Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Sporotrichosis is a subcutaneous fungal infection of evolution subacute or chronic, inflammatory lesions characterized by pyogranulomatous aspect, caused by the dimorphic fungus Sporothrix schenckii. Adenosine deaminase (ADA) is a key enzyme in the purine metabolism, promoting the deamination of adenosine, an important anti-inflammatory molecule. The increase in ADA activity has been demonstrated in several inflammatory conditions, however, no data in the literature associated with this fungal infection. The objective of this study was to evaluate the activity of serum ADA (S-ADA) and lymphocytes (L-ADA) of rats infected with S. schenckii. We used seventy-eight rats divided into two groups. In the first experiment, rats were infected subcutaneously and in the second experiment, infected intraperitoneally. Blood samples for hematologic evaluation and activities of S-ADA and ADA-L were performed on days 15, 30 and 40 post-infection (PI) to assess disease progression. In experiment II, was observed in an acute decrease in activity of S-ADA and L-ADA (p <0.05), suggesting a compensatory mechanism in the body's attempt to protect the host from excessive tissue damage. Chronicity of the disease the rats in the experiment I and II at 30 days PI, showed an increased activity of L-ADA (p <0.05), promoting an inflammatory response in an attempt to combat the spread of the agent. Thus, it is suggested that infection with S. schenckii alters the activities of S-ADA experimentally infected rats, demonstrating the involvement of this enzyme in the pathogenesis of sporotrichosis. / A esporotricose é uma infecção micótica subcutânea de evolução subaguda ou crônica, caracterizada por lesões inflamatórias de aspecto piogranulomatoso, causada pelo fungo dimórfico Sporothrix schenckii. A adenosina desaminase (ADA) é uma enzima chave no metabolismo das purinas, promovendo a desaminação da adenosina uma importante molécula anti-inflamatória. O aumento na atividade da ADA tem sido demonstrado em várias condições inflamatórias, porém, não existem dados na literatura associados com esta infecção micótica. O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade da ADA no soro (S-ADA) e nos linfócitos (L-ADA) de ratos infectados por S. schenckii. Foram utilizados setenta e oito ratos distribuídos em dois grupos. No experimento I, os ratos foram infectados por via subcutânea e no experimento II, infectados por via intraperitoneal. A coleta de sangue para a avaliação hematológica e atividades da S-ADA e L-ADA foram realizadas nos dias 15, 30 e 40 pós-infecção (PI), para avaliar a evolução da doença. No experimento II, foi observada na fase aguda uma diminuição na atividade da S-ADA e L-ADA (p<0.05), sugerindo um mecanismo compensatório do organismo na tentativa de proteger o hospedeiro da lesão tecidual excessiva. Com a cronicidade da enfermidade os ratos do experimento I e II aos 30 dias PI, apresentaram um aumento na atividade da L-ADA (p<0.05), promovendo uma resposta inflamatória na tentativa de combater a proliferação do agente. Assim, sugere-se que a infecção pelo S. schenckii altera as atividades da S-ADA e L-ADA de ratos infectados experimentalmente, demonstrando o envolvimento desta enzima na patogênese da esporotricose.

Toxoplasmosis, caused by the intracellular protozoan Toxoplasma gondii is an infectious disease, and this triggers the activation of the immune system. The pregnancy, in turn, shows characteristics of systemic inflammatory response. The ecto-enzymes as E-NTPDase and E- ADA activities in addition to possessing important in regulating the levels of adenine nucleotides and nucleoside, have shares extremely important in the immune system. Thus, the aim of this study was to determine the activity of enzymes that degrade adenine nucleotides and nucleoside in lymphocytes of women with antibodies to Toxoplasma gondii. Were included in the study, pregnant women seropositive (immune) and seronegative (susceptible) to toxoplasmosis in the last trimester of pregnancy, previously diagnosed service prenatal HUSM. Also, non-pregnant women seropositive and seronegative for toxoplasmosis, in the period from March to December 2012. We determined the enzymatic activities of ecto-enzymes: E-NTPDase and E-ADA in lymphocytes of pregnant and non-pregnant. The results showed an increase of the E-NTPDase activity and may lead to decreased levels of nucleotides ATP and ADP, and an increase in the activity of E-ADA, which may cause a decrease in the concentration of adenosine in groups: III (seronegative pregnant women toxoplasmosis) and IV (seropositive pregnant women for toxoplasmosis) when compared to the control group (I: non-pregnant women seronegative for toxoplasmosis). Pregnant women seropositive for toxoplasmosis compared with seronegative pregnant women did not change, thus revealing that toxoplasmosis in its chronic phase, may not interfere with purinergic signaling. In conclusion, the third trimester of pregnancy appears to be a physiological condition that involves purinergic signaling and toxoplasmosis in its chronic phase does not seem to be able to change this signaling. / A toxoplasmose, causada pelo protozoário intracelular Toxoplasma gondii é uma doença infecciosa,e com isso, desencadeia a ativação do sistema imune. A gestação, por sua vez, demonstra características da resposta inflamatória sistêmica. As ectoenzimas como: E-NTPDase e E-ADA, além de possuírem importante atividade na regulação dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeo da adenina, possuem ações extremamente importantes no sistema imunológico. