Zellen benutzen Signalwege ein, um auf Änderungen in ihrer unmittelbaren Umgebung zu reagieren. Der Signalweg des transformierenden Wachstumsfaktors β (TGFβ) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung vieler zellulärer Prozesse, einschließlich Zellproliferation, Differenzierung und Migration. Obwohl die Hauptkomponenten der TGFβ-Signalgebung in den letzten Jahrzehnten identifiziert und erforscht wurden, ist das Verständnis ihres dynamischen Verhaltens durch das Fehlen von Methoden eingeschränkt, die die Steuerung der TGFβ-Signalgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglichen. In dieser Arbeit wurde ein optogenetisches System (das optoTGFβ-System) entwickelt, bei dem Licht dazu verwendet wird, die TGFβ-Signalgebung zeitlich und räumlich präzise zu steuern. Erstens wurde die Funktionalität des optoTGFβ-Systems durch Vergleich mit dem endogenen TGFβ-Signalsystem überprüft. Zweitens wurde durch das gleichzeitige Überwachen der subzellulären Translokation der Rezeptoren und der Smad-Proteine mittels „Live Cell Imaging“ gezeigt, dass die TGFβ-Signalgebung durch Modulation der Lichtstimulationen in einzelnen Zellen spezifisch aktiviert werden kann. Drittens wurde in Kombination mit der mathematischen Modellierung die Dynamik der TGFβ-Signalgebung im optoTGFβ-System quantitativ bestimmt. Die räumliche und zeitliche Präzision der optischen Kontrolle machen das optoTGFβ-System zu einem neuartigen und leistungsfähigen Methode für die quantitative Analyse und Manipulation von TGFβ-Signalen auf Einzelzellebene. / Cells employ signaling pathways to make decisions in response to changes in their immediate environment. Transforming Growth Factor β (TGFβ) signaling pathway plays pivotal roles in regulating many cellular processes, including cell proliferation, differentiation and migrations. Although the principal components of TGFβ signaling have been identified and explored in recent decades, understanding its dynamic behavior is limited by the lack of tools that allow the control of TGFβ signaling at high spatiotemporal resolution. In this thesis, we developed an optogenetic system (the optoTGFβ system), in which light is used to control TGFβ signaling precisely in time and space. First, we validated the functionality of the optoTGFβ system by comparing it with the endogenous TGFβ signaling system. Second, by simultaneously monitoring the subcellular translocation of the receptors and Smad proteins using live cell imaging, we showed that TGFβ signaling can be specifically activated in single cells through modulating the light stimulations. Third, in combination with mathematical modeling, we quantitatively characterized the dynamics of TGFβ signaling in the optoTGFβ system. The spatial and temporal precision of optical control makes the optoTGFβ system a novel and powerful tool for quantitative analyses and manipulation of TGFβ signaling at the single cell level.

Cyanobakterien zŠhlen zu den Šltesten Lebewesen auf der Erde. Diese Bakterien, auch Blaualgen genannt, trugen wesentlich zur Sauerstoffanreicherung der Erde bei, da sie eine ausgeprŠgte FŠhigkeit zur Photosynthese besitzen. Der produzerte Sauerstoff der Photosynthese hemmt jedoch eine weitere AktivitŠt von Cyanobakterien, die Stickstofffixierung. Um die Hemmung zu vermeiden, werden diese AktivitŠten zeitlich getrennt und optimal dem tŠglichen Hell-Dunkel-Rhythmus angepasst. Ein evolutionŠrer Vorteil wird erzielt, wenn der Organismus diesen Rhythmus antizipiert und sich darauf vorbereitet. Aus diesem Grund haben Cyanobakterien eine innere Uhr entwickelt, deren Rhythmus zirkadian ist, ãzirka diemÒ bedeutet ãungefŠhr ein TagÒ. Cyanobakterien der Spezies Synechococcus elongatus PCC 7942 haben sich als Modellorganismus etabliert, weil in ihnen die ersten bakteriellen zirkadianen Oszillationen auf molekularer Ebene entdeckt worden sind. Ihre zirkadiane Uhr entspringt dreier, auf der DNS beieinanderliegenden, Gene (kaiA, kaiB, kaiC) und ihrer dazugehšrigen Proteine. Phosphorylierte KaiC-Proteine Ÿben eine RŸckkopplung auf die Transkription von kaiB und kaiC aus, wodurch die AktivitŠt des kaiBC-Promotors zirkadian oszilliert. Eines der wichtigsten Experimente der letzten Jahre hat gezeigt, dass dieser Transkriptions-Translations-Oszillator mit einem weiteren Oszillator gekoppelt ist, der nicht von Transkription und Translation abhŠngt. Das Experiment des Kondo Labors rekonstruiert zirkadiane Oszillationen mit nur drei Proteinen KaiA, KaiB, KaiC und ATP. Die Proteine bilden Komplexe verschiedener Stoichiometrie, die durchschnittliche Phosphorylierung des Proteins KaiC zeigt stabile Oszillationen mit einer zirkadianen Periode. Da ein Entfernen von einem der Proteine zum Verlust der Oszillationen fŸhrt, wird dieser Post-Translations-Oszillator auch als Kernoszillator bezeichnet. Der Phosphorylierungszyklus von KaiC wird bestimmt durch fortlaufende Phosphorylierung und Dephosphorylierung an zwei Positionen des Proteins, den AminosŠuren Serin 431 und Threonin 432. Die Phase des Kernoszillators kann an der Verteilung der vier PhosphorylierungszustŠnde (nicht-, serin-, threonin- und doppeltphosphoryliert) abgelesen werden. KaiC wechselwirkt mit KaiA und KaiB, damit verschieden phosphorylierte KaiC synchronisieren und die Uhr Ÿber mehrere Tage konstante Oszillationen zeigt. Die Details dieser Wechselwirkung sind jedoch unbekannt. In dieser Dissertation erstelle ich ein mathematisches Modell des Kernoszillators und simuliere die vorliegenden Experimente des O''Shea Labors. Die Simulation reproduziert den KaiC Phosphorylierungszyklus der Uhr quantitativ. Um die wichtigsten experimentellen Nebenbedingungen zu erfŸllen, muss das theoretische Modell zwei molekulare Eigenschaften von KaiC berŸcksichtigen, wodurch ich wichtige Vorhersagen treffe. Die erste Nebenbedingung ist durch die Robustheit des Systems gegeben. Die KaiC-Phosphorylierung Šndert sich nicht, wenn die Gesamtkonzentrationen der drei Proteine in gleicher Weise variiert werden. Um diese Bedingung zu erfŸllen, muss das Modell zwei verschiedenartige Komplexe von KaiA und KaiC berŸcksichtigen. ZusŠtzlich zu einem KaiAC Komplex, der die Autophosphorylierung von KaiC unterstŸtzt, muss KaiC den grš§ten Teil von KaiA unabhŠngig vom Phosphorylierungszustand sequestrieren. Diese zweite Bindestelle ist meine erste theoretische Vorhersage. Die zweite Nebenbedingung ist durch das Ÿbergangsverhalten nach Hinzugabe von KaiB gegeben. KaiB induziert eine Dephosphorylierung von KaiC, die abhŠngig vom Phosphorylierungsniveau ist. Ein Umschalten zwischen phosphoylierendem und dephosphorylierendem KaiC ist deshalb nur in bestimmten Zeitfenstern mšglich. Um die gemessenen Zeitfenster in der Simulation zu reproduzieren, postuliere ich im Modell, dass sechsfach Serin phosphorylierte KaiBC Komplexe KaiA inaktivieren. Diese hochgradig nichtlineare RŸckkopplung ist meine zweite theoretische Vorhersage. Die beiden Vorhersagen werden anschlie§end experimentell ŸberprŸft. HierfŸr werden aufgereinigte Kai-Proteine mit ATP gemischt. Proben an ausgewŠhlten Zeitpunkten werden mit der nativen Massenspektrometrie untersucht. Diese ist eine neuartige Methode, die es erlaubt, intakte Proteinkomplexe zu untersuchen. Die Spektren bestŠtigen sowohl die zweite KaiAC-Bindestelle als auch die nichtlineare RŸckkopplung. Das mathematische Modell erlaubt es au§erdem, die drei definierenden Prinzipien von zirkadianen Uhren fŸr den Kernoszillator zu erklŠren. Erstens sichern konstante Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsraten von KaiC und ein pŸnktliches Umschalten zwischen beiden Phasen den Freilauf des Oszillators. Dieser Freilauf bewirkt, dass die zirkadiane Uhr auch unter konstanten Bedingungen, vor allem gleichbleibenden LichtverhŠltnissen, weiterlaufen kann. Zweitens muss die Periodendauer des Oszillators zu unterschiedlichen Šu§eren Bedingungen erhalten bleiben (Temperaturkompensation). Diese Bedingung wird realisiert, indem temperaturabhŠngige Dissoziationskonstanten von KaiAC und KaiBC Komplexen Phasenverschiebungen erzeugen, die sich gegenseitig kompensieren. Drittens muss die Phase des Oszillators sich dem Tagesrhythmus anpassen kšnnen. Diese Anpassung folgt aus einem Šu§eren Warm-Kalt-Rhythmus, der die drei temperaturabhŠngigen Phasenverschiebungen nur zum Teil einschaltet und damit die Kompensation verhindert. Eine in silico Evolutionsanalyse zeigt, dass eine zweite phosphorylierbare AminosŠure einen evolutionŠren Vorteil bringt und die Verteilung der PhosphorylierungszustŠnde optimiert ist, um eindeutig die Zeit zu bestimmen. Das Ergebnis weist darauf hin, dass diese Verteilung die physiologisch wichtige Ausgangsgrš§e der Uhr ist und die vier PhosphroylierungszustŠnde die Funktionen der zirkadianen Uhr von Cyanobakterien sichern. / Biological activities in cyanobacteria are coordinated by an internal clock. The rhythm of the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 originates from the kai gene cluster and its corresponding proteins. In a test tube, the proteins KaiA, KaiB and KaiC form complexes of various stoichiometry and the average phosphorylation level of KaiC exhibits robust circadian oscillations in the presence of ATP. The characteristic cycle of individual KaiC proteins is determined by phosphorylation of serine 431 and threonine 432. Differently phosphorylated KaiC synchronize due to an interaction with KaiA and KaiB. However, the details of this interaction are unknown. Here, I quantitatively investigate the experimentally observed characteristic phosphorylation cycle of the KaiABC clockwork using mathematical modeling. I thereby predict the binding properties of KaiA to both KaiC and KaiBC complexes by analyzing the two most important experimental constraints for the model. In order to reproduce the KaiB-induced dephosphorylation of KaiC a highly non-linear feedback loop has been identified. This feedback originates from KaiBC complexes, which are exclusively phosphorylated at the serine residue. The observed robustness of the KaiC phosphorylation level to concerted changes of the total protein concentrations demands an inclusion of two KaiC binding sites to KaiA in the mathematical model. Besides the formation