A isquemia do intestino delgado ocorre nas oclusões arteriais dos vasos mesentéricos ou associada à baixa perfusão tecidual causada por choque circulatório. Seus efeitos deletérios locais e sistêmicos frequentemente agravam a evolução clínica de muitas doenças. Este estudo experimental investiga como a reposição do volume intravascular utilizando duas soluções salinas com diferentes concentrações de sódio (solução salina fisiológica e solução 7,5% de cloreto de sódio) modifica a resposta inflamatória e o estresse oxidativo causados pela isquemia do intestino delgado. Ratos Wistar, machos, peso corporal entre 250 e 300 g, número total =102, foram submetidos à oclusão transitória da artéria mesentérica superior durante 45 minutos. No protocolo utilizado, os animais foram sorteados para inclusão em um de quatro grupos experimentais: isquemia falsa (IF), isquemia intestinal seguida da infusão de solução salina hipertônica 7.5% em volume de 4 ml/kg de peso (SH), isquemia intestinal seguida da infusão de solução salina 0.9% em volume de 33 ml/kg de peso (SF) e isquemia intestinal sem reposição do volume intravascular (ST). Quando apropriado, as soluções foram administradas lentamente (5 minutos) pela veia jugular externa imediatamente antes da reperfusão intestinal. Em cada grupo experimental, logo após a reperfusão intestinal, os animais foram sorteados para tempo de sobrevida: 2 horas, 4 horas ou 6 horas após a reperfusão. Amostras de sangue foram colhidas pela veia jugular externa em vários períodos: imediatamente após a liberação da oclusão da artéria mesentérica, 2 horas, 4 horas e 6 horas após a reperfusão intestinal. O plasma foi separado e foram realizadas as dosagens de interleucinas (IL-6 e IL-10). No tempo determinado, os animais foram submetidos à eutanásia em condições humanamente aceitáveis e, então, nesse momento, foram colhidas amostras de tecidos (intestino, fígado e pulmão) para posterior quantificação das concentrações de malondialdeído (MDA) e interleucinas (IL-6 e IL-10). A atividade da mieloperoxidase (MPO) também foi avaliada nessas amostras. Os animais que não receberam tratamento apresentaram uma taxa de mortalidade maior do que os demais grupos. Os grupos de animais tratados com reposição de volume intravascular apresentaram uma taxa de mortalidade semelhante ao grupo de isquemia falsa. Os animais que receberam reposição de volume intravascular com soluções cristalóides (SH ou SF) apresentaram concentrações de MDA, MPO, IL-6 e IL-10 nos tecidos (intestino, fígado e pulmão) comparáveis ao grupo de animais com isquemia falsa. Em todos os momentos, esses valores foram mais elevados no grupo que não recebeu tratamento. As concentrações plasmáticas da IL-6 e da IL-10 foram mais elevadas nos animais tratados com SH. As análises mostram que a simples abertura da cavidade abdominal causa um trauma cirúrgico relevante aos animais e é responsável pelas alterações observadas no grupo de isquemia falsa. Os resultados sugerem que a isquemia intestinal transitória (45 minutos) realizada por oclusão da artéria mesentérica superior em ratos representa um modelo experimental de moderada gravidade. Dessa maneira, o modelo é adequado aos estudos das alterações bioquímicas e celulares que ocorrem a curto, médio e longo tempo de sobrevida. Este estudo foi elaborado para análise dos fatores relativos ao estresse oxidativo e reação inflamatória que ocorrem nas primeiras horas que seguem a reperfusão intestinal. De uma maneira geral, os animais foram beneficiados pela reposição do volume intravascular com soluções cristalóides. A solução salina fisiológica foi utilizada em volume aproximadamente oito vezes superior à solução hipertônica 7,5% de cloreto de sódio. Comparativamente, a atenuação similar das respostas deletérias após a reperfusão intestinal atingida com o uso de menor volume da solução hipertônica 7,5% de cloreto de sódio representa um fator positivo para a mesma. Considera-se que a maior concentração plasmática das interleucinas (IL-6 e IL-10) encontrada nos animais tratados com solução hipertônica7,5% de cloreto de sódio esteja relacionada ao aumento de permeabilidade da microcirculação associado às soluções hipertônicas / Gut ischemia is responsible for both local and systemic deleterious events. Since reperfusion occurs in a previous ischemic superior mesenteric artery territory (SMA), a succession of harmful mechanisms begins in the luminal epithelium that quickly lengthens the limits of the intestinal tract. Depending on the extension of the intestinal system involved in the ischemic/reperfusion injury there will be severe repercussion to distant organs in response to SMA occlusion. Several diseases could be associated with variables degrees of intestinal ischemia. Even minor intensity of intestinal ischemia had deleterious systemic effects and often aggravates the clinical outcome of many diseases. Our study investigates how different forms of volume restoration could modify two important mechanisms of injury after intestinal ischemia: oxidative stress and inflammatory responses. Wistar rats (n=102) were submitted to transient superior mesenteric artery occlusion (SMAo). After randomization, animals were divided in four groups: Sham intestinal ischemia; infusion of small volume of 7.5% hypertonic saline (HS), or infusion of high volume of 0.9% saline (NS) just prior reperfusion, and animals that did not receive intra vascular volume treatment (NT). At sequential times, the animals were euthanatized and tissue samples (lung, liver, and intestine) were collected to Malondialdehyde (MDA) dosage and myeloperoxidase (MPO) activity. Also, sequential plasmatic concentration of IL-6 and IL-10 were done. Animals treated with both forms of volume infusion showed lower levels of tissue MDA, MPO, IL-6, and IL-10 than found in NT group. Plasmatic concentration of IL-6 and IL-10 were higher in animals treated with HS. Positive correlation was found between tissue concentration of IL-10 and IL-6. The mortality rate was similar between the treated rats and the group of sham ischemia. The mortality rate was higher in the non treated animals. In this rat model of transient intestinal ischemia, adequate maintenance of intravascular volemia decreases oxidative stress and synthesis of inflammatory markers. Small volume of 7.5% HS (4ml/Kg body weight) and high amounts of NS ( 33 ml/Kg body weight) had similar effects in attenuation of these responses. In this study, 7.5% HS attenuates deleterious effects found after intestinal ischemia with the main advantage of the smallest volume utilized when compared with NS solution. Plasmatic concentrations of IL-6 and IL-10 were higher in HS treated animals. This observation is supported by action of hypertonic/hyperosmotic solutions at the microcirculatory level. These solutions increase the local vascular permeability. This characteristic of 7.5% HS solution could facilitate the passage of the locally produced interleukin to the systemic circulation

Sublinhagens de camundongos AIRmax e AIRmin homozigotas para os alelos R ou S do gene Slc11a1 apresentam distinta capacidade regenerativa à perfuração de suas orelhas. Animais AIRmaxSS exibiram regeneração tecidual precoce em comparação aos animais AIRmaxRR, sugerindo que o alelo S favorece a regeneração nestes animais. Camundongos das sublinhagens AIRmin não apresentaram regeneração após perfuração de suas orelhas. Em resposta ao estímulo, animais AIRmaxSS exibiram inflamação local mais intensa e tardia do que animais AIRmaxRR, demonstrando elevados níveis de MPO e edema, e influxo celular predominantemente de neutrófilos. Ensaios de expressão gênica global demonstraram genes diferencialmente expressos entre as sublinhagens, evidenciando genes sobre-representados no tema biológico proliferação celular em ambas sublinhagens, enquanto somente nos animais AIRmaxSS ocorreu sobre-representação para resposta inflamatória nos genes ativados e para contração muscular nos genes reprimidos. Os resultados de microarray foram validados por qPCR. / Homozygous AIRmax and AIRmin sublines for Slc11a1 R and S alleles present distinct regenerative capacity to the ear hole. AIRmaxSS mice exhibited early tissue regeneration compared to AIRmaxRR animals, suggesting that the Slc11a1 S allele promotes regeneration in these animals. AIRmin sublines didnt show regeneration after ear punch. In response to the stimulus, AIRmaxSS animals exhibited more intense and later local inflammation than AIRmaxRR animals, presenting elevated levels of MPO, edema and cellular influx predominantly of neutrophils. Global gene expression analysis showed differentially-expressed genes between the sublines, in which over-represented biological theme is cell proliferation in both sublines. AIRmaxSS animals displayed over-representation of inflammatory response in up-regulated genes and of muscle contraction in down-regulated genes. Microarray results were validated by using quantitative PCR.