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi determinar a atividade de enzimas que degradam nucleotídeos e nucleosídeo da adenina em linfócitos de gestantes com anticorpos para Toxoplasma gondii. Foram incluídas na pesquisa, gestantes com sorologia positiva (imunes) e com sorologia negativa (suscetíveis) para toxoplasmose, no último trimestre gestacional, previamente diagnosticadas no serviço pré-natal do HUSM. E também, mulheres não gestantes com sorologia positiva e com sorologia negativa para toxoplasmose, no período de março a dezembro de 2012. Foram determinadas as atividades enzimáticas das ectoenzimas: E-NTPDase e E-ADA nos linfócitos das gestantes e das não gestantes. Os dados encontrados revelaram uma alteração nas atividades das ectoenzimas do sistema purinérgico no grupo de gestantes. Os resultados demonstraram um aumento da atividade da E-NTPDase, podendo levar a uma diminuição dos níveis de nucleotídeos ATP e ADP; e um aumento na atividade da E-ADA, podendo ocasionar uma diminuição da concentração de adenosina nos grupos: III (gestantes soronegativas para toxoplasmose) e IV (gestantes soropositivas para toxoplasmose) quando comparados ao grupo controle (I: mulheres não gestantes soronegativas para toxoplasmose). As gestantes soropositivas para toxoplasmose quando comparadas com as gestantes soronegativas não apresentaram alteração, revelando assim, que a toxoplasmose na sua fase crônica, possivelmente não interfere na sinalização purinérgica. Em conclusão, o terceiro trimestre gestacional mostra-se uma condição fisiológica que envolve a sinalização purinérgica e que a toxoplasmose em sua fase crônica não parece ser capaz de alterar esta sinalização.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Type 1 diabetes (T1D) is a disease characterized by the individual's inability to produce the hormone insulin due to destruction of pancreatic β-cells by the immune cells of the organism itself. So far, there is no 100% effective therapy for treating the symptoms of T1D. Current treatments involve constant monitoring of blood glucose levels and regular insulin injections. Inflammatory processes are associated with the development and progression of T1D, and so new therapies involving drugs with anti-inflammatory properties have been the subject of increasing interest in the scientific community. Polyphenols are a class of heterocyclic compounds that include anthocyanins and rosmarinic acid, both known for their antioxidant and anti-inflammatory properties. We studied the effects of two polyphenol rich extracts (cooked potato and rosemary) and a concentrate of anthocyanins in a model of type 1 streptozotocin-induced diabetic rats. The extracts were administered by gavage for 30 days. After this period, the rats were euthanized and we assessed acetylcholinesterase (AChE) activity in lymphocytes and serum butyrylcholinesterase (BuChE) activity, because of the importance of these enzymes as biomarkers of inflammation. The activities of both enzymes were shown to be increased in diabetic rats compared to controls. The cooked potato peel extract and concentrated anthocyanins did not altered AChE activity in lymphocytes, probably due to low bioavailability, while rosemary extract was a potent inhibitor and reverted the activity to normal levels. None of the treatments had any effect on serum BuChE activity. These results support the involvement of inflammatory processes on TD1 pathology and present the rosemary extracts as a promising alternative for future phytochemical therapies for the treatment of inflammatory-related diseases, such as type 1 diabetes. / O diabetes tipo 1 (DT1) é uma doença caracterizada pela incapacidade do indivíduo de produzir o hormônio insulina devido à destruição das células-β pancreáticas pelas células imune do próprio organismo. Ainda não existe uma terapia 100 % eficaz para tratar os sintomas do DT1. Os tratamentos atuais envolvem monitoramento constante dos níveis de glicose do sangue e injeções periódicas de insulina. Os processos inflamatórios estão associados com o desenvolvimento e a progressão do DT1 e, por isso, novas terapias envolvendo fármacos com propriedades anti-inflamatórias têm sido alvo crescente de interesse no meio científico. Os polifenois são uma classe de compostos heterocíclicos dos quais fazem parte as antocianinas e o ácido rosmarínico, conhecidos por suas propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias. Neste trabalho, estudamos os efeitos de dois extratos ricos em polifenois batata cozida e alecrim - e de um concentrado de antocianinas em um modelo de ratos com diabetes tipo 1 induzido por estreptozotocina. Os extratos foram administrados por gavagem durante 30 dias. Após, os ratos foram eutanasiados e verificou-se os efeitos do tratamento sobre a atividade da acetilcolinesterase (AChE) de linfócitos e da butirilcolinesterase (BuChE) de soro, devido à importância dessas enzimas como biomarcadores de inflamação. As atividades de ambas as enzimas mostraram-se aumentadas nos ratos diabéticos em relação aos controles. O extrato de casca de batata cozida e as antocianinas concentradas não alteraram significativamente a atividade da AChE em linfócitos, provavelmente devido à sua baixa biodisponibilidade, enquanto o extrato de alecrim foi um potente inibidor dessa enzima. Nenhum dos tratamentos surtiu efeito sobre a atividade da BuChE de soro. Estes resultados reforçam a hipótese inflamatória na patologia do DT1 e apresentam o extrato de alecrim como uma possível terapia secundária para o tratamento de doenças associadas à inflamação, como o diabetes tipo 1.

