L’immunité innée antivirale repose en grande partie sur la production des interférons de type I (IFN-α/β) par les cellules infectées et les cellules immunitaires. Cette synthèse résulte de la reconnaissance de motifs viraux caractéristiques par des récepteurs cellulaires, parmi lesquels les RIG-I-Like Récepteurs (RLR) et le Toll-Like Récepteur 3 (TLR3) détectent l’ARN viral respectivement au niveau du cytosol et des endosomes. La signalisation induite par les RLRs et TLR3 conduit à l’activation d’IRF3 et de NF-κB, deux facteurs de transcription impliqués respectivement dans la production d’IFN-α/β et de cytokines pro-inflammatoires. TBK1 (TANK-Binding Kinase 1) joue un rôle essentiel dans l’immunité innée antivirale, de par la phosphorylation du facteur de transcription IRF3, nécessaire à la production des IFNs de type I. Bien que de nombreuses études aient montré le rôle crucial de cette kinase dans la signalisation antivirale, le processus entrainant son activation est encore mal déterminé à ce jour. Lors de cette étude nous avons démontré que suite à la stimulation du TLR3 et des RLRs, la forme active, ubiquitinylée et phosphorylée, de TBK1 se relocalise au niveau de l’appareil de golgi, grâce à son ubiquitination sur les résidus K30 et K401. Ce mécanisme implique la reconnaissance des chaines d’ubiquitines associées à TBK1 par l’Optineurine (OPTN), permettant la formation d’un complexe autorisant le rapprochement des molécules de TBK1 puis la trans-autophosphorylation au niveau de l’appareil de Golgi. Au cours de ce travail nous avons également découvert qu’OPTN est la cible d’une protéine virale, la protéine NS3 du BTV (Bluetongue Virus), qui neutralise son activité et diminue ainsi l’activation de TBK1 et la signalisation responsable de la sécrétion de cytokines antivirales. / Type-I interferons (IFN-α/β) production and release is a major event in innate antiviral immunity. IFN production depends on the interaction between viral structures and their corresponding cellular sensors. RIG-I-Like Receptors (RLRs) and Toll-Like Receptor 3 (TLR3) sense dsRNAs in the cytosol and endosomes respectively. Stimulation of these receptors by their ligands promotes a signal transduction leading to the activation of the transcription factors NF-κB and IRF3, and consequently to the production of proinflammatory cytokines and Type I Interferons (IFN-I). TBK1 (TANK-Binding Kinase 1), plays a crucial role in antiviral innate immunity, by phosphorylating the transcription factor IRF3, required for the production of type I IFNs. Although many studies have shown the critical role of this kinase in antiviral signaling, the molecular mechanism of its activation are largely unknown. We report here the localization of the ubiquitinated and phosphorylated active form of TBK1 to the Golgi apparatus after the stimulation of RLRs or TLR3, due to TBK1 ubiquitination on lysine residues 30 and 401. The ubiquitin-binding protein optineurin (OPTN) recruits ubiquitinated TBK1 to the Golgi apparatus, leading to the formation of complexes in which TBK1 is activated by trans-autophosphorylation. We also found that a viral protein binds OPTN at the Golgi apparatus, neutralizing its activity and thereby decreasing TBK1 activation and downstream signaling.

Le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), responsable du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA), a touché environ 70 millions d’individus, dont environ la moitié en sont morts. Bien qu’il existe aujourd’hui des traitements efficaces pour prévenir la progression du SIDA, il n’y a actuellement ni vaccin, ni traitement qui ne guérisse complètement. Les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) permettent de limiter l’établissement de l’infection en sécrétant des quantités importantes d’interféron de type I (IFN-I) en réponse à la détection du VIH. L’IFN-I permet non seulement d’établir un environnement antiviral, mais aussi d’amorcer la réponse immunitaire innée. Cette réponse des pDCs est régulée notamment par le récepteur immunoglobulin-like transcript 7 (ILT7) dont l’activation par son ligand, bone marrow stromal antigen 2 (BST2), réprime la production d’IFN. BST2 est par ailleurs un facteur de restriction du VIH-1 qui agit en retenant les particules virales à la surface des cellules infectées, limitant ainsi la dissémination du virus. La protéine accessoire Vpu du VIH-1 contrecarre l’action de BST2 sur la relâche virale par une régulation négative des niveaux de surface et par un déplacement hors des sites d’assemblages viraux. Ce déplacement, qui permet l’activation d’ILT7 par BST2, a un rôle double, soit d’augmenter la relâche virale par les cellules infectées, mais aussi de limiter la production d’IFN-I par les pDCs. Par une analyse de variants de Vpu provenant de souches pandémiques et non pandémiques du VIH-1, cette étude indique que cette fonction de Vpu est majoritairement associée au groupe pandémique M avec l’exception notable du sous-groupe C, responsable d’environ la moitié des infections mondiales. Ce phénotype des variants du sous-groupe C est associé à une incapacité à déplacer BST2 dans des cellules T infectées. Des analyses fonctionnelles où des cellules infectées détectées par des pDCs révèlent cependant que les protéines Vpu incapables d’augmenter l’activation d’ILT7 médiée par BST2 ont possiblement développé d’autres mécanismes pour limiter la production d’IFN-I par les pDCs, par exemple la limitation des contacts entre les cellules infectées et les pDCs afin de réduire la détection. / Human immunodeficiency virus (HIV), which is responsible for acquired immune deficiency syndrome (AIDS) has infected over 70 million people, approximately half of which have died from the illness. While there are treatments today that can prevent progression towards AIDS, there is currently no vaccine and no treatment that would completely cure people living with HIV. Plasmacytoid dendritic cells (pDC) limit the establishment of the infection by producing large amounts of type-I IFN (IFN-I) after sensing HIV. IFN-I not only establishes an antiviral environment, but also initiates the innate immune response. This pDC response is regulated, in part, by the pDC-specific receptor immunoglobulin-like transcript 7 (ILT7), which inhibits IFN-I production, upon engagement of its ligand, bone marrow stromal antigen 2 (BST2). BST2 is also an HIV host restriction factor that tethers budding virions at the surface of the infected cell, to limit spread. The HIV-1 accessory protein Vpu counteracts BST2’s restriction through downregulation at the cell surface and displacement away from viral assembly sites. This displacement, which enables ILT7 activation, has a double role: relieving the restriction by BST2 on viral release and repressing IFN-I by pDCs. We screened Vpu variants from pandemic and non-pandemic HIV-1 strains, and found that this function is mostly present in the pandemic group M, although not in variants from clade C which are responsible for half of the global infections. This phenotype in the clade C variants tested was associated with an inability to efficiently displace BST2 in infected T cells. Functional analyses in sensing assays, however, reveal that Vpu variants unable to enhance BST2-mediated ILT7 activation may have evolved compensatory mechanisms to dampen IFN-I production by p

