O diabetes tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune caracterizada pela destruição das células b presentes nas ilhotas pancreáticas por linfócitos T auto-reativos, especialmente Th1 e Th17, levando o indivíduo a um estado de hiperglicemia. Embora existam diversos estudos que abordam a resposta imune adaptativa no contexto do DM1, poucos trabalhos tentaram elucidar o papel da resposta imune inata no desenvolvimento da doença. Neste contexto, avaliamos o perfil de expressão e o papel do receptor NLRP1 na patogênese do DM1 experimental e em humanos. Nossos dados apontam que no modelo de DM1 induzido por STZ, NLRP1 possui um papel protetor no desenvolvimento da doença de forma independente da ativação do inflamassoma, através da inibição da translocação de bactérias para os linfonodos pancreáticos (LNPs), além de reduzir a diferenciação de células Th17 e Tc17 nos LNPs, o que foi correlacionado à diminuição de IL-17 no pâncreas. Posteriormente, analisamos o papel de NLRP1 em outro modelo experimental, o NOD (nonobese diabetic), onde descrevemos que NLRP1 também é expresso no desenvolvimento da doença. Por fim, avaliamos o papel de NLRP1 em pacientes com DM1, através da genotipagem desses pacientes para um polimorfismo com ganho de função em NLRP1, o rs12150220. Ao contrário do que acontece em camundongos, NLRP1 em humanos parece ter um papel patogênico, uma vez que detectamos mais células T produtoras de IL-17 em células mononucleares do sangue periférico de indivíduos com o polimorfismo, além de níveis elevados da citocina no soro. Em suma, nossos dados apontam para papéis distintos de NLRP1 em camundongos e humanos com DM1, sugerindo cautela ao tentarmos transpor os achados sobre o receptor em camundongos para a clínica. / Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease that is caused by the destruction of the pancreatic b cells by autoreactive T cells, especially Th1 and Th17, leading to a state of hyperglycemia. Even though there are several studies on the role of the adaptive immune response in T1D, little is known about the role of an innate immune response in the development of the disease. Thus, we investigated the role of NLRP1 in the pathogenesis of mouse and human T1D. Our data indicate that in STZ-induced T1D, NLRP1 exerts a protective role in the development of the disease in an inflammasome-independent pathway, through the inhibition of bacterial translocation to the pancreatic lymph nodes (PLNs), and inhibition of the differentiation of Th17 and Tc17 cells in the PLNs, which correlated with decreased levels of IL-17 in the pancreas. Then, we analyzed the role of NLRP1 in nonobese diabetic (NOD) mice. We demonstrate that NLRP1 is also expressed in the development of T1D in this murine model. Lastly, we evaluated the role of NLRP1 in T1D patients, by genotyping these individuals for a polymorphism with a gain-of-function in NLRP1, the rs12150220. Unlike murine NLRP1, NLRP1 in humans appears to be pathogenic, considering that we detected more IL-17-producing T cells in peripheral blood mononuclear cells in patients carrying the polymorphism, besides elevated levels of this cytokine in the serum. Overall, our data suggest distinct roles for murine and human NLRP1 in the context of T1D, suggesting carefulness when translating the findings from murine NLRP1 to the clinic.

A sequência de eventos bacterianos que ocorre durante a colonização do trato gastrointestinal pode afetar o futuro da saúde do hospedeiro, particularmente no que diz respeito à regulação do sistema imunológico. Um entendimento claro do processo de colonização do intestino humano neonatal nos países em desenvolvimento está faltando, porque os poucos estudos disponíveis foram, em sua maioria, realizados utilizando técnicas de cultura. O objetivo deste estudo foi detectar e quantificar as bactérias dos gêneros Bifidobacterium, Lactobacillus, Eubacterium e Lactococcus, importantes componentes anaeróbios da microbiota intestinal usando PCR em tempo real. O grupo de estudo foi composto por 10 crianças, acompanhadas durante o primeiro ano de vida, vivendo em baixas condições sócio-econômicas em São Paulo, Brasil. Amostras de fezes foram avaliadas em períodos de 24 horas, 7 dias, 30 dias, 3 meses, 6 meses e 1 ano. Durante o primeiro ano de vida, há um aumento da quantidade de Bifidobacterium spp., quando comparada com as outras bactérias anaeróbias estudadas, com médias variando de 8,27x1010 a 2,51x1012 número de cópias de DNA/g de fezes. Lactobacillus spp. também foi encontrado em todos os pontos de tempo estudado, com médias variando de 4,03x108 a 1,46x1010 número de cópias de DNA/g de fezes. Lactococcus spp. foi o gênero bacteriano encontrado em quantidades menores. As contagens máximas desses gêneros foram encontradas entre o terceiro e sexto mês de vida. Embora o gênero Eubacterium seja descrito como um dos principais membros da microbiota intestinal, este foi encontrado em amostras de apenas duas crianças. A inclusão de dieta sólida e a mudança do tipo de amamentação influenciam a composição da microbiota. No entanto, não se pode estabelecer um padrão para a presença destes micro-organismos ao longo dos meses, mostrando que a microbiota é única e está sujeita a interferências ambientais. / The sequence of bacterial events that occurs during the colonization of the gastrointestinal tract may affect the future health of the host, particularly with respect to the regulation