The NTPDase1 enzymatic activity (E.C.3.6.1.5, Apyrase, ecto-ATP-diphosphohydrolase, CD39) which hydrolyses ATP and ADP, was analyzed in peripheral lymphocytes from patients with B chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) which the main characteristic is the accumulation of monoclonal mature B-lymphocyte. The sample was composed by 23 patients with B-CLL whose were diagnosed according to the clinical and laboratorial criteria and also by the immunophenotypic characteristics. The patients were divided, according to the Binet staging system, in 4 groups: stage A (early), stage B (intermediate), stage C (advanced) and control group. The results demonstrated a significant increase in ATP hydrolysis (F(29,3)=26.79 p<0.001) for all the stages of the disease and related to the control as a function of length of disease advance with higher activity in stage C. ADP hydrolysis (F(29,3)=23.76 p<0.001) was also enhanced according to ATP results. Besides this it was found a great correlation between the activity of NTPDase-1 and the total absolute white cells count in peripheral blood. The alteration in NTPDase-1activity in lymphocytes from patients with B-CLL at the different stages, contributes to confirm the ectonucleotidases role in regulate the ATP and ADP levels, which actuates like signalling molecules in many blood cells like the lymphocytes. Therefore more studies need to be done so that we can elucidate such enzymatic system in the nucleotides and its role in the B-CLL. / A atividade da enzima NTPDase1 (E.C.3.6.1.5, Apyrase, ecto-ATP-difosfoidrolase,CD39) que hidrolisa ATP e ADP, foi analisada em linfócitos periféricos de pacientes com leucemia linfocítica crônica (LLC-B), doença que possui como característica principal o acúmulo de linfócitos B maduros. A amostra foi composta por 23 pacientes com LLC-B, diagnosticados de acordo com critérios clínicos, laboratoriais e resultados de imunofenotipagem. Os pacientes foram divididos, conforme o sistema de classificação de Binet, em 4 grupos: estágio A (inicial), estágio B (intermediário), estágio C (avançado) e um grupo controle. Os resultados demonstraram que a hidrólise do ATP foi significativamente aumentada (F(29,3)=26.79 p<0.001) em todos os estágios da doença e em relação ao controle e esse aumento é compatível com o avanço da doença mostrando a maior hidrólise no estágio C. A hidrólise do ADP acompanhou os resultados do ATP e também estava aumentada (F(29,3)= 23.76 p<0.001). Além disso, verificou-se uma forte correlação entre a atividade da enzima NTPDase1 e a contagem absoluta de glóbulos brancos do sangue periférico. A alteração na atividade da enzima NTPDase1 em linfócitos de pacientes com LLC-B em seus diferentes estágios, vem confirmar o importante papel das ecto-nucleotidases na regulação dos níveis de ATP e ADP, os quais atuam como moléculas sinalizadores em várias células sangüíneas como os linfócitos. Entretanto, mais estudos são necessários para melhor elucidar as funções desse sistema enzimático no controle de nucleotídeos e o seu papel na LLC-B.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Hypercholesterolemia is a metabolic disease characterized by high levels of serum low density lipoproteins and total cholesterol, associated with the inflammatory disorders, the migration of monocytes and T cells and with an endothelial dysfunction. The purinergic signaling system plays an important role in the modulation of inflammatory and immune response by extracellular biomolecules such as adenine nucleotides and their derived nucleoside adenosine, which are essential for the initiation and maintenance of response inflammatory. The effects of these molecules are promoted by the action of purinergic receptors specifics and controlled by ectoenzymes, in cell surface. Based on these principles, this study investigated the effect of guaraná on the activity of the E-NTPDase and E-ADA in lymphocytes, as well as analyze the biochemical parameters in rats with induced hypercholesterolemia by diet. The rats were divided in eight groups, of which four were induced hypercholesterolemia and the other four groups received normal diet. The animals in each diet were subdivided according treatment, saline, guaraná 12.5, 25 and 50 mg/kg/day orally for 30 days. There was observed an increase in 74% in ATP hydrolysis by E-NTPDase activity in lymphocytes of rats with hypercholesterolemia treated at doses of 25 and 50 mg/kg/day when compared with all other groups. However, E-NTPDase activity was not altered when used ADP as substrate for these three doses. Moreover, the hypercholesterolemic group treated with the higher concentration showed higher decreased of about 70% in E-ADA activity than the other normal diet groups. Was also observed that the guaraná