of KaiAC complexes enhancing the autophosphorylation activity of KaiC, the model accounts for a KaiC binding site, which constantly sequestrates a large fraction of free KaiA. These theoretical predictions have been confirmed by the novel method of native mass spectrometry, which was applied in collaboration with the Heck laboratory. The mathematical model elucidates the mechanism by which the circadian clock satisfies three defining principles. First, the highly non-linear feedback loop assures a rapid and punctual switch to dephosphorylation which is essential for a precise period of approximately 24 h (free-running rhythm). Second, the dissociation of the protein complexes increases with increasing temperatures. These perturbations induce opposing phase shifts, which exactly compensate during one period (temperature compensation). Third, a shifted external rhythm of low and high temperature affects only a part of the three compensating phase perturbations, which leads to phase shifts (phase entrainment). An in silico evolution analysis shows that the existing second phosphorylatable residue of KaiC is not necessary for the existence of sustained oscillations but provides an evolutionary benefit. The analysis demonstrates that the distribution of four phosphorylated states of KaiC is optimized in order for the organism to uniquely distinguish between dusk and dawn. Consequently, this thesis emphasizes the importance of the four phosphorylated states of KaiC, which assure the outstanding performance of the core oscillator.

Die Durchführung von Experimenten und das mathematische Modellieren von zellulären Prozessen gehören in der Systembiologie untrennbar zusammen. Das gemeinsame Ziel ist die Aufklärung des Zusammenspiels intrazellulärer Prozesse wie Metabolismus, Genexpression oder Signaltransduktion. Während sich molekularbiologische Untersuchungen mit den molekularen Mechanismen einzelner isolierter Systeme beschäftigen, zielt die Systembiologie auf die Aufklärung der Zusammenhänge ganzer Prozesse und schließlich auch ganzer Zellen ab. Die Verfügbarkeit von umfangreichen Datensätzen und die steigenden Möglichkeiten im Bereich der Computersimulation haben in den letzten Jahren den Weg geebnet, um auch Ganzzellsimulationen nicht mehr unmöglich erscheinen zu lassen. Diese Arbeit stellt das erste eukaryotische Ganzzellmodell der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae vor. Hefe als eukaryotischer Modellorganismus ist hierbei der perfekte Kandidat für die Erstellung eines solchen Modells. Er bietet, als wohl meist erforschter eukaryotischer Einzeller in Verbindung mit der Verfügbarkeit einer großen Menge experimenteller Daten, beste Voraussetzungen zur Erstellung eines solchen Modells. Das Projekt ist hierbei in drei Teile gegliedert: i) Die Erstellung eines modularen Ganzzellmodells das alle zellulären Funktionen wie Zellzyklus, Genexpression, Metabolismus, Transport und Wachstum abbildet. ii) Die Implementation einer spezialisierten Simulationsumgebung in Verbindung mit einer Datenbank, um die Erstellung, Simulation und Parametrisierung von Modulen zu ermöglichen. iii) Die Durchführung von Experimenten, um einen ganzheitlichen Datensatz zu erlangen, der Wachstum, Genexpression und Metabolismus abbildet. Die hier vorgestellte Arbeit liefert nicht nur ein mathematisches Modell, sondern benennt auch die Herausforderungen, die während der Arbeit an einem Ganzzellmodell auftreten und stellt mögliche Lösungsansätze vor. / In systems biology experiments and mathematical modeling are going hand in hand to gain and increase understanding of cellular processes like metabolism, gene expression, or signaling pathways. While molecular biology investigates single isolated parts and molecular mechanisms of cellular processes, systems biology aims at unraveling the whole process and ultimately whole organisms. Today the availability of comprehensive high-throughput data and computational power paved the way to increase the size of analyzed systems to reach the cellular level. This thesis presents the first whole-cell model (WCM) of a eukaryotic cell, the yeast Saccharomyces cerevisiae. This established model organism is the perfect candidate for the implementation of a holistic model based on the available experimental data and the accumulated biological knowledge. The project is split into three parts: i) The creation of a modular functional-complete whole-cell model, combining the processes cell cycle, gene expression, metabolism, transport, and growth. ii) The implementation of a specialized simulation environment and a database to support module creation, simulation, and parameterization. iii) The elicitation of experimental data by conducting an experiment to achieve a comprehensive data set for parameterization, combining growth, metabolic, proteomic, and transcriptomic data. The presented work provides not only a simple mathematical model but also addresses challenges occurring during the development of whole-cell models and names possible solutions and new methodologies required for the creation of WCMs.

