sequences displayed on two phage clones. Binding specificity of each phage clone to the pool of sera from patients with strongyloidiasis was analyzed by competitive ELISA. Sensitivity, specificity, diagnostic efficiency, area under curve and likelihood ratio were calculated for each antigen. All phage clones presented high diagnostic potential achieving area under curves higher than 0.8, the C9 clone presented reasonable sensitivity (87.5%), specificity (80%) and diagnostic efficiency (82.5%).Synthetic peptides C10 and D3 showed superior diagnostic performance, with areas under the curve greater than 0.9 and excellent sensitivity (95%, 95%), specificity (86.3%, 92.5%) and diagnostic efficiency (89 2%, 93.3%) respectively. It was concluded that the selected peptides by Phage display can mimic S. stercoralis epitopes and represent promising alternative to the currently available antigens for human strongyloidiasis diagnosis. / Estrongiloidiase humana é uma importante parasitose intestinal em todo mundo, 50% das pessoas infectadas são assintomáticas, entretanto pode haver hiperinfecção e disseminação em pacientes imunocomprometidos, levando à morte. A detecção precoce da doença previne o desenvolvimento das síndromes de hiperinfecção e disseminação, assim, o uso de uma ferramenta diagnóstica eficiente é de grande importância para identificar e controlar esta parasitose. Devido à falta de eficiência nos testes parasitológicos e sorológicos disponíveis atualmente para detectar estrongiloidiase humana é necessário aprimorar os testes imunodiagnósticos utilizando antígenos recombinantes e sintéticos, uma vez que há limitações para obter e utilizar antígenos homólogos, produzidos a partir do parasito. O objetivo deste trabalho foi selecionar por Phage display peptídeos miméticos a Strongyloides stercoralis ligantes a imunoglobulinas G de pacientes com estrongiloidiase. Uma biblioteca PhDTM-C7C foi utilizada no processo de seleção e o DNA dos clones selecionados foi extraído, sequenciado e analisado por ferramentas de bioinformática. Os testes ELISA foram feitos utilizando cinco clones de fagos distintos, os quais tiveram similaridades significantes com proteínas de S. stercoralis, e dois peptídeos sintéticos correspondentes às sequências expressas por dois clones selecionados. A especificidade de ligação de cada clone de fago ao pool de soros de pacientes com estrongiloidiase foi analisada por ELISA de competição. Sensibilidade, especificidade, eficiência diagnóstica, áreas sob a curva e razão de verossimilhança foram calculados para cada antígeno. Todos os clones de fagos analisados apresentaram alto potencial diagnóstico alcançando área sob a curva maiores que 0,8, se destacando o clone C9 com razoável sensibilidade (87,5%), especificidade (80%) e eficiência de diagnóstica (82,5%). Os peptídeos sintéticos C10 e D3 apresentaram desempenho diagnóstico superior, com áreas sob a curva maiores que 0,9 e excelente sensibilidade (95%, 95%), especificidade (86,3%, 92,5%) e eficiência de diagnóstica (89,2%, 93,3%) respectivamente. Concluiu-se que os peptídeos selecionados por Phage display podem mimetizar epitopos de S. stercoralis e representam alternativa promissora aos antígenos atualmente disponíveis para utilização no diagnóstico da estrongiloidiase humana. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A estrongiloidíase humana é uma parasitose intestinal negligenciada com ampla distribuição mundial, podendo acarretar cronificação e hiperinfecção caso não seja diagnosticada precocemente. Os casos que merecem mais atenção são aqueles relacionados, principalmente, à pacientes imunocomprometidos. O diagnóstico parasitológico desta helmintose é pouco sensível devido a eliminação pequena e irregular de larvas nas fezes. Os métodos imunológicos, principalmente enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), apresentam elevada sensibilidade e especificidade. No entanto há sempre a necessidade de aprimorar e elevar a eficiência diagnóstica para evitar reatividade-cruzada e casos de resultados falsos-negativos. O objetivo deste estudo foi de produzir e padronizar antígenos de excreção/secreção (E/S) de larvas filarioides (L3) de Strongyloides venezuelensis para uso no imunodiagnóstico. As larvas L3 de S. venezuelensis foram