Um dos mais versáteis mecanismos de reparo de DNA é o reparo por excisão de nucleotídeos (nucleotide excision repair- NER). Defeitos genéticos associados a esta via podem gerar diferentes síndromes com deficiência de reparo. Dentre essas, Xeroderma pigmentosum (XP) é a que apresenta maior sensibilidade à luz solar, resultando em um grande aumento na incidência de tumores em regiões expostas da pele e, em alguns casos, degeneração neurológica progressiva e envelhecimento prematuro. Na primeira parte deste projeto é apresentado o uso de adenovírus recombinantes portando genes da via de NER para identificar a deficiência gênica de três pacientes portadores de XP. Na segunda parte do trabalho os estudos de reparo de DNA são estendidos a modelos animais, com deficiências nos mesmos genes carregados pelos vetores adenovirais. A expressão gênica do vetor foi avaliada pela detecção de proteína e por visualização da fluorescência de EGFP na pele dos animais infectados. Em resumo, este trabalho apresenta o uso eficiente de vetores adenovirais portando genes de reparo em ensaios in vitro e in vivo, e descreve duas mutações deletérias no gene XPC de pacientes XP brasileiros, incluindo uma mutação nova. / One of the most versatile mechanisms of DNA repair is the nucleotide excision repair (NER). Genetic defects in NER can generate different syndromes. Among these, Xeroderma pigmentosum) presents the highest sensitivity to sunlight, resulting in a large increase in the incidence of skin cancer, especially in areas exposed to the sunlight, and in some cases, progressive neurological degeneration and premature aging. In the first part of this project, adenoviral vectors carrying NER genes were used to identify genetic deficiency of three XP patients. The second part of work was extended to animal models, deficient for the same XP genes carried by adenoviral vectors. The genetic expression of vector was evaluated by detection of protein and EGFP fluorescence visualization in the skin of animals transduced. In summary, this work presents the use of adenovirus, carrying DNA repair genes for in vitro in vivo studies reports two deleterious mutations in Brazilian XP patients, including a new mutation.

O início e a progressão do carcinoma espinocelular oral (CEO) são caracterizados pela aquisição de alterações genéticas e epigenéticas. A proteína SET é descrita como uma oncoproteína e, recentemente, o seu acúmulo foi mostrado em CEO. Diversas funções têm sido atribuídas à SET, tais como controle do ciclo celular, sobrevivência celular, migração celular, acetilação de histonas, e resposta ao estresse oxidativo. Este contexto sugere a SET como alvo terapêutico, mas primeiramente, é essencial entender a sua ação na tumorigênese e progressão em CEO. A hipótese central no presente estudo refere-se ao papel da SET na instabilidade genômica e reparo de DNA, bem como na regulação epigenética da expressão de miRNA, com impacto no desenvolvimento e progressão de CEO. O silenciamento estável de RNA foi realizado usando plasmídeo contendo short hairpin RNA contra SET (shSET) em linhagens de CEO in vitro (HN12 e Cal27) e in vivo (tumores xenoenxerto de HN12). Efeitos da redução da SET em CEO, in vitro e in vivo, foram avaliados no perfil de metilação (MSP, methylation specific PCR), expressão de miR-9 (qRT-PCR) e reparo de DNA (reparo mismatch e de quebra de fita dupla - DSB). A instabilidade genômica foi abordada por meio de cinco microssatélites (PCR convencional) para avaliar a instabilidade de microssatélites (MSI), e ensaio cometa para avaliar danos ao DNA (SSB, DSB, cross-link, etc.). O status de proteínas envolvidas em reparo de DSB (ATM, BRCA1 e MLH1) foi avaliado por imunofluorescência e Western blotting (WB). A resposta aos danos no DNA (DDR) induzidos por radioterapia (raios-X) foram analisados nas células HN12 por meio de ensaios clonogênico e de ciclo celular; proteínas associadas à apoptose, autofagia, ciclo celular e reparo foram avaliadas por WB. A redução da SET nas células HN12 modificou a transcrição dos loci codificantes do miR-9 por meio da reversão parcial de hipermetilação, tanto in vitro quanto in vivo, para o locus miR-9-1, e in vitro para o miR-9-3, com aumento