O presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética e dos fatores de virulência de isolados de U. diversum. As cepas foram submetidas a sequenciamento dos genes da urease e 16S rRNA e a testes para verificar os fatores de virulência: cápsula, fosfolipase C, IgAse e adesão e invasão. A análise do sequênciamento parcial do gene 16S rRNA resultou na presença de polimorfismos em 44 posições da seqüência, que diferenciou as amostras em sete grupos. Em relação aos fatores de virulência, os dados mostraram que as cepas estudadas apresentaram uma camada densa ao redor da membrana celular dos microrganismos e atividade de fosfolipase C. No entanto, não foi observado a atividade de IgAse nas cepas. Em relação a atividade de invasão, observou-se que os ureaplasma estudados puderam ser visualizados no interior de células Hep-2 com apenas um minutos de infecção, sendo observados em uma região perinuclear, mas não no interior do núcleo. Além disto, pode verificar que entre 1% a 10% dos ureaplasmas estudos penetraram na célula pelo teste da gentamicina. / The aim of the present study was the study of genetic variability and virulence factors of U. diversum clinical isolates. The strains were submitted to sequencing for 16S rRNA and urease genes. Moreover, the strains were analyzed to the virulence factors: capsule, phospholipase C, IgA protease and adhesion and invasion into Hep-2 cells. The sequencing of parcial 16S rRNA gene showed polymorphic patterns into 44 positions. These polymorphisms clustered the strains in seven groups. For the virulence factors, ureaplasma cells showed a dense-stained external capsule-like structure surrounding the cell membrane. A high level of phospholipase C activity was also detected in 31 studied ureaplasma. However, no strains showed IgA protease activity. For the invasion assay, the isolates and strains used were detected inside the cells after infection of one minute. The invasions of the ureaplasmas surrounded the nuclear region but were not observed inside the nuclei. The gentamicin invasion assay detected that 1% to 10% of studied ureaplasmas were inside the infected cells.

Neospora caninum (filo Apicomplexa) é um parasita obrigatório intracelular como todos os membros deste filo, alguns reconhecidos por causarem doenças com impacto relevante na saúde humana (Plasmodium e Toxoplasma) e veterinária (Babesia, Eimeria e Cryptosporidium). Causador da neosporose, N. caninum vem emergindo como um dos maiores causadores de abortos infecciosos em bovinos, levando a consideráveis perdas econômicas na bovinocultura mundial. Devido à sua recente descoberta, o conhecimento sobre diversos processos bioquímicos de N.caninum ainda é limitado, demandando novas pesquisas para a compreensão de seus mecanismos de sobrevivência e consequente identificação de alvos para intervenção terapêutica. O processo de invasão celular é bastante investigado em pesquisas envolvendo apicomplexas, uma vez que a sobrevivência desses parasitas depende do sucesso de sua entrada na célula hospedeira. Proteínas secretadas de organelas filo-específicas (micronemas, roptrias e grânulos densos) estão intimamente envolvidas com a invasão celular. Elas são responsáveis pela interação inicial com a célula hospedeira, participam da junção de movimento formada no momento da invasão, e contribuem para a estabilização do vacúolo parasitóforo. Neste trabalho as proteínas secretadas por taquizoítas de N. caninum foram investigadas de duas formas: (1) por caracterização molecular de proteínas com domínio Apple; e (2) por estudo do secretoma do parasita. Os domínios proteicos do tipo Apple são caracterizados pela capacidade de interação proteína-proteína e proteína-carboidrato, e estão presentes em algumas proteínas micronêmicas com propriedades adesivas. Neste trabalho três proteínas de N. caninum contendo domínios Apple foram caracterizadas: MIC17A, MIC17B e MIC17C. A análise das sequências proteicas e das estruturas dos domínios Apple, obtidas por modelagem molecular, mostraram alta identidade sequencial e estrutural entre MIC17A e MIC17C. Apesar de ser paráloga às outras duas, MIC17B apresenta diferenças importantes em sua sequência e estrutura. Para MIC17B e MIC17C foram realizados experimentos de detecção das proteínas nativas nos extratos total e secretado do taquizoíta que sugerem diferentes formas de processamento entre essas proteínas no parasita. Para MIC17B foi confirmada a localização em micronemas, num padrão diferente do observado para MIC17C. Os ensaios de invasão combinados aos de localização indicam que estas proteínas estejam relacionadas ao processo de invasão celular, porém, suas funções permanecem desconhecidas. O secretoma é o conjunto de proteínas secretadas pelo parasita e, para explorar a composição deste extrato (ESA) no taquizoíta de N. caninum, duas abordagens complementares foram utilizadas. Na primeira abordagem foram identificadas as proteínas presentes no ESA por espectrometria de massas. Na segunda abordagem realizou-se uma ii quantificação relativa das proteínas, marcadas por dois isótopos, nos extratos totais de taquizoítas submetidos ou não ao estímulo secretório. O resultado esperado seria com as proteínas secretadas diminuídas no parasita estimulado. Em ambas as abordagens foram utilizadas técnicas de espectrometria de massas de alta resolução (nanoLC-MS/MS), o que resultou num alto número de identificações; 615 proteínas no ESA e 2011 proteínas quantificadas. A comparação das duas abordagens permitiu o reconhecimento de proteínas com maior probabilidade de secreção. Uma rede de interação entre as proteínas diferencialmente expressas foi predita, gerando resultados que, associados às informações sobre as proteínas aumentadas, permitiram uma investigação sobre proteínas potencialmente envolvidas com a regulação do metabolismo relacionado à secreção. Os resultados obtidos por ambos os estudos aqui demonstrados somam conhecimento acerca do parasita N. caninum e demonstram ser úteis para guiar a busca e seleção de alvos a serem investigados para o desenvolvimento de terapêutica contra a neosporose. / Neospora caninum (Apicomplexa phylum) is an obligatory intracellular parasite like all members from this phylum, some causing diseases with relevant impact on human (Plasmodium and Toxoplasma) and veterinary (Babesia, Eimeria and Cryptosporidium) health. Causative agent of neosporosis, N. caninum has emerged as one of the leading causes of