L’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) est une pathologie redoutable résultant fréquemment de la rupture d’un anévrisme intracrânien. Elle est associée à une mortalité élevée et d’importants déficits neurologiques. Le saignement entraîne l’augmentation de la pression intracrânienne, la diminution du flux cérébral sanguin, l’apparition de l’inflammation cérébrale et la mort neuronale. Ces évènements de la phase d’insulte cérébrale précoce (72 premières heures) conditionnent le devenir du patient. Le vasospasme était initialement considéré comme la cause principale des ischémies cérébrales retardées (DCI), mais sa diminution pharmacologique n’a montré aucun bénéfice pour les patients. Cependant, l’infiltration rapide des leucocytes dans le SNC suivant le saignement semble impliquée dans le développement des DCI. Notre hypothèse est que l’activation précoce du système immunitaire à la suite de l’HSA est responsable de la mort neuronale retardée et de la survenue des déficits constatés chez les patients souffrant d’HSA. Nos buts étaient de caractériser la contribution des leucocytes dans l’inflammation cérébrale et la mort neuronale dans un modèle murin d’HSA, de moduler cette inflammation par l’utilisation de la protéine MFG-E8, une protéine anti-inflammatoire favorisant la clairance apoptotique, et de confirmer la présence d’une signature immunologique comparable chez les patients HSA. Notre modèle murin nous a permis d’induire chirurgicalement l’HSA et d’injecter par voie intrapéritonéale la protéine MFG-E8. La composition cellulaire du sang (humain et murin) et du cerveau des souris a été analysée par cytométrie en flux. Le plasma (humain et murin) et le liquide céphalo-rachidien (LCR) des patients ont été analysés par dosage cytokinique. Certains cerveaux de souris étaient inclus en paraffine pour l’imagerie par microscopie confocale. La lignée cellulaire de microglie nous a permis d’étudier la modulation de la capacité de phagocytose et de production de ROS par l’exposition au sérum ou au LCR de patients HSA. Dans une première étude, nous avons démontré le rôle de l’inflammation cérébrale précoce dans le développement de la mort neuronale et des symptômes chez les souris HSA. Nous avons également caractérisé la présence de marqueurs inflammatoires systémiques chez les patients HSA. Dans une deuxième étude, nous avons montré que le traitement par la protéine MFG-E8 chez les souris HSA entraînait la diminution de l’inflammation périphérique ainsi que de la présence des marqueurs M1, de l’activation des astrocytes et de la mort neuronale dans le cerveau aboutissant à la diminution de la sévérité des symptômes. L’étude de l’activation immunitaire chez les patients HSA, nous a permis d’observer une signature immunologique similaire à notre modèle murin. Nous avons montré que les patients HSA présentaient une augmentation des cellules immunitaires innées et une immunodépression lymphocytaire en comparaison avec des donneurs sains. Nous avons également décrit l’importance du grade et du genre des patients par la caractérisation d’un profil inflammatoire plus sévère chez les patients hauts gradés et chez les hommes. Finalement, nos résultats confirment l’existence d’une signature immunologique similaire entre les patients HSA et notre modèle murin aboutissant, dans les deux cas, à l’augmentation de l’activation de l’inflammation systémique et cérébrale. Cette signature immunologique est dépendante du sexe et du grade des patients. La diminution de la gravité des symptômes par le traitement avec la protéine MFG-E8 dans notre modèle souris confirme l’implication incontestable de l’inflammation dans l’apparition des déficits moteurs secondaires à la mort neuronale, et le potentiel thérapeutique de cette protéine MFG-E8 dans le développement de nouvelles thérapies. / Subarachnoid hemorrhage (SAH) is a redoubtable pathology resulting frequently from the rupture of an intracranial aneurysm. It is associated to an important mortality and severe neurologic deficits. The bleeding leads to an increase in the intracranial pressure, to a decrease in cerebral blood flow, to the development of cerebral inflammation and to neuronal death. These events of early brain injury (first 72 hours) determine the patient’s prognosis. The vasospasm was first thought to be the main cause of delayed cerebral ischemia (DCI), but its pharmacological decrease was not being associated to any benefits for the patients. However, rapid leucocytic infiltration in the CNS secondary to the bleeding seems implicated in the development of DCI. Our hypothesis is that the early immune system activation in SAH is responsible for delayed neuronal death and for the onset of symptoms in SAH patients. Our goals were to characterize the contribution of leucocytes in cerebral inflammation and neuronal death in our SAH mice model, to modulate the inflammation by using MFG-E8 protein, an anti-inflammatory protein promoting the apoptotic clearance, and to confirm this similar immunologic signature in SAH patients. Our mouse model allows us to surgically induce SAH and to inject the MFG-E8 protein by intraperitoneal injection. The cellular composition of blood (human and mouse) and of mouse brains were analyzed by flow cytometry. The plasma (human and mouse) and the cerebrospinal fluid (CSF) were analyzed by cytokine assay. Some mice brains were paraffin-embedded for confocal microscopy imaging. Microglia cell lines allowed us to evaluate the modulation of phagocytosis and reactive oxygen species (ROS) production secondary to the exposition to SAH patients’ serum and CSF. In the first study, we have demonstrated the impact of early cerebral inflammation on neuronal death and the occurrence of symptoms in SAH mice. We also have characterized the presence of systemic inflammatory markers in SAH patients. In the second study, we have shown that MFG-E8 protein treatment in our SAH mice model is linked to a decrease in peripheric inflammation as well as to a decrease of M1 markers, astrocytic activation and neuronal death in the brain leading to a decrease of symptoms severity. iv The study of immune activation in SAH patients allowed us to observe an immune signature like in our mouse model. We have revealed that SAH patients have an increase in innate immune cells and in lymphocytic immunosuppression in comparison to healthy donors. We have also described the importance of gender and SAH grade by the characterization of a more severe inflammatory profile in high-grade and in male patients. To conclude, our results confirm the existence of a similar immune signature between SAH patients and our mouse model leading in both cases to an increase in systemic and cerebral inflammation. This immunologic signature depends on the patients’ gender and on the grade of SAH. The decrease of symptom severity with MFG-E8 protein treatment in our mice model confirms the unquestionable implication of inflammation in the occurrence of motor deficits secondary to neuronal death and the therapeutic potential of MFG-E8 for the development of new therapies.