nos níveis de miR-9 e miR-9*. A análise de 5 microssatélites mostrou alteração no perfil alélico de dois marcadores, D5S346 e D2S123, nas células HN12 shSET e nos tumores xenoenxerto da HN12 shSET (in vivo) em relação aos respectivos controles, o que sugere a presença de MSI e é um indício do papel da SET no reparo de DNA tipo mismatch. A linhagem HN12 shSET apresentou diminuição de danos no DNA e aumento das proteínas de reparo de DSB, MLH1, ATM, p-ATM e BRCA1 em relação a células HN12 shCTRL. Na DDR induzida por raios-X as células HN12 shSET apresentaram nas primeiras 48 horas uma menor perda de viabilidade (menor % em sub G0/G1), com parada em G2/M, maior nível de ATM ativa, aumento dos níveis de p21 e LC3B-II, além de menor clivagem de PARP e caspase-8 em relação as células HN12 shCTRL; isto sugere uma melhor resposta a danos de DSB e ativação de vias de sobrevivência nas células HN12 shSET. Entretanto, após 12 dias de radioterapia as células HN12 shSET mostraram uma tendência a menor sobrevivência. Portanto, os nossos resultados indicam o envolvimento da SET na regulação transcricional do miR-9, nas vias de reparo do tipo mismatch e de DSB em CEO, com potenciais implicações tanto na tumorigênese quanto na progressão da doença. / Oral squamous cell carcinoma (OSCC) onset and progression are characterized by acquisition of genetic and epigenetic alterations. SET protein is known as an oncoprotein and, recently, its accumulation was demonstrated in OSCC. Several functions have been attributed to SET, such as cell cycle control, cell survival, cell migration, histone acetylation, and response to oxidative stress. This context outstands SET as a therapeutic target, but first, it is essential to understand its role in tumorigenesis and progression in OSCC. The central hypothesis of this study refers to SET role in genomic instability and DNA repair, as well as miRNA epigenetic regulation, with impact in OSCC development and progression. Stable SET knockdown (shSET) was achieved using short hairpin RNA against SET mRNA in vitro (HN12 and Cal27, OSCC cell lines) and in vivo (HN12 xenografts tumors). Effects of SET knockdown were assessed in OSCC, in vitro e in vivo, regarding DNA methylation (MSP, methylation specific PCR) and expression of miR-9 (qRT-PCR), and DNA repair (mismatch and double-strand breaks/DSB repair). Genomic instability was addressed by means of five microsatellites (conventional PCR) to assess microsatellite instability (MSI), and comet assay to assess DNA damage (SSB, DSB, cross-link, etc.). The status of proteins involved in DSB repair (ATM, BRCA1 and MLH1) was assessed by immunofluorescence and Western blotting (WB). The DNA damage response (DDR) induced by ionizing radiation (X-rays) was assessed in HN12 cells through clonogenic and cell cycle assays; proteins associated with apoptosis, autophagy, cell cycle and repair were assessed by WB. SET knockdown in HN12 cells modified miR-9 transcription through hypermethylation partial reversal for miR-9-1 locus, both in vitro and in vivo, and for miR-9-3 in vitro, with increase of miR-9 and miR-9* levels. Analysis of 5 microsatellites showed changes in the allelic profile of two markers, D5S346 and D2S123, in HN12 shSET cells (in vitro) and HN12 shSET xenografts tumors (in vivo) compared to their controls, suggesting MSI and it\'s a clue of SET role in mismatch repair. HN12 shSET cells showed decreased DNA damage and increased DSB repair protein levels (MLH1, ATM, p-ATM and BRCA1) compared to HN12 shCTRL. In the first 48 hours, HN12 shSET X-rays-induced DDR showed lower loss of viability (lower % in subG0/G1), increased G2/M checkpoint, higher levels of active ATM, p21, LC3B-II, and less PARP and caspase-8 cleavage than HN12 shCTRL. These results suggest a higher efficiency of DSB damage response and activation of survival pathways in the presence of SET knockdown. However, 12 days after radiotherapy, HN12 shSET cells presented a tendency for higher intrinsic radiosensitivity in relation to control. Therefore, our findings indicate a SET involvement in miR-9 transcriptional regulation, and in mismatch and DSB repair, with potential implications in oral tumorigenesis and progression.

As BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) são membros da superfamília de proteínas TGF-β (Transforming Growth Factor β ), regulam o crescimento e diferenciação de vários tipos celulares em diversos tecidos, e algumas delas desempenham um papel crítico na diferenciação de células de origem mesenquimal em osteoblastos. Particularmente, rhBMP2 e rhBMP7, promovem osteoindução tanto \"in vitro\" como \"in vivo,\" sendo, ambas as proteínas utilizadas terapeuticamente em Ortopedia/Odontologia para reparo ósseo. A expressão diferencial de genes durante a osteodiferenciação de células C2C12 induzida por rhBMP2 e rhBMP7, foi analisada através de microarranjos de DNA, selecionando 31 genes, dos quais 24 foram validados por qPCR, 13 dos quais são relacionados à transcrição, quatro associados a algumas vias de sinalização celular e sete associados à matriz extracelular. Análise funcional destes genes permitirá conhecer, com maiores detalhes, os eventos moleculares que ocorrem durante a diferenciação osteoblástica de células C2C12 induzida por rhBMPs. Em paralelo, foi perseguida a super-expressão de rhBMP2 e rhBMP7 em células HEK293T, demonstrando-se a atividade de rhBMP7, induzindo osteodiferenciação \"in vitro\" e formação de osso \"in vivo\", demonstrando a viabilidade do objetivo de se produzir estas proteínas para futura aplicação como biofármacos no Brasil. / The BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) are members of the TGF-β (Transforming Growth Factor β) superfamily of proteins, regulate growth and differentiation of various cell types in various tissues, and some play a critical role in differentiation of mesenchymal cells into osteoblasts. Particularly, rhBMP2 and rhBMP7, promote osteoinduction \"in vitro\" and \"in vivo\" and both proteins are used therapeutically in Orthopedics and Dentistry. The differential expression of genes during osteodifferentiation induced by rhBMP2 and rhBMP7 in C2C12 cells was analyzed through DNA microarrays, allowing the selection of 31 genes, of which 24 were validated by qPCR, 13 of which are related to transcription, four associated with cell signaling pathways and seven are associated with the extracellular matrix. Subsequent functional analysis of these genes should reveal more details on the molecular events which take place during C2C12 cells osteoblastic differentiation induced by rhBMPs In paralel, rhBMPs 2 and 7 were overexpressed in HEK293T cells and BMP7 activity to induce osteodifferentiation \"in vitro\" and bone formation \"in vivo\" was demonstrated, reinforcing the viability of our objective to produce these proteins for future application as biopharmaceuticals in Brazil.

