Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Light and ultraestructural changes of central and peripheral nervous system lesions in mice KO for connexin-32 and submitted to the ethidium bromide gliotoxic demyelinating model are described. Their KO condition was tested with PCR and a negative connexin-32 labelling was performed by immunofluorescence. The experimental animals were C57BL/6 normal mice and C57BL/6 KO for connexin-32. For all groups the animals were maintained in cages of 5 individuals within a temperature controlled room and had ration and filtered water ad libitum. A single local injection of either 0,1% ethidium bromide in normal saline (5 μl in the brainstem and 1 μl in the sciatic nerve) or normal saline was performed as described for Wistar rats. The injected mice were observed daily until euthanasia was performed at 24, 48 hours and 3, 7, 15, 21 and 30 days after injection. The mice were perfused through the heart with either neutral 10% formalin or 2,5% glutaraldehyde. Histochemical, immunohistochemical, immunofluorescence and transmission electron microscopic methods were used to analyze the development of the lesions after differentiated processing. Hematoxylin- eosine, luxol fast blue and toluidine blue methods and immunolabelling with anti-GFAP, anti-CNPase, anti-S100 protein and anti-OSP, anti Cx32 and anti Cx43 antibodies were used. Within the CNS the lesions showed an acute degenerative phase with disappearance of glial cells, and myelin sheaths were withdrawn by a scant number of macrophages. In KO mice some granulocytes were detected within the lesions in tight contact with decaying myelin sheaths. Remyelination was carried out by oligodendrocytes since no Schwann cells were seen during the regenerating process of KO mice. Occasional remyelinating Scwann cells were seen in normal mice. For the sciatic nerves, Schwann cells initially showed signs of intoxication and rejected their sheaths; after seven days, some thin newly formed myelin sheaths with uneven compaction and redundant loops (tomacula) were conspicuous. Mast cells degranulated or not were seen in all BE- induced lesions and after saline injection. It is concluded that the repair of the CNS demyelinated lesions differs from the observed in normal and immunosupressed rats because Schwann cells remyelination was absent; the absence of connexin-32 may have caused that absence. The regeneration of lost myelin sheaths within the PNS followed the pattern already reported for this model in other species. It is suggested that the absence of connexin-32 determined the different repair of the myelin sheaths within the CNS whereas for the PNS, the normal pattern of tissue response might be due to the early age of the injected mice. / São descritas as alterações de microscopia de luz e ultra-estruturais induzidas pelo brometo de etídio no sistema nervoso central e periférico de camundongos KO para conexina 32. O genótipo KO foi testado por PCR e confirmado por imunofluorescência negativa para conexina 32. Os animais dos experimentos foram camundongos C57BL-6 normais (controles) e KO para conexina 32. Todos os camundongos foram mantidos em gaiolas de 5 indivíduos em sala climatizada e receberam ração e água à vontade. Uma única injeção de BE 0,1% em salina 0,9% ou de salina 0,9% (5 μl na cisterna basal e 1μl no nervo ciático) foi realizada como descrita em ratos Wistar. Os camundongos eram observados diariamente até ser realizada a eutanásia às 24 e 48 h, 3, 7, 15, 21 e 30 dias após a injeção. Os camundongos foram perfundidos através do coração; um grupo com glutaraldeído 2,5% visando o processamento para microscopia eletrônica; um outro grupo com solução salina com EDTA e posterior fixação em metacarn para inclusão em parafina. As amostras incluídas em parafina foram analisadas através dos métodos de hematoxilina e eosina, luxol fast blue e azul de toluidina. Foram realizadas imunoistoquímica e imunofluorescência visando a marcação de GFAP, CNPase, OSP, S100, e Cx43 e Cx32, respectivamente. As lesões do SNC eram discretas e tiveram uma fase ativa com desaparecimento das células gliais; os debris celulares e de mielina foram retirados por um reduzido número de fagócitos. Nos camundongos KO foram vistos granulócitos em estreito contato com bainhas de mielina em degradação. A remielinização dos axônios desmielinizados foi realizada exclusivamente por oligodendrócitos nos camundongos KO; nos camundongos normais, ocasionais células de Schwann podiam ser encontradas remielinizando axônios do SNC. No nervo ciático, as células de Schwann intoxicadas rejeitaram seus internodos de mielina; após sete dias, finas bainhas reparadas eram encontradas, com compactação irregular da mielina e alças redundantes (tomacula). Mastócitos, desgranulados ou não, eram vistos nas lesões do BE e após a injeção de solução salina. Conclui-se que o reparo das lesões do SNC difere do observado em ratos normais e imunossuprimidos devido à ausência de remielinização por células de Schwann; a falta de expressão da Cx 32 e o tamanho reduzido das lesões podem ter contribuído para essa ausência. A regeneração das bainhas perdidas no SNP obedeceu ao padrão descrito para esse modelo em outras espécies. Sugere-se que a ausência da Cx 32 não afetou o reparo do SNP devido à idade precoce dos animais.

Introdução: Aneurisma de aorta é considerado uma doença inflamatória crônica, mas ainda é controverso se está relacionado a aterosclerose aos agentes infecciosos. Antígenos de Chlamydophila pneumoniae (CP) e Mycoplasma pneumoniae (MP) foram encontrados em grande quantidade nas placas instáveis que usualmente estão associadas a remodelamento positivo e inflamação do vaso. Metaloproteinase da matriz 9 (MMP-9) está implicada na fragilidade da parede vascular e na formação dos aneurismas. Os efeitos imunomodulatórios dos receptores ativados por proliferador de peroxissomo (PPARs) têm sido relacionados à aterosclerose. Objetivos: Comparar lesões ateroscleróticas graves com e sem aneurisma do ponto de vista inflamatório e infeccioso, analisando antígenos de MP e CP e expressão de MMP-9, TIMP-1 e PPARs. Métodos: No presente estudo quantificamos, através da técnica de imunoistoquímica, antígenos de MMP- 9, TIMP-1, PPARs a e , e dos agentes infecciosos CP e MP em fragmentos de aorta ateroscleróticos com aneurisma (n=14) e sem aneurisma (n=14). Resultados: A adventícia e o tecido adiposo periadventicial (TAP) dos aneurismas apresentaram intensa inflamação. Expressão de MMP-9 esteve aumentada no TAP e agentes infecciosos, TIMP-1 e PPAR a estiveram aumentados na adventícia e no TAP, sem diferença em relação a expressão de PPAR . Colágeno, TIMP-1 e PPARs estiveram positivamente correlacionados no grupo com aterosclerose, mas não no grupo com aneurisma. Conclusão: Nossos achados sugerem que aneurisma de aorta é uma complicação das lesões ateroscleróticas. Quantidade aumentada de Chlamydophila pneumoniae e Mycoplasma pneumoniae na adventícia e PAT sem correlação da resposta de TIMP-1 e PPARs são achados que estão associados com a presença de aneurisma nos segmentos de aorta ateroscleróticos / Introduction: Aortic aneurysm is considered a chronic inflammatory disease, but remains a controversial matter if it is related to atherosclerosis and infectious agents. Chlamydophila pneumoniae (CP) and Mycoplasma pneumoniae (MP) antigens were found in higher amount in unstable plaques that are usually associated to positive remodeling and vessel inflammation. Matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) has been implicated in vascular wall fragility and aneurysm development. The immunemodulator effects of peroxisome proliferators - activated receptor (PPARs) have been related to atherosclerosis. Objectives: To compare severe atherosclerotic lesions with and without aneurysms by inflammatory and infectious point of view, analyzing MP and CP, MMP-9, TIMP-1 and PPARs antigens. Methods: In the present study we quantified, using immunohistochemistry technique, MMP-9, TIMP-1, PPAR a and and infectious agents CP and MP antigens in aortic atherosclerotic fragments with aneurysms. (n=14) and without aneurysms (n=14). Results: Adventitia and periadventitial adipose tissue (PAT) from aneurysms showed intense inflammation. MMP-9 expression has increased in PAT and the infectious agents, TIMP-1 and PPAR a were increased in adventitia and PAT in aneurysmatic group, without difference related to PPAR expression. Collagen, TIMP-1 and PPARs were positively correlated in atherosclerotic group, but it was not observed in aneurysmatic group. Conclusion: Our data have suggested that aortic aneurysm is a complication of aortic atherosclerotic lesions. Increased amount of Chlamydophila pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae in the adventitia and PAT without a correlated TIMP-1 and PPARs response are findings that were associated with the presence of aneurysm in atherosclerotic aortic segments