Les neutrophiles jouent un rôle central dans la défense de l'hôte contre les infections et les lésions tissulaires. Les neutrophiles intègrent des signaux opposés au sein du microenvironnement inflammatoire, qui convergent vers des récepteurs sélectionnés. Parmi ces récepteurs se trouve le récepteur pléiotrope, le récepteur du formyle peptide 2/récepteur de la lipoxine (FPR2/ALX) qui peut reconnaître plus de 20 ligands protéiques, peptidiques et lipidiques structurellement divers. Parmi ces ligands se trouvent des peptides N-formylés libérés par les mitochondries de cellules hôtes mourantes ou mortes. À l'heure actuelle, on sait peu de choses sur la base moléculaire de la façon dont FPR2/ALX intègre des signaux opposés et déclenche diverses réponses biologiques. Nous avons constaté que le récepteur pléiotrope FPR2/ALX intègre des signaux opposés qui régissent la phagocytose, la destruction bactérienne, le sort des neutrophiles et, finalement, le résultat de la réponse inflammatoire. Cette action des peptides N-formylés est médiée par l'induction de la libération d'élastase neutrophile à partir des granules primaires et la régulation négative subséquente du récepteur C5a du complément à la surface cellulaire, qui peut être inversée par des médiateurs lipidiques pro-résolvants, déclenchée par l'aspirine 15-épi- lipoxine A4 (15-epi-LXA4) et 17-épi-résolvine D1 (17-epi-RvD1). Cela peut contribuer au développement de nouvelles stratégies pharmacologiques visant à améliorer les mécanismes de protection médiés par FPR2/ALX qui peuvent limiter la réponse inflammatoire et favoriser la résolution de l'inflammation. / Neutrophils play a central role in host defense against infection and tissue injury. PMNs integrate opposing cues within the inflammatory microenvironment, which converge on selected receptors. Among these receptors is the pleiotropic receptor, formyl peptide receptor 2/lipoxin receptor (FPR2/ALX), which can recognize over 20 structurally diverse proteins, peptides, and lipid ligands. Among these ligands are N-formylated peptides released from mitochondria of dying or dead host cells. At present, little is known about the molecular basis for how FPR2/ALX integrates opposing cues and triggers diverse biological responses. We wanted to test the effect of N-formylated peptides on human neutrophils' functions in sepsis-like syndrome. We found that the pleiotropic receptor FPR2/ALX integrates opposing signals that govern phagocytosis, bacterial killing, the fate of neutrophils, and ultimately the outcome of the inflammatory response. This action of N-formylated peptides is mediated through induction of the release of neutrophil elastase from the primary granules and subsequent downregulation of complement C5a receptor on the cell surface. This effect can be reversed by pro-resolving lipid mediators, aspirin-triggered 15-epi-lipoxin A4 (15-epi-LXA4) and 17-epi-resolvin D1 (17-epi-RvD1). Our results could lead to the development of novel pharmacological strategies to enhance FPR2/ALX-mediated protective mechanisms that may limit the inflammatory response and promote the resolution of inflammation.

Réalisé en cotutelle avec le Dr James G Martin de l'Université McGill (Meakins-Christie laboratories) / L’asthme chez l’homme et le souffle chez le cheval sont des maladies inflammatoires chroniques des voies respiratoires partageant plusieurs caractéristiques physiopathologiques dont la bronchoconstriction réversible, l’inflammation des voies respiratoires inférieures, l’hyperréactivité bronchique et le remodelage tissulaire. Les phénotypes cliniques d’asthme se caractérisent en partie selon le type d’inflammation affectant les voies respiratoires et la présence ou non d’allergie. Le souffle chez le cheval s’avère être un modèle adapté pour l’étude des mécanismes impliqués dans l’asthme neutrophilique, lesquels demeurent particulièrement mal compris, en contraste avec ceux associés avec l’asthme éosinophilique. La réponse immunologique sous-jacente au souffle implique entre autres l’expression de cytokines de type Th2, suggestives d’une réponse allergique (immunité acquise). La poussière environnementale qui provoque les symptômes du souffle contient également des agents non-spécifiques dérivés de bactéries, champignons et moisissures, susceptibles d’activer des mécanismes immunitaires innés chez les chevaux atteints du souffle. Nous avons étudié le rôle des neutrophiles dans l’inflammation associée à la réponse innée et acquise chez le cheval atteint du souffle. Dans un premier temps, l’effet de produits dérivés de bactéries sur l’activation des neutrophiles sanguins provenant de chevaux normaux et atteints de souffle a été étudié dans le but d’évaluer la contribution de la réponse innée dans la physiopathologie du souffle. Nous avons évalué l’effet de l’IL-4, une cytokine de type Th2, sur les neutrophiles des deux groupes de chevaux afin d’évaluer de quelle manière le neutrophile peut participer à la réponse acquise associée à la réponse allergique. Finalement, nous avons étudié l’expression des isoformes de l'arginase par les neutrophiles équins car cette enzyme métabolise la L-arginine et est potentiellement impliquée dans le bronchospasme et le remodelage tissulaire associés à l’asthme. Nos résultats suggèrent que les neutrophiles et les mononucléaires sanguins isolés des chevaux atteints du souffle possèdent une réponse inflammatoire exagérée en réponse aux lipopolyssacharides et peptides formylés et surexpriment les cytokines pro-inflammatoires IL-1β, TNF et IL-8. Cette réponse innée aberrante est associée à une inflammation systémique caractérisée par des concentrations sériques élevées de TNF chez les chevaux atteints du souffle en période de rémission clinique. De plus, nos résultats montrent que l’IL-4 active le neutrophile équin et favorise son chimiotactisme de manière autocrine. L’IL-4 induit un phénotype d’activation typique dans le neutrophile équin, caractérisé par l’expression accrue des cytokines pro-inflammatoires (IL-8 et TNF) ainsi que de récepteurs potentiellement impliqués dans la réponse allergique (IL-4Rα et CD23). Enfin, nous montrons que que l’arginase 1 n’est pas un marqueur de l’activation des neutrophiles équins par l’IL-4, mais que ces cellules expriment constitutivement l’isoforme 2 fonctionnelle de l’arginase. La surrégulation des deux isoformes au niveau des poumons périphériques semble être associée à la pathologie du souffle, ce qui est en accord avec les modèles d’asthme chez la souris, le rat et le cobaye. L'ensemble de ces travaux suggère que les neutrophiles sont des cellules effectrices importantes de la réponse innée et acquise dans la pathophysiologie du souffle, un modèle naturel d’asthme neutrophilique. / Human asthma and equine heaves are chronic pulmonary diseases sharing several