Evaporation plays an important role in the water balance on a different spatial scale. However, its direct and indirect measurements are globally scarce and accurate estimations are a challenging task. Thus the correct process approximation in modelling of the terrestrial evaporation plays a crucial part. A physically based 1D lumped soil–plant–atmosphere model (BROOK90) is applied to study the role of parameter selection and meteorological input for modelled evaporation on the point scale. Then, with the integration of the model into global, regional and local frameworks, we made cross-combinations out of their parameterization and forcing schemes to show and analyse their roles in the estimations of the evaporation. Five sites with different land uses (grassland, cropland, deciduous broadleaf forest, two evergreen needleleaf forests) located in Saxony, Germany, were selected for the study. All tested combinations showed a good agreement with FLUXNET measurements (Kling–Gupta efficiency, KGE, values 0.35–0.80 for a daily scale). For most of the sites, the best results were found for the calibrated model with in situ meteorological input data, while the worst was observed for the global setup. The setups' performance in the vegetation period was much higher than for the winter period. Among the tested setups, the model parameterization showed higher spread in performance than meteorological forcings for fields and evergreen forests sites, while the opposite was noticed in deciduous forests. Analysis of the of evaporation components revealed that transpiration dominates (up to 65 %–75 %) in the vegetation period, while interception (in forests) and soil/snow evaporation (in fields) prevail in the winter months. Finally, it was found that different parameter sets impact model performance and redistribution of evaporation components throughout the whole year, while the influence of meteorological forcing was evident only in summer months.

Adenosine-3′, 5′-cyclic monophosphate (cAMP) produced by adenylate cyclases (ADCYs) is an established key regulator of cell homoeostasis. However, its role in cell cycle control is still controversially discussed. This study focussed on the impact of soluble HCO3− -activated ADCY10 on cell cycle progression. Effects are quantified with Bayesian inference integrating a mathematical model and experimental data. The activity of ADCY10 in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was either pharmacologically inhibited by KH7 or endogenously activated by HCO3−. Cell numbers of individual cell cycle phases were assessed over time using flow cytometry. Based on these numbers, cell cycle dynamics were analysed using a mathematical model. This allowed precise quantification of cell cycle dynamics with model parameters that describe the durations of individual cell cycle phases. Endogenous inactivation of ADCY10 resulted in prolongation of mean cell cycle times (38.7 ± 8.3 h at 0 mM HCO3− vs 30.3 ± 2.7 h at 24 mM HCO3−), while pharmacological inhibition resulted in functional arrest of cell cycle by increasing mean cell cycle time after G0/G1 synchronization to 221.0 ± 96.3 h. All cell cycle phases progressed slower due to ADCY10 inactivation. In particular, the G1-S transition was quantitatively the most influenced by ADCY10. In conclusion, the data of the present study show that ADCY10 is a key regulator in cell cycle progression linked specifically to the G1-S transition.

Recent clinical findings in chronic myeloid leukemia (CML) patients suggest that the risk of molecular recurrence after stopping tyrosine kinase inhibitor (TKI) treatment substantially depends on an individual’s leukemia-specific immune response. However, it is still not possible to prospectively identify patients that will remain in treatment-free remission (TFR). Here, we used an ordinary differential equation (ODE) model for CML, which explicitly includes an anti-leukemic immunological effect and applied it to 21 CML patients for whom BCR-ABL1/ABL1 time courses had been quantified before and after TKI cessation. Immunological control was conceptually necessary to explain TFR as observed in about half of the patients. Fitting the model simulations to data, we identified patient-specific parameters and classified patients into three different groups according to their predicted immune system configuration ('immunological landscapes”). While one class of patients required complete CML eradication to achieve TFR, other patients were able to control residual leukemia levels after treatment cessation. Among them were a third class of patients, that maintained TFR only if an optimal balance between leukemia abundance and immunological activation was achieved before treatment cessation. Model simulations further suggested that changes in the BCR-ABL1 dynamics resulting from TKI dose reduction convey information about the patient-specific immune system and allow prediction of outcome after treatment cessation. This inference of individual immunological configurations based on treatment alterations can also be applied to other cancer types in which the endogenous immune system supports maintenance therapy, long-term disease control or even cure.