of the naive immune system. A clear understanding of the colonization process of the human neonatal gut in developing countries is lacking because the few available studies were mostly performed using culture techniques. The aim of this study was to detect and quantify the bacterial genera Bifidobacterium, Eubacterium, Lactobacillus and Lactococcus, important anaerobic components of the intestinal microbiota using real-time PCR. The study group comprised 10 children followed during the first year of life, living in low socio-economic conditions in São Paulo, Brazil. Fecal samples were evaluated at times of 24 hours, 7 days, 30 days, 3 months, 6 months and 1 year. During the first year of life, there is an increased amount of Bifidobacterium spp. compared to others studied anaerobic bacteria, with averages ranging from 8,27x1010 to 2,51x1012 DNA copy number/g of feces. Lacotbacillus was also found in all studied time point, with averages ranging from 4,03x108 to 1,46x1010 DNA copy number/g of feces. Bacterial genus Lactococcus is found in smaller quantities. The maximum counts of these genera were found between the third to sixth month of life. Although the genus Eubacterium is described as one of the leading members of the intestinal microbiota, this was found in samples of only 2 children. The inclusion of solid diet and change of type of feeding influences the composition of the microbiota, however, could not set a standard for the presence of these micro-organisms over the months, showing that the microbiota is unique and is subject to environmental interference.

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:48:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elisangela_Borsoi_Pereira.pdf: 4099678 bytes, checksum: 2154628e3fc69ca40c985e332b48f374 (MD5) Previous issue date: 2014-09-26 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Two experiments were conducte, in order to identify the best time for production and maturation of Traditional Colonial and Imbriago Colonial cheese in the municipality of Pinhão - Paraná. Ten Holstein heifers, grazing on pasture and supplemented, individually provided 11 liters of milk in the morning. The total volume was clotted raw immediately after milking, at 32°C, followed traditional Colonial process. One hundred cheeses were produced in five different seasons, each one subjected to seven maturation times, where zero for production day, one, two, three, four, six and eight months of maturation. Samples were weighed in duplicate, measured for water activity (Aw), number of lactic acid bacteria (LAB), lipolytic and proteolytic mesophilic and presence of Listeria spp. Temperature and ambient relative humidity were recorded. All data were subjected to analysis of variance (ANOVA), applied Tukey test, at 5% significance and analyzed by Sisvar statistical program. In the first study, the parameters on the Traditional Colonial Cheese were evaluated from time zero to eighth months of maturation. The lineation was completely randomized, in a double factorial scheme, considering the production period as factor 1 and maturation time as factor 2. The second work evaluated the peeling treatment occurred in the third month, in times four, six and eight months of maturation. The lineation was in randomized blocks in a scheme of split plots, being block: production period; plot: maturation time; and subplot: peeling treatment. In the first work, for weight loss, there was no difference between the cheeses at the end of eight months. The loss was relevant until the second month of maturation, the process initial critical phase. To Aw, cheeses made in May and June remained with the highest concentrations, and the ones produced in November with the lowest values. To BAL, for all assessed cheeses there was significant increase in the first month, but the decrease occurred only for cheeses made in November and May, indicating that the process of acidification and subsequent maturation stabilization may have occurred with more efficiency in these months. As for lipolytic bacteria, cheeses made in May and June had the highest scores, probably due to lower temperatures. For proteolytic bacteria, there was an evident effect of the coldest times on the counts, especially until the second month of maturation. Comparing the peeling treatments, in the second study, there was no effect on weight loss, lipolytic and proteolytic mesophilic bacteria counting. Imbriago cheeses showed contents for Aw and lactic acid bacteria counts significantly higher than Traditional Colonial, starting only in the fourth month of maturation, which may be a consequence of the hydration occurring at the peeling treatment time. It can be concluded that cheeses produced in May can be indicated as the best period for production, both for the colonial as for the Imbriago. Regarding the peeling treatment, the probable rehydration does not represent a health risk / Dois experimentos foram conduzidos com o intuito de identificar a melhor época para produção e tempo de maturação de queijo Colonial Tradicional e Colonial Imbriago no município de Pinhão Paraná. Dez fêmeas bovinas Holandês, mantidas em pastagem e suplementadas, forneceram individualmente 11 litros de leite pela manhã. O volume total foi coagulado cru imediatamente pós ordenha, à 32ºC, seguido processo tradicional do Colonial. Cem queijos foram produzidos em cinco diferentes épocas do ano, cada uma