INTRODUÇÃO: A síndrome de prune belly (PBS) é caracterizada por uma tríade com flacidez da parede abdominal, criptorquidia bilateral e malformações do trato urinário que compreende bexiga de capacidade aumentada, com complacência elevada, hipossensibilidade, hipocontratilidade, com divertículo ou fístula uracal e resíduo pós-miccional elevado. Alguns autores recomendam tratamento clínico, porém outros propõe correção cirúrgica, com reconstrução da via urinária incluindo ureteroplastia e cistoplastia redutoras, orquidopexia e abdominoplastia. Mesmo após a cirurgia, alguns doentes necessitam de cateterismo limpo intermitente. A inervação vesical determina seu funcionamento, mediado por neuroreceptores na junção neuromuscular. Os adrenoreceptores a1 estão relacionados à contratilidade detrusora e o b3 ao seu relaxamento, e certas condições como obstrução infravesical levam à hiperexpressão de receptores a1. O objetivo da presente pesquisa é verificar se no detrusor de doentes com PBS há alteração na densidade de terminações nervosas, hiper ou hipoexpressão de receptores adrenérgicos a1a, a1b, a1d e b3 e proporção anormal dos tecidos muscular e conectivo. MÉTODO Trata-se de estudo retrospectivo de caso-controle que envolveu 14 espécimes de detrusor de doentes com PBS operados entre 1985 a 2005 no Hospital das Clínicas da FMUSP. Dois grupos foram constituídos como controle: 13 fragmentos de bexiga de doentes submetidos à prostatectomia radical no Departamento de Urologia da Universidade de Mainz, com urodinâmica pré-operatória normal (GC1), e cinco fragmentos de bexiga de crianças submetidas à necrópsia no SVOC-USP, sem anomalias neurológicas e de trato urinário. A coloração de van Gieson foi realizada para análise da proporção músculo/tecido conectivo, e a reação imunohistoquímica para os anticorpos policlonais anti-proteína S100 e antiadrenoreceptores a1a, a1b, a1d e b3. A coloração castanho foi considerada evidência da expressão do adrenoreceptor na célula. Cinco a dez imagens digitais foram tomadas por meio de câmara digital e microscopia óptica. Estas foram analisadas pelo programa Adobe Photoshop CS2Ò. A quantidade relativa de receptores foi calculada e a análise estatística realizada pelos testes Kruskal-Wallis e Mann-Whitney. RESULTADOS A média de idade foi de 1,28 ± 1,14 ano no grupo caso (PBS), e de 64 ± 5,22 anos e 1,41 ± 1,11 ano, nos grupos GC1 e GC2, respectivamente. A mediana da relação músculo/tecido conectivo foi de 1,08 para o grupo PBS, 1,59 para o GC1 e para o GC2 de 1,28 (p=0,173). A mediana da proporção S100/tecido muscular foi de 0,21 para o grupo caso (PBS), de 0,20 para o GC1 e para o grupo GC2 de 0,01 (p=0,003). A mediana da relação a1a/tecido muscular foi de 0,06 para o grupo PBS, de 0,16 para o GC1 e para o grupo GC2 de 0,14 (p=0,026). Para a1b, as medianas foram 0,06 no grupo PBS, 0,006 no GC1 e 0,007 no GC2 (p=0,781). No a1d, as medianas foram 0,04 (PBS), 0,04 (GC1) e 0,05 (GC2) (p=0,618). Com relação ao b3, as medianas foram 0,07 no grupo PBS, 0,14 no GC1 e 0,10 no GC2 (p=0,378). CONCLUSÕES Comparando-se fragmentos de detrusor de doentes com PBS e bexigas normais não se observou alteração na densidade de terminações nervosas. Observou-se hipoexpressão do adrenoreceptor a1a, e não houve alteração dos adrenoreceptores a1b, a1d e b3. Também não se observou alteração entre a proporção de tecido muscular e conectivo no detrusor destes doentes. Investigações adicionais, com diferentes métodos e incluindo outros receptores, são necessárias antes de se aplicar esses conhecimentos na prática clínica. / INTRODUCTION: Prune belly syndrome (PBS) is charactherized by a triad of abdominal wall flaccidity, bilateral criptorchidism and urinary tract malformation, that includes a large-capacity bladder, with high detrusor compliance, low sensibility and contractility, associated to urachal diverticulum or fistula and elevated post void residual volumes. Some autors recommend clinical treatment, but others propose surgery correction, with urinary tract reconstruction, including reductive ureteroplasty and cystoplasty, orchidopexy and abdominoplasty. Even after surgery, some patients need intermittent catheterism. The detrusor innervation determines its function, mediated by neuroceptors at the neuromuscular junction. The a1 adrenoceptors are related to detrusor contractility and b3 to relaxation, and some conditions, like infravesical obstruction, lead to a1 adrenoceptor up-regulation. The objective of this work is to verify whether, in the detrusor from patients with PBS, there is altered nerve density, up or down-regulation of a1a, a1b, a1d and b3 adrenergic receptors and if there is an abnormal proportion between muscle and connective tissue. MATERIALS AND METHODS A retrospective case-control study was performed involving 14 detrusor specimens from patients with PBS, who underwent surgical treatment between 1985 an 2005 at University of São Paulo, Medical School Hospital. Two groups were taken as control: 13 bladder fragments from patients who underwent radical prostatectomy at Department of Urology of Mainz University, with normal urodynamic study prior to the surgery (GC1) and 5 bladder fragments from children submitted to autopsy at SVOC-USP, with no neurological or urinary tract malformation (GC2). Staining was performed using the van Gieson dye to analyse the proportion between muscle and connective tissue, and immunohistochemical reaction was employed, with polyclonal antibodies against S100 protein, as well as a1a, a1b, a1d and b3 adrenoceptors. Brown colour was considered as evidence of adrenoceptor cell expression. Five to ten digital images were captured on an optic microscope with a digital camera. These images were analysed with Adobe Photoshop CS2Ò software. The relative quantity of receptors was calculated and the statistic analysis was done with the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests. RESULTS Mean age was 1.28 ± 1.14 year in PBS patients, and 64 ± 5.22 yrs. and 1.41 ± 1.11 yrs. in GC1 and GC2, respectively. The median proportion between muscle and connective tissue was 1.08 in PBS, 1.59 in GC1 and in GC2 of 1.28 (p=0.173). The median proportion of S100/muscle area was 0.21 in PBS, 0.20 in GC1 and in GC2 of 0.01 (p=0.003). The median relative quantity of receptors of a1a was 0.06 in PBS, 0.16 in GC1 and 0.14 in GC2 (p=0.026). In a1b, the median values were 0.06 in PBS group, 0.006 in GC1 and 0.007 in GC2 (p=0.781). In a1d, the median values were 0.04 (PBS), 0.04 (GC1) and 0.05 (GC2) (p=0.618). Regarding b3, the median values were 0.07 in PBS, 0.14 in GC1 and 0.10 in GC2 (p=0.378). CONCLUSION Comparing detrusor fragments from patients with PBS and normal bladders, there was no alteration in the density of nerve endings. We observed downregulation of a1a adrenoceptors, but no alteration in the a1b, a1d and b3 receptors. Furthermore, there was no alteration of the proportion between muscle and connective tissue areas. Further investigations, with different methods and including other receptors, are necessary to transfer this knowledge to clinical use.