pathophysiological properties including lower airway inflammation, reversible bronchoconstriction, bronchial hyperresponsiveness, and tissue remodeling. Clinical phenotypes of asthma are characterized in part by the inflammatory cell populations infiltrating the airways, and the presence or absence of allergy. Heaves is a suitable animal model for the study of the poorly defined pathophysiological processes leading to airway neutrophilia. The immune response in heaves involves Th2 cytokine expression, which is, among other features, associated to allergic inflammation (acquired immunity). Environmental dust exposure leading to clinical exacerbation of heaves contains non-specific agents derived from bacteria, molds or fungi which could also activate innate immune responses in heaves affected horses. We studied the role of neutrophils in innate and acquired immune responses in heaves affected-horse. First, innate immune responses of neutrophils isolated from normal and heaves-affected horses to bacterial-derived products were studied. We also assessed the effect of IL-4, a Th2 cytokine, on equine neutrophils isolated from both groups of horses. Finally, we evaluated the arginase isoforms expressed by equine neutrophils as this enzyme that takes part to the L-arginine metabolism and is thought to contribute to bronchospasm and tissue remodeling associated with asthma. Our results suggest that both neutrophils and mononuclear cells from heaves-affected horses, when compared to healthy horses, have an excessive inflammatory response to lipopolyssacharides and formylated peptides characterized by increased IL-1β, IL-8 and TNF expression. This altered innate response was associated with systemic inflammation in asymptomatic susceptible horses as high serum TNF concentrations were detected. Furthermore, we found that equine neutrophils are activated by IL-4 and release neutrophil chemotactic factors in response to this cytokine. IL-4 also induces a distinctive activation phenotype in neutrophils that is characterized by increased expression of the pro-inflammatory cytokines (IL-8 and TNF) and receptors (IL-4Rα and CD23) potentially involved in the allergic response. Finally, we showed that arginase 1 is not a marker of IL-4-activated equine neutrophils although they constitutively express a functionally active isoform 2 of the enzyme. The up-regulation of arginase isoforms in the peripheral lungs of horses with heaves suggests a role for arginase in this model, as it is described in the mouse, rat and guinea pig models. Taken together, this work suggest that neutrophils could play an important role in both innate and acquired immune responses associated with heaves pathophysiology, a natural model of neutrophilic asthma.

Le diabète de type 2 (DT2) est caractérisé par une résistance des tissus périphériques à l’action de l’insuline et par une insuffisance de la sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas. Différents facteurs tels que le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’immunité innée affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Toutefois, leur implication dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline demeure imprécise. Le but de cette thèse était d’identifier et de caractériser le rôle du stress du RE et de l’immunité innée dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline. Les cellules β-pancréatiques ont un RE très développé, conséquence de leur fonction spécialisée de biosynthèse et de sécrétion d’insuline. Cette particularité les rend très susceptible au stress du RE qui se met en place lors de l’accumulation de protéines mal repliées dans la lumière du RE. Nous avons montré qu’ATF6 (de l’anglais, activating transcription factor 6), un facteur de transcription impliqué dans la réponse au stress du RE, lie directement la boîte A5 de la région promotrice du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans isolés de rat. Nous avons également montré que la surexpression de la forme active d’ATF6α, mais pas ATF6β, réprime l’activité du promoteur de l’insuline. Toutefois, la mutation ou l’absence de la boîte A5 ne préviennent pas l’inhibition de l’activité promotrice du gène de l’insuline par ATF6. Ces résultats montrent qu’ATF6 se lie directement au promoteur du gène de l’insuline, mais que cette liaison ne semble pas contribuer à son activité répressive. Il a été suggéré que le microbiome intestinal joue un rôle dans le développement du DT2. Les patients diabétiques présentent des concentrations plasmatiques élevées de lipopolysaccharides (LPS) qui affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Nous avons montré que l’exposition aux LPS entraîne une réduction de la transcription du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans de rats, de souris et humains. Cette répression du gène de l’insuline par les LPS est associée à une diminution des niveaux d’ARNms de gènes clés de la cellule β-pancréatique, soit PDX-1 (de l’anglais, pancreatic duodenal homeobox 1) et MafA (de l’anglais, mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). En utilisant un modèle de souris déficientes pour le récepteur TLR4 (de l’anglais, Toll-like receptor), nous avons montré que les effets délétères des LPS sur l’expression du gène de l’insuline sollicitent le récepteur de TLR4. Nous avons également montré que l’inhibition de la voie NF-kB entraîne une restauration des niveaux messagers de l’insuline en réponse à une exposition aux LPS dans les îlots de Langerhans de rat. Ainsi, nos résultats montrent que les LPS inhibent le gène de l’insuline dans les cellules β-pancréatiques via un mécanisme moléculaire dépendant du récepteur TLR4 et de la voie NF-kB. Ces observations suggèrent ainsi un rôle pour le microbiome intestinal dans la fonction de la cellule β du pancréas. Collectivement, ces résultats nous permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la répression du gène de l'insuline en réponse aux divers changements survenant de façon précoce dans l’évolution du diabète de type 2 et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui permettraient de prévenir ou ralentir la détérioration de l'homéostasie glycémique au cours de cette maladie, qui affecte plus de deux millions de Canadiens. / Type 2 diabetes is characterized by insulin resistance and impaired insulin secretion from the pancreatic β-cell. Endoplasmic reticulum (ER) stress and innate immunity have both been reported to alter pancreatic β-cell function. However, it is not clear whether these factors can affect the transcription of the insulin gene. The aim of this thesis was to assess the role of ER stress and innate immunity in the regulation of the insulin gene. Pancreatic β-cells have a well-developed endoplasmic reticulum (ER) due to their highly specialized secretory function