obtidas para a produção de extrato salino total (SE), E/S no meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e E/S em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Todos os antígenos foram utilizados na detecção de IgG anti-S. stercoralis em doentes com e sem condições imunossupressoras. Utilizaram-se 150 amostras de soro humano, divididas em 5 grupos. Indivíduos imunocompetentes positivos para estrongiloidíase (n = 30) ou negativos para estrongiloidíase (n = 30); Pacientes com outros parasitas (n = 30), como ancilostomídeos, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis nana, Giardia lamblia, Schistosoma mansoni, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura e Taenia sp; pacientes imunossuprimidos positivos para estrongiloidíase (N = 30), incluindo HIV, diabetes, alcoólatras, tuberculose, câncer e alcoólatras com câncer e pacientes imunossuprimidos negativos para parasitas intestinais (n = 30), incluindo HIV, diabetes, alcoolistas, tuberculose e câncer. Observou-se que todos os antígenos apresentaram frações antigênicas semelhantes com peso molecular de 62, 44, 39, 33 e 18 kDa. No entanto, quando utilizados em teste ELISA os antígenos E/S tanto em meio RPMI quanto em PBS apresentaram-se mais específicos que o SE, 94,4%, 96,7% e 77,8% respectivamente, enquanto que o antígeno E/S em PBS foi mais sensível (95,0%) que os outros dois antígenos (SE 93,3% e RPMI 86,7%). Os antígenos E/S apresentaram-se de fácil execução e o produto E/S em PBS mostrou-se mais sensível e específico que os demais antígenos em estudo. Concluiu-se que, o antígeno E/S em PBS é uma boa alternativa para diagnóstico mais sensível e específico da estrongiloidíase humana. / Human strongyloidiasis is a neglected intestinal parasitosis, with a large worldwide distribution, affecting millions of people, and may lead to chronification and hyperinfection if not diagnosed early. The cases that deserve more attention are those related, mainly, to immunocompromised patients. The parasitological diagnosis of this helminth is not very sensitive due to the small and irregular larval output in the faeces. Immunological methods, especially enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), present high sensitivity and specificity, however, there is always a need to improve and increase diagnostic efficiency to avoid cross-reactivity and cases of false-negative results. The aim of this study was to produce and standardize excretion/secretion (E/S) antigens of filarial larvae (L3) of Strongyloides venezuelensis for immunodiagnostic use. The L3 larvae of S. venezuelensis were obtained for the production of total saline extract (SE), E/S in Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) and E/S in phosphate-buffered saline (PBS). All antigens were used in the detection of IgG anti- S. stercoralis in patients with and without immunosuppressive conditions. A total of 150 human serum samples were used, divided into 5 groups. Immunocompetent individuals positive for strongyloidiasis (n=30) or negatives for strongyloidiasis (n=30); patients with others parasites (n=30) such as hookworms, Ascaris lumbricoides, Hymenolepis nana, Giardia lamblia, Schistosoma mansoni, Enterobius vermicularis, Trichuris trichiura and Taenia sp; immunosuppressed patients positive for strongyloidiasis (n=30), including HIV, diabetes, alcoholics, tuberculosis, cancer, and alcoholics with cancer and negative immunosuppressed patients for intestinal parasites (n=30) including HIV, diabetes, alcoholics, tuberculosis and cancer. All antigens were observed to have similar antigenic fractions having molecular weights of 62, 44, 39, 33 and 18 kDa. However, when used in the ELISA test the E/S antigens in both RPMI and PBS media were more specific than SE, 94.4%, 96.7% and 77.8%, respectively, whereas the antigen E/S in PBS was more sensitive (95.0%) than the other two antigens (SE 93.3% and RPMI 86.7%). The E/S antigens were easy to perform and the E/S product in PBS was more sensitive and specific than the other antigens in the study. It may conclude that the E/S in PBS antigen is a good alternative for a more sensitive and specific diagnosis of human strongyloidiasis. / Dissertação (Mestrado)