was able to reduce to basal levels, total cholesterol and LDL-C in hypercholesterolemic rats. In addition, the guaraná in high concentrations when associated with hypercholesterolemic diet was able to increase the ATP hydrolysis and decrease the E-ADA activity in lymphocytes, contributing to reducing the inflammatory process. Although requiring further study, guaraná could be used as a complementary therapy for the benefit of people with hypercholesterolemia. / A hipercolesterolemia é uma doença metabólica caracterizada por elevados níveis séricos de lipoproteínas de baixa densidade e de colesterol total, associada com desordens inflamatórias, com a migração de monócitos e linfócitos T e com disfunção endotelial. O sistema de sinalização purinérgica desempenha um papel importante na modulação das respostas inflamatórias e imunes através de biomoléculas extracelulares, como os nucleotídeos de adenina e seu derivado, o nucleosídeo adenosina, que são indispensáveis para a iniciação e manutenção de respostas inflamatórias. Os efeitos de tais moléculas são promovidos pela ação dos receptores purinérgicos específicos e controlados por ectoenzimas, na superfície das células. Com base nestes princípios, este estudo investigou o efeito do guaraná sobre a atividade da E-NTPDase e da E-ADA nos linfócitos, assim como analisar os parâmetros bioquímicos, de ratos com hipercolesterolemia induzida por dieta. Os ratos foram divididos em oito grupos, quatro foram induzidos à hipercolesterolemia e os outros quatro grupos receberam dieta normal. Os animais de cada dieta foram subdivididos de acordo com o tratamento, sendo utilizado solução salina, guaraná 12.5, 25 e 50 mg/kg/dia via oral, durante 30 dias. Observou-se um aumento em 74% na hidrólise de ATP na atividade da E-NTPDases de ratos com hipercolesterolemia, tratados com doses de 25 e 50 mg/kg/dia, quando comparados com todos os outros grupos. Contudo, a atividade da E-NTPDase não foi alterada quando utilizado ADP como substrato, para os ratos tratados nas três doses. No entanto, o grupo hipercolesterolêmico tratado com a maior concentração, apresentou maior diminuição na atividade da E-ADA, cerca de 70%, quando comparado com os outros grupos que receberam dieta normal. Também foi observado que o guaraná foi capaz de reduzir aos níveis basais, o colesterol total e LDL-C em ratos hipercolesterolêmicos. Em conclusão, o guaraná em concentrações elevadas quando associado com a dieta hipercolesterolêmica, foi capaz de aumentar a hidrólise do ATP e diminuir a atividade da E-ADA nos linfócitos, contribuindo para a redução do o processo inflamatório. Embora careça de maiores estudos, o guaraná poderia ser utilizado como uma terapia complementar em benefício de pessoas com hipercolesterolemia.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The exposure to the cigarette smoke xenobiotics is related with a compromised immune system and the development of many diseases such as Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) and lung cancer. The NTPDase and acetylcholinesterase (AChE) are important enzymes involved in the regulation of immune system and alterations in their activities have been showed in many diseases including the related with cigarette smoke-exposure. The curcumin (Cur), polyphenol isolated from the rhizomes of Curcuma longa and widely employed in the culinary and oriental traditional medicine, has many biological activities such as antioxidant, anticarcinogenic and antiinflammatory. Considering the relevance of lymphocytes in the establishment and progression of immune responses, the purpose of this study was to evaluate the effect of curcumin in the NTPDase and AChE activities in peripheral lymphocytes (PL) and lung lymphocytes (LL) from rats exposed to cigarette smoke. The establishment of a protocol to lung lymphocytes separation using the lung tissue was performed with the objective of optimize the cellular viability and the purity of separation, using as references the protocols for separation of human peripheral and lung lymphocytes. The experimental procedure to evaluate the effect of curcumin on the NTPDase and AChE in lymphocytes from rats exposed to the cigarette smoke was divided in two sets of experiments. In the first set, the animals were randomly divided into four groups: Vehicle; Cur 12.5 mg/kg; Cur 25 mg/kg; Cur 50 mg/kg. In the second experimental set, the animals were divided into 5 groups: Vehicle; smoke exposed; smoke and Cur 12.5 mg/kg; smoke and Cur 25 mg/kg; smoke and Cur 50 mg/kg. Curcumin was diluted with corn oil, administered by oral gavage, not exceeding 1 ml/kg body weight. The treatment with curcumin and cigarette smoke was carried out once a day, 5 days each week, during 30 days. It was administered the curcumin or corn