A criptococose é uma infecção fúngica sistêmica, predominantemente oportunista, causada por leveduras encapsuladas do gênero Cryptococcus. As infecções por Cryptococcus neoformans são comuns em nível mundial, e as formas graves são observadas nos pacientes imunocomprometidos. A principal fonte de infecção da criptococose são fezes de pássaros (principalmente pombos) contaminadas com o fungo, sendo a inalação de basidiósporos a principal via de infecção. O estabelecimento e a propagação da infecção são altamente dependentes da imunidade do hospedeiro, sendo o sistema imune celular o mecanismo primário de defesa do organismo contra C. neoformans. Nos últimos anos têm-se descrito outros elementos como ativadores e moduladores da resposta imune, destacando o sistema purinérgico e o sistema colinérgico. Desta maneira, este estudo buscou avaliar a influência da criptococose experimental sobre a atividade do sistema purinérgico e colinérgico, através de três objetivos: (1) avaliar a atividade da ecto-difosfoidrolases (E-NTPDase) e ecto-adenosina deaminase (E-ADA) em linfócitos e soro; (2) atividade da acetilcolinesterase (AChE) no cérebro e linfócitos, e butirilcolinesterase (BChE) no soro; e (3) avaliar os níveis de purinas no soro. Os resultados da avaliação do sistema purinérgico demonstraram que a hidrólise do trifosfato de adenosina (ATP) e difosfato de adenosina (ADP) foram diminuídas, bem como a atividade da E-ADA também esteva diminuída. Em relação a dosagem das colinesterases, observou-se um aumento na atividade da AChE nos linfócitos e no cérebro, e diminuição da BChE. Na dosagem do nível de purinas no soro, verificou-se um aumento nos níveis de ATP e adenosina (ADO) no dia 20 pós-infecção (PI), aumento de ATP e diminuição da ADO, inosina e ácido úrico no dia 50 PI. A avaliação da atividade da E-NTPDase e E-ADA levou a conclusão de que seus comportamentos hidrolíticos seriam compensatórios enquanto a E-NTPDase teria uma ação pró-inflamatória a E-ADA teria uma ação anti-inflamatória, gerando mecanismo de proteção contra danos teciduais secundários, possivelmente gerados respostas exacerbadas à infecção por C. neoformans. Adicionalmente, os dados da atividade da AChE, em amostras correspondentes, comprovaram o estabelecimento de uma resposta pró-inflamatória, corroborando com a hipótese da necessidade de um mecanismo de modulação. Por fim, observou-se um aumento nos níveis extracelulares de ATP caracterizando uma resposta pró-inflamatória. Desta forma, foi possível observar que existe uma participação direta dos sistemas purinérgico e colinérgico na imunomodulação da criptococose experimental, contribuindo para a instalação de uma resposta imune celular adequada para combater a proliferação da levedura, e um mecanismo de redução de danos teciduais associados à resposta imune exacerbada. / Cryptococcosis is a systemic fungal infection predominantly opportunistic, caused by encapsulated yeast from Cryptococcus genus. Cryptococcus neoformans infections are common worldwide, and the severe forms are observed in immunocompromised patients. The main source of cryptococcosis infection are bird droppings (especially pigeons) contaminated with the fungus, and the inhalation of basidiospore is the main route of infection. The establishment and spread of infection are highly dependent of the host immunity, and the cellular immune system is the primary mechanism for defense against C. neoformans. In recent years it has been described other elements as activators and modulators of the immune response, highlighting the purinergic and the cholinergic system. Thus, this study aimed to evaluate the influence of experimental cryptococcosis on the activity of purinergic and cholinergic systems through three objectives: (1) to evaluate the activity of the ecto-diphosphohydrolases (E-NTPDase) and ecto-adenosine deaminase (E-ADA ) in lymphocytes and serum; (2) the activity of acetylcholinesterase (AchE) in the brain and lymphocytes, and butyrylcholinesterase (BChE) in serum; and (3) evaluate the serum levels of purines. The results of the evaluation in the purinergic system demonstrated that the hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP) and adenosine diphosphate (ADP) was decreased as well as the E-ADA activity. For the dosage of the cholinesterase, there was an increase in AChE activity in lymphocytes and in the brain, and a decreased in BChE. The measurement of serum purine level demonstrate an increase in the levels of ATP and adenosine) on day 20 post-infection (PI), an increased in ATP and decreased in ADO, inosine and uric acid on day 50 PI. The assessment of the E-NTPDase and E-ADA activity led the conclusion that their hydrolytic behavior would be compensatory while the E-NTPDase would have a pro-inflammatory action, E-ADA would have an anti-inflammatory action, generating protective mechanism against secondary damage tissue, producing possibly exacerbated responses to C. neoformans infection. In addition, data of AChE activity in corresponding samples confirmed the establishment of a pro-inflammatory response, corroborating the hypothesis of the need for a modulation mechanism. Finally, there was an increase in extracellular levels of ATP featuring a pro-inflammatory response. In this way, it was observed a direct involvement of the purinergic and cholinergic systems in immunomodulation of experimental cryptococcosis, contributing to the installation of an immune cell response suitable to combat the proliferation of yeast, and a reduction mechanism of tissue damage associated with response immune exacerbated.