Introdução: Sepse é uma síndrome complexa definida por resposta inflamatória sistêmica, de origem infecciosa e caracterizada por manifestações múltiplas que podem determinar disfunção ou falência de um ou mais órgãos ou sistemas. É a principal causa de morte em unidades de terapia intensiva em pacientes críticos e tem representado uma fonte constante de preocupação para os sistemas de saúde em todo o mundo, devido, principalmente, às taxas elevadas de morbimortalidade. O tratamento da sepse é um desafio e continua a ser uma tarefa difícil devido a inúmeros fatores interferentes. Um estudo do nosso grupo demonstrou que a Escherichia coli (E. coli) é capaz de se ligar CD16 de um modo independente de opsonina, levando a um aumento na resposta inflamatória e a inibição da sua própria fagocitose, por conseguinte, procurou-se identificar os peptídeos no proteoma da E. coli envolvidos neste cenário. Metodologia: Utilizando a metodologia de Phage Display, que consiste numa técnica de clonagem, que permite a expressão de diversas sequências de peptídeos na superfície de bacteriófagos, nós identificamos 2 peptídeos que obtiveram interação com CD16. Após a seleção dos peptídeos identificamos uma proteína de membrana de E.coli que possui alta similaridade com um de nossos peptídeos selecionados. Nós acreditamos que esta proteína de membrana possa estar envolvida no processo de evasão imune desenvolvida pela E.coli e parece ser um forte candidato como uma nova opção terapêutica para controlar infecções por E. coli. Conclusão: A identificação de proteínas capazes de induzir inibição de fagocitose, através do receptor CD16, pode ser usada como uma nova forma de tratamento da sepse, assim como explorada no tratamento de doenças autoimunes / Introduction: Sepsis is a complex syndrome defined by a systemic inflammatory response of infectious origin and characterized by multiple manifestations that can determine dysfunction/failure of one or more organs and systems. It is the leading cause of death in intensive care units and represents a major health problem around the world, mainly due to its high mortality and morbidity rates. The treatment of sepsis is challenging and remains a difficult task due to numerous interfering factors. A study from our group demonstrated that Escherichia coli (E. coli) is able to bind CD16 in an opsoninindependent manner, leading to an increase in the inflammatory response and inhibition of its own phagocytosis, therefore we sought to identify the peptides in the E. coli proteome involved in this scenario. Methods and Results: Using the Phage Display technique, which is a cloning technique that allows the expression of various peptide sequences on the surface of bacteriophages (phages) and selecting these on the basis of affinity for a target molecule, we identified two peptides that interact with CD16. Next, using bioinformatic tools, we found an E. coli membrane protein that has high similarity with one of our selected peptides. We believe this membrane protein is involved in the process of immune evasion developed by E. coli and it is a strong candidate as a new therapeutic option to control E. coli infections. Conclusion: The identification of proteins capable of inducing inhibition of phagocytosis through the CD16 receptor, can be used as a new treatment of sepsis, as well as exploited in the treatment of autoimmune diseases

Introdução. A Aprotinina parece reduzir o uso de transfusões, o processo inflamatório e o dano miocárdico, pós-CEC. Material e Métodos. Estudo prospectivo randomizado em crianças de 30 dias a 4 anos de idade, submetidas à correção de cardiopatia congênita acianogênica, com CEC e divididas em dois grupos, um denominado Controle (n=9) e o outro, Aprotinina (n=10). Neste, a droga foi administrada imediatamente antes da CEC. A resposta inflamatória sistêmica e disfunções hemostáticas e multiorgânicas foram analisadas por marcadores clínicos e bioquímicos. Foram consideradas significantes as diferenças com p<0,05. Resultados. Os grupos foram semelhantes quanto às variáveis demográficas e intra-operatórias, exceto por maior hemodiluição no Grupo Aprotinina. Não houve benefício quanto aos tempos de ventilação pulmonar mecânica, permanência no CTIP e hospitalar, nem quanto ao uso de inotrópicos e função renal. A relação PaO2/FiO2 (pressão parcial de oxigênio arterial/fração inspirada de oxigênio) apresentou queda significativa com 24 h PO, no Grupo Controle. Ocorreu preservação da concentração plaquetária com a Aprotinina enquanto no grupo Controle houve plaquetopenia desde o início da CEC. As perdas sangüíneas foram semelhantes nos dois grupos. No grupo Aprotinina surgiu leucopenia significativa, em CEC, seguida de leucocitose. Fator de necrose tumoral alfa (TNF-) , Interleucinas (IL)-6, IL-8, IL-10, proporção IL-6/IL-10, troponina I cardíaca (cTnI), fração MB da creatinofosfoquinase (CKMB), transaminase glutâmico-oxalacética (TGO) e fração amino-terminal do peptídio natriurético tipo B (NT-proBNP) não apresentaram diferenças marcantes intergrupos. A proporção IL-6/IL-10 PO aumentou no grupo Controle. A lactatemia e acidose metabólica pós-CEC foi mais intensa no grupo Aprotinina. Não houve complicações com o uso da Aprotinina. Conclusão. A Aprotinina não minimizou as manifestações clínicas e os marcadores séricos de resposta inflamatória sistêmica e miocárdicos, mas preservou quantitativamente as plaquetas. / Introduction. Aprotinin seems to reduce the need for transfusion, the inflammatory process and myocardial damage after extracorporeal circulation (ECC). Material and Methods. A prospective randomized study was conducted on children aged 30 days to 4 years submitted to correction of acyanogenic congenital heart disease with ECC and divided into two groups: Control (n=9) and Aprotinin (n=10). In the Aprotinin Group the drug was administered immediately before ECC and the systemic inflammatory response and hemostatic and multiorgan dysfunctions were analyzed on the basis of clinical and biochemical markers. Differences were considered to be significant when P<0.05. Results. The groups were similar regarding demographic and intraoperative variables, except for a greater hemodilution in the Aprotinin Group. The drug had no benefit regarding time of mechanical pulmonary ventilation, permanence in the postoperative ICU and length of hospitalization, or regarding the use of inotropic drugs and renal function. The partial arterial oxygen pressure/inspired oxygen fraction ratio (PaO2/FiO2) was significantly reduced 24 h after surgery in the Control Group. Platelet concentration was preserved with the use of Aprotinin, whereas thrombocytopenia occurred in the Control Group since the beginning of ECC. Blood loss was similar for both groups. Significant leukopenia was observed in the Aprotinin Group during ECC, followed by leukocytosis. Tumor necrosis factor alpha (TNF-), interleukins (IL)-6, IL-8, IL-10, IL-6/IL-10 ratio, cardiac troponin I (cTnI), creatine kinase MB fraction (CKMB), glutamic-oxaloacetic transaminase (GOT) and the aminoterminal fraction of natriuretic peptide type B (NT-proBNP) ndid not differ significantly between groups.The postoperative IL-6/IL-10 fraction increased significantly in the Control Group. Post-ECC blood lactate concentration and metabolic acidosis was more intense in the Aprotinin Group. There were no complications with the use of Aprotinin. Conclusion. Aprotinin did not minimize the clinical manifestations or serum markers of the inflammatory, systemic and myocardial response, but quantitatively preserved the platelets.