infectious abortion in cattle, generating huge economical losses in worldwide livestock. Due to its recent discovery, knowledge of N. caninum biochemical processes remains scarce, demanding new research for comprehending its survival mechanisms and, consequently, identifying new targets for therapeutic intervention. The invasion process has often been investigated in apicomplexans since their survival depends on the success of their entry into the host cell. Proteins secreted from phylum-specific organelles (micronemes, rhoptries and dense granules) are deeply involved with invasion. They are responsible for the initial interaction with the host cell; participate of the moving junction formed in the moment of invasion; and contribute for the stabilization of the parasitophorus vacuole. In this study, the proteins secreted by N. caninum tachyzoites were investigated in two ways: (1) the molecular characterization of Apple domaincontaining proteins; and (2) exploring the parasite secretome. The Apple protein domains are characterized by the ability to interact as protein-protein and proteincarbohydrate, and are present in some microneme proteins with adhesive properties. Here three N. caninum proteins containing Apple domains were characterized: MIC17A, MIC17B and MIC17C. Analyses of the Apple domains sequences and structures, obtained by molecular modeling, revealed high sequential and structural identities between MIC17A and MIC17C. Although being a paralog of the other two proteins, MIC17B presents significant differences in its sequence and structure. Experiments were performed for native MIC17B and MIC17C detection in the total and secreted tachyzoite extracts, suggesting different processing forms for these proteins in the parasite. For MIC17B, the microneme localization was confirmed, differently from the pattern observed for MIC17C. Invasion and localization assays indicated that these proteins are related to the cell invasion process; nevertheless, their functions remain unknown. The secretome is the set of proteins secreted by the parasite and, to explore this extract (ESA) composition in N. caninum, two complementary approaches were used. Firstly proteins present in ESA were identified by mass spectrometry. In the second approach, a relative quantification was performed on the proteomes of ethanol stimulated/non stimulated tachyzoites, expecting that the secreted proteins would be down regulated at the stimulated parasite. Both approaches were performed with high resolution mass spectrometry techniques (nanoLC-MS/MS), reaching a high number of identifications: 615 proteins iv in ESA and 2011 quantified proteins. The comparison between both approaches allowed the recognition of the most likely secreted proteins. An interaction network was predicted, involving the differentially expressed proteins. These results, associated with the information of up regulated proteins, allowed the investigation of proteins potentially involved with the secretion metabolism regulation. The findings from our two studies add up knowledge about N. caninum and demonstrate to be useful in guiding the search and selection for new targets for therapeutic development against neosporosis.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:52:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Discompelta.pdf: 24643 bytes, checksum: 81e93ce5da3905f5c5edd8d632add05e (MD5) Previous issue date: 2009-11-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The present research has as main focus to analyze and to describe strategical procedures of invasion, occupation and displacement, used in urban interventions carried through by politic and, or, artistic, groups such as: Black Block, Reclaim The Streets, H.I.J.O.S., Grupo Empreza and ERRO Grupo. Considering the theories of Richard Schechner and the described situationists experiences in the urban space, this analysis contributes for the understanding of operational procedures and creative processes of urban action. The strategies of urban action, originated in artistic or politic groups, can be efficient in any environment which the proposal is the intervention. The study in question starts from the notion of the subject, the citizen and the contemporary urban space and searchs genealogies of urban intervention s procedures in, the beginning of the XX century, avant-garde artistic movements, as well as presents contemporaries urban interventions practices reflecting on the notion and the use of the strategical procedures of invasion, occupation and displacement. To demonstrate how much the concept of art and theater currently can be moving, or how much the street theater can be fed from other manifestations that happen in this same space and still keep iself inside the theatrical language, is one of the consequences of the researches and the observation of the practical use of these urban manifestation s strategical procedures. Nowadays, magnifying the knowledge about the strategical procedures of action can result in a fortuitous articulation of resistance principles notion for the transformation of the urban space / A presente pesquisa tem como focos principais analisar e descrever procedimentos estratégicos de invasão, ocupação e deslocamento, utilizados em intervenções urbanas realizadas por grupos políticos e, ou, artísticos, tais como: Black Block, Reclaim The Streets, H.I.J.O.S., Grupo Empreza e ERRO Grupo. Considerando as teorias de Richard Schechner e dos relatos de experiências situacionistas no espaço urbano, esta análise contribui para a compreensão de procedimentos operacionais e de processos criativos de ação urbana. As estratégias de ação urbana, originárias de grupos artísticos ou políticos, podem ser eficazes em qualquer âmbito onde a proposta seja a intervenção. O estudo em questão parte da noção do sujeito e do espaço urbano contemporâneo para buscar as genealogias de procedimentos de intervenção urbana nos movimentos artísticos de vanguarda do início do século XX, assim como apresenta práticas de intervenções urbanas contemporâneas refletindo sobre a noção e a utilização prática dos procedimentos estratégicos de invasão, ocupação e deslocamento. Demonstrar o quanto o conceito de arte e teatro atualmente pode ser movediço, ou o quanto o teatro de rua pode se alimentar de outras manifestações que acontecem neste mesmo espaço e ainda se manter dentro da linguagem teatral, é uma das conseqüências da pesquisa e da observação da utilização prática destes procedimentos estratégicos de manifestação urbana. Na contemporaneidade, a ampliação do conhecimento sobre os procedimentos estratégicos de ação urbana pode resultar em uma eventual articulação de uma noção de princípios de resistência para a transformação do espaço urbano