O objetivo deste trabalho foi caracterizar a formação e progressão de lesões periapicais induzidas experimentalmente em dentes de camundongos knockout para receptores toll-like 2 (TLR2 KO) comparados a animais wild-type (WT). As lesões periapicais foram induzidas nos primeiros molares inferiores de 28 camundongos WT e de 27 camundongos TLR2 KO. Decorridos 7, 21 e 42 dias da indução da lesão periapical, os animais foram submetidos à eutanásia em câmara de CO2, as mandíbulas foram removidas e submetidas ao processamento histotécnico. A seguir, cortes representativos foram corados com hematoxilina e eosina (HE), para descrição do tecido pulpar e das regiões apical e periapical, em microscopia óptica convencional, e mensuração da área das lesões periapicais, em microscopia de fluorescência. Espécimes sequenciais foram avaliados por meio de: histoenzimologia para a atividade da TRAP, para identificação de osteoclastos; coloração de Brown & Brenn, para localização de bactérias; e imunoistoquímica, para identificação de marcadores da osteoclastogênese (RANK, RANKL, OPG). Os resultados numéricos obtidos da análise morfométrica da extensão da área das lesões periapicais e do número de osteoclastos foram submetidos à análise estatística por meio dos testes não-paramétricos de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis, utilizando o software SAS (Statistical Analysis System) for Windows versão 9.1.3. O nível de significância adotado foi de 5%. Os resultados da coloração de Brown & Brenn e Imunoistoquímica foram expressos de maneira qualitativa. O grupo de animais WT apresentou diferença significante na extensão da área das lesões periapicais e no número de osteoclastos entre os períodos experimentais de 7 e 42 dias (p<0,05) e entre 21 e 42 dias (p<0.05). Por outro lado, no grupo de animais TLR2 KO, as diferenças para a extensão da área das lesões periapicais e número de osteoclastos foram encontradas entre os períodos experimentais de 7 e 21 dias (p<0,05) e entre 7 e 42 dias (p<0,05). Quando os períodos dos grupos foram comparados entre si, foram encontradas diferenças estatísticas entre todos os períodos experimentais, tanto para a análise morfométrica da extensão da área das lesões periapicais, quanto para o número de ostoclastos (p<0,05). A análise descritiva do tecido pulpar e das regiões apical e periapical, por meio da coloração de HE, bem como da localização das bactérias, por meio da coloração de Brown & Brenn, não mostrou diferenças entre os dois grupos de animais. Com relação à Imunoistoquímica, as marcações foram semelhantes entre os dois grupos de animais, exceto para as marcações de RANK, as quais não foram encontradas nas lesões periapicais do grupo de animais TLR2 KO. A partir das metodologias empregadas e dos resultados obtidos pode-se concluir que na ausência do TLR2, os animais desenvolveram lesões periapicais significantemente maiores (com maior presença de osteoclastos) quando comparados aos animais WT, sugerindo o importante papel desse receptor na resposta imune e inflamatória do organismo no sentido de combater a infecção do sistema de canais radiculares e dos tecidos perirradiculares. / The aim of the present study was to characterize the formation and progression of periapical lesions experimentally induced in the teeth of toll-like receptors 2 knockout (TLR2 KO) mice compared to wild-type (WT) mice. Periapical lesions were induced in the lower first molars of 28 WT and 27 TLR2 KO mice. After 7, 21 and 42 of periapical lesion induction, the animals were euthanized in a CO2 chamber, and the mandibles were removed and subjected to histotechnical processing. Representative histological sections were stained with hematoxylin and eosin (HE) for description of the features of the pulp tissue and the apical and periapical regions under conventional optical microscopy, and for determination of the size of the periapical lesions under fluorescence microscopy. Sequential specimens were evaluated by: TRAP histo-enzymology for identification de osteoclasts; Brown & Brenn staining for localization of bacteria; and immunohistochemistry for identification of osteoclastogenesis markers (RANK, RANKL, OPG). Data from the morphometric evaluation of the size of periapical lesions and the number of osteoclasts were subjected to statistical analysis by the nonparametric Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests, using the SAS (Statistical Analysis System) software for Windows version 9.1.3. A significance level of 5% was set for all analyses. Data from the Brown & Brenn staining and immunohistochemical analysis were displayed qualitatively. The group of WT mice presented statistically significant difference in the periapical lesion size and number of osteoclasts between the 7- and 42-day experimental periods (p<0.05) as well as between 21 and 42 days (p<0.05). On the other hand, in the group of TLR2 KO mice, significant differences in the periapical lesion size and number of osteoclasts were found between the 7- and 21-day experimental periods (p<0.05) as well as between 7 and 42 days (p<0.05). Comparison of the periods within each group revealed statistically significant differences among all experimental periods for the morphometric evaluation of the size of the periapical lesions and number of osteoclasts (p<0.05). Descriptive analysis of pulp tissue and apical and periapical regions by HE staining and localization of bacteria by Brown & Brenn staining did not show significant differences between the two groups of animals. The immunohistochemical results showed similar immunostaining in both groups of animals, except for RANK expression, which was not observed in the periapical lesions of the TLR2 KO mice. Based on the employed methodology and the obtained results it may be concluded that in the silence of TLR2, the animals developed superior size of periapical lesions (with higher presence of osteoclasts) compared to WT animals, suggesting the important role of this receptor during the immune and inflammatory response against the infection of root canal system and periapical tissues.