A teragnóstica de doenças tem sido extremamente marcada nos últimos anos por nanomateriais formados pela conjugação de nanopartículas a biomoléculas, pois a aplicação de tecnologias baseadas em materiais na dimensão nanométrica é capaz de aumentar a seletividade, sensibilidade e praticidade dos métodos atualmente empregados, ou mesmo criar novos métodos de diagnóstico e tratamento de doenças. Dentre os vários tipos de nanomateriais desenvolvidos, aqueles baseados em nanopartículas de ouro ou nanopartículas magnéticas apresentam propriedades químicas e físicas diferenciadas que propiciam novas possibilidades. Por exemplo, a presente tese demonstrou que nanopartículas superparamagnéticas são excelentes agentes de contraste em exames de imagem por ressonância magnética (IRM) por serem mais seguros, apresentarem melhor contraste nas imagens e possibilitarem direcionar/concentrar o material em tecidos ou tumores através de um gradiente de campo magnético aplicado. Foram feitos numerosos ensaios de toxicidade tanto in vitro quanto in vivo para assegurar a segurança da aplicação de nanopartículas no organismo, cujo potencial de uso somente se tornará uma realidade caso os nanomateriais se mostrem não tóxicos e biocompatíveis. Apesar dos significativos avanços na área da aplicação desses nanomateriais, não foram encontrados na literatura modelos capazes de explicar ou prever por quais sítios de ligação devem ocorrer as interações proteína-nanopartícula, como também não foram encontrados estudos sistemáticos acerca dos fatores que determinam a estabilidade e a funcionalidade dos nanobioconjugados (NBCs). Assim, nesta tese buscamos compreender os fatores responsáveis pela ligação/adsorção das proteínas nas nanopartículas de ouro e sua influência sobre a estabilidade das suspensões e a funcionalidade das proteínas. Desta forma, foram obtidos NBCs com propriedades adequadas para o desenvolvimento ou aprimoramento de ensaios de diagnóstico e até para o tratamento de doenças. Foi demonstrado o potencial das nanopartículas de ouro para melhorar a performance de imunoensaios do tipo ELISA, mas também podem ser utilizadas para o desenvolvimento de métodos de diagnóstico, explorando as propriedades plasmônicas das nanopartículas de ouro acopladas a técnicas como SERS, SPR e microscopia Raman confocal. / Theranostics has been intensively pursued in recent years using hybrid materials based on nanoparticles conjugated with biomolecules. This is an interesting strategy to increase the selectivity and sensitivity, as well as to improve the currently used methods facilitating their use or creating new ones. Among the various types of nanomaterials, those based on gold and magnetic nanoparticles exhibit interesting chemical and physical properties in the biological environment, differing from that of free drugs or current explored in assay methods. For example, superparamagnetic nanoparticles are excellent contrast agents for magnetic resonance image (MRI) diagnostics because they are safer, present a better contrast efficiency for imaging and can be magnetically accumulated in tissues or tumors using a magnetic field. Numerous in vitro and in vivo toxicity assays were performed to ensure the safety for medical applications. Clearly, these type of applications only will be realized if nanomaterials prove to be nontoxic and biocompatible. This imply an strict control on their structure and composition. However, despite the significant advances in the development of such nanomaterials, there were not found in the literature model systems explaining or that can be used to predict by which sites the protein-nanoparticle binding should take place. In addition, no systematic studies on the factors determining the stability and the functionality of nanobioconjugates (NBC) were found. Thus, this thesis is focused in unveiling the factors responsible for binding/adsorption of proteins on gold nanoparticles and their influence on the colloidal stability of hybrid nanoparticles suspensions while keeping the functionality of biomolecules. In fact, NBC with enhanced properties suitable for the development of diagnostic methods and even for treatment of diseases were obtained. These nanomaterials can improve the ELISA immunoassay, or other diagnosis methods can be developed by using the gold nanoparticles plasmonic properties in association with SERS, SPR and confocal Raman microscopy techniques.