Made available in DSpace on 2016-12-12T20:12:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGEF13MA003.pdf: 12110 bytes, checksum: 7b1ae939feda74e5283da74e397a79bf (MD5) Previous issue date: 2013-10-04 / This study aimed to evaluate the biological invasion by tree species in two Araucaria Forest fragments (F1 and F2) in Lages, SC. A total of 25 plots were allocated in each fragment, distributed in five, 20x100 m, transects perpendicular to fragment edge and, at least, 100 m apart from each other, where the adult (individual with dbh diameter at breast height higher or equal to 5 cm) and the regenerative component (individuals belonging to tree species, with dbh lower than 5cm and height higher than 10 cm) were evaluated. All sampled individuals were identified and measured (circumference and height). For each fragment and component, the phytosociological descriptors and the biological invasion index (BII) were determined. The relationships between BII and the distance from the edge were evaluated by simple linear regressions. The grouping among non-native and native species was analyzed through spearman correlation and clusters. A total of 3,701 individuals distributed in 105 species and 42 families were sampled, being five invasive species: Citrus limon (L.) Burm, Ligustrum lucidum W.T. Aiton., Ligustrum sinense Lour., Pinus elliottii Engel. and Pinus taeda L. Myrtaceae was the richest family (22), with a total of 890 sampled individuals. In F1 occurred a relative low value of BII, with Pinus taeda as the most expressive species, being grouping with native pioneers species. The BII in F2 was elevated, mainly in the regenerative component, due to the expressive participation of Ligustrum lucidum (the most important species in this component). No relationships between BII and the distance from the edges were observed. The results demonstrated that the fragments showed different biological invasion patterns that were determined by the nature of surrounding matrix and the ecological traits of invasive species / O presente estudo teve como objetivo principal avaliar a invasão biológica por espécies arbóreas em dois fragmentos (F1 e F2) de Floresta Ombrófila Mista em Lages, SC. Foram alocadas 25 parcelas em cada fragmento, distribuídas em cinco transeções de 20x100 m, perpendiculares as bordas e com distância mínima de 100 m entre si, onde foram avaliados os componentes arbóreos adulto (indivíduos com DAP - diâmetro a altura do peito - maior ou igual a 5 cm) e regenerante (indivíduos pertencentes à espécies arbóreas com DAP menor que 5 cm e altura maior que 10 cm). Estes foram identificados e mensurados (circunferência e altura). Foi calculado, para cada estrato e para cada fragmento, os descritores fitossociológicos e o Índice de Invasão Biológica (IIB). A relação entre o IIB e a distância da borda foi verificada por meio de regressões lineares simples. O agrupamento de espécies exóticas e nativas foi determinada por meio de correlações de Spearman e a construção de dendrogramas. No total, foram amostrados 3.701 indivíduos distribuídos em 105 espécies e 42 famílias, sendo cinco espécies invasoras: Citrus limon (L.) Burm, Ligustrum lucidum W.T. Aiton., Ligustrum sinense Lour., Pinus elliottii Engel. e Pinus taeda L. A família Myrtaceae apresentou o maior número de espécies (22), com um total de 890 indivíduos amostrados. No F1 houve um valor de IIB relativamente baixo, sendo Pinus taeda a espécie com maior participação na invasão. O IIB no F2 foi alto, especialmente no estrato regenerativo, pela alta participação de Ligustrum lucidum (maior Índice de Regeneração Natural nesse estrato). Não foi observada relação entre a distância da borda e a intensidade da invasão biológica. Os resultados demonstraram que os fragmentos apresentaram diferentes padrões de invasão biológica, determinados pela natureza da matriz de entorno e pelas características ecológicas das espécies invasoras

Made available in DSpace on 2014-07-29T16:21:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao parte 1 Thaisa Sala Michelan.pdf: 38222 bytes, checksum: 2f8d3a6cb8df8f1c42d663b0b5323ef6 (MD5) Previous issue date: 2011-05-28 / Exotic species represent strong threats to biodiversity. This concern is especially valid in freshwater ecosystems due to their high biodiversity and the highest rates of extinction, compared with terrestrial and marine ecosystems. The increasing habitat complexity provided by the presence of macrophytes may partially explain the high diversity of aquatic ecosystems. However, depending on the density and other particular characteristics of these plant, the diversity may be negatively affected. In this context, Urochloa subquadripara, a species native to Africa, is an aquatic macrophyte weed occurring in various natural and artificial aquatic ecosystems in America. In a small scale, the occurrence of this exotic species increases with reducing natives species richness; however, in a large scale U. subquadripara invades sites with more richness of native species. This controversy is typical of observational studies in invasion biology and it demand experiments to test effects of abiotic and biotic resistance on the invasive potential of this exotic. Accordingly, two experiments were conducted in order to test the following hypotheses: (i) the regeneration and colonization of U. subquadripara decreases with increasing time of exposure to dry, (ii) fragments of the apical part of this species, when compared with those of the basal part, have higher viability and colonization potential (first experiment) and (iii) the invasiveness of aquatic environments by U. subquadripara is negatively influenced by the richness and abundance of native species (second experiment). Our results supported all of our hypotheses: U. subquadripara showed high resistance to desiccation, and the fragments of the apical part were those which had higher viability and colonization potential. In addition, both richness and abundance of native species affected negatively the invasive potential of this exotic macrophyte. The second experiment demonstrated that the effect of richness and abundance