At the forefront of cancer treatment development and evaluation, three-dimensional Tumour Spheroid Control Experiments play a pivotal role in the battle against cancer. Conducting and evaluating in vitro experiments are time-consuming processes. This thesis details the development, implementation, and validation of an algorithmic model that classifies spheroids as either controlled or relapsed by assessing the success of their treatments based on criteria rooted in biological insights. The introduction of this model is crucial for biologists to accurately and efficiently predict treatment efficacy in 3D in vitro experiments. The motivation for this research is driven by the need to improve the objectivity and efficiency of treatment outcome evaluations, which have traditionally depended on manual and subjective assessments by biologists. The research involved creating a comprehensive dataset from multiple 60-day in vitro experiments by combining data from various sources, focusing on the growth dynamics of tumour spheroids subjected to different treatment regimens. Through preprocessing and analysis, growth characteristics were extracted and utilized as input features for the model. A feature selection and optimization technique was applied to refine the software model and improve its predictive accuracy. The model is based on a handful of comprehensive criteria, calibrated by employing a grid search mechanism for hyperparameter tuning to optimize accuracy. The validation process, conducted via independent test sets, confirmed the model’s capability to predict treatment outcomes with a high degree of reliability and an accuracy of about 99%. The findings reveal that algorithmic classification models can make a significant contribution to the standardization and automation of treatment efficacy assessment in tumour spheroid experiments. Not only does this approach reduce the potential for human error and variability, but it also provides a scalable and objective means of evaluating treatment outcomes.:1 Introduction 1.1 Background and Motivation 1.2 Biological Background 1.3 Iteration Methodology 1.4 Objective of the Thesis 2 Definition of basic Notation and Concepts 2.1 Time Series Analysis 2.2 Linear Interpolation 2.3 Simple Exponential Smoothing 2.4 Volume of a Spheroid 2.5 Heavyside Function 2.6 Least Squares Method 2.7 Linear Regression 2.8 Exponential Approximation 2.9 Grid Search 2.10 Binary Regression 2.11 Pearson Correlation Coefficient 3 Observation Data 3.1 General Overview 3.1.1 Structure of the Data 3.1.2 Procedure of Data Processing using 3D-Analysis 3.2 Data Engineering 3.2.1 Data Consolidation and Sanitization 3.2.2 Extension and Interpolation 3.2.3 Variance Reduction 4 Model Development 4.1 Modeling of Various Classification-Relevant Aspects 4.1.1 Primary Criteria 4.1.2 Secondary Criteria 4.1.3 Statistical Learning Approaches 4.2 Day of Relapse Estimation 4.3 Model Implementation 4.3.1 Combination of Approaches 4.3.2 Implementation in Python 4.4 Model Calibration 4.4.1 Consecutive Growth 4.4.2 Quintupling 4.4.3 Secondary Criteria 4.4.4 Combined Approach 5 Model Testing 5.1 Evaluation Methods 5.1.1 Applying the Model to New Data 5.1.2 Spheroid Control Probability 5.1.3 Kaplan-Meier Survival Analysis 5.1.4 Analysis of Classification Mismatches 5.2 Model Benchmark 5.2.1 Comparison to Human Raters 5.2.2 Comparison to Binary Regression Model 5.3 Robustness 5.3.1 Test using different Segmentation 5.3.2 Feature Reduction 5.3.3 Sensitivity 5.3.4 Calibration Templates 6 Discussion 6.1 Practical Application Opportunities 6.2 Evaluation of the Algorithmic Model 6.3 Limitations 7 Conclusion 7.1 Summary 7.2 Future Research Directions / Dreidimensionale Experimente zur Kontrolle von Tumorsphäroiden sind zentral für die Entwicklung und Evaluierung von Krebstherapien. Die Durchführung und Auswertung von In-vitro-Experimenten ist jedoch zeitaufwendig. Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung, Implementierung und Validierung eines algorithmischen Modells zur Einstufung von Sphäroiden als kontrolliert oder rezidivierend. Das Modell bewertet den Behandlungserfolg anhand biologisch fundierter Kriterien. Diese Innovation ist entscheidend für die präzise und effiziente Vorhersage der Wirksamkeit von Behandlungen in 3D-In-vitro-Experimenten und zielt darauf ab, die Objektivität und Effizienz der Beurteilung von Behandlungsergebnissen zu verbessern, die traditionell von manuellen, subjektiven Einschätzungen der Biologen abhängen. Die Forschung umfasste die Erstellung eines umfassenden Datensatzes aus mehreren 60-tägigen In-vitro-Experimenten, bei denen die Wachstumsdynamik von Tumorsphäroiden unter verschiedenen Behandlungsschemata untersucht wurde. Durch Vorverarbeitung und Analyse wurden Wachstumscharakteristika extrahiert und als Eingangsmerkmale für das Modell verwendet. Das Modell basiert auf wenigen umfassenden Kriterien, die mithilfe eines Gittersuchmechanismus zur Abstimmung der Hyperparameter kalibriert wurden, um die Genauigkeit zu optimieren. Der Validierungsprozess bestätigte die Fähigkeit des Modells, Behandlungsergebnisse mit hoher Zuverlässigkeit und einer Genauigkeit von etwa 99 % vorherzusagen. Die Ergebnisse zeigen, dass algorithmische Klassifizierungsmodelle einen wesentlichen Beitrag zur Standardisierung und Automatisierung der Bewertung der Behandlungseffektivität in Tumorsphäroid-Experimenten leisten können. Dieser Ansatz verringert nicht nur das Potenzial für menschliche Fehler und Schwankungen, sondern bietet auch ein skalierbares und objektives Mittel zur Bewertung von Behandlungsergebnissen.:1 Introduction 1.1 Background and Motivation 1.2 Biological Background 1.3 Iteration Methodology 1.4 Objective of the Thesis 2 Definition of basic Notation and Concepts 2.1 Time Series Analysis 2.2 Linear Interpolation 2.3 Simple Exponential Smoothing 2.4 Volume of a Spheroid 2.5 Heavyside Function 2.6 Least Squares Method 2.7 Linear Regression 2.8 Exponential Approximation 2.9 Grid Search 2.10 Binary Regression 2.11 Pearson Correlation Coefficient 3 Observation Data 3.1 General Overview 3.1.1 Structure of the Data 3.1.2 Procedure of Data Processing using 3D-Analysis 3.2 Data Engineering 3.2.1 Data Consolidation and Sanitization 3.2.2 Extension and Interpolation 3.2.3 Variance Reduction 4 Model Development 4.1 Modeling of Various Classification-Relevant Aspects 4.1.1 Primary Criteria 4.1.2 Secondary Criteria 4.1.3 Statistical Learning Approaches 4.2 Day of Relapse Estimation 4.3 Model Implementation 4.3.1 Combination of Approaches 4.3.2 Implementation in Python 4.4 Model Calibration 4.4.1 Consecutive Growth 4.4.2 Quintupling 4.4.3 Secondary Criteria 4.4.4 Combined Approach 5 Model Testing 5.1 Evaluation Methods 5.1.1 Applying the Model to New Data 5.1.2 Spheroid Control Probability 5.1.3 Kaplan-Meier Survival Analysis 5.1.4 Analysis of Classification Mismatches 5.2 Model Benchmark 5.2.1 Comparison to Human Raters 5.2.2 Comparison to Binary Regression Model 5.3 Robustness 5.3.1 Test using different Segmentation 5.3.2 Feature Reduction 5.3.3 Sensitivity 5.3.4 Calibration Templates 6 Discussion 6.1 Practical Application Opportunities 6.2 Evaluation of the Algorithmic Model 6.3 Limitations 7 Conclusion 7.1 Summary 7.2 Future Research Directions

Die Aktivierung des NF-kB Vorläuferproteins p100 und p105 erfolgt durch eine proteasomale Trunkierung, um die aktiven p52 und p50 zu erzeugen. Zur Erforschung wurde eine Massenspektrometrie-basierende Proteomik-Strategie entwickelt, die mit der gezielten Reaktionsüberwachungstechnik plus einer Isotopenmarkierung verwendet wurde. In einem endogenen murinen embryonalen Fibroblasten-System konnte gezeigt werden, dass beide Vorläufer zu den jeweiligen Produkten in einer parallelen und sich einander bedingenden Weise in Reaktion auf einen Lymphotoxin-β-Rezeptor-Agonisten verarbeitet werden. Unsere SRM-SILAC- Methode erlaubte die Unterscheidung von Prä-Stimulationsprotein-Populationen aus Proteinen, die de novo nach der Stimulation synthetisiert wurden, und zeigte eine Tendenz für ältere Vorläufermoleküle, sich einer Degradation zu unterziehen, während die de novo-Moleküle auf die Produkte verarbeitet wurden. Die langsame und anhaltende Kinetik, die ein typisches Merkmal des nicht-kanonischen NF-κB- Weges ist. Darüber hinaus, konnten wir beobachten, dass die hydrolytische Aktivität der AAA ATPase VCP / p97 in der Bildung von de novo p52 und p50 eine Rolle spielt. Durch ein MS-basiertes Screening für strahlungsinduzierte Protein-Interaktoren eines weiteren NF-κB-Players, der die regulatorische Untereinheit des IKK-Komplexes IKKγ / NEMO bildet, konnte der Enhancer von mRNA Decapping 4 (EDC4) entdeckt werden. Durch die zusätzliche Untersuchung der E3-Ligase, Parkin, konnte eine Verbindung mit dem NF-κB-Weg durch eine lineare Ubiquitinierung hergestellt werden. Es konnte gezeigt werden, dass Parkin ist Hauptkomponenten des linearen Ubiquitin-Ketten-Assemblierungskomplexes (LUBAC). Die Proteomanalyse im Proteinkinase A (PKA) -Signalisierungsweg konnte zwei neuartige Regulationsformen identifizieren: K63-verknüpfte Polyubiquitinierung die katalytische Untereinheit von PKA, PKAC in Richtung eines lysosomalen pathways führt, und auch durch einen Pseudosubstrat-Hemmungsmechanismus. / Activation of the NF-κB precursor protein p100 and p105 by a specific proteasomal truncation to yield the active products p52 and p50 is a distinct feature of the non- canonical pathway but the mechanism governing it remains elusive. A novel mass spectrometry-based proteomics strategy was developed, using the targeted selected reaction monitoring technique in conjunction with stable isotope labeling for both absolute quantitation of proteins and to mark precursor protein populations relative to the application of the lymphotoxin β stimulation. In an endogenous murine embryonic fibroblast system, we have shown that both precursors are processed to the respective products in a parallel and interdependent manner in response to a lymphotoxin β receptor agonist. Our Dynamic SRM-SILAC method allowed distinction of pre-stimulation protein populations from proteins synthesized de novo post- stimulation, and revealed a tendency for older precursor molecules to undergo degradation while the de novo molecules went on to be processed to the products, accounting for the slow and persistent kinetics that are a hallmark of the non- canonical NF-κB pathway. In addition, the hydrolytic activity of the AAA ATPase VCP/p97 was implicated in the generation of de novo p52 and p50. An MS-based proteomics screen for specific, radiation-induced protein interactors of another key NF-κB player, the regulatory subunit of the IKK complex, IKKγ/NEMO, turned up the Enhancer of mRNA Decapping 4 (EDC4). This unexpected finding has expanded the known role of NF-κB regulation of protein levels beyond transcription into mRNA stability. Separate investigations into the ubiquitin E3 ligase, parkin, connected it to the NF-κB pathway through a linear ubiquitination it helps catalyze on IKKγ/NEMO. Proteomic analysis of polyubiquitin in the protein kinase A (PKA) signalling pathway helped to identify two novel modes of regulation: a lysosomal degradation pathway; as well as a pseudosubstrate inhibition mechanism.

Die oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) spielt eine zentrale Rolle im Energiestoffwechsel der Zelle. Sie besteht aus der Atmungskette, deren vier Enzymkomplexe einen Protonengradienten über die innere mitochondriale Membran aufbauen, und der ATP-Synthase, die diesen Gradienten zur Phosphorylierung von ADP zu ATP, der zelluläre Energieeinheit, nutzt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein thermodynamisch konformes OXPHOS Modell erstellt, welches auf Differentialgleichungen basiert. Dazu wurden Gleichungen entwickelt, welche die Kinetiken jedes OXPHOS-Komplexes über weite Bereiche von Substrat- und Produktkonzentrationen sowie unterschiedlichster Werte des elektrochemischen Gradientens wiedergeben. Zunächst wurden für jeden Komplex der Atmungskette kinetische Messungen in Abwesenheit des Protonengradientens durchgeführt. Für deren Beschreibung erwiesen sich Gleichungen vom Typ Michaelis-Menten als adäquat; hierbei wurden verschiedene Gleichungstypen verglichen. Anschließend wurde der Einfluss des Protonengradientens auf die kinetischen Parameter so modelliert, dass physiologisch sinnvolle Raten in dessen Abhängigkeit erzielt werden konnten. Diese neuen Ratengleichungen wurden schließlich in ein OXPHOS Modell integriert, mit dem sich experimentelle Daten von Sauerstoffverbrauch, elektrischem Potential und pH-Werten sehr gut beschreiben ließen. Weiter konnten Inhibitor-Titrationskurven reproduziert werden, welche den Sauerstoffverbrauch in Abhängigkeit der relativen Hemmung eines OXPHOS-Komplexes darstellen. Dies zeigt, dass lokale Effekte auf globaler Ebene korrekt wiedergeben werden können. Das hier erarbeitete Modell ist eine solide Basis, um die Rolle der OXPHOS und generell von Mitochondrien eingehend zu untersuchen. Diese werden mit zahlreichen zellulären Vorgängen in Verbindung gebracht: unter anderem mit Diabetes, Krebs und Mitochodriopathien, sowie der Bildung von Sauerstoffradikalen, die im Zusammenhang mit Alterungsprozessen stehen. / Oxidative phosphorylation (OXPHOS) plays a central role in the cellular energy metabolism. It comprises the respiratory chain, consisting of four enzyme complexes that establish a proton gradient over the inner mitochondrial membrane, and the ATP-synthase that uses this electrochemical gradient to phosphorylate ADP to ATP, the cellular energy