Trichomonas vaginalis é o protozoário flagelado que parasita o trato urogenital humano causando a tricomonose, doença sexualmente transmissível (DST) de origem não viral mais comum no mundo. Durante a infecção a aquisição de nutrientes, como nucleotídeos púricos, pirimidínicos e ferro é essencial à sobrevivência do parasito. T. vaginalis não sintetiza de novo purinas e pirimidinas, dependendo de vias de salvação para aquisição destas moléculas. O ferro desempenha um papel crucial na patogenicidade da tricomonose, influenciando a expressão de múltiplos genes envolvidos na virulência. Nucleotídeos extracelulares, especialmente o ATP, são liberados em situações de estresse, anoxia ou injúria, atuando como sinalizadores pró-inflamatórios ao sistema imune. As enzimas NTPDase e ecto-5'-nucleotidase degradam ATP à adenosina, esta com ação anti-inflamatória. A enzima adenosina deaminase (ADA) degrada adenosina à inosina. A presença desta cadeia enzimática em T. vaginalis sugere a modulação das concentrações nucleotídeos/nucleosídeos durante a inflamação. A atividade da ADA foi caracterizada em T. vaginalis, porém há poucos relatos sobre a participação desta enzima na sobrevivência do parasito, bem como, a localização celular e o efeito de nutrientes essenciais na atividade enzimática e na expressão gênica. O estudo da localização da ADA em T. vaginalis foi realizado, indicando a presença da enzima na membrana celular e no citoplasma do trofozoíto. Avaliando-se o perfil da ADA de diferentes isolados de T. vaginalis em uma condição de limitação de soro bovino, o qual representa a fonte de adenosina aos trofozoítos, não se observou diferenças significativas na deaminação da adenosina à inosina. Na avaliação do efeito de diferentes fontes de ferro ou a privação deste cátion na atividade e na expressão gênica da ADA foi possível verificar uma diminuição da atividade e um aumento na expressão gênica após a privação do ferro, reforçando a hipótese que este elemento pode modular a atividade das enzimas envolvidas na sinalização purinérgica. Os resultados obtidos nesta dissertação permitem a avaliação de importantes aspectos da ADA, contribuindo para o melhor entendimento do sistema purinérgico em T. vaginalis e seu papel no estabelecimento e manutenção da infecção e consequente sobrevivência do parasito. / Trichomonas vaginalis is a flagellate protozoan that parasitizes the urogenital human tract causing trichomonosis, the non-viral sexually transmitted disease (STD) most common in the world. During infection the acquisition of nutrients such as purine and pyrimidine nucleotides, and iron is essential to the parasite survival. T. vaginalis lacks de novo purines and pyrimidines synthesis depending on the salvation pathway for the acquisition of these molecules. Iron plays a crucial role in trichomonosis pathogenesis, influencing the expression of multiple genes involved in virulence. Extracellular nucleotides, especially ATP, are released during stress, injury or anoxia, acting as a pro-inflammatory signaling to the immune system. The enzymes NTPDase and ecto-5'-nucleotidase degrade ATP to adenosine with anti-inflammatory action. The adenosine deaminase (ADA) enzyme degrades adenosine to inosine. The presence of this enzymatic chain in T. vaginalis suggests the modulation of nucleotides/nucleosides concentrations during inflammation. The ADA activity was characterized in T. vaginalis, but there are few reports on the participation of this enzyme in the parasite survival, as well as the cellular localization and the effect of essential nutrients on enzyme activity and gene expression. The study of ADA localization in T. vaginalis was performed, indicating the presence of the enzyme on trophozoite cell membrane and cytoplasm. Evaluating the ADA profile in different T. vaginalis isolates in bovine serum limitation condition, which is the source of adenosine for the trophozoites, no significant differences were observed in the deamination of adenosine to inosine. Regarding the effect of different iron sources or iron deprivation in activity and gene expression of ADA, it was observed a decrease in activity and an increase in gene expression after iron deprivation, reinforcing the hypothesis that this element can modulate the activity of enzymes involved in the purinergic signaling. The results obtained in this study allow the assessment of important aspects of ADA, contributing to a better understanding of the purinergic system in T. vaginalis and its role in the establishment and maintenance of infection and consequent survival of the parasite.

Toxoplasmosis, caused by the intracellular protozoan Toxoplasma gondii is an infectious disease, and this triggers the activation of the immune system. The pregnancy, in turn, shows characteristics of systemic inflammatory response. The ecto-enzymes as E-NTPDase and E- ADA activities in addition to possessing important in regulating the levels of adenine nucleotides and nucleoside, have shares extremely important in the immune system. Thus, the aim of this study was to determine the activity of enzymes that degrade adenine nucleotides and nucleoside in lymphocytes of women with antibodies to Toxoplasma gondii. Were included in the study, pregnant women seropositive (immune) and seronegative (susceptible) to toxoplasmosis in the last trimester of pregnancy, previously diagnosed service prenatal HUSM. Also, non-pregnant women seropositive and seronegative for toxoplasmosis, in the period from March to December 2012. We determined the enzymatic activities of ecto-enzymes: E-NTPDase and E-ADA in lymphocytes of pregnant and non-pregnant. The results showed an increase of the E-NTPDase activity and may lead to decreased levels of nucleotides ATP and ADP, and an increase in the activity of E-ADA, which may cause a decrease in the concentration of adenosine in groups: III (seronegative pregnant women toxoplasmosis) and IV (seropositive pregnant women for toxoplasmosis) when compared to the control group (I: non-pregnant women seronegative for toxoplasmosis). Pregnant women seropositive for toxoplasmosis compared with seronegative pregnant women did not change, thus revealing that toxoplasmosis in its chronic phase, may not interfere with purinergic signaling. In conclusion, the third trimester of pregnancy appears to be a physiological condition that involves purinergic signaling and toxoplasmosis in its chronic phase does not seem to be able to change this signaling. / A toxoplasmose, causada pelo protozoário intracelular Toxoplasma gondii é uma doença infecciosa,e com isso, desencadeia a ativação do sistema imune. A gestação, por sua vez, demonstra características da resposta inflamatória sistêmica. As ectoenzimas como: E-NTPDase e E-ADA, além de possuírem importante atividade na regulação dos níveis de nucleotídeos e nucleosídeo da adenina, possuem ações extremamente importantes no sistema imunológico. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi determinar a atividade de enzimas que degradam nucleotídeos e nucleosídeo da adenina em linfócitos de gestantes com anticorpos para Toxoplasma gondii. Foram incluídas na pesquisa, gestantes com sorologia positiva (imunes) e com sorologia negativa (suscetíveis) para toxoplasmose, no último trimestre gestacional, previamente diagnosticadas no serviço pré-natal do HUSM. E também, mulheres não gestantes com sorologia positiva e com sorologia negativa para toxoplasmose, no período de março a dezembro de 2012. Foram determinadas as atividades enzimáticas das ectoenzimas: E-NTPDase e E-ADA nos linfócitos das gestantes e das não gestantes. Os dados encontrados revelaram uma alteração nas atividades das ectoenzimas do sistema purinérgico no grupo de gestantes. Os resultados demonstraram um aumento da atividade da E-NTPDase, podendo levar a uma diminuição dos níveis de nucleotídeos ATP e ADP; e um aumento na atividade da E-ADA, podendo ocasionar uma diminuição da concentração de adenosina nos grupos: III (gestantes soronegativas para toxoplasmose) e IV (gestantes soropositivas para toxoplasmose) quando comparados ao grupo controle (I: mulheres não gestantes soronegativas para toxoplasmose). As gestantes soropositivas para toxoplasmose quando comparadas com as gestantes soronegativas não apresentaram alteração, revelando assim, que a toxoplasmose na sua fase crônica, possivelmente não interfere na sinalização purinérgica. Em conclusão, o terceiro trimestre gestacional mostra-se uma condição fisiológica que envolve a sinalização purinérgica e que a toxoplasmose em sua fase crônica não parece ser capaz de alterar esta sinalização.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Dementia is a brain disorder characterized by decline in several mental functions and results in deficits in memory functioning in a variety of cognitive tasks. Evidence has emerged showing that anthocyanins (ANT) possess antioxidant, vasodilator and neuroprotective properties, and more recently are able to improve memory. The aim of our study was to investigate the role of ANT on memory and relate these changes to the cholinergic and purinergic in a model of amnesia induced by scopolamine (SCO), in a model of sporadic dementia of the Alzheimer type (SDAT), induced by intracerebroventricular injection of streptozotocin (ICV-STZ). We used male adult rats, which were previously treated with an extract rich in ANT (200mg/kg) for seven days. For each study protocol, we used the same dose of ANT only varying the time of drug administration SCO ip (1mg/kg) and ICV-STZ (3mg/kg) specific to the models of amnesia and dementia, respectively. The results showed that pretreatment with ANT reversed the memory deficits in an amnesia model and also in the model of SDAT. Regarding the activity of AChE enzyme was observed a significant increase in SCO group accompanied by a decrease in the activity of Na+, K+-ATPase and Ca2+-ATPase, and these effects were prevented by ANT treatment. It was also observed an increase in NTPDase activity, decreased in ADA and 5'-NT activity from brain of animals injected with SCO, accompanied by a reduction in the ATP and adenosine levels, which can compromise the purinergic signaling. ANT treatment was able to prevent changes in NTPDase, ADA and 5 -NT. The ICV-STZ treated animals showed a high anxiogenic-like behavior and ANT treatment prevented this effect, indicating that it can be seen with anxiolytic properties molecules, as in vitro experiments demonstrated their affinity for the benzodiazepine site of GABAA receptors. The animals ICV-STZ treated showed marked increase in AChE activity and Ca2+-ATPase, and decreased activity of Na+, K+-ATPase, causing disturbances in electrolyte concentrations of Na+ and Ca2+ and this could lead to neuronal excitotoxic and increased activity AChE in SDAT, and these effects were prevented by administration of ANT. Moreover, both the density and immunoreactivity for 5'-NT was markedly reduced in animals ICV-STZ as compared with the group of -normal rats. In addition, ICV-STZ treatment showed a significant decrease in 5'-NT and NTPDase activity in a model of SDAT. In the hippocampus of ICV-STZ animals was found considerable increase in levels of ROS total, MDA and NOx, indicating marked oxidative stress, which could lead to a decrease in neuronal viability and NTPDase and 5'-NT activity, since they are linked to the cell membrane. In this context, we suggest that both cholinergic and purinergic systems can be regulated by ANT treatment, thus defining use of this compound as a new strategy to control the deterioration of memory in aging associated with these systems. / A demência é uma desordem cerebral caracterizada por um declínio em várias funções mentais e resulta em déficits no funcionamento da memória e em uma variedade de tarefas cognitivas. Evidências têm surgerido que as antocianinas (ANT) possuem propreidades antioxidantes, vasodilatadoras e neuroprotetoras, sendo capazes de melhorar a memória. O objetivo do nosso trabalho foi investigar o papel das ANT sobre a memória e, relacionar estas mudanças com o sistema colínergico e purinérgico em um modelo de amnésia induzido por escopolamina (SCO), em um modelo de demência esporádica do tipo Alzheimer (DAS), induzido por administração intracerebroventricular de streptozotocina (ICV-STZ). Foram utilizados ratos machos adultos, os quais foram tratados previamente com um extrado rico em ANT (200mg/kg) durante sete dias. Para cada protocolo de estudo, foi utilizada a mesma dose de ANT variando apenas o tempo de administração das drogas SCO ip (1mg/kg) e ICV-STZ (3mg/kg) especificas para aos modelos de amnésia e de demência, respectivamente. Os resultados obtidos demonstraram que o tratamento prévio de ANT reverteu déficits de memória no modelo de amnésia e no modelo de DAS. Em relação à atividade da enzima AChE foi observado um aumento significativo nos grupos SCO acompanhado por uma diminuição da