O uso de fitoterápicos é difundido na cultura popular dos países da América do Sul, substancialmente no Brasil. Passiflora edulis Sims (tipo de maracujá) está presente na lista da RENISUS e é uma espécie utilizada para promover a cicatrização de feridas cutâneas, no entanto, a literatura científica é pobre em relação aos mecanismos de ação da planta. Passiflora setacea DC é uma espécie silvestre de maracujá, sendo mais resistente à morte precoce e infecções por patógenos. Para este estudo procedemos à obtenção e fracionamento do extrato hidroetanólico a 60% das partes aéreas (folhas e caules) de Passiflora edulis e Passiflora setacea. Posteriormente, obtivemos o perfil cromatográfico em CCD e CLAE dos extratos e das frações, isolando os compostos majoritários e fizemos a análise da capacidade oxidativa dessas frações. Em uma segunda fase, verificamos a atividade cicatrizante dos extratos e das frações, em ratos, através da análise macroscópica do processo de cicatrização (área e tamanho do ferimento); análise da migração de neutrófilos (em bolsa de ar induzida no dorso dos animais) e mediadores inflamatórios liberados (TNF-α, IL-1&#946 e CINC-2 &#945/&#946) na bolsa de ar induzida. Os caracteres morfoanatômicos apresentados neste trabalho para Passiflora setacea irão contribuir para sua morfodiagnose e principalmente para sua distinção da Passiflora oficial brasileira, Passiflora edulis. A triagem fitoquímica demonstrou a presença de compostos fenólicos, tais como flavonoides e taninos e ausência de alcaloides, cumarinas e saponinas, nas duas espécies, Passiflora edulis e Passiflora setacea, sendo possível a diferenciação das duas espécies por técnica de CCD e CLAE. Na Passiflora setacea foi identificado um pico majoritário que não foi encontrado na Passiflora edulis e que com uso de técnicas de CLAE semi-preparativa, espectroscopia de massas e ressonância magnética nuclear, este composto foi identificado como sendo luteolina-8-C-ramnosil-glicosideo. Todos os resultados observados nas analises biológicas permitem concluir que estas duas espécies de Passifloras têm atividade cicatrizante e anti-inflamatória significativamente diversa dos sistemas empregados como controle e que podem constituir auxiliares importantes no preparo de futuros medicamentos para melhoria do processo de cicatrização. / The use of herbal medicines is widespread in popular culture of the South American countries, substantially in Brazil. Passiflora edulis Sims (passion fruit) is present in the list of RENISUS and is a species used to promote healing of skin wounds; however, the scientific literature is low in relation to the mechanisms of action of the plant. Passiflora setacea DC is a wild species of passion fruit, being more resistant to early death and infection by pathogens. In the first part of this work, we obtained the 60 % extract of aerial parts (leaves and stems), of the two species, made the fractionation and phytochemical screening of Passiflora edulis and Passiflora setacea. We obtained the chromatographic profile of the extracts and fractions on TLC and HPLC, isolating the majority compounds and we made the analysis of the oxidative capacity of these fractions. In a second phase, we verified the healing activity of extract and fractions in rats by macroscopic analysis of the healing process (the area and size of injury); analysis of neutrophil migration (in air bag-induced on the backs of animals) and inflammatory mediators released (TNF-α, IL-1β and CINC-2 &#945/&#946) on the induced air bag. The macro and micro characters presented in this work for Passiflora setacea will contribute to its diagnose and mainly for its distinction of the official Brazilian Passionflower Passiflora edulis. The phytochemical screening demonstrated the presence of phenolic compounds such as flavonoids and tannins and absence of alkaloids, coumarins and saponins in Passiflora edulis and Passiflora setacea, being possible the differentiation of the two species by TLC and HPLC techniques. Passiflora setacea presented by HPLC a major peak that was not found in Passiflora edulis and using semi-preparative HPLC technique, mass spectroscopy and nuclear magnetic resonance, this compound was identified as luteolin-8-C-rhamnosyl-glucoside. All results observed in biological analyses lead to the conclusion that these two species of Passifloras have healing and anti-inflammatory activity significantly diverse from the control systems and they can be important in the preparation of future medications to improve the healing process.