limited the development of U. subquadripara, although such effect was not sufficient to prevent the invasion of macrophyte communities by this species. Based on these results, it appears that the population growth of U. subquadripara is greater in disturbed sites, mainly those affected by drought, which in general, have lower abundance and diversity of native species. / Espécies exóticas representam fortes ameaças à biodiversidade. Essa preocupação é especialmente válida em ecossistemas aquáticos continentais em função da elevada biodiversidade e das maiores taxas de extinção, quando comparados com ecossistemas terrestres e marinhos. O aumento da complexidade dos habitats promovido pela presença de macrófitas aquáticas pode explicar em parte a elevada diversidade dos ecossistemas aquáticos. No entanto, dependendo das densidades e de outras características espécies-específicas dessas plantas, a diversidade pode ser negativamente afetada. Nesse contexto, Urochloa subquadripara, espécie nativa da África, é uma macrófita aquática infestante de vários ecossistemas aquáticos naturais e artificiais na América. Em pequena escala espacial, a ocorrência dessa exótica aumenta com a redução do número de espécies nativas, já em grande escala U. subquadripara invade locais com maior riqueza de espécies nativas. Essa controvérsia é típica de estudos observacionais em biologia de invasões sendo necessária a realização de experimentos para testar efeitos da resistência abiótica e biótica sobre o potencial invasor de exóticas. Nesse sentido, foram realizados dois experimentos, com o objetivo de testar as seguintes hipóteses: (i) a regeneração e colonização de U. subquadripara diminui com o aumento do tempo de exposição a seca; (ii) os fragmentos da parte apical dessa espécie, quando comparados com aqueles da parte basal, apresentam maior viabilidade e potencial de colonização (primeiro experimento) e (iii) a invasibilidade de ambientes aquáticos por U. subquadripara é influenciada negativamente pela riqueza e abundância de espécies nativas (segundo experimento). De modo geral, todas as hipóteses foram aceitas: U. subquadripara apresentou alta resistência a dessecação, sendo que os fragmentos da parte apical foram os que apresentaram maior viabilidade e potencial de colonização e tanto a riqueza como a abundância de espécies afetaram negativamente o potencial invasor dessa exótica. Esse último experimento demonstrou que, apesar de limitar o desenvolvimento de U. subquadripara, o efeito da riqueza e abundância de nativas não é suficiente para impedir a invasão de comunidades de macrófitas por essa espécie. Com base nesses resultados, infere-se que o crescimento populacional de U. subquadripara é maior em locais perturbados, principalmente por distúrbios como a seca que, em geral, também apresentam menor abundância e diversidade de espécies nativas.

No Brasil, foram introduzidas diversas espécies de Pinus e a espécie P. elliottii Engelm apresenta o comportamento invasor em unidades de conservação de Cerrado, no estado de São Paulo. O objetivo deste estudo foi comparar P. elliottii com outras duas espécies do mesmo gênero, P. caribaea Moret e P. oocarpa Shiede ex Schltdl, através de: viabilidade e germinabilidade das sementes, em laboratório; sobrevivência das plântulas logo após a germinação e acompanhamento de seu crescimento em estufa; germinabilidade em fisionomias campestres; e chuva de sementes dentro de talhões. Para P. elliottii, também foi verificada a distância de dispersão das sementes. As sementes utilizadas nos testes em laboratório foram coletadas em Águas de Santa Bárbara (Estação Ecológica de Santa Bárbara - EEcSB; Floresta de Águas de Santa Bárbara - FASB) e Itirapina (Estação Experimental de Itirapina - EExI). Primeiramente, as sementes foram colocadas em água para separação das sementes cheias das vazias (flutuabilidade). Em seguida, as sementes cheias foram testadas quanto à viabilidade por meio de sal de tetrazólio e quanto à germinabilidade. As sementes germinadas foram acompanhadas até os cotilédones ficarem visíveis e uma parte destas teve o crescimento acompanhado até a 24ª semana. A germinabilidade em fisionomias campestres foi realizada apenas na EEcSB, onde as sementes das três espécies foram semeadas em diferentes graus de umidade do solo. Coletores de sementes foram instalados dentro dos talhões de Pinus spp., tanto na EEcSB-FASB como na EExI, para quantificar a chuva de sementes. A distância de dispersão das sementes de P. elliottii foi avaliada apenas na EEcSB, durante o período de maior dispersão de sementes (março a maio), e teve como classes de distâncias em relação ao talhão: 10, 30, 60, 100, 150 e 250 m. Os resultados dos testes em laboratório mostraram que P. caribaea e P. elliottii apresentam as maiores proporções de sementes cheias (>70%) e P. oocarpa e P. elliottii, as maiores taxas de viabilidade (>90%) e germinabilidade (>90%). Dentre as sementes germinadas das três espécies, mais de 90% desenvolveram-se até o aparecimento dos cotilédones. Quanto ao crescimento, P. caribaea e P. oocarpa apresentaram maior vigor em relação a P. elliottii. Em campo, as três espécies apresentaram, de maneira similar, baixíssima porcentagem de germinação (<1,5% do total semeado), preferencialmente em solos mais úmidos. A chuva de sementes de P. elliottii dentro de talhões foi muito maior (pelo menos o dobro) em comparação com as outras duas espécies. A distância de dispersão das sementes de P. elliottii foi maior nos primeiros 30 m, mas chegou até os 150 m. Portanto, P. caribaea e P. oocarpa apresentaram condições de se tornarem invasores pela viabilidade de suas sementes, vigor de crescimento e germinação em campo, mas o fator determinante para o sucesso na invasão P. elliottii é, provavelmente, a pressão de propágulos, maior do que as outras duas espécies, causada pela sua alta produção de sementes e intenso plantio. / Several pine species of the genus Pinus have been introduced in Brazil, and P. elliottii Engelm is presently considered an invasive species in the Brazilian savanna (Cerrado) in São Paulo State. The aim of this study was to compare P. elliottii with two other Pinus species, P. caribaea Moret and P. oocarpa Shiede ex Schltdl according to: seed viability and germinability, in laboratory; survival of seedlings soon after germination and their growth, in greenhouse; germination at field conditions; and seed rain inside the plantation. The