O colágeno V vem emergindo como um potente indutor de morte celular (apoptose) via caspase. Nosso objetivo, neste estudo, foi examinar a interface entre o colágeno dos tipos I, III e V, apoptose tumoral e endotelial, angiogênese e células imunes, assim como o impacto desses fatores no prognóstico de pacientes com carcinomas não de pequenas células (CNPC) de pulmão. As amostras foram obtidas de 65 pacientes com CNPC de pulmão cirurgicamente excisados. Foram utilizados imunofluorescência e histomorfometria para colágenos I, III e V; imunohistoquímica e histomorfometria para avaliar apoptose endotelial e epitelial pelas caspases 5, 6, 8, 9 e via TUNEL, antiapoptose pela expressão do Bcl-2 e Bcl-6, densidade microvascular utilizando CD34, atividade vascular através da endotelina, VCAM e CD54, além da laminina. As células imunes foram imunomarcadas pelo CD3, CD4, CD8, CD20, CD56 Cd1a, S100, CD68 e as seguintes citocinas foram quantificadas: IL-4, IL-6, IL-8 e TGF-. O modelo de sobrevida de Cox mostrou que, quando controlados pelo estadiamento patológico linfonodal N, somente o colágeno do tipo V e a apoptose endotelial via caspase-9 foram significativamente associados com a sobrevida. Uma medida de corte ao nível da mediana para o colágeno do tipo V e caspase-9 dividiu os pacientes em dois grupos distintos de prognóstico. Aqueles com colágeno V maior do que 9,40% e apoptose vascular maior que 1,09% apresentaram baixo risco de morte (0,27 e 0,41, respectivamente), comparados com aqueles com colágeno V inferior a 9,40% e apoptose vascular inferior a 1,09%. Foi observada também menor densidade de células imunes e citocinas no microambiente tumoral do que não tumoral. O modelo de sobrevida de Cox, associando todas as variáveis estudadas, mostrou que baixo risco de morte associou-se com tabagismo menor que 41 maços/ano, estadiamento linfonodal N0, tratamento cirúrgico, ao tipo histológico carcinoma de células escamosas, fração de linfócitos CD4 > 16,2%, macrófagos CD68 > 4,5%, citocina IL-4 > 0,8%, citocina IL-6 > 2,2%, células dendríticas Cd1a > 1,6% e colágeno V > 9,4%. Coletivamente, os dados indicaram que o CNPC de pulmão não desencadeou uma resposta imune efetiva no sítio tumoral. Além disso, baixa síntese no colágeno V e apoptose endotelial pela caspase-9 em CNPC de pulmão estão fortemente associadas à sobrevida, sugerindo que estratégias destinadas a prevenir a baixa síntese de colágeno V, baixos índices de apoptose e resposta imune inata e adaptativa têm impacto no prognóstico dos CNPC de pulmão e podem ser marcadores promissores em novas abordagens na imunoterapia, podendo, assim, ter grande impacto no tratamento do câncer de pulmão / Type V collagen emerging promise as inductor of death response (apoptosis) via caspase. Our aim was to verify the remodeling of the microenvironment by type V collagen, tumoral/vascular apoptosis, angiogenesis, immune response and their impact on prognosis of patients with non-small cell lung carcinomas (NSCLC). Collagen, apoptosis, angiogenesis and immune cells were examined in tumor tissues from 65 patients with surgically excised NSCLC. We used immunofluoresce, immunohistochemistry, morphometry, 3D reconstruction and real-time PCR to evaluate the amount, structure and mRNA chains expression of type V collagen, endothelium and epithelial apoptosis caspases 5, 6, 8, 9 and via TUNEL; anti-apoptotic expression Bcl-2 and Bcl-6; immune cells CD3, CD4, CD8, CD20, CD56 Cd1a, S100 and CD68 and IL-4, IL-6, IL-8 e TGF- cytokines; microvessel density (CD34) and vascular activity by endotelin, V-CAM and Cd54. Impact of these markers was tested on follow-up until death from recurrent lung cancer. Decreased and abnormal synthesis of collagen V leads to increased angiogenesis by low endothelial death rate, and low immune response. Cox model analysis demonstrated that controlled for N stage, just two variables were significantly associated with survival time: collagen V and endothelium apoptosis caspase 9 +. Once these two variables were accounted for, none of the others related to survival. A cutpoint at the median for collagen V and endothelium apoptosis caspase 9 divided patients into two groups with distinctive prognosis. Those with collagen V > 9.40% and endothelium apoptosis caspase 9 > 1.09% have low risk of death (0.27 and 0.41, respectively) than those with collagen V < 9.40% and endothelium apoptosis caspase 9 + < 1.09%.In addition low levels of immune cells and cytokines in the tumour environment when compared with non-tumour environment. Cox model analysis with all variables showed low risk of death for tabagism < 41 packs/year, N0 stage, SCC, CD4+ > 16.81%,macrophages/monocytes > 4.5%cytokine IL-4 > 0,8%, cytokines IL-6 > 2,2%, dendritic cells Cd1a > 1,6% and collagen V > 9,4%. Collectively, the data indicated that NSCLC did not trigger a substantive immune cell infiltrate at tumour sites. More over Collagen V and endothelium apoptosis caspase 9 + in resected NSCLC are strongly related to prognosis, suggesting that strategies aimed at preventing the low collagen V synthesis, or local responses to low endothelium apoptosis and immune cell infiltration has impact on NSCLC prognosis and may be a promising marker for new immunotherapeutic approaches and may have a greater impact in lung cancer

Hemangiopericitomas (CHP) assim como schwanomas são neoplasias cutâneas de origem mesenquimal, sendo os hemangiopericitomas freqüentemente relatados em cães, ao contrário dos neurofibromas que são mais raros nos mesmos. Relata-se que o CHP origina-se de pericitos, ou células que se localizam ao redor de vasos sanguíneos. São observadas mais freqüentemente nos membros, como massas, bem circunscritas, firmes e grandes. Os hemangiopericitomas têm características histológicas comuns aos schwanomas (neurofibromas), sugerindo uma possível semelhante histogênese. Na realidade, na experiência deste Serviço de Anatomia Patológica, o diagnóstico diferencial entre hemangiopericitomas e neurofibromas apenas com base na morfologia é bastante difícil. O aspecto histopatológico do hemangiopericitoma e schwanoma correspondem à presença de agrupamentos celulares na forma de espiral pericapilar ou não respectivamente. Na tentativa de melhor caracterizar os hemangiopericitomas e distinguí-los de outros tumores mesenquimais, principalmente dos neurofibromas, propõe-se a caracterização histológica, epidemiológica e imunoistoquímica, dos hemangiopericitomas em animais da espécie canina. Com este, espera-se refinar o diagnóstico diferencial destes tumores, por tratar-se de neoplasias pouco e mal diagnosticadas devido à dificuldade de caracterizá-las morfologicamente. Procura-se estudar também, a proliferação celular nos três subtipos histológicos dos CHP e contagem dos critérios morfológicos de malignidade, correlacionando com o prognóstico clínico. Para isto, o presente estudo propôs realizar um levantamento criterioso dos casos de hemangiopericitomas e neurofibromas e/ou neurofibrossarcomas em cães nos Arquivos do Serviço de Necroscopia do Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ/USP) durante o período de 1990 a 2003, reclassificando histologicamente estas neoplasias e graduando os subtipos dos CHP. Os resultados apontaram um total de 77 casos de CHP dos quais o subtipo perivascular correspondeu (35/77casos); o estoriforme (20/77) e o epitelióide (22/77).As conclusões da imunoistoquímica para tipo perivascular (HPV) revelam positividade de 100% para F8; 60% para S100; 100% para vimentina; 7% para GFAP e 0% para CD34 e citoqueratina. O tipo estoriforme (HES) revelou 70% de positividade para F8; 50% para S100; 100% para vimentina; 0% para citoqueratina e GFAP; 