to produce insulin in response to glucose and nutrients. In a first study, using several approaches we showed that ATF6 (activating transcription factor 6), a protein implicated in the ER stress response, directly binds to the A5/Core of the insulin gene promoter in isolated rat islets. We also showed that overexpression of the active (cleaved) fragment of ATF6α, but not ATF6β, inhibits the activity of an insulin promoter-reporter construct. However, the inhibitory effect of ATF6α was insensitive to mutational inactivation or deletion of the A5/Core. Therefore, although ATF6 binds directly to the A5/Core of the rat insulin II gene promoter, this direct binding does not appear to contribute to its repressive activity. In recent years, the gut microbiota was proposed has an environmental factor increasing the risk of type 2 diabetes. Subjects with diabetes have higher circulating levels of lipopolysaccharides (LPS) than non-diabetic patients. Recent observations suggest that the signalling cascade activated by LPS binding to Toll-Like Receptor 4 (TLR4) exerts deleterious effects on pancreatic β-cell function; however, the molecular mechanisms of these effects are incompletely understood. We showed that exposure of isolated human, rat and mouse islets of Langerhans to LPS dose-dependently reduced insulin gene expression. This was associated in mouse and rat islets with decreased mRNA expression of two key transcription factors of the insulin gene, PDX-1 (pancreatic duodenal homeobox 1) and MafA (mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). LPS repression of insulin, PDX-1 and MafA expression was not observed in islets from TLR4-deficient mice and was completely prevented in rat islets by inhibition of the NF-kB signalling pathway. These results demonstrate that LPS inhibits β-cell gene expression in a TLR4-dependent manner and via NF-kB signaling in pancreatic islets, suggesting a novel mechanism by which the gut microbiota might affect pancreatic β-cell function. Our findings provide a better understanding of the molecular mechanisms underlying insulin gene repression in type 2 diabetes, and suggest potential therapeutic targets that might prevent or delay the decline of β-cell function in the course of type 2 diabetes, which affects more than two million Canadians.

Les virus ont besoin d’interagir avec des facteurs cellulaires pour se répliquer et se propager dans les cellules d’hôtes. Une étude de l'interactome des protéines du virus d'hépatite C (VHC) par Germain et al. (2014) a permis d'élucider de nouvelles interactions virus-hôte. L'étude a également démontré que la majorité des facteurs de l'hôte n'avaient pas d'effet sur la réplication du virus. Ces travaux suggèrent que la majorité des protéines ont un rôle dans d'autres processus cellulaires tel que la réponse innée antivirale et ciblées pas le virus dans des mécanismes d'évasion immune. Pour tester cette hypothèse, 132 interactant virus-hôtes ont été sélectionnés et évalués par silençage génique dans un criblage d'ARNi sur la production interferon-beta (IFNB1). Nous avons ainsi observé que les réductions de l'expression de 53 interactants virus-hôte modulent la réponse antivirale innée. Une étude dans les termes de gène d'ontologie (GO) démontre un enrichissement de ces protéines au transport nucléocytoplasmique et au complexe du pore nucléaire. De plus, les gènes associés avec ces termes (CSE1L, KPNB1, RAN, TNPO1 et XPO1) ont été caractérisé comme des interactant de la protéine NS3/4A par Germain et al. (2014), et comme des régulateurs positives de la réponse innée antivirale. Comme le VHC se réplique dans le cytoplasme, nous proposons que ces interactions à des protéines associées avec le noyau confèrent un avantage de réplication et bénéficient au virus en interférant avec des processus cellulaire tel que la réponse innée. Cette réponse innée antivirale requiert la translocation nucléaire des facteurs transcriptionnelles IRF3 et NF-κB p65 pour la production des IFNs de type I. Un essai de microscopie a été développé afin d'évaluer l’effet du silençage de 60 gènes exprimant des protéines associés au complexe du pore nucléaire et au transport nucléocytoplasmique sur la translocation d’IRF3 et NF-κB p65 par un criblage ARNi lors d’une cinétique d'infection virale. En conclusion, l’étude démontre qu’il y a plusieurs protéines qui sont impliqués dans le transport de ces facteurs transcriptionnelles pendant une infection virale et peut affecter la production IFNB1 à différents niveaux de la réponse d'immunité antivirale. L'étude aussi suggère que l'effet de ces facteurs de transport sur la réponse innée est peut être un mécanisme d'évasion par des virus comme VHC. / Viruses interact with cellular factors in order to successfully replicate and propagate in host cells. Germain et al. (2014) performed a proteomics analysis to elucidate viral-host interactors of hepatitis C virus (HCV). They found that the majority of host factors did not have an effect on viral replication, suggesting that these host proteins may be beneficial to the virus by affecting other cellular processes such as evading the innate antiviral immunity. To test that hypothesis, 132 virus-host interactors were selected and silenced by RNAi for their effect on inteferon-beta (IFNB1) production as a readout of the innate antiviral response. 53 were found to modulate the response with enrichment in the gene ontology (GO) terms related to nucleocytoplasmic transport and the nuclear pore complex. An interesting point is that the genes associated with these terms (CSE1L, KPNB1, RAN, TNPO1, and XPO1) were previously elucidated as HCV NS3/4A interactors by Germain et al. (2014), as well as positive regulators of the innate antiviral response. Although it is surprising that a cytoplasmic-replicating virus like HCV would interact with proteins associated with the nucleus, we proposed that viruses interact with these proteins for their benefit to interfere with the innate immune response. The innate antiviral response requires the nuclear translocation of IRF3 and NF-κB p65 for the production of type I interferons. As it is unclear which transporters or nucleoporins are involved, 60 genes associated with the nuclear pore complex and nucleocytoplasmic transport were studied for their effect on the nuclear translocation of IRF3 and NF-κB p65 via a microscopy-based RNAi screen during a 10-hour viral infection time course. Overall, the study revealed that many of these proteins are involved in the trafficking of these transcription factors during a viral infection, and can affect the production of IFNB1 at different levels of the innate antiviral response. The study also suggests that the effect of these transport factors on the immune response may be an evasion mechanism for viruses such as HCV.