distance of seed distance dispersal was also verified for P. elliottii. The seeds for the laboratory tests were collected in Águas de Santa Bárbara (Santa Barbara Ecological Station - EEcSB; Águas de Santa Bárbara Forest - FASB) and Itirapina (Itirapina Experimental Station - EExI). First, the seeds were placed in water to separate the full from the empty seeds (flutuability). Then full seeds were tested by viability (tetrazolium) and germinability. Germinated seeds were monitored until the cotyledons were visible and some of those were monitored up the 24th week to verify their growth rate. In the EEcSB, seeds of the three species were sown at different levels of soil moisture to observe the germination in the field. In order to quantify the species seed rain seed collectors were installed inside the Pinus spp. stands, in both EEcSB-FASB and EExI. The distance of P. elliottii seed spread was evaluated only at the EEcSB, during the greater period of seed dispersion (March to May), at the distances of 10, 30, 60, 100, 150 and 250 m from the planted areas. The results of laboratory tests showed that P. caribaea and P. elliottii have the highest proportions of full seeds (> 70%) and P. oocarpa and P. elliottii, the highest viability (> 90%) and germination rates (> 90%). Among the germinated seeds of the three species more than 90% developed to seedling stage. Concerning seedling growth, P. caribaea and P. oocarpa showed greater vigor than P. elliottii. In the field, the three species showed similar and very low germination rates (<1.5% of the total sown), preferably in more humid soils. The seed rain of P. elliottii inside the plantation stand was much higher (at least twice) compared to the other two species. The dispersal distance of P. elliottii seeds was higher in the first 30 m, but reached 150 m. The results show that P. caribaea and P. oocarpa are able to become invaders due to their high values of seed viability and germination, and vigor growth, however, the determining factor for the invasive success of P. elliottii is probably its higher propagule pressure, caused by several human mediated introductions, and high production of seeds.

Neste trabalho, esclarecemos tópicos da patogenicidade de EIEC que sustentam a sua menor virulência quando comparada à S. flexneri, e mostramos a importância das células dendríticas (CD) nesse processo. Estudou-se o comportamento de EIEC e S. flexneri quando em contato com células Caco-2, avaliando-se uma cinética de expressão dos genes envolvidos na invasão e disseminação bacteriana. Em geral, todos os genes foram menos expressos em EIEC, fato corroborado pelo fenótipo de disseminação bacteriana, onde EIEC foi menos eficiente do que Shigella. Também foi avaliada a modulação da resposta inflamatória de células dendríticas intestinais murinas pela produção de citocinas, expressão de moléculas co-estimulatórias e apresentação de antígenos, após desafio das células com as bactérias. Os resultados sugerem que EIEC induz a uma resposta protetora ao hospedeiro, enquanto que Shigella estaria \"driblando\" o sistema imune, além de provavelmente super-estimular o sistema imune adaptativo, fato que poderia levar a um agravamento da doença. As ações integradas das células Caco-2, células dendríticas e estímulos bacterianos foram estudadas em co-cultura celular. Observou-se que EIEC e suas proteínas secretadas induzem a migração das CDs ao compartimento apical da co-cultura; nada foi observado quando o desafio se deu com Shigella. Também foram avaliadas as concentrações de citocinas inflamatórias no microambiente infeccioso formado. A citocina TNF-&#945;, bem como CCL20 e MCP-1 foram mais proeminentes após estímulo com EIEC, fato que poderia explicar parcialmente a migração das CDs ao lado apical da co-cultura após estímulo com EIEC e suas proteínas secretadas. Nossas evidências experimentais indicam que a doença desencadeada por EIEC é mais restrita a um determinado local da infecção, ou seja, não é capaz de se disseminar a ponto de estender a lesão tecidual de forma mais drástica, como Shigella. Esse fenômeno pode estar associado à menor expressão de seus dos fatores de virulência e à resposta imune inata induzida no sítio de infecção, o que levaria, fatalmente, à resolução da doença. / In this study, we clarify topics of pathogenicity from EIEC that support its lower level of virulence when it is compared to S. flexneri, and we have shown the importance of dendritic cells (DC) in this process. We studied the conduct of EIEC and S. flexneri when they were in contact with Caco-2 cells and we analyzed the kinetics of the genes expression that was involved in the spread and invasion of the bacteria. In general, all genes were expressed less in EIEC, as demonstrated by the phenotype of the bacterial spread, where EIEC was less efficient than Shigella. We also analyzed the modulation of the inflammatory response by the murine intestinal dendritic cells by the production of cytokine, expression of co-stimulators molecules and antigens presentation, after the interaction of the cells with the bacteria. The results showed that EIEC induces a response that protects the host while Shigella manipulate the host intestinal innate and adaptive immune system and it probably over-stimulates the adaptive immune system which could let the disease worse. The integrated actions of Caco-2 cells, dendritic cells and bacterial stimulus, were studied in a co-culture cell. We observed that EIEC and its secreted proteins induce the migration of the DCs to the apical compartment of the co-culture; nothing was observed related to Shigella. We also evaluated the concentrations of the inflammatory cytokines at the infective micro environment that was formed. The cytokine TNF-&#945;, as CCL20 and MCP-1 were more prominent after been stimulated with EIEC, a fact that could partially explain the migration of DCs to the apical side of the co-culture after the stimulus with EIEC and its secreted proteins. Our experimental evidence shows that the disease triggered by the EIEC is more restricted at a definite infection place, which means that it is not capable of disseminating beyond a certain point to extend the tissue\'s injury and let it worsen, as Shigella do. This phenomenon can be associated with the lower level of expression of its virulence factors and to the immune response induced in the infection site, what could finally lead to the eradication of the disease.