Introdução: Chlamydia trachomatis (CT) é causa da infecção sexualmente transmitida de origem bacteriana mais comum. Na mulher, a infecção genital pela CT pode causar cervicite, uretrite, endometrite, salpingite. Infecções persistentes ou recorrentes provavelmente representam um importante fator de risco para o desenvolvimento de sequelas associadas, como dor pélvica crônica, gravidez ectópica e infertilidade por fator tubário. A lectina ligadora de manose (MBL), componente doo sistema imune inato, tem importante papel na defesa antimicrobiana, reconhecendo vírus, fungos e patógenos bacterianos. O gene que codifica para a MBL é polimórfico, e a substituição de um único nucleotídeo resulta na produção de uma proteína instável, que é rapidamente degradada. Objetivo: Avaliar se mulheres brasileiras portadoras de um polimorfismo do gene da MBL apresentam diferentes susceptibilidades para a ocorrência de obstrução tubária, na presença ou ausência de uma infecção prévia por Chlamydia trachomatis. Métodos: Em estudo caso-controle, foram avaliadas 75 pacientes com obstrução tubária e 75 pacientes com tubas pérvias, atendidas na Divisão de Ginecologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo (HCFMUSP). Anticorpos IgG anti-CT foram mensurados através de um ensaio de imunoabsorção enzimática para investigar uma infecção prévia pela CT. Para o polimorfismo, realizou-se coleta de células bucais e o DNA extraído foi analisado através de reação em cadeia da polimerase (PCR), digestão de endonuclease e gel de eletroforese, utilizando pares de primers específicos para a região polimórfica. Todo material foi mantido a -80°C e enviado em gelo seco para a Division of Immunology and Infectious Diseases da Weill Cornell Medicine em Nova York. Associações entre genótipos de MBL ou alelos e permeabilidade tubária foram analisadas pelo teste de qui-quadrado de Pearson com ou sem correção de Yates. Resultados: Não houve diferença na detecção de anticorpos da CT entre os grupos. Mulheres com tubas obstruídas tiveram uma prevalência maior do genótipo AB (36%) versus (16%), resultado estatisticamente significativo (p < 0,01). De maneira semelhante, a distribuição do alelo A e do alelo variante B também apresentaram diferenças significantes entre os grupos (p < 0,01). Conclusão: Os achados sugerem, que embora a exposição à Chlamydia trachomatis tenha sido semelhante em ambos os grupos, a presença do alelo variante B do gene que codifica para a MBL aumenta o risco de desenvolvimento da obstrução tubária, subsequente à infecção pela CT ou outros agentes infecciosos. Nas mulheres brasileiras avaliadas a presença de tal polimorfismo genético aumentou a probabilidade de obstrução tubária em consequência de uma infecção do trato genital / Introduction: Chlamydia trachomatis (CT) is the cause of the most common bacterial sexually transmitted infection. In women, genital CT infection may cause cervicitis, urethritis, endometritis, salpingitis. Persistent or recurrent infections probably represent an important risk factor for the development of associated sequelae, such as chronic pelvic pain, ectopic pregnancy and tubal factor infertility. Mannose-binding lectin (MBL), a component of the innate immune system, has an important role in antimicrobial defense, recognizing viral, bacterial and fungal pathogens. The gene coding for MBL is polymorphic and a single nucleotide substitution results in production of an unstable protein, that is rapidly degraded. Objective: To evaluate whether Brazilian women with a polymorphism in the MBL gene present different susceptibilities to the occurrence of fallopian tube damage, in the presence or absence of a previous infection by CT. Method: In a case-control study, 75 patients with tubal obstruction and 75 patients with patent tubes were studied, all seen at the Gynecology Division of the Hospital das Clínicas of the University of São Paulo (HCFMUSP). IgG anti-CT antibodies were measured by enzyme-linked immunoassay to investigate a previous CT infection. For the polymorphism analysis, buccal cells were collected and the extracted DNA was analyzed by polymerase chain reaction (PCR), endonuclease digestion and gel electrophoresis using primer pairs specific for the polymorphic region. All material was maintained at -80 ° C and sent on dry ice to the Division of Immunology and Infectious Diseases at Weill Cornell Medicine in New York. Associations between MBL genotypes or alleles and tubal permeability were analyzed by the Pearson chi-square test with or without Yates correction. Results: There was no difference in CT antibody detection between the two groups. Women with obstructed tubes had a higher prevalence of being positive for the heterogenous genotype AB (36%) versus (16%) (p < 0.01). Similarly, the distribution of the normal A allele and variant B allele were also significant different between the two groups (p < 0,01). Conclusion: The findings suggest that while exposure to CT was similar in both groups of women the presence of the variant MBL B allele increases the risk for development of tubal obstruction, subsequent to a CT or other infection. In the Brazilian women evaluated possession of this genetic polymorphism increased the likelihood that blocked fallopian tubes will be a consequence of a genital tract infection

This study aimed to evaluate the effect of vegetable by-products, including fruit by-products (passion fruit, orange, acerola, and mango) and soy by-product (okara), on the folate production by starter and probiotic strains for the bio-enrichment of fermented soy products. In the first part of this study, the impact of amaranth flour on folate production by these microorganisms was also evaluated. The effect of vegetable by-products and amaranth flour on the ability of three starters - Streptococcus thermophilus (ST-M6, TH-4, and TA-40) and ten probiotic strains (Lactobacillus (Lb.) acidophilus LA-5, Lb. fermentum PCC, Lb. reuteri RC-14, Lb. paracasei subsp. paracasei Lb. casei 431, Lb. paracasei subsp. paracasei F19, Lb. rhamnosus GR-1, and Lb. rhamnosus LGG, Bifidobacterium (B.) animalis subsp. lactis BB-12, B. longum subsp. longum BB-46, and B. longum subsp. infantis BB-02) to produce folate was evaluated, using a modified MRS broth. Most of the microorganisms were able to produce folate. However, folate production was strain-dependent and also dependent on the environmental conditions and on the vegetable substrate used. Passion fruit by-product presented the lowest folate concentration and was selected for the following experiments. Thus, the impact of the supplementation of soymilk with passion fruit by-product and/or commercial prebiotic fructooligosaccharides FOS P95 on the folate production by three St. thermophilus strains, as well as four probiotic Lactobacillus strains (LA-5, LGG, PCC, and RC-14) were evaluated. St. thermophilus ST-M6 and TH-4 produced the highest amounts of folate in all fermented soymilks. The concentration of the vitamin was also high when these strains grew in co-culture with LA-5 and LGG. Soymilk supplemented with both passion fruit by-product and FOS together presented the highest concentration of folate when fermented by the co-culture TH-4+LGG. This co-culture was selected to produce four fermented soy products (FSP). All FSP were bio-enriched