atividade das enzimas Na+,K+-ATPase e Ca2+-ATPase, e estes efeitos foram prevenidos pelo tratamento com ANT. Foi também observado aumento na atividade da NTPDase, diminuição na atividade da ADA e 5 -NT no cérebro de animais injetados com SCO, acompanhado por uma redução nos niveis de ATP e adenosina, ao qual pode comprometer a sinalização purinérgica. E o tratamento com ANT impediu alterações na atividade destas enzimas. Os animais ICV-STZ tratados apresentaram elevado comportamento ansiogênico e o tratamento com ANT previniu este efeito, indicando que as ANT podem ser consideradas moléculas com propriedades ansiolíticas, uma vez que experimentos in vitro, mostraram sua afinidade pelo sítio benzodiazepínico de receptores GABAA. Os animais tratados com ICV-STZ apresentaram marcante elevação na atividade da AChE e Ca2+-ATPase, e redução na atividade da Na+,K+-ATPase, causando perturbações nas concentrações eletrolíticas de Na+ e de Ca2+ e isto poderia levar a excitotoxicidade neuronal e aumento na atividade da AChE na DAS, e estes efeitos foram prevenidos pela administração de ANT. Além disso, tanto a densidade como a immunorreatividade para a 5 -NT foi marcadamente reduzida em animais ICV-STZ em comparação com o grupo de ratos normais. Além disso, o tratamento com STZ mostrou uma diminuição significativa para a atividade da NTPDase e 5 -NT no modelo em animais ICV-STZ tratados. No hipocampo de animais ICV-STZ tratados foi encontrado uma elevação considerável nos níveis de ROS total, MDA e NOx, indicando marcante estresse oxidativo, que poderia levar a diminuição na viabilidade de neurônios e na atividade das enzimas NTPDase e 5 -NT, uma vez que elas estão ligadas a membrana celular. Neste contexto, podemos sugerir que tanto o sistema colinérgico como purinérgico podem ser regulados pelo tratamento com antocianinas, definindo assim, o uso deste composto como uma nova estratégia para controlar a deteriorização mnemônica no envelhecimento associado a esses dos sistemas.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Hypercholesterolemia is a metabolic disease characterized by high levels of serum low density lipoproteins and total cholesterol, associated with the inflammatory disorders, the migration of monocytes and T cells and with an endothelial dysfunction. The purinergic signaling system plays an important role in the modulation of inflammatory and immune response by extracellular biomolecules such as adenine nucleotides and their derived nucleoside adenosine, which are essential for the initiation and maintenance of response inflammatory. The effects of these molecules are promoted by the action of purinergic receptors specifics and controlled by ectoenzymes, in cell surface. Based on these principles, this study investigated the effect of guaraná on the activity of the E-NTPDase and E-ADA in lymphocytes, as well as analyze the biochemical parameters in rats with induced hypercholesterolemia by diet. The rats were divided in eight groups, of which four were induced hypercholesterolemia and the other four groups received normal diet. The animals in each diet were subdivided according treatment, saline, guaraná 12.5, 25 and 50 mg/kg/day orally for 30 days. There was observed an increase in 74% in ATP hydrolysis by E-NTPDase activity in lymphocytes of rats with hypercholesterolemia treated at doses of 25 and 50 mg/kg/day when compared with all other groups. However, E-NTPDase activity was not altered when used ADP as substrate for these three doses. Moreover, the hypercholesterolemic group treated with the higher concentration showed higher decreased of about 70% in E-ADA activity than the other normal diet groups. Was also observed that the guaraná was able to reduce to basal levels, total cholesterol and LDL-C in hypercholesterolemic rats. In addition, the guaraná in high concentrations when associated with hypercholesterolemic diet was able to increase the ATP hydrolysis and decrease the E-ADA activity in lymphocytes, contributing to reducing the inflammatory process. Although requiring further study, guaraná could be used as a complementary therapy for the benefit of people with hypercholesterolemia. / A hipercolesterolemia é uma doença metabólica caracterizada por elevados níveis séricos de lipoproteínas de baixa densidade e de colesterol total, associada com desordens inflamatórias, com a migração de monócitos e linfócitos T e com disfunção endotelial. O sistema de sinalização purinérgica desempenha um papel importante na modulação das respostas inflamatórias e imunes através de biomoléculas extracelulares, como os nucleotídeos de adenina e seu derivado, o nucleosídeo adenosina, que são indispensáveis para a iniciação e manutenção de respostas inflamatórias. Os efeitos de tais moléculas são promovidos pela ação dos receptores purinérgicos específicos e controlados por ectoenzimas, na superfície das células. Com base nestes princípios, este estudo investigou o efeito do guaraná sobre a atividade da E-NTPDase e da E-ADA nos linfócitos, assim como analisar os parâmetros bioquímicos, de ratos com hipercolesterolemia induzida por dieta. Os ratos foram divididos em oito grupos, quatro foram induzidos à hipercolesterolemia e os outros quatro grupos receberam dieta normal. Os animais de cada dieta foram subdivididos de acordo com o tratamento, sendo utilizado solução salina, guaraná 12.5, 25 e 50 mg/kg/dia via oral, durante 30 dias. Observou-se um aumento em 74% na hidrólise de ATP na atividade da E-NTPDases de ratos com hipercolesterolemia, tratados com doses de 25 e 50 mg/kg/dia, quando comparados com todos os outros grupos. Contudo, a atividade da E-NTPDase não foi alterada quando utilizado ADP como substrato, para os ratos tratados nas três doses. No entanto, o grupo hipercolesterolêmico tratado com a maior concentração, apresentou maior diminuição na atividade da E-ADA, cerca de 70%, quando comparado com os outros grupos que receberam dieta normal. Também foi observado que o guaraná foi capaz de reduzir aos níveis basais, o colesterol total e LDL-C em ratos hipercolesterolêmicos. Em conclusão, o guaraná em concentrações elevadas quando associado com a dieta hipercolesterolêmica, foi capaz de aumentar a hidrólise do ATP e diminuir a atividade da E-ADA nos linfócitos, contribuindo para a redução do o processo inflamatório. Embora careça de maiores estudos, o guaraná poderia ser utilizado como uma terapia complementar em benefício de pessoas com hipercolesterolemia.