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:56:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1722534 bytes, checksum: d8557488d35ade21ba45951fd8412a2f (MD5) Previous issue date: 2014-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / DNA methylation, characterized by the addition of a methyl group in cytosines within CpG dinucelotides can modified gene transcription, leading to decrease or even silence a gene. The ability of the environmental factors to induce epigenetic changes has been investigated and many studies have shown a relationship between them. Studies show that pesticides, metal ions, drugs, diet, alcohol dependence and smoking are associated with epigenetic changes. Smoking is often associated with the risk of cancer in various tissues and cardiovascular diseases, being considered the leading cause of preventable death. The MLH1 gene is related to the repair of badly paired bases of DNA (DNA mismatch repair (MMR)). The hTERT gene comprises the catalytic subunit of telomerase enzyme, which is considered a biological clock, a marker indicating that the cellular senescence can be installed inevitably form. The TP53 is a tumor suppressor gene and its hypermethylation is related to the development of various cancers. The aim of this work was to investigate the smoking habit influence on DNA methylation status in the promoter of cancer-related genes, MLH1, hTERT and TP53 in oral epithelial cells of healthy subjects. Samples of oral epithelium of smokers, nonsmokers and former smokers were collected by rinsing and DNA was extracted. After, DNA Methylation analysis was performed by Methylation Sensitive Restriction Enzymes, using two restriction enzymes, the HpaII and HhaI, which cleave different sites. Following the enzymatic digestion, DNA was amplified by PCR, subjected to electrophoresis on a 6% polyacrylamide gel and stained with silver nitrate. Statistical analysis was performed by Chi-square test at a significance level of 5%. The investigated CpG dinucleotides located at HhaI and HpaII sites in the MLH1 gene promoter were observed to be fully methylated in DNA majority samples from the smoker group and statistical differences were found between nonsmokers and smokers and between smokers and former smokers (p<0.05). The same was observed in the hTERT gene promoter at HhaI site (p<0.05) and for HpaII site the unmethylated condition was more frequent in smoker in comparison to nonsmokers (p<0.05). For TP53 no differences were found among groups (p>0.05) which the fully methylated condition was found to be an usual event in healthy oral epithelial cells. We conclude that smoking may induce changes in DNA methylation status in cancer-related genes, such as MLH1 and hTERT of healthy oral epithelial cells and the cessation of smoking reversed the process. / A metilação de DNA é uma modificação química na molécula de DNA, e consiste na presença de um radical metil em dinucleotídeos CpG, presente principalmente em regiões promotoras do gene. Uma das principais funções da metilação de DNA é regular a transcrição gênica, sendo que a presença do radical metil pode suprimir por completo a expressão gênica. Estudos mostram que o meio ambiente pode modular a metilação de DNA. Como exemplo de fatores ambientais temos: a radiação ultravioleta, agrotóxicos, dieta, fármacos, uso crônico do álcool e o hábito de fumar. O fumo é frequentemente associado ao risco de câncer em diversos tecidos e doenças cardiovasculares, sendo considerado a maior causa de morte evitável. O gene MLH1 está relacionado ao reparo de bases mal pareadas do DNA (DNA mismatch repair (MMR)). O gene hTERT compõe a subunidade catalítica da enzima telomerase, a qual é considerada um relógio biológico, um marcador que indica que a senescência celular poderá se instalar de forma inevitável. O TP53 é um gene supressor tumoral e sua hipermetilação está relacionada ao desenvolvimento de diversos tipos de câncer. Assim, o objetivo deste estudo foi investigar o efeito do tabagismo no perfil de metilação de DNA em genes relacionados ao câncer, MLH1, hTERT e TP53 em células da mucosa bucal de indivíduos saudáveis. Para tanto, amostras de epitélio da mucosa bucal de indivíduos fumantes, não fumantes e ex-fumantes foram coletadas por bochecho e o DNA dessas células foi extraído. Após esse processo, a análise de metilação de DNA foi feita utilizando o método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação, utilizando-se de duas enzimas de restrição, a HhaI e a HpaII, as quais clivam sítios diferentes. Em seguida à digestão enzimática, DNA foi amplificado por PCR, submetido à eletroforese em gel de poliacrilamida a 6% e corado pelo nitrato de prata. A análise estatística foi realizada pelo Teste de Qui-Quadrado ao nível de significância de 5%. Os dinucleotídeos CpG localizados nos sítios HhaI e HpaII no promotor do gene MLH1 mostraram-se totalmente metilados na maioria dos