oil, and approximately 10 minutes later, the smoking groups were exposed to the sidestream smoke of four commercial cigarettes (nicotine 0.9 mg, tar 10 mg each) inside a whole-body smoke exposure chamber. Control animals were placed in an equal chamber for the same amount of time. After thirty days, the animals were euthanized, the lung was removed and the peripheral blood collected for separation of lymphocytes. With the standardization of the protocol to the separation of lung lymphocytes it was achieved a percentage of lymphocytes higher than 82% and it was observed a strong correlation between the enzyme activity using ATP and ADP as substrates, which indicates that the results can be expressed in milligram of protein, millions of cells and millions of viable cells. The results from the experiments with the cigarette smoke exposure demonstrated that the treatment with curcumin prevented the alterations observed in the cigarette smoke-exposed animals such as the decrease of ATP and ADP hydrolysis in PL and LL, and the increase of AChE activity in PL. We suggest that the treatment with curcumin was protective, since the high concentrations of ATP are positively related with inflammation and tissue damage, and the emphysematous damages observed in cigarette smoke-exposed was not observed in the groups treated with curcumin. / A exposição aos xenobióticos da fumaça do cigarro está relacionada com o comprometimento do sistema imune e o desenvolvimento de diversas doenças como a Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) e câncer de pulmão. A NTPDase e a acetilcolinesterase (AChE) são importantes enzimas envolvidas na regulação do sistema imune e alterações nas suas atividades tem sido descritas em várias doenças incluindo as relacionadas à exposição à fumaça do cigarro. A curcumina (Cur), polifenol obtido a partir de rizomas de Curcuma longa e amplamente utilizado na culinária e na medicina tradicional oriental, possui muitas atividades biológicas como antioxidante, anticarcinogênica e antiinflamatória. Tendo em vista a relevância dos linfócitos no estabelecimento e progressão de respostas imunes, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da curcumina na atividade das enzimas NTPDase e AChE em linfócitos periféricos (PL) e linfócitos pulmonares (LL) de ratos expostos à fumaça do cigarro. A padronização da separação dos linfócitos a partir de tecido pulmonar foi realizada com o objetivo de otimizar a viabilidade celular e a pureza da separação, utilizando-se como base os protocolos de separação de linfócitos periféricos e pulmonares de seres humanos. Os procedimentos experimentais para a avaliação do efeito da curcumina sob a atividade das enzimas NTPDase e AChE em linfócitos de ratos expostos à fumaça do cigarro foram divididos em duas etapas. Primeiramente, os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: veículo; Cur 12.5 mg/kg, Cur 25 mg/kg; Cur 50 mg/kg. Na segunda etapa experimental os animais foram divididos aleatoriamente em cinco grupos: veículo; cigarro; cigarro e Cur 12.5 mg/kg; cigarro e Cur 25 mg/kg; cigarro e Cur 50 mg/kg. A curcumina foi diluída em óleo de milho, administrada por gavagem oral, não excedendo 1 ml/kg de massa corpórea. O tratamento com a curcumina e com a fumaça do cigarro foi realizada uma vez por dia, cinco dias por semana, durante trinta dias. A curcumina foi administrada e, após aproximadamente dez minutos, os grupos fumantes eram expostos à fumaça de quatro cigarros comerciais (0,9 mg nicotina, 10 mg alcatrão cada) dentro de uma câmara de exposição. Os animais não expostos à fumaça do cigarro foram colocados em uma câmara equivalente, pelo mesmo período. Após trinta dias, os animais foram eutanasiados, os pulmões removidos e o sangue periférico coletado para a separação dos linfócitos. Com a padronização da técnica para a separação de linfócitos pulmonares foi obtido um percentual de linfócitos superior a 82% e ainda observou-se uma forte correlação entre a atividade da enzima usando ATP e ADP como substrato o que indica que os resultados podem ser expressos tanto em miligramas de proteína, quanto em milhões de células quanto em milhões de células viáveis. Os resultados dos experimentos com a fumaça do cigarro demonstraram que o tratamento com a curcumina preveniu as alterações observadas nos animais expostos à fumaça do cigarro como a diminuição na hidrólise de ATP e ADP em PL e LL, e o aumento da atividade da AChE em PL. Analisando os resultados obtidos, sugere-se que o tratamento com a curcumina foi protetor, uma vez que as altas concentrações de ATP estão positivamente relacionadas com inflamação e dano tecidual, e as lesões enfisematosas observadas no grupo exposto à fumaça do cigarro não foram observadas com os tratamentos com a curcumina.