O Transtorno do Espectro Autista (TEA), segundo o DSM-5, se enquadra nos Transtornos do Desenvolvimento e é caracterizado por uma díade comportamental: 1) prejuízos na comunicação e interação social e 2) comportamentos repetitivos ou estereotipados. Apesar da etiologia do TEA ser desconhecida, tanto fatores genéticos quanto ambientais já foram associados à desordem, incluindo a utilização de ácido valproico (VPA) durante a gestação. Observando essa relação importante, desenvolveu-se um modelo animal de autismo induzido pela exposição pré-natal ao VPA, o qual já foi amplamente validado em aspectos comportamentais e moleculares. No primeiro capítulo desta tese, utilizamos o modelo animal de autismo obtido através de uma única injeção intraperitoneal de VPA (600mg/kg) no dia E12,5 nas ratas Wistar prenhes e testamos um tratamento pré-natal com resveratrol (RSV), através de injeções subcutâneas (3,6 mg/Kg) administradas nas ratas prenhes nos dias E6,5-E18,5. O tratamento pré-natal com RSV demonstrou ser capaz de prevenir alterações na sociabilidade recíproca, porém não teve impacto nos prejuízos na memória olfativa e comportamentos repetitivos induzidos pelo VPA. No que se refere aos dados de microRNA (miRNA), RSV foi capaz de prevenir a alteração na expressão de miR134-5p, o qual também se observou alterado em pacientes com TEA, juntamente com o miR138-5p, ambos com alvos associados à modulação do citoesqueleto na estrutura de espinhos dendríticos. Em conjunto, esses resultados demonstram que o RSV altera vias importantes no modelo, possivelmente através das suas características antioxidantes e anti-inflamatórias, as quais contrapõem os aspectos inflamatórios do VPA. Este trabalho permitiu o aprimoramento e melhor conhecimento da técnica de RT-qPCR para análise de miRNA, sendo tema do segundo capítulo da presente tese, reunindo diferentes estratégias que auxiliaram a superar potenciais problemas e interferentes no uso dessa técnica. Finalmente, no terceiro capítulo, utilizamos o modelo VPA para avaliar o efeito do tratamento pós-natal com suramina, através de uma única injeção subcutânea (20 mg/kg) administrada nos filhotes machos na idade P30. Este tratamento foi capaz de reverter alterações de sociabilidade, novidade social e comportamento do tipo ansioso, enquanto os prejuízos na sociabilidade recíproca, comportamento exploratório, estereotipia e processamento sensorial não foram revertidos por esse tratamento. Nos dados moleculares, a suramina não foi capaz de reverter o aumento de expressão nos receptores purinérgicos P2X4 (hipocampo e córtex pré-frontal medial) e P2Y2 (hipocampo), porém reverteu o aumento de IL-6 promovido pelo VPA. Assim, possivelmente a modulação comportamental associada à suramina parece não estar associada a interações específicas nos receptores purinérgicos, mas sim com uma modificação neuroimune através da interleucina pró-inflamatória IL-6, demonstrando a importância do sistema imunológico na fisiopatologia do TEA. De forma geral, a tese contribuiu para elucidar mecanismos envolvidos no desenvolvimento das características do tipo autista, demonstrando o papel relevante das alterações neuroimunes e da modulação de alvos por miRNA, as quais, em conjunto, podem contribuir para o desenvolvimento de métodos diagnósticos e adequação de estratégias farmacológicas voltados ao TEA. Palavras-chave: Comportamento animal, microRNA, neuroimune, PCR, resveratrol, sistema purinérgico, suramina, transtorno do espectro autista. / According to DSM-5, Autism Spectrum Disorder (ASD) is a developmental disorder characterized by a behavioral dyad: 1) deficits in communication and social interaction, and 2) repetitive and stereotyped behaviors. Although the etiology of ASD is still unknown, both genetic and environmental factors have been associated with the disorder, including the use of valproic acid (VPA) during gestation. Observing this important relationship, an animal model of autism induced by prenatal exposure to VPA was developed, which has already been widely validated in behavioral and molecular aspects. In the first chapter of this thesis, we used the animal model obtained through a single intraperitoneal injection of VPA (600 mg/kg) at E12.5 in pregnant Wistar rats and tested a prenatal treatment with resveratrol (RSV) by subcutaneous injections (3.6 mg/kg) administered in the pregnant rats at E6.5 to E18.5. The prenatal treatment with RSV was able to prevent changes in the reciprocal sociability, but had no impact on the deficits in olfactory memory and repetitive behavior induced by VPA. Regarding the microRNA (miRNA) data, RSV treatment was able to prevent the alteration in the expression of miR134-5p, which also was altered in ASD patients along with miR138-5p, both with targets associated with cytoskeletal modulation in the structure of dendritic spines. Taken together, these results demonstrate that RSV alters important pathways in the model, possibly through its antioxidant and anti-inflammatory properties, which counteract the inflammatory aspects of VPA. This work allowed the improvement and better knowledge of the RT-qPCR technique for miRNA analysis, which was the theme of the second chapter of this thesis, combining different strategies to overcome potential problems and interferences in this methodology Finally, in the third chapter we used the same animal model to evaluate the effect of postnatal treatment with suramin after a single subcutaneous injection (20 mg/kg) administered to male pups at P30. This treatment was able to revert VPA-induced deficits in sociability, social novelty, and anxiety-like behavior, whilst present no effect on impairments in reciprocal sociability, exploratory behavior, repetitive behavior and sensory processing. In the molecular data, suramin was not able to reverse the increase of expression in the purinergic receptors P2X4 (hippocampus and medial prefrontal cortex) and P2Y2 (hippocampus), but reversed the VPA-induced increase of proinflammatory interleukin IL-6. Thus, behavioral modulation associated with suramin appears to be related not with specific interactions in purinergic receptors, but with a neuroimmune modification through the IL-6, indicating the importance of the immune system in the ASD pathophysiology. In general, the thesis contributed to elucidate the mechanisms involved in the development of autistic-like features, demonstrating the relevant role of neuroimmune alterations and the modulation of targets by miRNA, which, together, may contribute to the development of diagnostic methods and improvement of pharmacological strategies related to ASD.