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_ana_munhoz_vianna.pdf: 719262 bytes, checksum: c1b68d796b66c4c6c3d0037b6024cb3d (MD5) Previous issue date: 2011-07-25 / The equine piroplasmosis caused by Theileria equi is considered one of the most important equine diseases in both tropical and subtropical countries. Theileriosis is endemic in Brazil and causes significant economic losses for equine breeders. Disease-free countries restrict horse transit coming from endemic areas due to the high prevalence of asymptomatic carrier animals. In order to prevent and control this disease, it is therefore necessary to develop efficient diagnostic methods. Previous Theileria equi immunological diagnostic studies have been based in outer membrane antigens. Equi merozoite antigen (EMA) is a major outer membrane antigen of this protozoan, recognized by antibodies of Theileria equi positive horses. In this study, we reported the expression, purification and characterization of EMA-2 protein of Theileria equi in the yeast Pichia pastoris. The EMA-2 gene was cloned into the expression vector pPICZαB and the expressed protein was secreted to the medium as a soluble form. The expression and antigenicity of rEMA-2 protein was demonstrated by Dot and Western Blotting, using anti-histidine and equine Theileriosis clinically positive antibodies. An indirect ELISA with the rEMA-2 was performed and it was possible to differentiate with more than a threefold difference between negative and positive serum from horses confirmed with Theileriosis. The data obtained in this work suggest that the rEMA-2 protein expressed in P. pastoris is a potential candidate for use as antigen in immunodiagnostic of T. equi. / A Piroplasmose equina causada por Theileria equi é considerada uma das mais importantes doenças dos equinos em regiões tropicais e subtropicais. Acomete os equinos de forma endêmica no Brasil levando a significativas perdas econômicas. Países livres da doença não permitem a entrada de animais provindos de regiões endêmicas devido à alta prevalência de animais assintomáticos. Para controle e prevenção desta enfermidade se faz necessário desenvolvimento de métodos de diagnóstico eficazes. Os estudos sobre o diagnóstico imunológico para Theileriose concentram-se em antígenos da membrana externa. O principal antígeno da membrana externa deste protozoário, Equi Antígeno Merozoite (EMA) é reconhecido por anticorpos de cavalos positivos para Theileria equi. Neste estudo reportamos a expressão, purificação e a caracterização da proteína EMA-2 de Theileria equi na levedura Pichia pastoris. O gene EMA-2 foi clonado no vetor de expressão pPICZαB sendo a proteína expressa, secretada de forma solúvel ao meio. A expressão e antigenicidade da proteína rEMA-2 foi demonstrado por Dot e Western Blotting utilizando-se anti-histidina e anticorpos de equinos clinicamente positivos para Theileriose. Um ELISA indireto com rEMA-2 foi realizado e foi possível determinar uma diferença de mais de três vezes entre os soros de equinos confirmados como positivos e negativos para Theileriose. Com os dados obtidos neste trabalho podemos sugerir que a proteína rEMA-2 é um potencial candidato para ser utilizado como antígeno em imunodiagnóstico de T. equi.

A estrongiloidíase é a infecção parasitária causada pelo nematódeo Strongyloides stercoralis. O diagnóstico definitivo é realizado pela visualização de larvas, principalmente nas fezes. Porém as técnicas parasitológicas têm baixa sensibilidade. As técnicas sorológicas apresentam-se como importante alternativa diagnóstica. Pesquisas apontam para a utilização de antígenos heterólogos solúveis, principalmente de Strongyloides venezuelensis. A identificação e caracterização dos antígenos de membrana podem fornecer fonte alternativa de antígenos e assim auxiliar o desenvolvimento das técnicas imunológicas. O presente trabalho teve como objetivo a avaliação das técnicas ELISA e WB frente a diferentes frações antigênicas de larvas filarioides de S. venezuelensis. Foram utilizadas amostras de sangue e fezes de 92 indivíduos, 20 indivíduos com estrongiloidíase (grupo I), 32 indivíduos com outras parasitoses (grupo II) e 40 indivíduos negativos (grupo III) pelos métodos de Lutz, cultura em placa de ágar e Rugai. Para preparação dos antígenos foram utilizadas larvas infectantes obtidas a partir de