Orientador: Marisa Masumi Beppu / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-18T11:40:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vasconcellos_FernandodaCruz_D.pdf: 16906370 bytes, checksum: f307344fa0f9ccb976c0dbb73c5bf226 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O trabalho trata da produção de filmes nanoestruturados multicamadas de biopolímeros sobre substratos sólidos com a técnica de deposição layer-by-layer (LbL). A técnica de montagem layer-by-layer é uma ferramenta adequada para produção controlada de filmes de multicamadas com propriedades importantes tais como: a biocompatibilidade, a biodegrabilidade, a baixa toxicidade, a hidrofilicidade e a baixa citotoxicidade, concedendo a estes filmes grande versalitidade em suas aplicações. O foco principal da pesquisa foi estudar multicamadas dos polieletrólitos naturais quitosana e ácido hialurônico e sua aplicabilidade para: 1) promover a adesão de linfócitos B, 2) gerar superfícies antibacterianas. Os testes da preparação e o estudo da variação de parâmetros de montagem de filmes dos biopolímeros, assim como sua caracterização foram úteis para a avaliação dessas aplicações. O estudo também incluiu a produção de filmes multicamadas contendo outros biopolímeros (alginato de sódio e carboximetilcelulose), assim como polímeros sintéticos e nanopartículas. A caracterização dos filmes envolveu diversas técnicas de análise, dentre elas: microscopia de força atômica (MFA), que permitiu obter informações sobre a topologia e elasticidade dos filmes, e microbalança de cristal de quartzo com dissipação (QCM-D), que permitiu fazer uma análise em tempo real das características dos filmes durante a deposição dos biopolímeros. Os resultados obtidos neste trabalho mostram a viabilidade da fabricação de filmes multicamadas a base de biopolímeros para uso na imobilização de linfócitos B. Os resultados mapeiam e otimizam as variáveis de preparação dos filmes de multicamadas dos polieletrólitos (PEMs) de HA e CHI através do pH, força iônica, e última camada depositada, que influenciam a imobilização seletiva dos linfócitos. Estes filmes exploram as interações CD44-ácido hialurônico sem a necessidade de utilização de reações químicas agressivas e promovem a adesão seletiva de linfócitos assegurando a viabilidade, habilidade de replicação e funções dos linfócitos, após a imobilização. Filmes assim construídos tem aplicação em biossensores a base de células, engenharia do sistema imune, sistemas de diagnóstico e tratamento de doenças entre outras. Os resultados mostraram também que a técnica LbL é viável para a construção de superfícies antibacterianas. As propriedades antibacterianas e de imobilização de linfócitos da superfície desses filmes são passíveis de aplicações biotecnológicas / Abstract: This thesis is on the production of biopolymer nanostructured multilayered thin films deposited on solid substrates utilizing the layer-by-layer (LbL) deposition technique. The layer-by- layer deposition technique of assembly is a simple yet versatile and powerful tool for the controlled production of biopolymer multilayered thin films carrying important properties, such as: biocompatibility, biodegradability, low toxicity, hydrophilicity, low cytotoxicity, which entice them as candidates for a wide variety of applications. The main focus of the research was the study of natural biopolymer polyelectrolytes such as chitosan and hyaluronic acid, and their applicability in: 1) promoting the adhesion of B lymphocytes, and 2) generating antibacterial surfaces. The film preparation process in itself and the study of the film properties as a function of deposition parameters, such as pH and ionic strength, during assembly, were very important in tailoring the multilayer film for specific applications. The study also included the production of multilayered films composed by other biopolymers (sodium alginate, carboxymethylcellulose), as well as by synthetic polymers and nanoparticles. The characterization of the films involved various techniques, such as: atomic force microscopy (AFM) - which allowed the acquisition of information regarding film topology and elasticity, and the quartz crystal microbalance with dissipation (QCM-D), which permitted an analysis, in real time, of the film characteristics during deposition of the biopolymers. The results obtained in this work show the feasibility of fabricating multilayered thin films based on biopolymers for their use in the adhesion of B lymphocytes. The results map out and optimize the preparation of polyelectrolyte multilayered (PEMs) composed of HA and CHI through the variation of pH, ionic strength, and choice of last layer deposited, all factors that influence the selective immobilization of lymphocytes. These films explore the CD44- hyaluronic acid interactions without the use of aggressive chemical reactions to promote the selective adhesion of lymphocytes, maintaining their viability, meaning, maintaining their ability to replicate and their native functions after being immobilized. The results also show the feasibility of the LbL technique in producing biopolymer films having antibacterial properties. Both film characteristics - the adhesion and the antibacterial properties - find applicability in the area of bionanotechnology. These films may be used in the fabrication of cell based sensors, in immune system engineering, in diagnostics systems and in disease treatments, among others / Doutorado / Engenharia de Processos / Doutor em Engenharia Química