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Hypercholesterolemia is a risk factor for the development of atherosclerosis, which is a chronic inflammatory disease characterized by accumulation of platelets on the walls of arteries and also by an inflammatory process. Platelets accumulated within atherosclerotic lesions, may recruit additional platelets to form a thrombus. Extracellular nucleotides and nucleosides such as ATP, ADP, AMP and adenosine have important functions, including the regulation of the thrombus, causing a variety of effects on platelets. The family of ecto-enzymes (E-NTPDase, E-5'-nucleotidase, E-NPP, E-ADA) that regulates the concentration of these nucleotides and nucleosides. Studies show that physical exercise may cause changes in lipid profile. Among the exercises, swimming in rats has been used to evaluate cardiovascular adaptations to exercise, may be an adjunct therapy to prevent progression of atherosclerosis. In the exercise, natural products have been used for the control of cardiovascular diseases, such as curcumin, a natural phenolic compound, which has antioxidant and hypocholesterolemic. Therefore, the objective of this study was to evaluate the activity of ecto-enzymes E-NTPDase, E-5'-nucleotidase, E-NPP and E- ADA in platelets of rats with induced hypercholesterolemia treated with curcumin and submitted to physical exercise. The rats used in the study were divided into eight groups: standard diet (C), standard diet along with curcumin (CC), standard diet along with physical exercise (PE), standard diet along with curcumin and physical exercise (CCPE), hypercholesterolemic diet (H), hypercholesterolemic diet along with curcumin (HCC), hypercholesterolemic diet along with physical exercise (HPE), and hypercholesterolemic diet along with curcumin and physical exercise (HCCPE). The activity of E-NTPDase, E-NPP, E-5'-NT and E-ADA were measured in isolated platelets. Curcumin was administered by gavage at a dose of 25 mg / kg / day, the rats were submitted to forced swimming. There was an increase in the hydrolysis of ATP and ADP in rats with hypercholesterolaemia induced. When these mice were treated with curcumin and physical exercise, physical exercise per se was able to further enhance the hydrolysis of ATP. In the hydrolysis of ADP, it was observed a decrease in activity of the E- NTPDase when hypercholesterolemic rats were treated with curcumin and physical exercise per se, well as when it was associated with curcumin and physical exercise. The activities of E-5'nucleotidase, E-NPP and E-ADA and platelet aggregation, did not show any significant. These results suggest that the hypercholesterolemic diet alters the activity of ecto-enzyme in platelets, and that treatment with curcumin and physical exercise may be able to modulate hydrolysis of nucleotides and nucleosides of adenine this experimental condition. / A hipercolesterolemia é um fator de risco para o surgimento da aterosclerose, sendo esta uma doença inflamatória crônica caracterizada por acúmulo de plaquetas nas paredes das artérias e também por um processo inflamatório. As plaquetas acumuladas dentro das lesões ateroscleróticas, podem recrutar plaquetas adicionais para formar um trombo. Os nucleotídeos e nucleosídeos extracelulares como ATP, ADP, AMP e adenosina têm funções importantes, incluindo a regulação do trombo, exercendo uma variedade de efeitos sobre as plaquetas. A família de ectoenzimas (E-NTPDase, E-5'-nucleotidase, E-NPP, E-ADA) é que regula a concentração destes nucleotídeos e nucleosídeos. Estudos demonstram que o exercício físico, pode provocar alterações no perfil lipídico. Dentre os exercícios físicos, o nado tem sido utilizado em ratos para avaliação de adaptações cardiovasculares ao exercício, podendo ser uma terapia adjuvante para a prevenção da progressão da aterosclerose. Além do exercício físico, produtos naturais tem sido utilizado para o controle de doenças cardiovasculares, como é o caso da curcumina, um composto fenólico natural, que tem propriedades antioxidantes e hipocolesterolêmicas. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade das ectoenzimas E-NTPDase, E-5 -nucleotidase, E-NPP e E-ADA em plaquetas de ratos com hipercolesterolemia induzida tratados com curcumina e submetidos ao exercício físico. Os ratos utilizados no estudo foram divididos em 8 grupos: dieta padrão (C), dieta padrão mais curcumina (CC), dieta padrão mais exercício físico (PE), dieta padrão mais exercício físico e curcumina (CCPE), dieta hipercolesterolêmica (H), dieta hipercolesterolêmica mais curcumina (HCC), dieta hipercolesterolêmica mais exercício físico (HPE), e dieta hipercolesterolêmica mais exercício físico e curcumina (HCCPE). A atividade da E-NTPDase, E-NPP, E-5'-NT e E-ADA foram medidos em plaquetas isoladas. A curcumina foi administrada por gavagem na dose de 25 mg/kg/dia e os ratos foram submetidos ao nado forçado. Foi observado um aumento na hidrólise do ATP e ADP nos ratos com hipercolesterolemia induzida. Quando esses ratos receberam tratamento com curcumina e exercício físico, o exercício físico por si só foi capaz de aumentar a hidrólise de ATP. Na hidrólise de ADP, observou-se uma diminuição na atividade da E-NTPDase quando os ratos hipercolesterolêmicos foram tratados com curcumina e exercício físico por si só, bem como quando foram tratados com curcumina e exercício físico concomitante. A atividade da E-5'nucleotidase, E-NPP, E-ADA e agregação plaquetária não mostraram diferenças significativas. Estes resultados sugerem que a dieta hipercolesterolêmica altera a atividade das ecto-enzimas em plaquetas, e que o tratamento com a curcumina e exercício físico pode ser capaz de modular a hidrólise de nucleotídeos e nucleosídeos de adenina nesta condição experimental.