submetida em sete tempos de maturação, onde zero para dia da produção, um, dois, três, quatro, seis e oito meses de maturação. Em duplicata as amostras foram pesadas, mensuradas para atividade da água (Aw), número de bactérias láticas (BAL), mesófilas lipolíticas e proteolíticas e presença de Listeria spp. Foram registradas temperatura e umidade relativa ambiente. Todos os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), aplicado teste de Tukey, a 5% de significância e analisados pelo programa estatístico Sisvar. No primeiro trabalho foram avaliados os parâmetros sobre o Queijo Colonial Tradicional do tempo zero ao oitavo meses de maturação. O delineamento foi inteiramente casualizado em esquema fatorial duplo, considerando o período de produção como fator 1 e tempo de maturação como fator 2. O segundo trabalho avaliou o tratamento da casca ocorrido no terceiro mês, nos tempos quatro, seis e oito meses de maturação. O delineamento foi em blocos casualizados em esquema de parcelas subdivididas, sendo bloco: período de produção; parcela: tempo de maturação; e sub-parcela: tratamento da casca. No primeiro trabalho, para perda de peso, não houve diferença entre os queijos ao final dos oito meses. A perda foi relevante até o segundo mês de maturação, fase crítica inicial do processo. Para Aw, os queijos produzidos em maio e junho se mantiveram com maiores teores e os produzidos em novembro com os menores valores. Para BAL, para todos os queijos avaliados houve aumento significativo no primeiro mês, mas o decréscimo ocorreu apenas para os queijos produzidos em novembro e maio, indicando que o processo de acidificação e posterior estabilização da maturação pode ter ocorrido com maior eficiência nestes meses. Quanto às bactérias lipolíticas, os queijos produzidos em maio e junho tiveram as maiores contagens, provavelmente em função das menores temperaturas. Para bactérias proteolíticas, houve evidente efeito das épocas mais frias sobre as contagens, principalmente até o segundo mês de maturação. Comparados os tratamentos da casca, no segundo trabalho, não houve efeito sobre perda de peso, contagem de bactérias mesófilas lipolíticas e proteolíticas. Os queijos Imbriago apresentaram teores para Aw e contagem de bactérias ácido láticas significativamente superiores ao Colonial Tradicional, que ocorreu apenas no quarto mês de maturação, que pode ser consequência da hidratação ocorrida no momento do tratamento da casca. Pode-se concluir que os queijos produzidos em maio podem ser representar o melhor período para a produção, tanto para o colonial como para o Imbriago. Quanto ao tratamento da casca, a provável reidratação não representa um risco sanitário

A pele dos anfíbios atua como primeira barreira de proteção contra microorganismos invasores. Além dos componentes mecânicos, essa proteção deve incluir mecanismos bioquímicos e biológicos derivados tanto da comunidade microbiana ali residente quanto da secreção de moléculas bioativas a partir de glândulas dérmicas. Os objetivos gerais deste estudo foram: caracterizar a comunidade microbiana hospedada pela espécie Proceratophrys boiei e analisar a sua relação com comunidades microbianas ambientais; avaliar se nessa espécie a microbiota e a secreção cutâneas podem ser entendidas como um componente de proteção; avaliar a estabilidade de tais componentes a partir de diferentes populações em fragmentos florestais. Especificamente, as seguintes hipóteses foram testadas: 1. A composição da microbiota ambiental varia entre os fragmentos e micro-hábitats de Floresta Atlântica amostrados e tem relação com alguns parâmetros ambientais analisados; 2. A diversidade da microbiota cutânea de P. boiei é relacionada à diversidade da microbiota nos ambientes que ocupa. Ademais, em termos de composição, a microbiota cutânea é um subconjunto da microbiota ambiental que ocorre nos seus micro-hábitats; 3. A riqueza e abundância de bactérias da microbiota cutânea de P. boiei varia entre os diferentes remanescentes de Floresta Atlântica; 4. A riqueza e a abundância de bactérias presente na pele de P. boiei com atividade antimicrobiana varia entre populações ou locais de amostragem; 5. Existe efeito antimicrobiano das secreções sobre alguns patógenos e os perfis das secreções cutâneas diferem entre populações de P. boiei. Os resultados mostraram que a microbiota cutânea de P. boiei apresenta variações entre indivíduos e populações. Além disso, a qualidade do hábitat pode ser importante para a composição de bactérias hospedadas. Existe um compartilhamento de bactérias entre a microbiota cutânea de P. boiei e os micro-hábitats solo e água, ocupados por essa espécie, porém as comunidades dérmicas compõem-se principalmente por bactérias não detectadas nas amostras ambientais analisadas. Foi observada certa estabilidade na estrutura da microbiota cutânea de P. boiei quando analisadas populações distintas, mas variações na distribuição de morfotipos bacterianos em uma mesma localidade ocorre. Microbiota cutânea e secreções dérmicas de P. boiei podem prevenir infecções na pele, dada a atividade antimicrobiana demonstrada nesta pesquisa. Contudo, variações nos espectros de ação foram observadas em ambos os componentes, assim como, diferenças populacionais nas abundâncias e percentuais de bactérias produtoras de antimicrobianos. O estudo também demonstrou que certas características independem do contexto ambiental ocupado pelas populações, uma evidência