Les cellules endothéliales (EC) constituent une première barrière physique à la dissémination de virus pléiotropiques circulant par voie hématogène mais leur contribution à la défense innée anti-virale est peu connue. Des dysfonctions des EC de la barrière hémato-encéphalique (BMEC) et des sinusoïdes hépatiques (LSEC) ont été rapportées dans des neuropathologies et des hépatites aiguës ou chroniques d’origine virale, suggérant que des atteintes à leur intégrité contribuent à la pathogenèse. Les sérotypes de coronavirus de l’hépatite murine (MHV), se différenciant par leur capacité à induire des hépatites et des maladies neurologiques de sévérité variable et/ou leur tropisme pour les EC, représentent des modèles viraux privilégiés pour déterminer les conséquences de l’infection des EC sur la pathogenèse virale. Lors d’infection par voie hématogène, le sérotype MHV3, le plus virulent des MHV, induit une hépatite fulminante, caractérisée par une réponse inflammatoire sévère, et des lésions neurologiques secondaires alors que le sérotype moins virulent, MHV-A59, induit une hépatite modérée sans atteintes secondaires du système nerveux central (SNC). Par ailleurs, le sérotype MHV3, à la différence du MHV-A59, démontre une capacité à stimuler la production de cytokines par la voie TLR2. Les variants atténués du MHV3, les virus 51.6-MHV3 et YAC-MHV3, sont caractérisés par un faible tropisme pour les LSEC et induisent respectivement une hépatite modérée et subclinique. Compte tenu de l’importance des LSEC dans le maintien de la tolérance hépatique et de l’élimination des pathogènes circulants, il a été postulé que la sévérité de l’hépatite et de la réponse inflammatoire lors d’infections par les MHV est associée à la réplication virale et à l’altération des propriétés tolérogéniques et vasculaires des LSEC. Les désordres inflammatoires hépatiques pourraient résulter d’une activation différentielle du TLR2, plutôt que des autres TLR et des hélicases, selon les sérotypes. D’autre part, compte tenu du rôle des BMEC dans la prévention des infections du SNC, il a été postulé que l’invasion cérébrale secondaire par les coronavirus est reliée à l’infection des BMEC et le bris subséquent de la barrière hémato-encéphalique (BHE). À l’aide d’infections in vivo et in vitro par les différents sérotypes MHV, chez des souris ou des cultures de BMEC et de LSEC, nous avons démontré, d’une part, que l’infection in vitro des LSEC par le sétotype MHV3, à la différence des variants 51.6- et YAC-MHV3, altérait la production du facteur vasodilatant NO et renversait leur phénotype tolérogénique en favorisant la production de cytokines et de chimiokines inflammatoires. Ces dysfonctions se traduisaient in vivo par une réponse inflammatoire incontrôlée et une dérégulation du recrutement intrahépatique de leucocytes, favorisant la réplication virale et les dommages hépatiques. Nous avons aussi démontré, à l’aide de souris TLR2 KO et de LSEC dont l’expression du TLR2 a été abrogée par des siRNA, que la sévérité de l’hépatite et de la réponse inflammatoire induite par le sérotype MHV3, dépendait en partie de l’induction et de l’activation préférentielle du TLR2 par le virus dans le foie. D’autre part, la sévérité de la réplication virale au foie et des désordres dans le recrutement leucocytaire intrahépatique induits par le MHV3, et non par le MHV-A59 et le 51.6-MHV3, corrélaient avec une invasion virale subséquente du SNC, au niveau de la BHE. Nous avons démontré que l’invasion cérébrale du MHV3 était associée à une infection productive des BMEC et l’altération subséquente des protéines de jonctions serrées occludine, VE-cadhérine et ZO-1 se traduisant par une augmentation de la perméabilité de la BHE et l’entrée consécutive du virus dans le cerveau. Dans l’ensemble, les résultats de cette étude mettent en lumière l’importance du maintien de l’intégrité structurale et fonctionnelle des LSEC et des BMEC lors d’infections virales aigües par des MHV afin de limiter les dommages hépatiques associés à l’induction d’une réponse inflammatoire exagérée et de prévenir le passage des virus au cerveau suite à une dissémination par voie hématogène. Ils révèlent en outre un nouveau rôle aggravant pour le TLR2 dans l’évolution de l’hépatite virale aigüe ouvrant la voie à de nouvelles avenues thérapeutiques visant à moduler l’activité inflammatoire du TLR2. / Endothelial cells (EC) act as a physical barrier against invasion by pleiotropic blood borne viruses but their contribution in innate antiviral defense is poorly known. Dysfunctions in blood-brain barrier EC (BMECs) and liver sinusoidal EC (LSECs) have been reported in viral neuropathologies and hepatitis, suggesting that loss of ECs integrity may contribute to the pathogenesis. Mouse hepatitis coronaviruses (MHV), differing in their ability to induce severe to subclinical hepatitis and neurological diseases and / or their tropism for ECs, are relevant viral models to study the consequences of EC infection in viral pathogenesis. Following hematogenous infection, the MHV3 serotype, the most virulent MHV, induces fulminant hepatitis, characterized by severe inflammatory response, followed by neurological damage whereas the less virulent MHV-A59 serotype induces milder hepatitis but does not invade the central nervous system (CNS). In addition, MHV3, in contrast to MHV-A59, shows ability to induce TLR2-dependent cytokine response. The attenuated MHV3 variants, 51.6-MHV3 and YAC-MHV3, are characterized by a weak tropism for LSECs and induce moderated and subclinical hepatitis respectively. Given the importance of LSECs in hepatic tolerance and the elimination of circulating pathogens, it has been postulated that the severity of hepatitis and inflammatory response induced by MHVs correlates with infection and alterations in vascular and tolerogenic properties of LSECs. Hepatic inflammatory disorders may result from differential activation of TLR2, rather than other TLRs and helicases, according to serotypes. Moreover, given the role of BMECs in preventing CNS infections, it has been postulated that secondary cerebral invasion by coronaviruses is related to infection of BMECs and subsequent breakdown of the blood-brain barrier (BBB). Through in vitro and in vivo infections of isolated BMECs, LSECs or mice with the different MHVs, we demonstrated, first, that in vitro productive