10% para CD34. Destaca-se para o epitelióide (HEP) 70% de positividade para o F8; 40 % para o S100; 90% para vimentina; 0% para citoqueratina; GFAP e CD34. A contagem estatística dos critérios de malignidade como PCNA (CL3); índice mitótico (CL1); índice apoptótico (CL4); células multinucleadas (CL0) revelaram nos subseqüentes (HPV, HE, HEP) subtipos de CHP, respectivamente: CL0 (6.135&plusmn;4.038; 5.067&plusmn;3.019; 11.217&plusmn;5.729); CL1 (6.155&plusmn;2.380; 7.545&plusmn;1.941; 12.540&plusmn;8.629); CL3 (30.042&plusmn;10.824; 39.1.22&plusmn;11.158; 41.945&plusmn;9.705); CL4 (1.153&plusmn;1.1443; 1.888&plusmn;1.988; 2.400&plusmn;1.648). O prognóstico clínico revelou 59% de taxa de recidiva para o tipo epitelióide. Assim, o presente estudo mostrou que os hemangiopericitomas devem ser graduados histologicamente por três subtipos dos quais o epitelióide parece ser o mais agressivo e o perivascular o mais incidente (45,5%) (35/77 casos) e que a imunoistoquímica pode ter papel importante na diferenciação entre os hemangiopericitomas e neurofibromas, devido à positividade e negatividade do Fator 8 respectivamente; no entanto não auxilia para distinção entre os subtipos dos CHP. Contudo o estabelecimento de critérios para diferenciar, graduar e caracterizar os CHP poderão ter implicações epidemiológicas, terapêuticas e prognósticas importantes como mostra o presente estudo / Haemangiopericytomas CHP like Schwanomas are cutaneous neoplasms of mesenchymal origin, frequently appearing in dogs, unlike neurofibromas, which are rare on the species. There are cases reported that CHP originates from pericytes, or cells located around blood vessels. They are observed more in limbs such as tissues, they are well defined, big and firm. Haemangiopericytomas have histologic characteristics common to schwanomas (neurofibromas), suggesting a possible similarity in histogenesis. In fact, at this service of Animal Pathology experience, the distinguishing final diagnosis between Haemangiopericytomas and neurofibromas, based only on morphology offers great difficulty. The hispathological aspects of the haemangiopericytons and of the schwanomas correspond to the presence or not (respectively) of spiral pericilar shape cell forms. Attempting to better identify and distinguish the haemangiopericytons from other mesenquimal tumors, mainly neurofiberns, the study indicates the histological, epidemiological and immunohistochemical characterization of Haemangiopericytomas in canine species. With this, it is expected to refine the distinguishing diagnosis of such tumors, for they are known to be neoplasms rarely and wrongly diagnosed due to difficulties to identify them morphologically. The work also studies cell proliferation at the three histological subtypes of CHP and the count for morphological malignity, correlating with the clinic prospect. In order to accomplish it, the work proposes a thoroughly case study of Haemangiopericytomas and neurofibromas and/or neurobrosarcomas in dogs; investigating on the archives of the Necrology Department of Pathology at the Veterinary Medical and Zoology at São Paulo University; from 1990 to 2003, to reclassify histologically these neoplasms and scale the subtypes of CHP. The results indicated a sum of 77 cases of CHP from which the subtype perivascular accounted for (35/77) cases; the storiform (20/77) and the epithelioid (22/77). The conclusions of immunohistochemical to perivascular type (HPV) reveal positiveness of 100% to F8; 60% to S100; 100% to vimentin; 7% to GFAP and 0% to CD34 and cytokeratin. The type estoriform (HES) revealed 70% positiveness to F8; 50% to S100; 100% to vimentin; 0% to cytokeratin and GFAP; 10% to CD34. Note that to epithelioid (HEP) 70% positiveness to F8; 40% to S100; 90% to vimentin; 0% to cytokeratin; GFAP and CD34. Statistical count of malignity criteria such as PCNA (CL3); miotic level (CL1); apoptotic level (CL4); multinucleous cells (CLO) reveal on subsequent (HPV, HE, HEP) subtypes of CHP, respectively: CLO (6.135 (6.135&plusmn;4.038; 5.067&plusmn;3.019; 11.217&plusmn;5.729); CL1 (6.155&plusmn;2.380; 7.545&plusmn;1.941; 12.540&plusmn;8.629); CL3 (30.042&plusmn;10.824; 39.1.22&plusmn;11.158; 41.945&plusmn;9.705); CL4 (1.153&plusmn;1.1443; 1.888&plusmn;1.988; 2.400&plusmn;1.648). The clinical prognostic revealed 59% receding rate to epithelioid. Therefore the study showed that Haemangiopericytomas must be histologically scaled by three subtypes of which the epithelioid appears to be the most AGGRESSIVE =INVASIVE) and perivascular the most incidental (45,5%) (35/77cases); immunohistochemical may have an important role on distinguishing between Haemangiopericytomas and neurofibrossarcomas due to positiveness and negativeness of Factor 8 respectively; notwithstanding it does not aid to distinguish between subtypes from CHP. Nevertheless, a criteria definition that enables to distinguish, scale and define CHP may have relevant epidemiologic, therapeutical and prognostical connotations as shown by the present study

O estresse por isolamento social aplicado em ratos a partir do desmame e mantido durante o desenvolvimento encefálico tem sido utilizado como um modelo experimental de desordens psiquiátricas como a esquizofrenia. Tem sido demonstrado que o isolamento induz alterações morfológicas, comportamentais (como hiperatividade em um novo ambiente) e neuroquímicas semelhantes àquelas que ocorrem em humanos esquizofrênicos. Evidências sugerem que as sinapses glutamatérgicas sejam o sitio primário das anormalidades que ocorrem na esquizofrenia, sendo as alterações dopaminérgicas secundárias às glutamatérgicas. Nesse sentido, alterações nos mecanismos de regulação desta neurotransmissão pelos transportadores de glutamato podem contribuir para o desenvolvimento e/ou manutenção da esquizofrenia. Neste estudo analisamos o padrão de atividade locomotora e a expressão de transportadores de glutamato (EAAC1 e GLT1) no córtex pré-frontal e córtex entorrinal de ratos criados em isolamento a partir do desmame. Ratos Wistar machos (PND21) foram aleatoriamente alocados em 2 grupos (n=11-12): controle (agrupados, 3 animais/caixa) ou isolados (1 animal/caixa) por 10 semanas. Os animais foram testados no campo aberto (arena) durante 20 min. e registrados: números de cruzamentos (exploração horizontal), número de levantamentos (exploração vertical) e tempo despendido, tanto no centro como na periferia da arena. Os grupos foram comparados utilizando ANOVA ou teste t de Student (significante quando p 0.05). Os animais foram anestesiados (uretana-Sigma, 25%, 5ml/kg), perfundidos e os encéfalos retirados, congelados e posteriormente utilizados nos experimentos de imunoistoquímica. Secções (40m) do córtex pré-frontal (CPF) e córtex entorrinal (CE) foram utilizadas para o estudo da expressão de EAAC1 e GLT1. A criação em isolamento induziu hiperatividade, com um aumento no número total de cruzamentos em relação aos animais agrupados (F1,22=0,38; p<0,05), sendo mais consistente na periferia da arena e após 5 minutos de teste (73%, (F1,22=14,08; p<0,001). Em contraste, o isolamento induziu redução no número total de levantamentos (F1,22=0,27; p=0,05), principalmente no centro da arena (58%, F1,22=12,48; p<0,01), nos primeiros 15 minutos de teste e significante no 1° e 3° blocos de tempo (BT1 e BT3). Na periferia o isolamento induziu aumento significante no número de levantamentos em BT2 e BT3. O tempo despendido no centro e na periferia da arena pelos animais criados em isolamento foi, respectivamente, reduzido (54%; F1,22=11,11; p<0,001) e aumentado (65%; F1,22=11,20; p<0,01) quando comparados aos animais agrupados. A expressão de EAAC1 foi significantemente