de que o microambiente da pele dessa espécie oferece condições e certa estabilidade para a colonização de comunidades bacterianas específicas. A sustentabilidade de populações dessa espécie pode estar relacionada às interações entre hospedeiro, microrganismos e ambiente. / The skin of amphibians acts as first barrier of protection against invading microorganisms. Besides the mechanical components, this protection probably include biochemical and biological mechanisms derived from both the resident microbial community and the secretion of bioactive molecules from dermal glands. The aims of this study were to characterize the microbial community hosted by Proceratophrys boiei and analyse its relationship with environmental microbial communities; evaluate whether microbiota and skin secretion of this species can be understood as a protection component; evaluate the stability of these components through different populations in forest fragments. Specifically, the following hypotheses have guided this research: 1. The composition of environmental microbiota varies among microhabitats and fragments of Atlantic Forest and relates to some environmental parameters; 2. The diversity of skin microbiota of P. boiei relates to the diversity of microbes in the environment it occupies. Furthermore, in terms of composition, the skin microbiota is a subset of environmental microbes that occurs in its microhabitat; 3. The richness and abundance of bacteria from the skin microbiota of P. boiei varies between different remnants of Atlantic Forest; 4. The richness and abundance of bacteria present on the skin P. boiei with antimicrobial activity varies between populations or sampling sites; 5. There is antimicrobial activity of the skin secretions against some pathogens and its profiles differ between populations of P. boiei. The results showed variations on the microbial skin of P. boiei between individuals and populations and the quality of habitats could be important for the composition of hosted community. There is a sharing of bacteria between the skin microbiota of P. boiei and the microbial communities of microhabitats soil and water. However, mainly bacteria not detected in environmental samples composes the dermal communities. We observed some stability in the structure of the skin microbiota when analysed different populations, but variations in the distribution of bacterial morphotypes occurs in all sites. Skin microbiota and dermal secretions of P. boiei can prevent infection through the skin, according to the antimicrobial activity demonstrated in this study. There were variations in the action spectrum for both components, but population differences were mainly in abundance and percentage of bacteria producing antibiotics. This research showed the importance of the microbiota and skin secretion of P. boiei as components of protection and the importance of the environment for the composition of these associated communities. At the same time, we have shown that certain characteristics are independent of the environmental context occupied by the population, evidence that the microenvironment of the skin provides a certain stability for the colonization of specific bacterial communities. The sustainability of populations of this species may relates to interactions between host organisms and the environment.

A ativação de receptores da imunidade inata nas células do sistema imune, no tecido adiposo e as alterações na microbiota intestinal foram relacionadas aos fenótipos inflamatórios e metabólicos na obesidade. Aqui, nós formulamos a hipótese de que a via MyD88 em determinados tecidos é crítica e determinante nas alterações secundárias a obesidade experimental. Verificamos que camundongos MyD88 nocaute (KO) desenvolvem severa síndrome metabólica e diminuição de IL-1β, TNF-α e IL-6 no tecido adiposo apesar do predomínio de macrófagos de perfil M1. No intestino, observamos menor inflamação e aumento da permeabilidade. A microbiota dos camundongos MyD88 KO induziu resistência à insulina nos camundongos WT. A depleção de MyD88 no tecido adiposo não alterou o perfil metabólico, porém, a depleção de MyD88 nos macrófagos, protegeu os camundongos da síndrome metabólica. No tecido adiposo dos camundongos MyD88 KO obesos, observamos um aumento da expressão de Dectina-1 e IFN-β. Assim, MyD88 desempenha um papel importante no desenvolvimento da obesidade modulando a microbiota e o perfil inflamatório. / Activation of innate immune receptors in immune cells, adipose tissue, and changes in intestinal microbiota were related to inflammatory and metabolic phenotypes during obesity. Here, we hypothesize that MyD88 signaling in certain tissue are critical to those phenotypes observed in obese mice. We observed that MyD88 knockout (KO) mice develop severe metabolic syndrome and decreased IL-1β, TNF-α and IL-6 in adipose tissue despite the predominance of M1 macrophage. In the intestine, we observed decreased inflammation and increased permeability. The microbiota of MyD88 KO mice induced insulin resistance in WT mice. Depletion of MyD88 in adipose tissue did not alter the metabolic profile. However, depletion of MyD88 in macrophages protected mice from metabolic syndrome. In adipose tissue of MyD88 KO obese mice, we observed an increased expression of Dectin-1 and IFN-β. Thus, MyD88 plays an important role in the development of obesity modulating gut microbiota and the inflammatory profile.