Dentre as 18 espécies do gênero Yersinia, as espécies Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis e Y. pestis foram extensivamente caracterizadas em diversos aspectos como ecologia, epidemiologia e mecanismos de patogenicidade. Sete das 15 espécies restantes (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii e Y. rohdei), usualmente conhecidas como Y. enterocolitica-like, até o momento, não tiveram seu potencial patogênico caracterizado e são, geralmente, consideradas não-patogênicas. Entretanto, dados da literatura sugerem que algumas dessas espécies possam causar doença. Esses dados estimularam o surgimento de questões sobre os mecanismos pelos quais as espécies de Y. enterocolitica-like possam interagir com as células do hospedeiros e causar doenças. Esse projeto teve como principal objetivo caracterizar o potencial patogênico de linhagens de Y. enterocolitica-like, especificamente das espécies Y. frederiksenii, Y. kristensenii e Y. intermedia. No presente trabalho, o potencial patogênico de 118 linhagens de Y. enterocolitica-like (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia e 13 Y. kristensenii) foi avaliado pela pesquisa da presença dos genes relacionados à virulência ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB e virF por PCR. Além disso, a habilidade de algumas linhagens de Yersinia de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 após diferentes períodos de incubação, bem como, de sobreviver no interior de macrófagos humanos U937 foi testada. Aspectos morfológicos da adesão bacteriana foram visualizados por microscopia eletrônica. Finalmente, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência foi avaliada a partir do sequenciamento de RNA de uma linhagem de Y. enterocolitica-like. As linhagens estudadas apresentaram os seguintes genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) e ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) e tccC (35%); e Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) e hreP (54%). De modo geral, as linhagens de Y. enterocolitica-like tiveram a habilidade de aderir e invadir células Caco-2 e HEp-2 inferior à da linhagem altamente patogênica Y. enterocolitica 8081. Contudo, Y. kristensenii FCF 410 e Y. frederiksenii FCF 461 apresentaram elevado potencial de invasão a células Caco-2 após cinco dias de pré-incubação, os quais foram 45 e 7,2 vezes maiores do que o controle Y. enterocolitica 8081, respectivamente, porém, o gene ail não foi detectado nessas linhagens. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 ii mostrou que as linhagens de Y. frederiksenii FCF 461 (40,0%) e Y. frederiksenii FCF 379 (24,6%) tiveram porcentagens de sobrevivência superior à de Y. enterocolitica 8081 (13,4%). Todavia, linhagens de Y. intermedia e Y. kristensenii apresentaram uma capacidade reduzida de sobreviver em macrófagos. A microscopia eletrônica de varredura mostrou as bactérias em contato com a filipódia celular. As bactérias foram distribuídas tanto individualmente quanto em pequenos aglomerados. Portanto, podemos concluir que a presença dos genes relacionados à virulência encontrados nas Y. enterocolitica-like estudadas indicou o possível potencial patogênico de algumas dessas linhagens. Os ensaios de adesão e invasão a células de mamíferos sugerem que a patogenicidade de Y. kristensenii e Y. frederiksenii possa ser linhagem-dependente. O ensaio de sobrevivência em macrófagos humanos U937 evidenciou o potencial patogênico de algumas linhagens de Y. frederiksenii. Em conjunto, os resultados obtidos sugerem a existência de mecanismos de virulência alternativos aos mecanismos clássicos descritos para Y. enterocolitica patogênica. Contudo, a presença de possíveis novos mecanismos de virulência não pode ser verificada, uma vez que a plataforma 454 GS Junior (Roche) não se mostrou adequada para a realização de sequenciamento de RNA de amostras provenientes de interações com células devido à baixa cobertura obtida. / Among the 18 species of the Yersinia genus, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis and Y. pestis were extensively characterized in different subjects as ecology, epidemiology and pathogenicity mechanisms. Seven among the remaining 15 species (Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. frederiksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. mollaretii and Y. rohdei), often called Y. enterocolitica-like have not their pathogenic potential characterized and are usually considered to be nonpathogenic. However, literature data suggest that some of these species can cause diseases. These data stimulate the upsurge of questions about the mechanisms of which Y. enterocolitica-like species may interact with host cells and cause diseases. The main objective of this preject was to characterize the pathogenic potential of Y. enterocolitica-like strains, specifically of the species Y. frederiksenii, Y. kristensenii and Y. intermedia. This work evaluated the pathogenic potential of 118 Y. enterocolitica-like strains (50 Y. frederiksenii, 55 Y. intermedia and 13 Y. kristensenii) searching for the presence of the virulence-related genes ail, fepA, fepD, fes, hreP, myfA, tccC, ystA, ystB and virF by PCR. Besides, Yersinia strains ability of adhesion and invasion to Caco-2 and HEp-2 cells after different pre-incubation periods, and its survival within human macrophages U937 were tested. Morphologic aspects of bacterial adhesion were observed by scanning electronic microscopy. Finally, the presence of new possible virulence mechanisms was evaluated through RNA sequencing of one Y. enterocolitica-like strain. The studied strains showed the following genes: Y. frederiksenii, fepA (44%), fes (44%) and ystB (18%); Y. intermedia, ail (53%), fepA (35%), fepD (2%), fes (97%), hreP (2%), ystB (2%) and tccC (35%); and Y. kristensenii, ail (62%), ystB (23%), fepA (77%), fepD (54%), fes (54%) and hreP (54%). Usually Y. enterocolitica-like strains presented less ability of adhere and invade Caco-2 and HEp-2 cells than the highly pathogenic strain Y. enterocolitica 8081. On the other hand, Y. kristensenii FCF 410 and Y. frederiksenii FCF 461 showed high potential of invasion in Caco-2 cells after 5 days of pre-incubation, which were 45 and 7.2 times higher than the control Y. enterocolitica 8081 respectively, but ail gene was not found in these strains. Survival assay in human macrophages U937 showed that Y. frederiksenii FCF 461 (40.0%) and Y. frederiksenii FCF 379 (24.6%) strains presented survival percentages higher than Y. enterocolitica 8081 (13.4%). However, Y. intermedia and Y. iv kristensenii strains showed a reduced capability of surviving in macrophages. Scanning electron microscopy showed bacteria at the surface in contact with the cellular filopodia. The bacteria were distributed either individually or in small clumps. Therefore, it may be concluded that the presence of virulence-related genes in some of the Y. enterocolitica-like strains indicated their possible pathogenic potential. Mammal cells adhesion and invasion assays suggest that the pathogenicity of Y. kristensenii and Y. frederiksenii may be strain-dependent. Human macrophages U937 surviving assay highlighted the pathogenic potential of some Y. frederiksenii strains. Together, the results suggest the existence of alternative virulence mechanisms other than the classical mechanisms described for pathogenic Y. enterocolitica. However, we could not verify the presence of possible new virulence mechanisms because 454 GS Junior (Roche) platform was not suitable for RNA sequencing of strains from cells interaction due its low coverage obtained.