aumentada pelo isolamento no CPF (38%, t= 2,730, p=0,017). Em contraste, nenhuma diferença foi encontrada no CE (t= 1,892; p= 0,081). O isolamento não induziu alteração no número de células imunopositivas para GLT1 no CPF (t=-1,28; p=0,21). Entretanto, marcação fluorescente de GLT1 foi observada associada a células gliais e neuroniais do CPF e CE. Os resultados comportamentais sugerem: i) ratos Wistar criados em isolamento social apresentam hiperatividade em novo ambiente; ii) a hiperatividade locomotora somente é detectável após períodos maiores que cinco minutos de exposição a um novo ambiente; iii) o padrão de exploração apresentado pelos animais demonstra clara preferência pela periferia da arena. Os resultados moleculares fornecem evidências para a participação dos transportadores de glutamato na redução da neurotransmissão glutamatérgica no CPF de ratos criados em isolamento a partir do desmame. / Isolation rearing of rats from weaning has been used as an experimental model of psychiatric disorders like schizophrenia. It has been demonstrated that isolation induces morphological, behavioral (like hyperactivity in a novel environment) and neurochemical changes similar to those reported for humans with schizophrenia. Evidence suggest that glutamatergic synapses might be the site of primary abnormalities in this disorder with the dopaminergic changes being secundary to the glutamatergic ones. In this context, changes on the mechanisms of regulation of the glutamatergic neurotransmission through glutamate transporters may contribute to the development and/or maintenance of schizophrenia. In this study we analyzed the pattern of locomotor activity and the expression of glutamate transporters (EAAC1 and GLT1) in prefrontal cortex and entorhinal cortex of rats reared in social isolation from weaning. Male Wistar rats (PND 21) were randomly allocated in 2 groups (n=11-12): control (grouped, 3 animals/cage) or isolated (1 animal/cage) for 10 weeks. The animals were tested in the open field (arena) for 20min. and recorded: number of crossings (horizontal exploration), number of rearings (vertical exploration) and time spent either at the center or at the periphery of the arena. The groups were compared using ANOVA or Sudents \"t\" test (significance level was set at p 0.05). The animals were anesthetized (urethane-Sigma, 25%, 5ml/kg), perfused and the brains removed, frozen and further used on the experiments of immunohistochemistry. Sections (40m) of the prefrontal córtex (PFC) and entorhinal córtex (EC) were used for studying the expression of EAAC1 and GLT1. Isolation rearing induced hyperactivity, with an increase in the number of crossings related to grouped animals (F1,22=0,38; p<0,05), being more consistent at the periphery of the arena and after 5 minutes of test (F1,22=14,08; p<0,001). In contrast, isolation induced a decrease in the total number of rearings (F1,22=0,27; p=0,05), mainly in the center of the arena (58%, F1,22=12,48; p<0,01), in the first 15 minutes of test and significant on the 1st and 3rd blocks of time (BT1 e BT3). In the periphery isolation induced a significant increase in the number of rearings in BT2 and BT3. The time spent in both center and periphery of the arena by the rats reared in isolation was, respectively, decreased (54%; F1,22=11,11; p<0,01) and increased (65%; F1,22=11,20; p<0,01) when compared to grouped rats. The expression of EAAC1 was significantly increased by isolation in PFC (38%, t = 2,730, p = 0,017). In contrast, no change was found in EC (t = 1,892, p = 0,081). Isolation rearing did not induce alterations in the number of immunopositive cells for GLT1 in PFC (t= -1,28; p = 0,21). However, fluorescent labeling of GLT1 was seen associated to both glial cells and neuronal cells. The behavioral results suggest: i) Wistar rats reared in social isolation present hyperactivity in a novel environment; ii) the hyperactivity is only detectable after periods longer than 5 minutes; iii) the pattern of exploration showed by the animals demonstrate clear preference for the periphery of the arena. The molecular results provide evidence for the involvement of glutamate transporters on the reduction of glutamatergic neurotranmission in PFC of rats reared in isolation from weaning.

INTRODUÇÃO: O conhecimento sobre os tipos celulares envolvidos na patogenia da urticária constitui um elemento essencial para a compreensão da fisiopatologia desta doença. Poucos autores têm dado atenção às interações entre mastócitos e dendrócitos da derme na urticária. Os objetivos deste estudo são orientados no sentido de descreverem-se os tipos de degranulação mastocitária na urticária aguda associada a medicamentos, e o de analisarem-se as interações entre dendrócitos da derme e mastócitos. MÉTODOS: Sete doentes com urticária aguda associada com medicamentos foram incluídos neste estudo. Foram obtidas biopsias cutâneas das lesões urticadas e da pele aparentemente normal destes doentes. Os quatorze fragmentos coletados foram divididos em duas partes (28 fragmentos): uma das partes foi enviada para processamento pela coloração de hematoxilina-eosina, para a coloração de Azul de Toluidina e reações de imunoistoquímica com anticorpos anti-CD34, antifator XIIIA (anti- FXIIIa) e antitriptase e o outro fragmento foi processado para uso na microscopia imunoeletrônica, utilizando-se anticorpos para triptase e FXIIIa, além de dupla imunomarcação com ouro com o uso de anticorpos antitriptase e anti-FXIIIa. RESULTADOS: células imunomarcadas com anticorpos anti-CD34 foram observadas de forma esparsa na derme superficial e de forma mais proeminente na derme reticular. Havia múltiplos dendrócitos dérmicos FXIIIa+ na derme superficial e média, dispersos nas regiões subepidérmicas e em torno doa vasos da derme, tanto na pele urticada com na pele aparentemente normal. O número destas células foi similar nos dois grupos de amostras. Não houve diferença estatística entre o número de células triptase-positivas na pele aparentemente normal e na pele urticada, em todos os doentes. Nós observamos mastócitos íntegros na maioria das amostras da pele aparentemente normal. Tanto as amostras de pele aparentemente normal quanto as amostras de pele urticada apresentavam mastócitos em processo de degranulação do tipo anafilático, com inúmeros grânulos extruídos. Após a dupla imunomarcação com ouro, na imuno-microscopia eletrônica de transmissão foram observadas partículas de ouro de 10 nm (FXIIIa) e 15 nm (Triptase) marcando concomitante os grânulos dos mastócitos indicando que tanto a triptase como o FXIIIa encontraram-se presentes nos grânulos destas células. De forma interessante, nós encontramos uma forte evidência de que grânulos contendo tanto FXIIIa, como triptase, extruídos dos mastócitos são fagocitados pelos dendrócitos da derme. CONCLUSÕES: na urticária aguda associada a medicamentos o padrão de degranulação observado foi do tipo anafilático. Este estudo constitui a primeira demonstração da expressão do FXIIIa nos grânulos intracitoplasmáticos e nos grânulos extruídos dos mastócitos, dispersos na matriz extracelular, nos doentes com urticária aguda associada a medicamentos. Outro fato inédito foi a demonstração da fagocitose dos grânulos extruídos dos mastócitos pelos dendrócitos da derme FXIIIa+ / BACKGROUND: The knowledge about the cell types involved in urticaria is an essential element for understanding the pathophysiology of this disease. Few authors have been attempting on interactions among mast cells and dermal dendrocytes in urticaria. The aims of this study are to describe the types of mast cell degranulation in drug-induced acute, besides to analyze the