As leveduras Saccharomyces cerevisiae são consideradas importantes matérias primas na nutrição animal pela sua capacidade prebiótica. Os prebióticos são compostos não digeridos pelo organismo animal, mas que são fermentados pelos microrganismos do trato gastrintestinal, cujos produtos são capazes de prover benefícios ao hospedeiro. A fermentação depende de fatores como: substrato utilizado para o seu crescimento, método de fermentação, modo e condição de secagem e idade das células. Assim, os processos produtivos modernos têm como intuito a produção de leveduras com elevado potencial prebiótico. Este estudo objetivou avaliar os efeitos de teores crescentes de leveduras com metabólitos ativos (LSC; baseada na fermentação de substratos específicos) na digestibilidade aparente dos nutrientes da dieta, microbiota e produtos da fermentação fecal e parâmetros imunológicos de gatos adultos. Foram utilizados 27 gatos adultos, idade média de 9,44±5,35 anos, machos e fêmeas, sem raça definida e saudáveis. Os animais foram distribuídos em delineamento em blocos casualizados (idade), constituído de três tratamentos experimentais, denominados: DC (dieta controle), LSC 0,3 (dieta controle com 0,3% de leveduras com metabólitos ativos) e LSC 0,6 (dieta controle com 0,6% de leveduras com metabólitos ativos). Os resultados obtidos foram analisados através do programa computacional Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 2004), sendo considerados significativos valores de p<0,05 e as médias comparadas pelo teste de Tukey. Verificou-se que a inclusão do aditivo alterou apenas a digestibilidade aparente da fibra bruta, da matéria mineral e energia metabolizável (p<0,05). Já em relação aos produtos da fermentação e microbiota das fezes, observou-se redução em ácido lático (p=0,0040) e Clostridium perfringens (p=0,0226) com a inclusão do prebiótico e diminuição do ácido isovalérico (p=0,0144) no tratamento LSC 0,3. Pode-se concluir que o aditivo, nos teores de inclusão avaliados, parece apresentar potencial prebiótico em relação aos produtos da fermentação e microbiota fecal / Saccharomyces cerevisiae yeast are considered important raw materials in animal nutrition due their prebiotic capacity. Prebiotics are compounds not digested by animal organism, but are fermented by microorganisms in the gastrointestinal tract, which products are capable of providing benefits to the host. The fermentation depends on factors such as: substrate used for growth, fermentation method, way and drying condition and age of the cells. Thus, modern production processes have the objective of producing yeast with high prebiotic potential. This study aimed to evaluate the effects of increasing levels of yeast with active metabolites (LSC) based on the fermentation of specific substrates on apparent digestibility of diet nutrients, microbiota and fecal fermentation products and immunological parameters in adult cats. Twenty seven male or female cats with mean weight of 4.19 ± 0.83kg and mean age of 9.44 ± 5.35 years were used and distributed in an unbalanced randomized block design (age), consisting of three experimental treatments, DC (control diet), LSC 0.3 (control diet with 0.3% yeast with active metabolites) and LSC 0.6 (control diet with 0.6% yeast with active metabolites). The results were analyzed using the computer program Statistical Analysis System (SAS Institute Inc., 2004), with significance level of p<0.05 and the averages compared by Tukey test. The inclusion of the additive only changed the apparent digestibility of crude fiber and mineral content (p<0.05). Regarding the fermentation products and microbiota of feces, there was a reduction in lactic acid (p=0,0040) and Clostridium perfringens (p=0,0226) with inclusion of prebiotic and decreased of isovalerate (p=0,0144) in the LSC 0.3 treatment. It can be concluded that the additive, in the levels of inclusion assessed, seems to have prebiotic potential on fecal fermentation products and microbiota

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-03-29T19:15:57Z No. of bitstreams: 1 patriciaguedesgarcia.pdf: 1420428 bytes, checksum: 551d89ea9ff226d1f121abd878c41208 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-03-30T11:25:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 patriciaguedesgarcia.pdf: 1420428 bytes, checksum: 551d89ea9ff226d1f121abd878c41208 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-30T11:25:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patriciaguedesgarcia.pdf: 1420428 bytes, checksum: 551d89ea9ff226d1f121abd878c41208 (MD5) Previous issue date: 2009-11-20 / Diarréia aguda é um problema de saúde pública, causa importante de morbidade e mortalidade, sobretudo, em países em desenvolvimento. A etiologia das doenças diarréicas é variada e entre os patógenos bacterianos destacam-se as linhagens diarreiogênicas ou patotipos de Escherichia coli. Foi investigada a ocorrência de E. coli comensal ou diarreiogênica em 141 amostras fecais de crianças de zero até cinco anos de idade de origem comunitária em