ratos infectados experimentalmente com S. venezuelensis. Seis frações antigênicas foram preparadas: frações salinas solúveis e de membrana (PBS 0,01M pH 7,2 e SDS 1%, SS e MS; Tris-HCl 25mM pH 7,5 e CHAPS 1%, ST e MT, respectivamente) e frações alcalinas solúvel e de membrana (NaOH 0,15M e SDS 1%, SA e MA, respectivamente). Para a técnica ELISA foram utilizadas placas sensibilizadas com 10ug/mL de antígeno, soro dos indivíduos diluídos 1:200 em PBS 0,05% Tween 3% de leite (PBSTM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em PBSTM. As amostras foram consideradas positivas quando o Índice ELISA foi maior que 1. Para a técnica de WB os soros foram diluídos 1:100 em Tris-HCl 5% de leite (TM) e o conjugado (anti IgG-humana peroxidase) em TM. Após as técnicas sorológicas foram determinadas os parâmetros de diagnóstico pela curva ROC como sensibilidade (SE), especificidade (ES), Likelihood ratio (LR) além da determinação da acurácia diagnóstica (AC) e do índice Kappa (k). A técnica ELISA destacou as frações de membrana com melhor desempenho em relação aos parêmetros diagnósticos estudados (SE 95%, ES 94,4%, AC 94,8%, LR 17,1, k 0,848). O WB revelou componentes antigênicos imunodominantes variando de 260-10kDa, mas destacam-se as frações de 40-35kDa mais frequentes em todas frações antigênicas. Pela técnica de WB, a fração ST apresentou melhor desempenho em relação aos parêmetros diagnósticos estudados (SE 100%, ES 93,1%, AC 94,5, LR 14,4,k 0,854). A utilização das frações de membrana no imunodiagnóstico da estrongiloidíase humana torna-se fonte acessível e eficaz em relação às frações purificadas, não necessitando de gastos complementares para sua obtenção / Strongyloidiasis is a parasitic infection caused by a nematode Strongyloides stercoralis. The definitive diagnosis is made by the larvae visualization in stool samples. However parasitological techniques have low sensitivity. Serological techniques became as suitable diagnostic alternative. Research indicates for the soluble heterologous antigen utilization, mainly Strongyloides venezuelensis. Identification and characterization of membrane antigen may constitute an alternative source of antigen and then assist the development of serological techniques. The aim of this study was evaluate ELISA and WB techniques behind different antigenic fractions of S. venezuelensis´ infective larvae. A total of 92 serum and stool samples was analyzed, 20 from individuals with strongyloidisis (group 1), 32 with other parasitic diseases (group 2) and 40 from individuals with negative coproparasitology (group 3) using Lutz, agar plate culture and Rugai methods. For the antigen preparation infective larvae of S. venezuelensis from experimental infected rats were employed. Six antigenic fractions were prepareted: saline soluble and from membrane fractions (0.01M PBS pH 7.2, and 1% SDS, SS and MS; 25mM Tris-HCl pH 7.5, 1% CHAPS, MT and ST, respectively) and alkaline soluble and membrane fractions (0.15 M NaOH and 1% SDS, SA and MA, respectively). For ELISA technique, plates were sensitized with 10 ug/mL of antigen, serum samples were diluted 1:200 in 0.05% Tween in PBS 3% milk (PBSTM) and conjugate (anti-human IgG peroxidase) in PBSTM. Positive samples were considered when ELISA index was greater than 1. To WB technique, serum samples were diluted 1:100 in Tris-HCl 5% milk (TM) and conjugate (anti-human IgG peroxidase) in the TM. After serological techniques diagnostics parameters were determined by ROC curve how sensitivity (SE), specificity (ES), Likelihood ratio (LR) and determination of diagnostic accuracy (AC) and Kappa (k) index. ELISA technique highlighted the membrane fractions with better performance compared to parameters diagnoses studied (95% SE, 94.4% ES, 94.8% AC, 17.1 LR, 0.848 k). The WB revealed immunodominant antigenic components ranging from 260-10kDa, but there are the fractions of 40-35kDa more frequent in all antigenic fractions. WB technique showed ST fraction better performance in relation to the diagnostic parameters (100% SE, 93.1% ES, 94.5% AC, 14.4 LR, 0.854 k). Membrane fractions in the immunodiagnosis of human strongyloidiasis become an accessible and effective source of antigens in relation to the purified fractions, requiring no additional expense to obtain it