interactions between mast cell and dermal dendrocyte in urticaria. METHODS: Seven patients with drug-induced acute urticaria were enrolled in the study. We token skin biopsies of urticarial lesion and apparently normal skin. The fourteen fragments collected were divided into two parts (28 sections): one to haematoxylin-eosin stain, Toluidine blue stain and immunohistochemisty reactions with anti-CD34, anti-FXIIIa and anti-tryptase antibodies and other part to immunogold electron microscopy using single antibodies to tryptase and FXIIIa, besides double immunogold labelling with anti-tryptase and anti-FXIIIa. RESULTS: immunolabelled CD34+ cells were observed scattered in the superficial dermis and more prominent in the reticular dermis. There were multiple FXIIIa+ dermal dendrocytes in upper and mid dermis, dispersed in subepidermal areas and around blood vessels, both in apparently normal skin and urticarial lesion of drug-induced acute urticaria. The number of these cells was similar in both groups. There was no difference in tryptase positive cells number between apparently normal skin and urticarial lesions, in all patients. We observed intact mast cells in the majority of the sections of the apparently normal skin. Some sections demonstrated a few mast cells in degranulation process, in anaphylactic degranulation type. In urticarial lesions, several mast cells showed degranulation process, in anaphylactic degranulation type. After double immunogold staining, 10 nm (FXIIIa) and 15 nm (Tryptase) gold particles were seen together over the granules in mast cells indicating that tryptase and FXIIIa are each localized into granules of these cells. Interestingly, we found a strong evidence of than the exocytosed mast cell granules contents both FXIIIa and Tryptase immunolabelled are phagocytised by dermal dendrocytes. CONCLUSIONS: In drug-induced acute urticaria the degranulation pattern of mast cells found was composed by anaphylatic. This is the first report, in acute urtuicaria, concern of the expression of FXIIIa in the cytoplasmic mast cell and in extruded granules into extracellular matrix. Phagocytosis of the extruded mast cell granules by FXIIIa+ dermal dendrocytes in urticaria was observed

O transplante autólogo de tecido ovariano constitui alternativa relevante na preservação da fertilidade e da função hormonal ovariana em mulheres sujeitas à falência ovariana prematura e infertilidade, por causas malignas, tratamentos adjuvantes ou cirurgias. É a única opção para crianças, fase pré-puberal e para mulheres que não podem retardar a quimioterapia ou não podem ser submetidas à estimulação do ciclo. O transplante ovariano autólogo pode ser, quanto ao local de reimplantação, ortotópico ou heterotópico e, quanto à conservação, a fresco ou após o período de criopreservação. As várias etapas envolvidas neste transplante são estudadas mundialmente na atualidade, como a retirada e preservação do tecido ovariano, as técnicas de criopreservação, o local apropriado para o reimplante e as possibilidades de redução da perda folicular. A avaliação da apoptose - morte celular programada - é útil na avaliação da rejeição e viabilidade dos enxertos de transplantes estabelecidos na prática clínica, tanto autólogos como heterólogos. Com o intuito de utilizar animais de maior porte, conseguir seguimento de médio prazo e realizar os procedimentos cirúrgicos por via laparoscópica, padrão ouro em humanos, o presente estudo utilizou como modelo experimental fêmeas suínas, em idade reprodutiva, da raça Minipig. Este projeto teve como propósito avaliar a influência da criopreservação e do local de implante na qualidade e na viabilidade do transplante autólogo de ovário, a fresco e após criopreservação, no tecido celular subcutâneo e na região intraperitoneal peri-infundibular. Foram avaliados a quantidade e a densidade folicular dos implantes e os aspectos morfológicos e histomorfométricos, bem como a apoptose, por meio da imunoexpressão de proteínas proapoptóticas- Bax e antiapoptóticas-Bcl-2, além da Caspase 3-clivada, fase final das vias extrínseca e intrínseca dos mecanismos de apoptose.Quarenta animais foram divididos em cinco grupos: Controle com ooforectomia (Grupo I), ooforectomia e transplante a fresco subcutâneo (Grupo II), a ooforectomia e transplante fresco intraperitoneal (Grupo III), ooforectomia e transplante criopreservado subcutâneo (Grupo IV) e ooforectomia e transplante criopreservado intraperitoneal (GrupoV). Os resultados mostraram que independente da técnica empregada, havia folículos em desenvolvimento e corpos lúteos em todos os tecidos ovarianos transplantados; que a contagem de folículos antrais não degenerados foi menor nos grupos após criopreservação em relação ao grupo controle e que a imunoexpressão sugestiva de apoptose ocorreu em todos os grupos transplantados, sendo maior nos transplantes intraperitoneais. Concluiu-se que a técnica utilizada para o transplante de ovário e criopreservação foi viável no modelo suíno, em tecido celular subcutâneo e na região intraperitoneal peri-infundibular. O transplante autólogo heterotópico subcutâneo apresentou melhores taxas de apoptose que o transplante ortotópico. / Autotransplantation of ovarian tissue is an important alternative to preserve fertility and hormonal ovarian function in women undergoing ovarian failure and premature infertilidade, because of cancer or surgery. It is the only option for infants, pre-pubertal patients and for women who can not delay chemotherapy or not may be subjected to stimulation of the cycle. The various steps involved in the transplant are studied worldwide today, as the removal and preservation of ovarian tissue, the techniques of cryopreservation, the appropriate site and mechanisms to reduce follicular loss. Assessment of apoptosis - programmed cell death-is useful in the study of the viability of the grafts and rejection of transplants established in clinical practice, both autologous and heterologous. In order to use larger animals, getting following medium term (over 21 days) and to perform surgical procedures by laparoscopy (gold standard in humans), this study used an experimental model sows, reproductive age, Minipig race. This project aims to evaluate the influence of cryopreservation and implantation site of the quality and viability of ovarian autografts, fresh and after cryopreservation, at subcutaneous site and at intraperitoneal site. We analyzed the quantity and density of follicular implants and the morphological and histomorphometric as well as apoptosis, by proteins immunoexpression antiapoptotic and proapoptotic. Forty animals were divided into five groups: Control with oophorectomy (Group I), oophorectomy and fresh transplantation to subcutaneous site (Group II), oophorectomy and fresh transplantation to intraperitoneal site (Group III), oophorectomy and transplantation of cryopreserved ovarian tissue to subcutaneous site (Group IV) and oophorectomy and transplantation of cryopreserved ovarian tissue to intraperitoneal site (Group V). We concluded that the autologous ovarian transplantation was feasible in the technical proposals, in subcutaneous and intraperitoneal site in the porcine model; that regardless of the technique, there was developing follicles and corpora lutea in all ovarian tissue transplanted; that antral non-degenerate follicle count was lower in groups after cryopreservation that in the control group and that the immunoexpression of apotposis occurred in all transplanted groups, more evident in intraperitoneal transplants