Juiz de Fora, MG. Dos espécimes, 84 foram provenientes de doadores com manifestação clínica de diarréia aguda (CD) e 57 de doadores clinicamente saudáveis, sem diarréia (SD). Após identificação e caracterização microbiana, foi determinado o seu perfil de susceptibilidade a antimicrobianos. As linhagens bacterianas foram identificadas fenotípica e genotipicamente por métodos bioquímicos clássicos e moleculares, respectivamente, e a caracterização dos patotipos de interesse no trato gastrintestinal foi feita por metodologia molecular. O perfil de susceptibilidade a antimicrobianos foi determinado pelo método de Kirby-Bauer, segundo recomendações do CLSI (2007). Considerando-se todo o grupo amostral, 136 linhagens de E. coli foram recuperadas de fezes CD (36,8% diarreiogências) e 84 de fezes SD (30,9% diarreiogênicas). A confirmação da identificação bioquímica por metodologia molecular mostrou uma correlação de 97,3% entre as duas metodologias. E. coli enteroagregativa (EAEC) foi o patotipo mais freqüentemente recuperado no grupo CD (16,2%) e o único isolado no grupo SD (30,9%). E. coli enteropatogênica (EPEC) atípica foi o segundo patotipo mais isolado no grupo CD (10,3%), seguido de E. coli produtora de toxina Shiga (STEC) (7,4%) e E. coli enterotoxigênica (ETEC) (2,9%). Nenhuma linhagem de EPEC típica e E. coli enteroinvasiva (EIEC) foi recuperada. A investigação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos demonstra elevada resistência a fármacos, como ampicilina, tetraciclina e sulfametoxazol-trimetoprim, enquanto que resistência intermediária foi observada contra a ampicilina/sulbactam, cefalotina, tetraciclina e amicacina e gentamicina. Os antimicrobianos mais eficazes foram ceftazidima, ceftriaxona, imipenem e piperacilina/tazobactan, para os quais não foi verificada resistência bacteriana. A diferenciação entre os patotipos de E. coli é de grande importância, uma vez que estes microrganismos estão implicados em diarréias agudas em crianças e, quase sempre, necessitarão de tratamento medicamentoso. De maneira geral, nossos resultados indicam a relevância da participação de agentes bacterianos diarreiogênicos na gênese da diarréia aguda na infância, em crianças de 0 a 5 anos. A alta resistência a antimicrobianos observada em nosso trabalho suscita uma ampla discussão sobre uso indiscriminado/indevido de antibióticos e os riscos inerentes da automedicação. / Acute diarrhea is a public health problem, important cause of morbidity and mortality, especially in developing countries. The etiology is varied and considering the bacterial pathogens, the diarrheagenic Escherichia coli pathotypes are among the most important. In this study we have investigated the occurrence of commensal or diarrheagenic E. coli in 141 fecal samples from children of zero to five years of age in Juiz de Fora, MG. Of the specimens, 84 were obtained from clinically injured donors with acute diarrhea (CD) and 57 from clinically healthy donors without diarrhea (SD). After microbial identification and characterization the bacterial antimicrobial susceptibility patterns were determined. The bacterial strains were phenotipically and genotipically indentified by conventional biochemical methods and molecular approach, respectively. The E. coli pathotypes were also genetically characterized by molecular methodology. The antimicrobial susceptibility patterns were determined by the Kirby-Bauer method, according to the CLSI guidelines (2007). Considering all fecal specimens, 136 E. coli strains were isolated and identified (36.8%, CD) and 84 (30.9%, SD). Confirmation of identification by molecular approach showed 97,3% of correlation between the two methodologies. Enteroaggregative E. coli (EAEC) was the most frequently recovered pathotype identified in the acute diarrhea group (16.2%) whereas the only recovered pathotype identified in the feces from healthy donors (30.9%). Enteropathogenic E. coli (EPEC) was the second most isolated pathotype group (10.3%), followed by STEC (7.4%) and ETEC (2.9%). No typical EPEC or EIEC strains were recovered. The antimicrobial susceptibility patterns shown high antimicrobial resistance rates against ampicillin, tetracycline, and sulfamethoxazole-trimethoprim. Intermediary resistance was observed against ampicillin/sulbactam, cefalotin, tetracycline, amikacin and gentamicin. The most effective antimicrobials were ceftazidime ceftriaxone, imipenem and piperacillin/tazobactam, for which no bacterial resistance was observed. The differentiation between the diarrheagenic E. coli pathotypes is of great importance, since they are involved in acute diarrheal diseases in children and, almost often will require antimicrobial chemotherapy. Overall, our results may indicate the importance of the bacterial agents in the etiology of diarrheic diseases in childhood, mainly considering children of 0 to 5 years. The high antimicrobial resistance observed in our study raises a broad discussion on the indiscriminate or improper use of antimicrobials, besides the risks of self-medication.