O câncer de mama é o tipo de câncer mais comumente detectado em mulheres de todo o mundo. Na maioria das pacientes, a causa de morte se deve, principalmente, à doença metastática que pode se desenvolver a partir do tumor primário. O processo metastático envolve uma complexa cascata de eventos, incluindo a quebra organizada dos componentes da matriz extracelular por metaloproteinases de matriz (MMPs). A atividade das MMPs é precisamente regulada por inibidores específicos, os inibidores teciduais das MMPs (TIMPs). Dado seu papel na progressão tumoral, níveis elevados de MMPs têm sido associados com prognóstico desfavorável para pacientes com câncer. Por outro lado, sendo os TIMPs proteínas multifuncionais, níveis elevados de TlMP-1 e de TIMP-2 correlacionam com agressividade do tumor e prognóstico ruim em diferentes tipos de câncer, incluindo o câncer de mama. O gene supressor de metástase RECK codifica uma glicoproteína de membrana capaz de inibir a invasão e a metástase tumoral através da regulação negativa da atividade de MMPs envolvidas em carcinogênese: MMP-2, MMP-9 e MMP-14 (MT1-MMP). A fim de analisar o papel das MMPs e de seus inibidores (TIMPs e RECK) na progressão tumoral do câncer de mama, o perfil de expressão destes genes foi detectado, através de ensaios de Real-Time PCR, em um painel de cinco linhagens celulares de carcinoma de mama humano com diferentes potenciais invasivos e metastáticos e em 72 amostras teciduais de tumores primários de mama e 30 amostras teciduais de borda normal adjacente ao tumor. O perfil de expressão protéica de RECK foi avaliado em 236 amostras de tumores primários de mama através de ensaios de Tissue Microarray. Além disso, a atividade proteolítica das MMPs foi detectada em ensaios de Zimografia. Os resultados obtidos indicam que a progressão do câncer de mama humano está relacionada com um aumento dos níveis de expressão das MMPs e de seus inibidores específicos. O aumento dos níveis de expressão dos TIMPs parece estar relacionado ao seu papel como proteína multifuncional que pode estar funcionando de maneira a promover, mais do que suprimir, a progressão tumoral. Níveis elevados da expressão protéica de RECK estão associados com pior prognóstico. No entanto, para pacientes em estádios clínicos avançados, altos níveis de expressão de RECK podem estar correlacionados com melhor prognóstico, dependendo do balanço MMP/inibidor. Os níveis de expressão das MMPs apresentaram correlação positiva em relação aos níveis de expressão de seus inibidores específicos, sugerindo a existência de fatores e vias de sinalização comuns envolvidas na regulação coordenada destes genes. Além disso, a síntese do inibidor pode estar relacionada a uma resposta celular ao aumento da expressão e atividade de proteases. O balanço transcricional enzima/inibidor favorece a enzima nas amostras tumorais e, de modo contrário, o inibidor específico nas amostras de borda normal, sugerindo o balanço como o principal fator na determinação da degradação da MEC em processos invasivos e metastáticos. Os resultados obtidos podem contribuir para um melhor entendimento da complexidade dos mecanismos envolvidos na metástase do câncer de mama. / Breast cancer is among the most common tumors affecting women. Like most solid tumors, metastatic disease rather than the primary tumor itself is responsible for death. The metastatic process involves a complex cascade of events, including the organized breakdown of the extracellular matrix by matrix metalloproteinases (MMPs). The activity of these proteases is tightly regulated by specific inhibitors, known as tissue inhibitors of MMPs (TIMPs). Consistent with their role in tumor progression, high levels of a number of MMPs have been shown to correlate with poor prognosis in human cancers. On the other hand, TIMPs are multifunctional molecules with high levels of TIMP-1 and TIMP-2 having been shown to predict adverse prognosis and correlate with tumor aggressiveness in several different human cancers, including breast cancer. The RECK metastasis suppressor gene encodes a membrane-associated MMP regulator protein that is able to suppress tumor invasion and metastasis by negatively regulating MMPs involved in carcinogenesis, namely: MMP-2, MMP-9 and MMP-14 (MT1-MMP). In order to analyse the role of these genes in breast cancer progression, the expression levels of MMPs and theirs inhibitors were detected by Real Time PCR in a panel of five human breast cancer cell lines displaying different degrees of invasiveness and metastatic potential and in 72 primary breast cancer and 30 adjacent normal tissue specimens. The RECK protein expression profile was also examined in 236 primary breast cancer tissue specimens by Tissue Microarray technology. The proteolytic activity of MMPs was examined by Zymography. The results suggest that high expression levels of MMPs and their inhibitors are correlated with breast cancer progression. High levels of TIMP transcript may be involved in tumor-promoting activity as a result of their multifunctional role. Increased levels of the RECK protein are correlated with poor prognosis for the patient. However, high levels of RECK would be expected to confer a favorable prognosis to patients with advanced disease. The expression levels of MMPs significantly correlated with the levels of TIMPs and may be explained by coordinate correlation of these molecules or, alternatively, the synthesis of an inhibitor may be a cellular reaction to the presence of the protease. The enzyme/inhibitor balance at the transcriptional level favors the enzyme in tumor tissue and the inhibitor in adjacent normal tissue. It is probably the parameter that will determine the matrix degradation at invasion and metastatic process. Our results are likely to contribute for better understanding of the complex mechanisms involved in breast cancer metastasis.