infection of LSECs by the highly virulent MHV3 serotype, in contrast to 51.6- et YAC-MHV3 variants, altered their production of vasoactive factors and overthrew their intrinsic tolerogenic properties by promoting inflammatory cytokines and chemokines production. These disturbances were reflected in vivo by an uncontrolled inflammatory response and a deregulation of intrahepatic leukocyte recruitment, favoring viral replication and liver damages. We demonstrated, using TLR2 KO mice and LSECs treated with siRNA for TLR2 that the abnormal inflammatory response induced by MHV3 depended in part on preferential induction and activation of TLR2 by the virus on the surface of hepatic cells. Moreover, the severity of the primary viral replication in the liver and disorders in intrahepatic leucocyte recruitment induced by MHV3, but not by MHV-A59 and 51.6-MHV3, correlated with a subsequent brain invasion at the BBB level. Such invasion was related to productive infection of BMECs and subsequent IFN--dependent disruption of tight junction proteins occludin, VE-cadherin and ZO-1, resulting in an increase of BBB permeability and further viral entry into the CNS. Overall, the results of this study highlight the importance of structural and functional integrity of LSECs and BMECs during acute viral infections by MHVs to limit liver damages associated with viral-induced exacerbation of inflammatory response and prevent brain invasion by MHVs following viral spread through the bloodstream. They also reveal a new worsening role for TLR2 in the evolution of acute viral hepatitis paving the way for new therapies targeting TLR2-induced inflammatory activity.

Contexte. Les carcinomes des voies aérodigestives supérieures (VADS) arrivent en 6ème position parmi les cancers les plus fréquents au niveau mondial. La fonction du récepteur TLR3 dans les cellules de carcinomes des VADS est encore très mal comprise. Objectifs et méthodes. 1) Déterminer le niveau d’expression du récepteur TLR3 dans les lignées et les biopsies de carcinomes des VADS par western blot et par immunohistochimie. 2) Etudier le rôle de TLR3 dans la croissance tumorale de ces tumeurs, en utilisant notamment des lignées invalidées de façon conditionnelle pour TLR3. 3) Evaluer in vitro les effets cytotoxiques de ligands artificiels de TLR3 soit seuls, soit utilisés en combinaisons avec un inhibiteur d’IAP (inhibitor of apoptosis protein).Résultats. La protéine TLR3 est détectée à un niveau élevé en western blot dans les lignées de carcinomes des VADS étudiées, comparativement à un panel d’autres tumeurs épithéliales humaines. TLR3 est également constamment détecté en immunohistochimie dans les biopsies. TLR3 semble jouer un rôle dans la croissance tumorale des carcinomes des VADS : dans certaines conditions de culture (culture en hypoxie ou en milieu pauvre en SVF et en nutriments), la stimulation de TLR3 par un ligand exogène, le poly(A:U), favorise la croissance des cellules tumorales. Nous avons étudié l’effet de la stimulation de TLR3 sur le métabolisme glucidique dans ces mêmes cellules en utilisant un appareil de type Seahorse® qui mesure la consommation d’oxygène et la production de protons à partir de cellules cultivées en microplaques. Ces expériences montrent que la stimulation de TLR3 fait augmenter l’activité des voies du métabolisme cellulaire anaérobie (glycolyse extra-mitochondriale). Une étude métabolomique a mis en évidence des différences significatives dans le profil métabolique des cellules tumorales stimulées par le poly(A:U) comparativement aux cellules non traitées. Par ailleurs, nous avons montré que la stimulation de TLR3 permettait de détecter le facteur de transcription HIF1 en Western blot, même en conditions normoxiques. Sachant que des ARN libérés par des cellules en état de nécrose peuvent stimuler TLR3, il est tentant de penser que ce récepteur pourrait favoriser la survie des cellules malignes en zone hypoxique au voisinage de cellules nécrotiques. Néanmoins, l’expression de TLR3 représente aussi un facteur de vulnérabilité pour les cellules de carcinome des VADS : en effet les ligands artificiels de TLR3 utilisés en combinaison avec un inhibiteur d’IAP (Inhibitor of Apoptosis Protein) produisent des effets cytotoxiques sur les lignées de carcinomes des VADS étudiées. / Background. Head and Neck (HN) carcinomas are the 6th most frequent type of cancer worldwide. The role of the TLR3 receptor in HN carcinomas remains poorly understood.Objectives and Methods. 1) To assess the expression level of TLR3 in HN carcinoma cell lines and biopsies by Western blot and immunohistochemistry, respectively. 2) To study the role of TLR3 in tumour growth using specific cell lines with conditional knock-down of TLR3. 3). To assess in vitro the cytotoxic effects of artificial ligands of TLR3 used either alone or in combination with an IAP (inhibitor of apoptosis protein) inhibitor.Results. TLR3 protein was detected at a high level by Western blot analysis in HN carcinoma cell lines, by comparison with a panel of other human epithelial cancer cell lines. TLR3 was also consistently detected by immunohistochemistry in tumour biopsies. TLR3 seem to play a role in HN carcinoma cell growth: under certain culture conditions (hypoxic or low fetal calf serum/low nutrient culture conditions), TLR3 stimulation by a synthetic ligand, the poly(A:U), favours tumour cell growth. We investigated the effects of TLR3 stimulation on glucose metabolism using a Seahorse® analyzer, which measures the oxygen consumption and the proton production in living cells. Our results indicate that TLR3 stimulation induces an increase in anaerobic metabolism (extra-mitochondrial glycolysis). A metabolomic study revealed significant changes in the metabolic profile of cancer cells treated by poly(A:U) by comparison with untreated cells. We also showed that under TLR3 stimulation, HIF1 became detectable by Western blot analysis, even in normoxia. Given the fact that RNA fragments released by dying cells are able to trigger TLR3, one can assume that TLR3 might favour cancer cell survival in hypoxic areas located near the necrotic core of the tumour. However, TLR3 expression is also a factor of vulnerability for HN carcinoma cells: indeed, the combination of TLR3 artificial ligands with an IAP inhibitor has a strong cytotoxic effect on HN carcinoma cells in vitro.