A microbiota intestinal é um ecossistema complexo que geralmente vive em harmonia com seu hospedeiro. É essencial para o desenvolvimento e funcionamento adequado do sistema imunológico da mucosa durante o início da vida, um processo que atualmente é conhecido por ser importante para a imunidade de adultos. A microbiota intestinal compreende aproximadamente 1000 espécies, das quais 80% não são cultiváveis. Tendo em vista a importância de se conhecer a microbiota humana e a utilização da ferramenta da construção da biblioteca genômica RNAr 16S ser relativamente recente, esse estudo tem como objetivo analisar diferentes protocolos para avaliar o uso desta ferramenta para o estudo da microbiota intestinal humana. Para a realização dos ensaios experimentais, o DNA extraído de fezes de seis crianças, em diferentes faixas etárias, foi utilizado para a criação de um pool, o qual foi utilizado nos ensaios de PCR. As bibliotecas RNAr 16S foram construídas utilizando 2 pares de iniciadores bactéria-específicos 27F-1492R e 63F-1387R, variando o tempo de desnaturação inicial de cada reação de amplificação do gene RNAr 16S entre 5 e 10 minutos, e 1 par de iniciadores 341F-518R. Os clones foram selecionados aleatoriamente, parcialmente sequenciados e analisados com base em banco de dados do gene RNAr 16S. A diversidade da microbiota foi menor quando os iniciadores 63F-1387R foram utilizados, em comparação aos resultados dos iniciadores 27F-1492R, no entanto, apenas o par de iniciadores 63F-1387R identificou Bifidobacterium sp., gênero importante para o desenvolvimento da microbiota intestinal humana. Não houve diferenças significativas na diversidade quando o tempo de desnaturação inicial da reação de PCR foi estendido para 10 minutos. Com o uso do par de iniciadores 341F-518R mostrou uma diversidade satisfatória, uma maior riqueza, quando comparada com os outros pares de iniciadores e detectou a presença de Bifidobacterium sp. Os dados obtidos sugerem que mais de um par de iniciadores deve ser empregado para o estudo da microbiota fecal quando se utilizar a biblioteca de RNAr 16S como ferramenta. / The intestinal microbiota is a complex ecosystem that usually lives in harmony with its host. It is essential for the development and proper functioning of the mucosal immune system during beginning of the life, a process that is currently known to be important for overall immunity of adults. The intestinal microbiota comprises about 1000 species, 80% of which are not cultivable. Given the importance of understanding the human microbiota and that the use of the tool library construction genomic 16S rRNA is relatively recent, this study aims to analyze different protocols to evaluate the use of this tool to study of the human intestinal microbiota. To perform the experimental tests, the DNA extracted from feces of six children, in different age groups, was used for the creation of a pool, which was used in the PCR assays. The 16S rRNA libraries were constructed using 2 pairs of primers specific-bacterium 27F-1492R and 63F-1387R, varying the denaturation time of each initial amplification reaction between 5 and 10 minutes, and the pair of primers 341F - 518R.The clones were randomly selected, partially sequenced and analyzed based on database 16S rRNA gene. The diversity of the microbiota was lower when the primers 63F - 1387R were used when compared with the results of the primers 27F - 1492R. However, only the pair 63F - 1387R was able to identified Bifidobacterium spp., important genus for the development of the microbiota from human gut. No significant differences in diversity were observed when the time of initial denaturation of the PCR reaction was extended to 10 minutes. By using the pair of primers 341F - 518R a satisfactory diversity, with detection of Bifidobacterium spp., and greater richness were observed, compared with the other pairs of primer. The data suggests that more than one pair of primers should be used for the study of fecal microbiota when using the library of 16S rRNA as a tool.