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patotipo emergente e heterogêneo que causa a diarréia aguda ou persistente em indivíduos de diferentes faixas etárias e em pacientes imunocomprometidos. Além disso, EAEC é um dos principais agentes etiológicos da diarréia dos viajantes. O padrão de aderência agregativa de EAEC está associado ao plasmídeo de aderência agregativa (pAA). Genes presentes no plasmídeo e no cromossomo codificam proteínas envolvidas na secreção extracelular de fatores de virulência na superfície ou diretamente na célula hospedeira. A capacidade de produção de muco e biofilme, elaboração de toxinas, aderência e indução de inflamação intensa na mucosa intestinal são importantes características da patogenicidade de EAEC. Nesse estudo, determinamos o perfil genotípico de genes do sistema de secreção Tipo V (SST5) e sistema de secreção Tipo VI (SST6) em cepas de EAEC. Os genes do SST5 ocorreram com mais frequência que os genes do SST6. A presença de pelo menos um gene do SST5 foi detectada em 79% das cepas, enquanto que os genes relacionados ao SST6 foram detectados em apenas 42% das cepas analisadas. A produção de biofilme foi observada em teste quantitativo e verificamos que 67% das cepas produziram biofilme. No teste qualitativo, o tipo de biofilme que predomina é o biofilme moderado (11 cepas), seguido do biofilme forte (9 cepas) e do biofilme discreto (4 cepas). A presença ou ausência de genes do SST5 e SST6 não parece interferir com a capacidade de produção de biofilme, nem com o tipo de biofilme formado. Em ensaios de citotoxicidade, apenas 25% das cepas EAEC (sobrenadante) causaram redução significativa na viabilidade de células T84 avaliada pelo teste de redução com MTT. Nossos resultados mostram que as cepas EAEC isoladas de crianças com diarréia aguda ou de grupo controle são invasoras para células T84. Ao compararmos a capacidade invasora das cepas clinicas e controle, observamos que a média do índice de internalização obtido nas 15 cepas do grupo clinico foi de 5,7% 1,7 e para as 9 cepas do grupo controle foi de 2.4 % 0,7; entretanto essa diferença observada não foi estatisticamente significativa. Não foi possível correlacionar o perfil genotípico dos genes do SST5 e SST6 com o perfil fenotípico analisado (formação de biofilme, citotoxicidade e invasão).O que pode ser atribuído a heterogeneidade genotípica e fenotípica, uma característica relevante de cepas EAEC. / Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) is an emerging and heterogeneous pathotype that causes acute or persistent diarrhea in individuals of different age groups and HIV-positive patients. In addition, EAEC is a major etiologic agent of travelers' diarrhea. The pattern of aggregative adherence of EAEC is associated with the aggregative adherence plasmid (pAA). Genes present in the plasmid and chromosome encode proteins involved in extracellular secretion of virulence factors on the surface or directly into the host cell. The production of mucus, biofilm and toxins; and induction of intense inflammation in the intestinal mucosa and mucosal adherence are major features of EAEC pathogenesis. In this study, we determined the genotypic profile of type V secretion system (T5SS) and type VI secretion system (T6SS) genes in EAEC strains. T5SS genes occurred more frequently than T6SS genes. The presence of at least one T5SS gene was detected in 79% of the strains, while genes related with T6SS were detected in only 42% of the strains tested. The biofilm production was observed in quantitative test, we have found that 67% of strains produced biofilm. In the qualitative test, we detected three distinctive patterns of biofilm formation: moderate (11 strains), strong (9 strains) and discrete biofilm (4 strains). The presence or absence of T5SS and T6SS genes do not interfere with the ability to produce biofilm, neither with biofilm pattern. In cytotoxicity assays, only 25% of EAEC strains (supernatant)resulted in significant reduction of T84 cells activity as evaluated by MTT reduction test. Our results show that EAEC strains isolated from children with acute diarrhea or the control group are able to invade T84 cells. When comparing the invasive ability of clinical and control strains, we observed that the average rate of internalization obtained in 15 clinical strains was 5.7% 1.7, for the nine strains of control group was 2.4% 0. 7, however this difference was not statistically significant. It was not possible to correlate the genotypic profile of T5SS and T6SS genes with the phenotypic profile analysed (biofilm formation, cytotoxicity and invasion), which can be attributed to genotypic and phenotypic heterogeneity, an important characteristic of EAEC strains