with folate produced by the co-culture and the probiotic strain LGG remained always above 8 log CFU/mL until the end of the storage period (28 days at 4ºC). In contrast, the concentration of the vitamin was stable until day 14 then a slight decrease was observed at the end of the storage period. The FSP supplemented with both passion fruit by-product and FOS together may contribute with around 14% of the recommended daily intake for folate if consumed until day 14 of storage. During the in vitro simulated gastrointestinal conditions, the folate content of the digested FSP increased from 1.3 to 3.6-fold, especially at the small and large intestinal in vitro phases and the strain LGG was recovered. In contrast, St. thermophilus TH-4 was not recovered during the assay. Finally, the prebiotic potential of the bioactive compounds present in the fruit by-products was characterized. Fruit by-product water extracts (FWE) containing soluble fibres from fruit by-products were obtained through a hot-water extraction and were associated to phenolic compounds and showed antioxidant activity. The FWE (especially, orange and mango water extracts) presented an anti-inflammatory potential by decreasing the nitric oxide concentration produced in vitro by macrophages stimulated with lipopolisaccharides (LPS) from Salmonella Thyphymurium. The FWE (especially from mango) were able to stimulate the growth of the strains TH-4 and LGG, as well the folate production by these microorganisms when tested individually and in co-culture. The FWE also increased the adhesion of TH-4 and LGG to Caco-2 cells in an in vitro model. These results suggest a prebiotic potential of the fruit by-products evaluated and their potential towards increased folate production by the selected microorganisms. Therefore, the bio-enrichment of fermented soy products with folate produced by beneficial microorganisms is an alternative for the development of functional foods with high folate content. Additionally, fermentable bioactive compounds with functional and/or biological activity, such as soluble fibres associated to phenolic compounds with antioxidant activity, present in the fruit by-products, may act as potential prebiotic ingredients. These bioactive molecules may represent a potential natural alternative to synthetic drugs for the treatment of inflammatory processes. / O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de subprodutos vegetais, incluindo subprodutos do processamento de fruta (maracujá, laranja, acerola e manga) e de soja (okara) na produção de folatos de novo por microrganismos strater e probióticos para bioenriquecer um produto de soja fermentado. Na primeira etapa deste trabalho, o impacto da farinha de amaranto na produção de folatos pelos microrganismos também foi avaliado. Neste sentido, primeiramente, verificou-se o efeito desses subprodutos vegetais e da farinha de amaranto na capacidade de três cepas starter - Streptococcus thermophilus (ST-M6, TH-4 e TA-40) e 10 cepas probióticas (Lactobacillus (Lb.) acidophilus LA-5, Lb. fermentum PCC, Lb. reuteri RC-14, Lb. paracasei subsp. paracasei Lb. casei 431, Lb. paracasei subsp. paracasei F19, Lb. rhamnosus GR-1, and Lb. rhamnosus LGG, Bifidobacterium (B.) animalis subsp. lactis BB-12, B. longum subsp. longum BB-46, e B. longum subsp. infantis BB-02) em produzir folato utilizando um caldo MRS modificado. A maior parte dos microrganismos testados foi capaz de produzir folato. Entretanto, a produção foi considerada cepa-dependente e, também, dependente das condições ambientais e do tipo de subproduto vegetal empregado. O subproduto de maracujá apresentou a menor concentração de folato e, por isso, foi selecionado para os testes seguintes. Neste sentido, o impacto da suplementação do leite de soja com subproduto de maracujá e/ou com o prebiótico comercial fruto-oligosacarídeo FOS P95 na produção de folato pelas três cepas de St. thermophilus, bem como quarto cepas probióticas do gênero Lactobacillus (LA-5, LGG, PCC e RC-14), também foi avaliado. Em cultura pura, as cepas de St. thermophilus ST-M6 e TH-4 produziram grande quantidade de folato nas formulações de extrato de soja fermentados. A concentração da vitamina foi maior quando tais cepas se desenvolveram em co-cultura com LA-5 e LGG. Observou-se que o extrato de soja suplementado concomitantemente com subproduto de maracujá e FOS apresentou a maior quantidade de folato quando fermentado pela co-cultura TH-4+LGG. Esta co-cultura, portanto, foi selecionada para desenvolver os produtos fermentados de soja (PFS). Todas as formulações foram bioenriquecidas e a cepa LGG manteve-se viável por todo o período de armazenamento (28 dias a 4ºC). Entretanto, a concentração da vitamina manteve-se estável apenas até o dia 14, observando-se uma diminuição da quantidade de folato ao final do período de armazenamento. Constatou-se que o produto fermentado de soja suplementado concomitantemente com subproduto de maracujá e FOS pode contribuir com cerca de 14% da ingestão diária recomendada para folato se consumido até o dia 14 do armazenamento. Além disso, durante a simulação gastrointestinal in vitro, observou-se que a digestão aumentou de 1,3 a 3,6 vezes a concentração da vitamina incrementando, consideravelmente, a bioacessibilidade do folato, principalmente nas porções simuladas do intestino delgado e grosso do intestino e a cepa LGG foi recuperada. Entretanto, a cepa St. thermophilus TH-4 não foi recuperada durante o ensaio. Por fim, o potencial prebiótico de componentes bioativos presentes nos subprodutos de fruta foi caracterizado. Uma extração Hot Water foi conduzida, a fim de obter extratos aquosos de subprodutos de fruta ricos em fibras solúveis associadas a compostos fenólicos com atividade antioxidante. Observou-se, ainda, que tais extratos aquosos de subprodutos de fruta (laranja e manga) apresentaram potencial anti-inflamatório constatado pela diminuição da concentração de óxido nítrico produzido por macrófagos estimulados com lipopolissacarideo (LPS) de Salmonella Typhymurium in vitro. Além disso, os extratos aquosos de subprodutos de fruta (principalmente o extrato aquoso de subproduto de manga) foram capazes de estimular a multiplicação das cepas TH-4 e LGG, bem como a produção de folatos por estes microrganismos quando avaliados individualmente e em co-cultura. Adicionalmente, esses extratos aquosos de subprodutos de fruta aumentaram a adesao do TH-4 e do LGG a células Caco-2 em modelo in vitro. Neste sentido, os resultados sugerem um potencial prebiótico dos subprodutos de fruta testados, de modo a estimular, não somente o desenvolvimento dos microrganismos avaliados mas, principalmente, o potencial destes em produzir folatos na presença dos substratos vegetais testados. O bioenriquecimento dos produtos fermentados de soja com folatos produzidos por microrganismos benéficos emerge como alternativa de alimento potencialmente funcional com alto teor de folato. Adicionalmente, compostos bioativos fermentescíveis e com atividade biológica como, por exemplo, as fibras solúveis associadas a compostos fenólicos com atividade antioxidante, presentes nos subprodutos de fruta testados podem constituir potenciais ingredientes prebióticos, além de representarem uma possível alternativa natural para o tratamento de processos inflamatórios.