L’asthme chez l’homme et le souffle chez le cheval sont des maladies inflammatoires chroniques des voies respiratoires partageant plusieurs caractéristiques physiopathologiques dont la bronchoconstriction réversible, l’inflammation des voies respiratoires inférieures, l’hyperréactivité bronchique et le remodelage tissulaire. Les phénotypes cliniques d’asthme se caractérisent en partie selon le type d’inflammation affectant les voies respiratoires et la présence ou non d’allergie. Le souffle chez le cheval s’avère être un modèle adapté pour l’étude des mécanismes impliqués dans l’asthme neutrophilique, lesquels demeurent particulièrement mal compris, en contraste avec ceux associés avec l’asthme éosinophilique. La réponse immunologique sous-jacente au souffle implique entre autres l’expression de cytokines de type Th2, suggestives d’une réponse allergique (immunité acquise). La poussière environnementale qui provoque les symptômes du souffle contient également des agents non-spécifiques dérivés de bactéries, champignons et moisissures, susceptibles d’activer des mécanismes immunitaires innés chez les chevaux atteints du souffle. Nous avons étudié le rôle des neutrophiles dans l’inflammation associée à la réponse innée et acquise chez le cheval atteint du souffle. Dans un premier temps, l’effet de produits dérivés de bactéries sur l’activation des neutrophiles sanguins provenant de chevaux normaux et atteints de souffle a été étudié dans le but d’évaluer la contribution de la réponse innée dans la physiopathologie du souffle. Nous avons évalué l’effet de l’IL-4, une cytokine de type Th2, sur les neutrophiles des deux groupes de chevaux afin d’évaluer de quelle manière le neutrophile peut participer à la réponse acquise associée à la réponse allergique. Finalement, nous avons étudié l’expression des isoformes de l'arginase par les neutrophiles équins car cette enzyme métabolise la L-arginine et est potentiellement impliquée dans le bronchospasme et le remodelage tissulaire associés à l’asthme. Nos résultats suggèrent que les neutrophiles et les mononucléaires sanguins isolés des chevaux atteints du souffle possèdent une réponse inflammatoire exagérée en réponse aux lipopolyssacharides et peptides formylés et surexpriment les cytokines pro-inflammatoires IL-1β, TNF et IL-8. Cette réponse innée aberrante est associée à une inflammation systémique caractérisée par des concentrations sériques élevées de TNF chez les chevaux atteints du souffle en période de rémission clinique. De plus, nos résultats montrent que l’IL-4 active le neutrophile équin et favorise son chimiotactisme de manière autocrine. L’IL-4 induit un phénotype d’activation typique dans le neutrophile équin, caractérisé par l’expression accrue des cytokines pro-inflammatoires (IL-8 et TNF) ainsi que de récepteurs potentiellement impliqués dans la réponse allergique (IL-4Rα et CD23). Enfin, nous montrons que que l’arginase 1 n’est pas un marqueur de l’activation des neutrophiles équins par l’IL-4, mais que ces cellules expriment constitutivement l’isoforme 2 fonctionnelle de l’arginase. La surrégulation des deux isoformes au niveau des poumons périphériques semble être associée à la pathologie du souffle, ce qui est en accord avec les modèles d’asthme chez la souris, le rat et le cobaye. L'ensemble de ces travaux suggère que les neutrophiles sont des cellules effectrices importantes de la réponse innée et acquise dans la pathophysiologie du souffle, un modèle naturel d’asthme neutrophilique. / Human asthma and equine heaves are chronic pulmonary diseases sharing several pathophysiological properties including lower airway inflammation, reversible bronchoconstriction, bronchial hyperresponsiveness, and tissue remodeling. Clinical phenotypes of asthma are characterized in part by the inflammatory cell populations infiltrating the airways, and the presence or absence of allergy. Heaves is a suitable animal model for the study of the poorly defined pathophysiological processes leading to airway neutrophilia. The immune response in heaves involves Th2 cytokine expression, which is, among other features, associated to allergic inflammation (acquired immunity). Environmental dust exposure leading to clinical exacerbation of heaves contains non-specific agents derived from bacteria, molds or fungi which could also activate innate immune responses in heaves affected horses. We studied the role of neutrophils in innate and acquired immune responses in heaves affected-horse. First, innate immune responses of neutrophils isolated from normal and heaves-affected horses to bacterial-derived products were studied. We also assessed the effect of IL-4, a Th2 cytokine, on equine neutrophils isolated from both groups of horses. Finally, we evaluated the arginase isoforms expressed by equine neutrophils as this enzyme that takes part to the L-arginine metabolism and is thought to contribute to bronchospasm and tissue remodeling associated with asthma. Our results suggest that both neutrophils and mononuclear cells from heaves-affected horses, when compared to healthy horses, have an excessive inflammatory response to lipopolyssacharides and formylated peptides characterized by increased IL-1β, IL-8 and TNF expression. This altered innate response was associated with systemic inflammation in asymptomatic susceptible horses as high serum TNF concentrations were detected. Furthermore, we found that equine neutrophils are activated by IL-4 and release neutrophil chemotactic factors in response to this cytokine. IL-4 also induces a distinctive activation phenotype in neutrophils that is characterized by increased expression of the pro-inflammatory cytokines (IL-8 and TNF) and receptors (IL-4Rα and CD23) potentially involved in the allergic response. Finally, we showed that arginase 1 is not a marker of IL-4-activated equine neutrophils although they constitutively express a functionally active isoform 2 of the enzyme. The up-regulation of arginase isoforms in the peripheral lungs of horses with heaves suggests a role for arginase in this model, as it is described in the mouse, rat and guinea pig models. Taken together, this work suggest that neutrophils could play an important role in both innate and acquired immune responses associated with heaves pathophysiology, a natural model of neutrophilic asthma. / Réalisé en cotutelle avec le Dr James G Martin de l'Université McGill (Meakins-Christie laboratories)