Orientadores: Ronei Luciano Mamoni, Maria Heloisa Souza Lima Blotta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T10:53:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Longhi_LarissaNaraAlegrini_D.pdf: 4091504 bytes, checksum: 149e4a062c177377d07fb66598d14e85 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Pesquisas recentes têm demonstrado a importância da resposta imune inata no controle da resposta adaptativa. Em estudo anterior pudemos demonstrar que as células Natural Killer (NK) participam da resposta imunológica ao Paracoccidioides brasiliensis, agente etiológico da Paracoccidioidomicose (PCM). Atualmente sabe-se que células dendríticas (DCs) são capazes de interagir com células NK, aumentando a sua atividade. O objetivo deste trabalho foi avaliar o mecanismo utilizado pelas células NK no reconhecimento de células leveduriformes de P. brasiliensis e, se DCs estimuladas pelo fungo são capazes de interagir com células NK e por conseguinte influenciar a diferenciação de linfócitos T. Foram utilizadas DCs derivadas de monócitos e células CD56+ (NK) isoladas do sangue periférico de indivíduos saudáveis. A análise do papel dos receptores do tipo toll (TLR-2 e TLR-4) e do receptor de complemento 3 (CR3 - CD11b) no reconhecimento do P. brasiliensis pelas células NK demonstrou que este último receptor é provavelmente mais importante, uma vez que o seu bloqueio diminuiu a ativação e a atividade citotóxica direta das células NK contra o fungo. Enquanto que o TLR2, em conjunto com o CR3 leva à produção de citocinas como IFN-gama e TNF-alfa. Além disso, nossos resultados demonstraram que DCs estimuladas com o fungo são ativadas e produzem citocinas importantes para a ativação de células NK (IL-12, IL-18, IL-23 e IL-15). Células NK estimuladas com essas citocinas ou cocultivadas com DCs (previamente estimuladas com leveduras do fungo) apresentam maior capacidade de proliferação, aumento na expressão de marcadores de ativação (CD25 e CD69), aumento na capacidade fungicida e aumento da produção de citocinas como IFN-gama e TNF-alfa. Esses efeitos foram parcialmente dependentes de contato, provavelmente envolvendo a participação de IL-15 associada à membrana das DCs, e também à produção de citocinas solúveis (IL-12, IL-23 e IL-18) pelas DCs. Por outro lado, a interação entre células NK e DCs leva estas últimas a aumentarem a expressão de moléculas coestimulatórias (CD80 e CD86) e de moléculas de MHC de classe II, importantes para a apresentação de antígenos aos linfócitos T. Também pudemos observar que a interação entre DCs estimuladas com células leveduriformes de P. brasiliensis e células NK levam a diferenciação de linfócitos T CD4+ e T CD8+ produtores de IFN-gama, ao mesmo tempo inibindo a diferenciação de linfócitos T produtores de IL-4. Em conjunto nossos resultados demonstraram que a interação entre DCs e células NK estimuladas com células leveduriformes de P. brasiliensis leva a um aumento tanto da ativação das DCs quanto das células NK, e que essa interação pode ser importante para modular a resposta imunológica adquirida subsequente / Abstract: Several studies have shown that the innate immune response presents a fundamental role in controlling the adaptive immune response. In a previous study we demonstrated that natural killer cells (NK) participate in the immune response to Paracoccidioides brasiliensis, the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM). Currently it is known that dendritic cells (DCs) are able to interact with NK cells, increasing its activity. The objective of this study was to evaluate the mechanism used by NK cells in the recognition of P. brasiliensis yeast cells and, whether DCs stimulated by the fungus are able to interact with NK cells and therefore influence the differentiation of T lymphocytes. We used DCs derived from monocytes and CD56 + (NK) cells isolated from peripheral blood of healthy individuals. We analyzed the role of some toll-like receptors (TLR-2 and TLR-4) and the complement receptor 3 (CR3 - CD11b) in the recognition of P. brasiliensis NK cells. Our results showed that the CR3 is probably more important, since that its blockage decreased the activation and the direct cytotoxic activity of NK cells against the fungus. Furthermore, activation via TLR2, together with CR3, leads to the production of cytokines such as IFN-gamma and TNF-alpha. Moreover, our results demonstrated that DCs stimulated with the fungus are activated and produce cytokines important for the activation of NK cells (IL-12, IL-18, IL-23 and IL-15). NK cells stimulated with these cytokines or co-cultured with DCs (previously stimulated with yeast cells) presented greater capacity for proliferation, increased expression of activation markers (CD25 and CD69), increased fungicide capacity and increased production of cytokines such as IFN-gamma and TNF-alpha. These effects were partially dependent on contact, probably involving the participation of membrane associated IL-15, and also the production of soluble cytokines (IL-12, IL-23 and IL-18) by DCs. In addition, the interaction between NK cells and DCs leads to an increased expression of molecules important for the antigen presentation to T cells, such as costimulatory molecules (CD80 and CD86) and class II MHC on DCs. We also observed that the interaction between DCs (stimulated with the fungus) and NK cells increased the differentiation of T CD4+ and T CD8+ cells into IFN-gamma producing lymphocytes, while inhibited the differentiation of IL-4 producing T lymphocytes. Altogether our results demonstrate that the crosstalk between DCs and NK cells stimulated with P. brasiliensis yeast cells leads to an increased activation of both DCs and NK cells, and that this interaction can be important for modulating the subsequent acquired immune response against the fungus / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutora em Ciências Médicas