Os neutrófilos são os leucócitos circulantes mais abundantes. Apesar de serem importantes no combate às infecções, o intenso recrutamento e a consequente ativação dessas células levam à liberação de mediadores inflamatórios que estão relacionados com o agravamento do quadro clínico de inúmeras doenças. Dessa forma, nos últimos anos tem-se intensificado a procura por substâncias terapêuticas que minimizem os danos teciduais ocasionados pela infiltração neutrofílica. Estudos prévios do grupo de pesquisa mostraram que as 3-fenilcumarinas, que constituem uma classe de produtos naturais de origem vegetal, são substâncias promissoras como moduladores do metabolismo oxidativo de neutrófilos. Em continuidade a essas investigações, o derivado sintético 3-fenilcumarínico 6,7-diidroxi-3-[3\',4\'- metilenodioxifenil]-cumarina (C13) foi selecionado, por apresentar o grupo substituinte ortodiidroxi nas posições C-6 e C-7 do esqueleto cumarínico e a metilenodioxila ligada ao anel fenílico, no intuito de avaliar o seu efeito nas demais funções efetoras dos neutrófilos, como também em um modelo animal de inflamação articular. Foi avaliado o efeito modulatório in vitro da C13 sobre a quimiotaxia, a produção de ERO e interação com o sítio ativo da mieloperoxidase (MPO), a fagocitose de imunocomplexos (IC), a desgranulação da enzima elastase, a atividade microbicida sobre Candida albicans, a mobilização e o influxo de cálcio, a polimerização do citoesqueleto, e a formação e liberação das NETs em neutrófilos humanos. A C13 inibiu, de forma dependente da concentração, o metabolismo oxidativo de neutrófilos estimulados via receptores de IgG (Fc?R) e/ou de complemento (CR), utilizando-se diferentes tipos de IC e foi capaz de interagir com o sítio ativo da MPO. Nas concentrações próximas da necessária para inibir 50% do metabolismo oxidativo (~ 2µmol/L), a C13 não interferiu nas demais funções efetoras dos neutrófilos avaliadas. No entanto, na maior concentração avaliada (20 µmol/L), a C13 inibiu cerca de: 30% da capacidade das células de migrar a favor dos agentes quimiotáticos n-formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP) e leucotrieno B4; 70% da fagocitose de IC mediada por CR; 40% e 80% da desgranulação estimulada por fMLP e IC imobilizados, respectivamente; 50% do processo de formação e liberação das NETs. Esta concentração de C13 também interferiu na polimerização do citoesqueleto de actina, mas não inibiu: a quimiotaxia de neutrófilos frente à interleucina (IL) 8; a capacidade fagocítica de IC estimulada via Fc?R e Fc?R+CR; e a atividade microbicida sobre C. albicans. Na segunda parte deste trabalho, foi avaliada a toxicidade da C13 sobre neutrófilos mantidos em condições de cultura celular por 6 e 12 h. Nos períodos avaliados, essa substância não alterou a viabilidade dos neutrófilos. Por último, a C13 foi incorporada em vesículas lipossomais e sua atividade biológica foi avaliada em ratos Wistar com inflamação articular induzida por zimosan. O tratamento dos animais com a C13 lipossomal (1mg/Kg) reduziu a formação do edema e a infiltração de leucócitos e neutrófilos na sinóvia inflamada, mas não alterou a concentração sinovial das citocinas inflamatórias fator de necrose tumoral ?, IL-1? e IL-6. Portanto, o derivado 3-fenilcumarínico C13 pode servir de protótipo para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos com aplicação no tratamento de doenças onde há intensa participação dos neutrófilos. / Neutrophils are the most abundant circulating leukocytes. Although neutrophils are important to fight against infections, the massive recruitment and consequent activation of these cells result in the release of inflammatory mediators that are associated with worsening of the clinical condition in many diseases. In this sense, the search for new therapeutic compounds that minimize tissue damage caused by neutrophil infiltration has been intensified in the past few years. Previous studies have demonstrated that 3-phenylcoumarins, a class of plantderived natural compounds, are promising modulators of neutrophil oxidative metabolism. To continue these investigations, we selected the 3-phenylcoumarin derivative 6,7-dihydroxy-3- [3?,4?-methylenedioxyphenyl]-coumarin (C13), bearing the 6,7-dihydroxyl and the 3?,4?- methylenedioxyl groups, to further assess its effects on the other effector functions of neutrophils, as well as on in an animal model of articular inflammation. We examined the in vitro modulator effect of C13 on the human neutrophil chemotaxis, production of ROS and interaction with active site of myeloperoxidase (MPO), phagocytosis of immune complexes (IC), degranulation, killing of Candida albicans, calcium mobilization and influx, cytoskeleton polymerization, and the formation and release of NETs. C13 inhibited, in a concentration-dependent manner, the neutrophil ROS generation elicited via IgG (Fc?R) and/ or complement (CR) receptors using different types of IC and it interacted with active site of MPO. At concentrations near to that required to suppress the ROS production by 50% (~ 2µmol/L), C13 did not modulate the other neutrophil effector functions assessed. However, at the highest concentration tested (20 µmol/L), C13 inhibited nearly: 30% of the cell ability to migrate towards n-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) and leukotriene B4; 70% of CR-mediated phagocytosis of IC; 40% and 80% of cell degranulation triggered by fMLP and immobilized IC, respectively; and 50% of the NETs formation and release process. Such C13 concentration also interfered in the actin cytoskeleton polymerization, but it did not suppress the neutrophil: chemotaxis towards interleukin (IL) 8; capacity to phagocytose IC elicited via Fc?R and Fc?R+CR; and killing of C. albicans. In the second part of this study, we examined whether C13 was toxic towards neutrophils maintained in culture for 6 and 12 h. At the time points assessed, this compound did not change the viability of neutrophils. Finally, we incorporated C13 into liposomes and examined its biological activity in Wistar rats of zymosan-induced articular inflammation. Treatment of animals with liposomal C13 reduced edema formation, and leukocyte and neutrophil infiltration in the inflamed synovia, but it did not change the synovial concentration of the inflammatory cytokines tumor necrosis factor ?, IL-1?, and IL-6. Therefore, the 3-phenylcoumarin derivative C13 can be a prototype for the development of novel therapeutic agents to be used in the treatment of diseases where neutrophils have intense participation.