unit. In this work a thermodynamically consistent OXPHOS model was built based on a set of differential equations. Therefore rate equations were developed that describe the kinetics of each OXPHOS complex over a wide concentration range of substrates and products as well for various values of the electrochemical gradient. In a first step, kinetic measurements on bovine heart submitochondrial particles have been performed in the absence of the proton gradient. An appropriate data description was achieved with Michaelis-Menten like equations; here several types of equations have been compared. The next step consisted in incorporating the proton gradient into the rate equations. This was realized by distributing its influence among the kinetic parameters such that reasonable catalytic rates were obtained under physiological conditions. Finally, these new individual kinetic rate expressions for the OXPHOS complexes were integrated in a global model of oxidative phosphorylation. This new model could fit interrelated data of oxygen consumption, the transmembrane potential and the redox state of electron carriers. Furthermore, it could well reproduce flux inhibitor titration curves, which validates its global responses to local perturbations. This model is a solid basis for analyzing the role of OXPHOS and mitochondria in detail. They have been linked to various cellular processes like diabetes, cancer, mitochondrial disorders, but also to the production of reactive oxygen species, which are supposed to be involved in aging.

Die intrazellulären Parasiten der Bakteriengattung Wolbachia sind weit verbreitet im Phylum der Arthropoden. In vielen Wirten lösen sie eine Paarungsinkompatibilität zwischen nicht infizierten Weibchen und infizierten Männchen aus. Die mögliche Rolle dieser zytoplasmatischen Inkompatibilität in Artbildungsprozessen der Wirtsorganismen wird seit langer Zeit diskutiert. In dieser Arbeit analysieren wir häufig angeführte Kritikpunkte einer solchen Rolle mit Hilfe von mathematischen Modellen, in denen Infektionsdynamik von Wolbachia und Populationsgenetik der Wirte kombiniert werden. Die einzelnen Teile befassen sich mit dem Folgenden: (i) Wir untersuchen die Stabilität von Infektionsmustern in Wirts-Metapopulationen, indem wir kritische Migrationsraten herleiten. (ii) Zur Abschätzung des Einflusses der zytoplasmatischen Inkompatibilität auf den Genfluss zwischen Populationen berechnen wir effektive Migrationsraten. (iii) Wir bestimmen die Bedingungen, die die Verstärkung von Reproduktionsbarrieren durch die Evolution von weiblichen Paarungspräferenzen begünstigen. Schließlich (iv) wenden wir unsere Modelle auf einen realen Artbildungsprozess zweier Drosophila-Arten in Nordamerika an, diskutieren auftretende Probleme und unterbreiten Vorschläge für weiterführende Forschung. Zusammenfassend implizieren unsere Ergebnisse, dass Wolbachien häufig mit der Entstehung neuer Wirtsarten verknüpft sein können, allerdings in den meisten Fällen nur, indem sie als einer von mehreren Faktoren zur reproduktiven Isolation beitragen. Eine Verstärkung sexueller Isolation wird nur unter speziellen Bedingungen bewirkt. / The intracellular bacterial parasites of the genus Wolbachia are widespread among arthropod species. In many hosts, they induce a reproductive incompatibility between uninfected females and infected males. The potential role of this cytoplasmic incompatibility in speciation processes of the bacteria''s hosts has long been debated. In this thesis, we analyze common criticisms of such a role by means of mathematical models, combining Wolbachia infection dynamics and host population genetics. In particular, we are concerned with the following: (i) In order to measure the stability of infection patterns within host metapopulations, we derive critical migration rates. (ii) We evaluate the impact of cytoplasmic incompatibility on gene flow between populations by calculating effective migration rates. (iii) We determine the conditions that favor the evolution of female mating preferences through reinforcement. Finally, (iv) we apply our models to a particular real-world speciation process of two sibling Drosophila species in North America, discuss emerging problems, and suggest future directions of research. In summary, our results implicate that Wolbachia might be a frequent factor in host speciation, but usually only by contributing to overall reproductive isolation among other factors. Reinforcement of premating isolation is selected for only under stringent conditions.