Orientadores: Liana Maria Cardoso Verinaud, Wilson Savino / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T20:13:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Francelin_Carolina_D.pdf: 110859425 bytes, checksum: e99991048374fbaee764c7b0f509643f (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O timo é o órgão linfoide primário responsável pela geração de linfócitos T maduros. Para que isso ocorra, células precursoras de linfócitos T, provenientes da medula óssea, entram no timo e migram constantemente através do microambiente tímico ¿ o qual é composto por componentes linfoides e não linfoides. Esta migração intratímica é fundamental para que os precursores das células T encontrem os sinais necessários para sobrevivência, proliferação, diferenciação e geração de diversidade de repertório. Assim como os outros órgãos linfoides, o timo está sujeito a um rígido controle neuroendócrino, o qual impõe consequências diretas sobre o funcionamento do sistema imunológico através de neurotransmissores, hormônios e citocinas. Entretanto, ainda é pouco o que se sabe sobre as interações entre os componentes do timo e hormônios do eixo HPA. Neste trabalho, foram avaliados os compartimentos linfoide e estromal na atrofia tímica observada no modelo experimental da diabetes tipo I. Nesse estudo foi observado que camundongos diabéticos apresentaram redução nos níveis séricos e intratímicos de leptina e elevados níveis séricos e intratímicos de corticosteroide, acompanhando a queda dos níveis séricos de insulina. Diante das alterações hormonais, nós observamos: modificações nos componentes linfoides e estromais do timo, caracterizadas por redução no número de timócitos, aumento na secreção de elementos de matriz extracelular, contração da porção cortical do timo acompanhada por acúmulo de linfócitos no estágio pré - seleção positiva, aumento da apoptose de células epiteliais tímicas e timócitos e aumento na exportação de células T imaturas para os órgãos linfoides secundários. Sucintamente, após o estabelecimento da hiperglicemia e ausência de insulina circulante, o timo de animais diabéticos apresentou alterações morfológicas e em todos os tipos celulares e fatores solúveis que compõe o estroma tímico, culminando em alterações nas células presentes na periferia do sistema imune. Acreditamos que os dados gerados nesse estudo contribuem, s.m.j., para um melhor entendimento da deficiência na resposta imune em indivíduos diabéticos e do desenvolvimento do linfócito T na ausência de insulina / Abstract: Thymus is the primary lymphoid organ responsible for the generation of T lymphocytes. For this to occur, precursor cells of T lymphocytes from bone marrow enter the thymus and migrate continuously through the thymic microenvironment - which consists of lymphoid and non-lymphoid components. This intrathymic migration is essential for T cell precursors get contact with signs that promote survival, proliferation, differentiation and generation of diversity of repertoire. Like other lymphoid organs, the thymus is subject to a rigid neuro-endocrine control, which requires direct consequences on the functioning of the immune system through neurotransmitters, hormones and cytokines. However, it is still little known about the interactions between the components of thymus hormones and the HPA axis. In this study, we evaluated the alterations in lymphoid and stromal thymic compartiments in thymic atrophy during experimental model of diabetes type I. Here in, we found that diabetic mice exhibit a reduction in serum aand intrathymic levels of leptin yet, intrathymic and serum corticosteroid levels were high, followed by a drop in serum insulin levels. Given the hormonal changes, we observed: changes in lymphoid and non-lymphoid component of the thymus, characterized by reduction in the number of thymocytes, increased secretion of extracellular matrix elements, contraction of the cortical portion of the thymus accompanied by accumulation of lymphocytes in the pre stage - positive selection, increased apoptosis of thymic epithelial cells and thymocytes and increase in export of immature T cells to secondary lymphoid organs. Briefly, after the onset of hyperglycemia and lack of circulating insulin, thymus in diabetic animals showed alterations in all cell types that comprise the thymic microenvironment, resulting in abnormal cells present in the periphery of the immune system. We believe that the data generated in this study will contribute to a better understanding of the immune deficiency in diabetic individuals and the development of T lymphocytes in the absence of insulin response / Doutorado / Imunologia / Doutora em Genética e Biologia Molecular

As células dendríticas (DCs) expressam receptores que reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), sendo capazes de capturar, processar e apresentar antígenos para os linfócitos. O contato com PAMPs induz a maturação das DCs e, consequentemente, a ativação dos linfócitos. Nossa estratégia para desenvolver vacinas é empregar anticorpos monoclonais contra os receptores endocíticos DEC205 e DCIR2, presentes nas subpopulações de DCs, em fusão com o antígeno de interesse. E estimular a maturação delas utilizando os adjuvantes poly I:C, CpG ODN 1826 e flagelina de S. Typhimurium . Imunizamos camundongos selvagens ou knockouts para os receptores TLR 3, 5 e 9 com adjuvantes e anticorpos quiméricos anti-DEC205, anti-DCIR2 ou isotipo controle (Iso) fundidos a proteína MSP119 de Plasmodium vivax. Avaliamos as repostas humoral e celular no grupos imunizados. Os resultados indicam que, seja qual for o adjuvante usado, a maioria dos parâmetros analisados aponta para a superioridade do direcionamento do antígeno para o receptor DEC205. / Dendritic cells (DCs) express receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), and are able to capture, process and present antigens to lymphocytes. In recent years, a immunization strategy that directs antigens to DCs in vivo has been developing. This consists in the use of monoclonal antibodies fused with the antigen of interest. However, effective immune activation occurs mainly when the chimeric antibodies anti-DEC or anti-DCIR2 are administered in the presence of a DC maturation stimulus. We immunized wild type and knockout mice for TLR3, 5 and 9 with adjuvants (poly I:C, CpG ODN 1826 and flagellin from S. typhimurium) and chimeric anti-DEC205, anti-DCIR2 or isotype control fused to the Plasmodium vivax MSP119 protein. After the administration of two doses, we evaluated the humoral and cellular immune responses in the different groups. Our results indicate that, irrespectively of the adjuvant, the majority of parameters analyzed points out to the superiority of antigen targeting to the DEC205 receptor.