L'alcool est une des principales causes de maladie du foie en Europe avec peu d'options thérapeutiques. Parmi les consommateurs d'alcool, seul certains patients vont évoluer vers des formes sévères d'atteinte hépatique et le microbiote intestinal a été identifié comme cofacteur de cette susceptibilité individuelle. Il interagit avec le foie notamment via la production de métabolites bactériens tels que les acides biliaires secondaires.L'objectif de ce travail a été dans un premier temps d'analyser le microbiote intestinal, au sein d’une cohorte de patients alcooliques à différents stades de la maladie alcoolique du foie, et d’étudier sa relation avec les acides biliaires. Dans un deuxième temps, ce projet avait pour but d’étudier s’il était possible d'améliorer l'atteinte hépatique liée à l'alcool, en modulant le microbiote intestinal, dans un modèle animal de maladie alcoolique du foie.Les patients avec une atteinte hépatique sévère liée à l'alcool ont un profil d’acides biliaires plus hydrophobe, et donc plus toxique, associé à une dysbiose et à des modifications des fonctions bactériennes. Ces modifications des fonctions bactériennes participent à la gravité de la maladie. La modulation du microbiote par la pectine, un prébiotique, permet de prévenir mais également de faire régresser les lésions hépatiques chez la souris. Les effets protecteurs de la pectine sont corrélés avec le métabolisme du tryptophane.Ce travail de thèse montre que le microbiote intestinal et ses métabolites sont une cible thérapeutique potentielle dans la maladie alcoolique du foie. Il ouvre la porte à la réalisation d'essais cliniques chez l'homme dans lesquels nous pourrions limiter la progression des lésions hépatiques liées à l'alcool en contrôlant le microbiote intestinal grâce à l’utilisation de la pectine ou du métabolisme du tryptophane. / Alcohol is one of the main causes of alcoholic liver disease in Europe with few therapeutic options. Among alcohol consumers, only a part of these patients will develop severe liver lesions. This individual susceptibility is driven by intestinal microbiota. Intestinal microbiota interacts with the liver through the production of bacterial metabolites including the secondary bile acids.The aim of my project, was firstly to study the relationship between the intestinal microbiota and the bile acids composition depending on the severity of alcoholic liver disease in a cohort of alcoholic patients. Secondly, I assessed the improvement of alcohol induced liver lesions by changing the intestinal microbiota in a mouse model of alcoholic liver disease.Patients with a severe form of alcoholic liver disease display a higher hydrophobic bile acid pool, more toxic, associated with a specific dysbiosis and changes in the bacterial functions. Changing the intestinal microbiota by using pectin, a prebiotic, prevents and reverts alcohol induced liver injury in mice. These protective effects of pectin involve changes in the tryptophan metabolism.In conclusion, these studies highlight that the intestinal microbiota and its metabolites are potential therapeutic targets for alcoholic liver disease. Moreover, pectin as an alimentary product could be proposed in the management of alcoholic liver disease in humans.

In questa tesi di Dottorato, l’obiettivo era valutare l’impatto di diversi ingredienti alimentari sul metabolismo di alcuni batteri intestinali e viceversa, mediante l’applicazione di tecniche omiche. Utilizzando le tecniche di metabolomica e trascrittomica, è stata studiata la risposta all’acido linoleico del ceppo Bifidobacterium breve DSM 20213. Utilizzando un approccio combinato di metagenomica e metabolomica, è stato possibile studiare le modifiche a carico del microbiota intestinale, del profilo fenolico e degli acidi grassi, in biscotti senza glutine (a base di erba medica) durante digestione e fermentazione in vitro. Inoltre, è stato valutato come alcuni batteri potessero interferire negativamente su una terapia farmacologica a base di Diclofenac, un farmaco usato per alcune patologie intestinali. Per questo tipo di studio è stata utilizzata la spettrometria di massa ad alta risoluzione, che ha consentito di ipotizzare un coinvolgimento dell’enzima batterico β-glucuronidasi. Una sola tecnica omica, seppure di ultima generazione, non permette di valutare tutte le modificazioni del microbiota intestinale data la complessità dei fattori coinvolti. Per questa ragione, integrare più approcci omici potrebbe risultare una buona strategia per analizzare il reale impatto del microbiota sulla salute dell’ospite. Questo permetterebbe di valutare le interazioni microbiota-ospite, i principali metabolismi e le interconnessioni tra gruppi batterici coinvolti nella risposta ad uno stimolo esterno come l’assunzione di particolari ingredienti con l’alimentazione. / The aim of the present PhD thesis was to explore the metabolic response of intestinal bacteria to food components by using ‘omics’ approaches. In particular, the first part of this thesis was focused on the effect of linoleic acid on Bifidobacterium breve DSM 20213 strain. Firstly, an untargeted metabolomics-based approach was used to explore the primary changes in metabolic profile of this strain grown in presence of linoleic acid. Secondly, the gene expression of B. breve DSM 20213 induced by linoleic acid exposure was investigated. Integrated use of metabolomics/transcriptomics was applied to better understand the response mechanisms to linoleic acid stress. In the third part of the thesis, using a combination of metagenomics and metabolomics, the in vitro large intestine fermentation of gluten-free rice cookies containing alfalfa seed was investigated. In the last part of my PhD, the negative effect of β-glucuronidase producing bacteria was evaluated by means of qualitative high-resolution mass spectrometry. Based on my experience there is not a gold standard approach for evaluating a complex environment such as the gastrointestinal tract. For this reason, an integrated use of different techniques should be mandatory to have an accurate framework of gut microbiota composition, its potential metabolic network and the impact on the host physiology and health.