Introdução: Os anticorpos anticitoplasma de neutrófilos (ANCA) são classificados em três padrões observados na imunofluorescência indireta (IFI) utilizando neutrófilos humanos fixados em etanol e formaldeído como substrato. O c-ANCA apresenta forte associação com a enzima neutrofílica proteinase 3 (PR3), enquanto o p-ANCA está fortemente associado à mieloperoxidase (MPO). Na hepatite autoimune (HAI), colangite esclerosante primária (CEP) e doença inflamatória intestinal (DII) é observado outro padrão de IFI classificado como p-ANCA atípico que não apresenta reatividade contra as enzimas PR3 e MPO. Objetivo: Determinação da frequência dos diferentes padrões de ANCAs na CEP com ou sem DII concomitante (CEP/DII+, CEP/DII-), em três subtipos de hepatite autoimune (HAI-1 com anticorpo antimúsculo liso padrão tubular; HAI-2 com anticorpo antimicrossoma de fígado e rim tipo 1; HAI antiantígeno hepático solúvel/fígado e pâncreas, na colangite biliar primária (CBP) e em controles saudáveis. O anticorpo antinúcleo poderia estar presente em todos os subtipos. Os resultados dos ANCAs foram comparados com os do ELISA para verificação de concordância entre os padrões e as reatividades antigênicas. Metodologia: Foram estudados 249 pacientes (42 CEP/DII+; 33 CEP/DII-; 31 HAI-1; 30 HAI-2; 31 HAI-3; 52 CBP; 30 indivíduos saudáveis). As amostras de soro desses pacientes foram processadas pelos ensaios comerciais INOVA: ANCA Etanol, Quanta LiteTM MPO ELISA, Quanta LiteTMPR3 ELISA, Quanta LiteTM FAN HEp-2; e em lâminas com neutrófilos humanos fixados em etanol preparadas in house. Para as análises estatistícas foram utilizados os testes de Fisher com correção de Holm, os testes kappa e de McNemar. Resultados: O p-ANCA esteve presente em 4 (1,6%), o c-ANCA em 3 (1,2%), o p-ANCA atípico em 62 (24,9%), o c-ANCA atípico em dois (0,8%) e o padrão inconclusivo em 14 (5,6%) de 249 amostras testadas. O p-ANCA atípico foi mais frequentemente detectado na CEP/DII+ (52,4%; IC 95% = 37,7-66,6) em relação à CEP/DII- (21,2; IC 95% = 10,4-38,0), p=0,005. Não houve diferença significante na frequência do p-ANCA atípico na CEP/DII- em relação a CBP (15,38%, IC 95% = 7,83-27,89), p=0,501. O p-ANCA atípico foi significantemente mais positivo na HAI-1 (45,2%, IC 95% = 29,15-62,24, p < 0,001) e HAI-3 (32,3%, IC = 18,46-49,97, p=0,012) em comparação a HAI-2 (3,3%, IC 95% = 0-18,09). Não foi detectada diferença entre a HAI-1 e a HAI-3 (p=0,434). Ao considerarmos todos os padrões conjuntamente, persistiram as mesmas diferenças significantes entre a CEP/DII+ versus CEP/ DII- (p=0,037) e entre a HAI-2 versus HAI-1 (p=0,011) e versus HAI-3 (p=0,024). A reatividade do anti-PR3 foi encontrada em 25 das 249 amostras, sendo mais frequente na CEP/DII+ (31,0% IC 95%: 22,94 - 50,88) do que na CEP/ DII- (12,1%, IC 95%: 4,52-29,46, p = 0,025). Anticorpos anti-MPO foram identificados em oito de 249 amostras (3,2%). Das 25 amostras positivas para o anti-PR3 apenas uma apresentou c-ANCA; outras duas amostras positivas para o c-ANCA foram negativas para o anti-PR3. As oito amostras positivas para o anti-MPO não apresentaram reatividade para o p-ANCA e as quatro que tinham esse padrão não foram reativas para o anti-MPO. Entre as 62 amostras reativas para o p-ANCA atípico 49 não apresentaram reatividade para o anti-PR3 e anti-MPO. Das treze amostras positivas para o p-ANCA atípico e que exibiram reatividade ao ELISA, doze apresentaram positividade para o anti-PR3 e uma para o anti-MPO e para o anti-PR3. Conclusões: 1) Do ponto de vista de reatividade dos ANCAs e do anti-PR3 a CEP/DII+ teve comportamento diferente da CEP/ CEP/ DII - que que que que teve comportamento semelhante ao da CBP, o que pode sugerir que a maior frequência do p-ANCA atípico e do anti-PR3 esteja mais associada à DII do que à CEP; 2) Quanto à reatividade dos ANCAs, pacientes com HAI-1 e HAI-3 tiveram características semelhante entre si e diferente do da HAI-2; 3) Não houve concordância entre os resultados da IFI para os padrões c-ANCA e p-ANCA clássicos e os do ELISA anti-PR3 e anti-MPO; 4) A melhor concordância de leitura dos padrões do ANCA foi para o p-ANCA atípico, porque a maioria dos soros com esse padrão não teve reatividade nem para o anti-PR3 nem para o anti-MPO por ELISA; 5) Para doenças do aparelho digestivo (DII, CEP e HAI) é difícil relacionar os padrões do ANCA obtidos na imunofluorescência indireta com a reatividade observada nos ELISAs comerciais / Background: The antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) has 3 main subtypes according to the pattern observed by indirect immunofluorescence (IIF) on ethanol and formalin fixed human neutrophils. The cANCA has a strong association to a neutrophil enzyme proteinase 3 (PR3), while the classical pANCA has a strong association to myeloperoxidase (MPO), catepsin G, elastase, lactoferrin, lysozyme. Autoimmune hepatitis (AIH), primary sclerosing cholangitis (PSC) and inflammatory bowel disease (IBD), shows another pattern called atypical pANCA that does not react to the enzymes PR3 and MPO. Aims: Determine the frequency of different types of ANCA in PSC, with or without association to IBD (PSC/IBD+, PSC/IBD-); 3 AIH subtypes (AIH type 1, with antismooth muscle antibody (ASMA) with the tubular pattern and with or without antinuclear antibody (ANA); AIH type 2, with anti-LKM1 antibody; AIH anti-Soluble liver antigen/liver pancreas antigen (anti-SLA/LP), with or without ANA associated); primary biliary cholangites (CBP) and healthy controls. Methods: we studied 249 patients (42 PSC/IBD+; 33 PSC/IBD-; 31 AIH-1; 30 AIH-2; 31 HAI antiSLA/LP; 52 CBP; 30 healthy controls). The serum sample of these patients were processed with the INOVAÒ commercial kits: ANCA Etanol, Quanta LiteTM MPO ELISA, Quanta LiteTM PR3 ELISA, Quanta LiteTM FAN HEp-2; and human neutrophil slides ethanol fixed in house. Statistical analysis were performed using the Fisher Test, with Holm correction when nedeed, McNemar and Kappa Test. Results: The classical pANCA were present in 1.9% (IC 95%: 0 - 11.07) CBP patients and 7.1% (IC 95%: 1.77 - 19.7) of PSC/IBD+ patients. There were no statistical significance between groups. The atypical pANCA were identified in 62 out of 249 samples (24.9%). It were more frequently detected in PSC/IBD+ (52.4%, IC 95%: 37.72-66.6) then in PSC/IBD- (21.2%, IC 95%: 10.38 - 38.05), p = 0.005. The Fisher test did not show statistical significance between PSC/IBD+ and CBP for atypical pANCA reactivity (21.2%, IC 95%: 10.38-38.05 versus 15.4%, IC 95%: 7.74 - 27.79), p = 0.56. However, there was statistical significance for atypical pANCA between AIH subtypes, p < 0,001. Among AIH subtypes, the atypical pANCA were more frequent in AIH-1 than in AIH-2 (45.2%, IC 95%: 29.15 - 62.24 versus 3.3%, IC 95%: 0 - 18.09, p < 0.001) and more frequent in AIH-3 than in AIH-2 (32.3%, IC 95%: 18.46-49.97 versus.3.3%, IC 95%: 0 - 18.09, p = 0.012). There were no statistical diference between AIH-1 e a AIH-3 (p = 0.434).None of the 30 healthy controls showed the atypical pANCA pattern. The classical cANCA were present in just 3 of 249 patient samples (1.2%), 1 CBP, 1 PSC/IBD+ and 1 AIH-1. The atypical cANCA is rarely described in the literature. We identified just 2 samples with the atypical cANCA of 249 samples (0.8%), one PSC/IBD+ patient and another AIH-2 patient. 