Diversas neoplasias podem atingir o sistema nervoso central e dentre elas, os tumores cerebrais são os mais prevalentes. Dentre todos os tumores cerebrais, dois merecem especial atenção: gliomas e meduloblastomas, por serem os mais recorrentes em adultos e crianças, respectivamente. O alfa-bisabolol é um pequeno álcool sesquiterpeno oleoso, que apresenta diversas atividades biológicas dentre elas, citotoxicidade. Apesar dos diversos estudos com essa molécula, pouco se sabe das atividades biológicas de seu análogo natural, o óxido de bisabolol A. Além disso, o sistema purinérgico tem sido relacionado com progressão e desenvolvimento tumoral. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de dois promissores novos agentes quimioterápicos (alfa-bisabolol e óxido de bisabolol A) e correlacionar esses efeitos com possíveis modulações do sistema purinérgico, que é considerado um novo alvo terapêutico em linhagens de glioma e meduloblastoma. Nós observamos que a atividade da ecto-5’-nucleotidase, importante enzima do sistema purinérgico, é aumentada tanto em linhagens de glioma quanto de meduloblastoma quando estas são tratadas com alfa-bisabolol. Vimos também que esse aumento na atividade deu-se por um efeito direto do tratamento sob a enzima, com uma redução da expressão do mRNA da ecto-5’-nucleotidase em linhagem de glioma e sem alteração no imunoconteúdo dessa enzima em linhagens de meduloblastoma. Em linhagens de glioma, adicionalmente, a atividade citotóxica do alfa-bisabolol foi correlacionada com estímulo ao receptor de adenosina A3. Ainda, as linhagens estudadas foram sensíveis aos tratamentos com alfa-bisabolol e óxido de bisabolol A. Em conclusão, os dados obtidos nesse trabalho demonstram que tanto o alfabisabolol quanto o óxido de bisabolol A são interesseantes novas possibilidades terapêuticas para os tumores cerebrais e que a atividade citotóxica do primeiro composto envolve modulação do sistema purinérgico. Mais estudos são necessários para entender a efetividade desses tratamentos in vivo e se o tratamento com o óxido de bisabolol A também modula o sistema purinérgico. / Among all the cancers that can affect the central nervous system, the brais tumors are the most prevalent. Two of this tumors deserve special attention: glioma and medulloblastoma once they are the most prevalent in adults and children respectively. Alpha-bisabolol is a small oily sesquiterphene alcohol that presents diverse biological activities, among them, citotoxicity. In despite of the diverse studies using this molecule, little is known about the biological activities of its natural analogue bisabolol oxide A. Besides, the purinergic system has been related to tumor development and progression. Therefore, the objective of this work was to evaluate the effect of two new promising chemotherapic agents (alpha-bisabolol and bisabolol oxide A) and correlate this effects with possible modulations of the purinergic system which is considered an interesting therapeutical target to glioma and medulloblastomas. We observed that the activity of ecto-5’-nucleotidase, an important enzyme of the purinergic system, is increased in both glioma and medulloblastoma cell lines when the cells are treated with alpha-bisabolol. It was also observed that this increase on activity was due to and direct effect of this treatment in the enzyme. Also, the treatment lead to a reduction on mRNA level of ecto-5’- nucleotidase on glioma cell line and no alterations on the imunocontent of the enzyme was observed on medulloblastoma cell lines. Additionally, the citotoxic activity of alpha-bisabolol on glioma cell line was correlated with modulation on A3 adenosine receptor. Moreover, the cell lines used in this work were sensible to the treatments with alpha-bisabolol and bisabolol oxide A. In a conclusion, the data obtained in this work demonstrate that alpha-bisabolol and bisabolol oxide A are both interesting new therapeutical possibilities to brain tumors and the citotoxic activity of the first compound is related with modulations on the purinergic system. More studies are needed to better understand the effectiveness of these treatments in vivo and if the compound bisabolol oxide A also promotes a modulation on the purinergic system.

Diversas neoplasias podem atingir o sistema nervoso central e dentre elas, os tumores cerebrais são os mais prevalentes. Dentre todos os tumores cerebrais, dois merecem especial atenção: gliomas e meduloblastomas, por serem os mais recorrentes em adultos e crianças, respectivamente. O alfa-bisabolol é um pequeno álcool sesquiterpeno oleoso, que apresenta diversas atividades biológicas dentre elas, citotoxicidade. Apesar dos diversos estudos com essa molécula, pouco se sabe das atividades biológicas de seu análogo natural, o óxido de bisabolol A. Além disso, o sistema purinérgico tem sido relacionado com progressão e desenvolvimento tumoral. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de dois promissores novos agentes quimioterápicos (alfa-bisabolol e óxido de bisabolol A) e correlacionar esses efeitos com possíveis modulações do sistema purinérgico, que é considerado um novo alvo terapêutico em linhagens de glioma e meduloblastoma. Nós observamos que a atividade da ecto-5’-nucleotidase, importante enzima do sistema purinérgico, é aumentada tanto em linhagens de glioma quanto de meduloblastoma quando estas são tratadas com alfa-bisabolol. Vimos também que esse aumento na atividade deu-se por um efeito direto do tratamento sob a enzima, com uma redução da expressão do mRNA da ecto-5’-nucleotidase em linhagem de glioma e sem alteração no imunoconteúdo dessa enzima em linhagens de meduloblastoma. Em linhagens de glioma, adicionalmente, a atividade citotóxica do alfa-bisabolol foi correlacionada com estímulo ao receptor de adenosina A3. Ainda, as linhagens estudadas foram sensíveis aos tratamentos com alfa-bisabolol e óxido de bisabolol A. Em conclusão, os dados obtidos nesse trabalho demonstram que tanto o alfabisabolol quanto o óxido de bisabolol A são interesseantes novas possibilidades terapêuticas para os tumores cerebrais e que a atividade citotóxica do primeiro composto envolve modulação do sistema purinérgico. Mais estudos são necessários para entender a efetividade desses tratamentos in vivo e se o tratamento com o óxido de bisabolol A também modula o sistema purinérgico. / Among all