A vitamina D (VD) pode estar envolvida no controle da proliferação, diferenciação e apoptose em linhagens mamárias. Existem evidências de que mulheres com câncer de mama apresentam menor concentração sérica de 25(OH)D3 ou de 1,25(OH)2D3 em relação às mulheres sem câncer. Por outro lado, pouco se sabe se a concentração sérica de VD pode influenciar o desenvolvimento de câncer de mama em cadelas e se o hormônio pode ter efeito quimiopreventivo, inibindo o aparecimento de tumores ou mesmo efeito terapêutico, reduzindo a proliferação de células malignas. Logo, nossos objetivos foram comparar a concentração sérica de 25(OH)D3 em animais com e sem tumor mamário e analisar as ações de 1,25(OH)2D3 em glândulas mamárias normais e tumorais de cadelas, utilizando como modelo a cultura de tecidos. Inicialmente foram incluídas 39 cadelas portadoras de tumor de mama e 64 cães sem tumor (controle), sendo que 50 eram fêmeas e 14 eram machos. Observamos que os animais do grupo tumoral possuíam idade mais avançada (mediana de 108 meses) em relação ao grupo controle (mediana de 36 meses para os machos e 24 meses para as fêmeas). No grupo controle, a concentração sérica foi maior nos machos (32,5 ± 19,3 ng/mL) do que nas fêmeas (22,8 ± 9,6 ng/mL), mas não houve diferença em relação ao grupo tumor (26,62 ± 14,25 ng/mL). Em relação à dieta, a concentração sérica de 25(OH)D3 foi maior nas fêmeas do grupo controle que se alimentavam de ração em comparação às que se alimentavam de comida caseira e ração. Entretanto, não houve diferença em relação à exposição ao sol e características da pelagem em todos os animais. No grupo tumoral, houve correlação inversa da concentração sérica de 25(OH)D3 em relação à idade, mas não houve diferença quanto ao tipo histológico ou estadiamento da doença. Foram coletadas 70 amostras de tumor de mama e de tecido mamários normal de cadelas, as quais foram cultivadas em fatias. Dos tecidos tumorais, 50% eram positivos para receptor de estrógeno (acima de 10% de células marcadas) e 44% eram positivos para HER-2 (método HercepTest). Detectou-se expressão gênica e proteica do receptor da vitamina D (VDR) em tecido mamário normal e tumoral, sendo identificado três padrões na imunoistoquímica: I - células epiteliais e mioepiteliais (mais frequentemente encontrada em tecido normal), II - marcação predominante em células mioepiteliais (mais comum em tecido tumoral e III - marcação predominante em células epiteliais. As amostras foram tratadas com 1,25(OH)2D3 nas concentrações 0,228 nM, 2 nM e 100 nM (concentração fisiológica, farmacológica que não induz hipercalcemia e farmacológica que induz hipercalcemia, respectivamente). O conteúdo de VD tecidual avaliado por cromatografia líquida foi crescente de acordo com as concentrações de VD utilizadas, indicando penetração do hormônio nas fatias. Observou-se indução da expressão de CYP24A1, que variou de 27 a 158 vezes dependendo da concentração utilizada, indicando ativação genômica da via da VD e que o tecido permanece metabolicamente ativo em cultura. Entretanto, não houve diferença da expressão gênica de outros genes envolvidos com o metabolismo da VD (CYP27B1), genes envolvidos no controle da proliferação (CDKN1A e CDKN1B) e genes envolvidos com a imunidade (CD14). O tratamento com calcitriol nas diferentes concentrações não induziu a apoptose (expressão proteica de caspase-3 clivada) e não alterou a proliferação nos tecidos normais (expressão proteica de Ki-67), mas diminuiu a proliferação nos tecidos tumorais. Não foi observada correlação entre a indução da apoptose e redução da proliferação com os padrões de expressão proteica de VDR. Concluindo, não observamos diferença na concentração sérica de 25(OH)D3 entre cadelas com tumor de mama e animais controle. Detectamos que o calcitriol em concentração fisiológica ativa a via genômica de VD em mama normal e tumoral e reduz o índice de proliferação (expressão de Ki-67) nos tumores de mama / Vitamin D (VD) may be involved in the control of proliferation, differentiation and apoptosis of mammary cell lines exposed to high concentrations of the hormone. There is some evidence that women with breast cancer present lower serum level of 25(OH)D3 or 1,25(OH)2D3 compared to women without cancer. Moreover, little is known if serum concentration of VD can influence the development of mammary tumors in dogs and if the hormone may have chemopreventive effect by inhibiting the appearance of tumors or therapeutic effect, reducing the proliferation of malignant cells. Therefore, our goals were to compare the serum 25(OH)D3 level in animals with and without mammary tumor and to analyze 1,25(OH)2D3 effects in normal and tumoral canine mammary glands, using as a model the tissue culture. At first, 39 bitches with mammary tumor and 64 dogs without tumor (control), of which 50 were females and 14 were males were included. Animals in tumor group were older (median 108 months) compared to control group (median 36 months for males and 24 months for females). In control group, serum concentration was higher in males (32.5 ± 19.3 ng/mL) than in females (22.8 ± 9.6 ng/mL), but there was no difference when compared to tumor group (26.62 ± 14.25 ng/mL). Regarding diet, serum 25(OH)D3 level was higher in control bitches fed commercial pet food compared to those fed homemade and commercial pet food combined. However, there was no difference of serum 25(OH)D3 concentration, sun exposure and coat features. In tumor group, there was an inverse correlation between serum 25(OH)D3 and age, but there was no difference in 25(OH)D3 concentration among bitches with different histological type or clinical stage of the disease. Seventhy bitches diagnosed with mammary tumors had tumor and mammary samples collected, sliced and cultured. In tumor tissues, 50% were positive for estrogen receptor (over 10% of cells stained), and 44% were positive for HER-2 (HercepTest method). Vitamin D receptor (VDR) protein and genic expression was detected in normal and tumoral samples. Three patterns of VDR were detected by immunohistochemistry: I - localizated in epithelial and myoepithelial cells (more often in normal tissues), II - predominantly in myoepithelial cells (most common in tumor tissues) and III - predominantly in epithelial cells. Normal anmammary slices were treated with 1,25(OH)2D3 0.228 and 100nM concentrations (concentration physiological and pharmacological, respectively) and mammay tumor slices were treated with 1,25(OH)2D3 2 nM concentrations (drug concentration which does not induce hypercalcemia) and 100 nM, for 24 hours. VD tissue content measured by liquid chromatography was higher in samples exposed to high VD concentration, indicating penetration of the hormone in slices. VD treatment induced CYP24A1 expression, 27 to 158 fold depending on the concentration used, and indicating activation of the VD genomic pathway. This result also suggest that the tissue remains metabolically active in culture. However, no difference in gene expression of other target genes such as CYP27B1, genes involved in proliferation as CDKN1A and CDKN1B and genes involved in immunity, such as CD14. Calcitriol treatment at different concentrations did not induce apoptosis (protein expression of cleaved caspase-3) and did not alter proliferation in normal tissues (expression of protein Ki -67), but decreased proliferation in tumor tissues. No correlation was observed between the induction of apoptosis and reduction of proliferation with the protein expression patterns of VDR. In conclusion, no difference in serum 25(OH)D3 between bitches with mammary tumor and control animals was observed. In normal and tumoral mammary samples calcitriol physiologic concentration activated VD genomic pathway and in tumor samples calcitriol reduced the proliferation index (Ki-67)