14 out of 249 samples (5.6%), showed a positive fluorescence on ethanol fixed slides, even though we couldn\'t define a ANCA pattern because of the ANA interference. However, the Fisher test did not show a statistical significance between the studied groups (among AIH subtypes, p= 0.207 and PSC/IBD+ versus PSC/IBD-, p = 0.945). Antibodies against proteinase-3, that is considered the classical cANCA target, we detected 25 out of 249 samples (10.0%). The anti-PR3 were more frequent in PSC/IBD+ (31.0%, IC 95%: 22.94-50.88) than in PSC/IBD- (12.1%, IC 95%:4.52-29.46), p = 0,025. Antibodies against antimyeloperoxidase, one of the target antigens of the classical pANCA, were identified in 8 out of 249 samples (3.2%). The overall ELISA results, adding the anti-PR3 and anti-MPO, show that this autoantibodies were more frequent in PSC among the other groups, mainly PSC/IBD+ (p= 0.002). It is worth mentioning that PSC/IBD+ 2 patients showed simultaneously anti-PR3 and anti-MPO reactivity. If we consider atypical pANCA as atypical pANCA by IIF and negative ELISA (anti-MPO and anti-PR3), 49 out of 249 samples (19.7%), The Fisher test showed a difference statistical significance in atypical pANCA IIF+/ELISA- between PSC/IBD+ (35.7%, IC 95%: 22.94 - 50.88) and PSC/IBD- (12.1%, IC 95%:4.21 - 27.93), p = 0,018. The Fisher test did not show significant difference between PSC/IBD- and CBP (13.5%, IC 95%: 6.37 - 25.58), p = 1. The same test showed statistical significance reactivity of ANCA IIF+/ELISA- among AIH subtypes (p=0,001), been more frequent in AIH-1 then in AIH-2 (p = 0.001) and among AIH-3 versus AIH-2 (p = 0.025). There was no statistical difference among AIH-1 versus AIH-3, p = 0,426. Conclusion:SC/IBD+ had a different serological pattern compared with PSC/IBD-, since atypical p-ANCA and anti-PR3 antibodies were significantly more frequent in the former. According to the ANCA profile, PSC/IBD- had a similar behavior to PBC which may suggest that atypical p-ANCA and anti-PR3 antibodies are more associated with IBD than with PSC. Patients with ASMA AIH and with anti-SLA/LP had higher frequency of atypical p-ANCA than anti-LKM1 AIH; There was no concordance between the results of indirect immunofluorescence and those of ELISA. Then, the results of ANCA by immunofluorescence are completely observer-dependent

Os mecanismos fisiopatológicos associados aos efeitos benéficos da reanimação guiada pela saturação venosa mista de oxigênio (SvO2) durante a sepse não são claros. Nosso objetivo foi avaliar os efeitos de um algoritmo de reanimação guiado pela SvO2 incluindo fluidos, noradrenalina e dobutamina na hemodinâmica, resposta inflamatória e estresse oxidativo cardiovascular durante um modelo experimental que se assemelha clinicamente ao choque séptico. Dezoito porcos anestesiados e cateterizados (35-45 kg) foram submetidos à peritonite por inoculação fecal (0,75 g/Kg). Depois de permanecerem hipotensos, antibióticos foram administrados e os animais foram randomizados em dois grupos: controle (n=9), com suporte hemodinâmico visando pressão venosa central de 8-12 mmHg, débito urinário de 0,5 ml/kg por hora, e pressão arterial média acima de 65 mmHg; e grupo SvO2 (n=9), com os objetivos acima referidos, além de SvO2 acima de 65%. As intervenções duraram 12 hs e incluíram Ringer Lactato e norepinefrina (ambos os grupos) e dobutamina (grupo SvO2). A resposta inflamatória foi avaliada pela concentração plasmática de citocinas, expressão de CD14 de neutrófilos, geração de espécies reativas de oxigênio e apoptose. O estresse oxidativo foi avaliado pelas concentrações de nitratos no miocárdio e no plasma, a atividade miocárdica e vascular de NAD(P)H oxidase, conteúdo de glutationa do miocárdio e expressão de nitrotirosina. A reanimação guiada por SvO2 foi associada com melhor índice sistólico, oferta de oxigênio e diurese. A sepse induziu em ambos os grupos um aumento significativo na concentração de IL-6, nas concentrações de nitrato de plasma e diminuição persistente na expressão de CD14 em neutrófilos. A apoptose e a geração de espécies reativas de oxigênio por neutrófilos não foram diferentes entre os grupos. As estratégias de tratamento não alteraram significativamente os parâmetros de estresse oxidativo. Assim, uma abordagem destinada a otimizar a SvO2 durante a sepse melhora a hemodinâmica, porém sem qualquer efeito significativo sobre a resposta inflamatória e estresse oxidativo. Os efeitos benéficos associados a esta estratégia podem estar relacionados a outros mecanismos. / The pathogenetic mechanisms associated to the beneficial effects of mixed venous oxygen saturation (SvO2)-guided resuscitation during sepsis are unclear. Our purpose was to evaluate the effects of an algorithm of SvO2-driven resuscitation including fluids, norepinephrine and dobutamine on hemodynamics, inflammatory response and cardiovascular oxidative stress during a clinically resembling experimental model of septic shock. Eighteen anesthetized and catheterized pigs (35-45 Kg) were submitted to peritonitis by fecal inoculation (0.75 g/Kg). After hypotension, antibiotics were administered, and the animals were randomized to two groups: control (n=9), with hemodynamic support aiming central venous pressure 8 to 12 mmHg, urinary output 0.5 ml/Kg per hour, and mean arterial pressure greater than 65 mmHg; and group SvO2 (n =9), with the goals above, plus SvO2 greater than 65%. The interventions lasted 12 h, and lactated Ringer\'s and norepinephrine (both groups) and dobutamine (SvO2 group) were administered. Inflammatory response was evaluated by plasma concentration of cytokines, neutrophil CD14 expression, oxidant generation, and apoptosis. Oxidative stress was evaluated by plasma and myocardial nitrate concentrations, myocardial and vascular NAD(P)H oxidase activity, myocardial glutathione content, and nitrotyrosine expression. Mixed venous oxygen saturation-driven resuscitation was associated with improved systolic index, oxygen delivery, and diuresis. Sepsis induced in both groups a significant increase on IL-6 concentrations and plasma nitrate concentrations and persistent decrease in neutrophil CD14 expression. Apoptosis rate and neutrophil oxidant generation were not different between groups. Treatment strategies did not significantly modify oxidative stress parameters. Thus, an approach aiming SvO2 during sepsis improves hemoynamics, without any significant effect on inflammatory response and oxidative stress. The beneficial effects associated with this strategy may be related to other mechanisms