the cancers that can affect the central nervous system, the brais tumors are the most prevalent. Two of this tumors deserve special attention: glioma and medulloblastoma once they are the most prevalent in adults and children respectively. Alpha-bisabolol is a small oily sesquiterphene alcohol that presents diverse biological activities, among them, citotoxicity. In despite of the diverse studies using this molecule, little is known about the biological activities of its natural analogue bisabolol oxide A. Besides, the purinergic system has been related to tumor development and progression. Therefore, the objective of this work was to evaluate the effect of two new promising chemotherapic agents (alpha-bisabolol and bisabolol oxide A) and correlate this effects with possible modulations of the purinergic system which is considered an interesting therapeutical target to glioma and medulloblastomas. We observed that the activity of ecto-5’-nucleotidase, an important enzyme of the purinergic system, is increased in both glioma and medulloblastoma cell lines when the cells are treated with alpha-bisabolol. It was also observed that this increase on activity was due to and direct effect of this treatment in the enzyme. Also, the treatment lead to a reduction on mRNA level of ecto-5’- nucleotidase on glioma cell line and no alterations on the imunocontent of the enzyme was observed on medulloblastoma cell lines. Additionally, the citotoxic activity of alpha-bisabolol on glioma cell line was correlated with modulation on A3 adenosine receptor. Moreover, the cell lines used in this work were sensible to the treatments with alpha-bisabolol and bisabolol oxide A. In a conclusion, the data obtained in this work demonstrate that alpha-bisabolol and bisabolol oxide A are both interesting new therapeutical possibilities to brain tumors and the citotoxic activity of the first compound is related with modulations on the purinergic system. More studies are needed to better understand the effectiveness of these treatments in vivo and if the compound bisabolol oxide A also promotes a modulation on the purinergic system.

Diversas neoplasias podem atingir o sistema nervoso central e dentre elas, os tumores cerebrais são os mais prevalentes. Dentre todos os tumores cerebrais, dois merecem especial atenção: gliomas e meduloblastomas, por serem os mais recorrentes em adultos e crianças, respectivamente. O alfa-bisabolol é um pequeno álcool sesquiterpeno oleoso, que apresenta diversas atividades biológicas dentre elas, citotoxicidade. Apesar dos diversos estudos com essa molécula, pouco se sabe das atividades biológicas de seu análogo natural, o óxido de bisabolol A. Além disso, o sistema purinérgico tem sido relacionado com progressão e desenvolvimento tumoral. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de dois promissores novos agentes quimioterápicos (alfa-bisabolol e óxido de bisabolol A) e correlacionar esses efeitos com possíveis modulações do sistema purinérgico, que é considerado um novo alvo terapêutico em linhagens de glioma e meduloblastoma. Nós observamos que a atividade da ecto-5’-nucleotidase, importante enzima do sistema purinérgico, é aumentada tanto em linhagens de glioma quanto de meduloblastoma quando estas são tratadas com alfa-bisabolol. Vimos também que esse aumento na atividade deu-se por um efeito direto do tratamento sob a enzima, com uma redução da expressão do mRNA da ecto-5’-nucleotidase em linhagem de glioma e sem alteração no imunoconteúdo dessa enzima em linhagens de meduloblastoma. Em linhagens de glioma, adicionalmente, a atividade citotóxica do alfa-bisabolol foi correlacionada com estímulo ao receptor de adenosina A3. Ainda, as linhagens estudadas foram sensíveis aos tratamentos com alfa-bisabolol e óxido de bisabolol A. Em conclusão, os dados obtidos nesse trabalho demonstram que tanto o alfabisabolol quanto o óxido de bisabolol A são interesseantes novas possibilidades terapêuticas para os tumores cerebrais e que a atividade citotóxica do primeiro composto envolve modulação do sistema purinérgico. Mais estudos são necessários para entender a efetividade desses tratamentos in vivo e se o tratamento com o óxido de bisabolol A também modula o sistema purinérgico. / Among all the cancers that can affect the central nervous system, the brais tumors are the most prevalent. Two of this tumors deserve special attention: glioma and medulloblastoma once they are the most prevalent in adults and children respectively. Alpha-bisabolol is a small oily sesquiterphene alcohol that presents diverse biological activities, among them, citotoxicity. In despite of the diverse studies using this molecule, little is known about the biological activities of its natural analogue bisabolol oxide A. Besides, the purinergic system has been related to tumor development and progression. Therefore, the objective of this work was to evaluate the effect of two new promising chemotherapic agents (alpha-bisabolol and bisabolol oxide A) and correlate this effects with possible modulations of the purinergic system which is considered an interesting therapeutical target to glioma and medulloblastomas. We observed that the activity of ecto-5’-nucleotidase, an important enzyme of the purinergic system, is increased in both glioma and medulloblastoma cell lines when the cells are treated with alpha-bisabolol. It was also observed that this increase on activity was due to and direct effect of this treatment in the enzyme. Also, the treatment lead to a reduction on mRNA level of ecto-5’- nucleotidase on glioma cell line and no alterations on the imunocontent of the enzyme was observed on medulloblastoma cell lines. Additionally, the citotoxic activity of alpha-bisabolol on glioma cell line was correlated with modulation on A3 adenosine receptor. Moreover, the cell lines used in this work were sensible to the treatments with alpha-bisabolol and bisabolol oxide A. In a conclusion, the data obtained in this work demonstrate that alpha-bisabolol and bisabolol oxide A are both interesting new therapeutical possibilities to brain tumors and the citotoxic activity of the first compound is related with modulations on the purinergic system. More studies are needed to better understand the effectiveness of these treatments in vivo and if the compound bisabolol oxide A also promotes a modulation on the purinergic system.