indivíduos do grupo fumante e diferenças significativas foram observadas entre fumantes e não fumantes e entre fumantes e ex-fumantes (p<0,05). O mesmo foi observado para o sítio HhaI no promotor do gene hTERT (p<0,05) e para o sítio HpaII a condição não metilada foi mais frequente em fumantes em comparação com não fumantes (p<0,05). Para o gene TP53 não foram encontradas diferenças entre os grupos (p>0,05), sendo a condição totalmente metilada um evento usual das células saudáveis da mucosa bucal. Assim, concluímos que o fumo está associado a alterações no perfil de metilação de DNA em genes relacionados ao câncer, como MLH1 e hTERT em células epiteliais saudáveis da mucosa bucal e a cessação do hábito de fumar reverteu o processo.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:05:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ThayseAS_TESE.pdf: 2133799 bytes, checksum: c236c1e72798e2c7e1008d1c78d046a4 (MD5) Previous issue date: 2013-03-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / In vitro and in animal models, APE1, OGG1, and PARP-1 have been proposed as being involved with inflammatory response. In this work, we have investigated if the SNPs APE1 Asn148Glu, OGG1 Ser326Cys, and PARP-1 Val762Ala are associated to meningitis and also developed a system to enable the functional analysis of polymorphic proteins. Patients with bacterial meningitis (BM), aseptic meningitis (AM) and controls (non-infected) genotypes were investigated by PIRA-PCR or PCR-RFLP. DNA damages were detected in genomic DNA by Fpg treatment. IgG and IgA were measured from plasma and the cytokines and chemokines were measured from cerebrospinal fluid samples using Bio-Plex assays. The levels of NF-?B and c-Jun were measured in CSF by dot blot assays. A significant (P<0.05) increase in the frequency of APE1 148Glu allele in BM and AM patients was observed. A significant increase in the genotypes Asn/Asn in control group and Asn/Glu in BM group was also found. For the SNP OGG1 Ser326Cys, the genotype Cys/Cys was more frequent (P<0.05) in BM group. The frequency of PARP-1 Val/Val genotype was higher in control group (P<0.05). The occurrence of combined SNPs increased significantly in BM patients, indicating that these SNPs may be associated to the disease. Increasing in sensitive sites to Fpg was observed in carriers of APE1 148Glu allele or OGG1 326Cys allele, suggesting that SNPs affect DNA repair activity. Alterations in IgG production were observed in the presence of SNPs APE1Asn148Glu, OGG1Ser326Cys or PARP-1Val762Ala. Reductions in the levels ofIL-6, IL-1Ra, MCP-1/CCL2and IL-8/CXCL8 were observed in the presence of APE1148Glu allele in BM patients, however no differences were observed in the levels of NF-?B and c-Jun considering genotypes and analyzed groups. Using APE1 as model, a system to enable the analysis of cellular effects and functional characterization of polymorphic proteins was developed using strategies of cloning APE1 cDNA in pIRES2-EGFP vector, cellular transfection of the construction obtained, siRNA for endogenous APE1 and cellular cultures genotyping. In conclusion, we obtained evidences of an effect of SNPs in DNA repair genes on the regulation of immune response. This is a pioneering work in the field that shows association of BER variant enzymes with an infectious disease in human patients, suggesting that the SNPs analyzed may affect immune response and damage by oxidative stress level during brain infection. Considering these data, new approaches of functional characterization must be developed to better analysis and interactions of polymorphic proteins in response to this context / Estudos in vitro e em modelos animais sugerem que as prote?nas de reparo de DNA da via de reparo por excis?o de bases (do ingl?s, BER) APE1, OGG1 e PARP-1 est?o envolvidas tamb?m na resposta inflamat?ria. Neste trabalho foi investigado se os SNPs APE1 Asn148Glu, OGG1 Ser326Cys e PARP-1 Val762Ala associam-se ? meningite, e foi desenvolvido um sistema para an?lise funcional destas variantes polim?rficas. Os gen?tipos de pacientes com meningite bacteriana (MB), meningite ass?ptica (MA) e n?o infectados (controles) foram investigados por PIRA-PCR ou PCR-RFLP. Danos no DNA gen?mico foram detectados por meio de tratamento com Fpg. IgG e IgA foram titulados no plasma e citocinas e quimiocinas foram mensuradas em amostras de l?quor atrav?s de ensaios em Bio-Plex. Os n?veis de NF-?B e c-Jun foram dosados no l?quor dos pacientes por meio de dot blot. Foi observado um aumento significativo (P<0.05) na frequ?ncia do alelo APE1 148Glu nos casos de MB e MA. Os gen?tipos Asn/Asn no grupo controle e Asn/Glu no grupo da MB tamb?m apresentaram relevante aumento em suas frequ?ncias (P<0.05). Para o SNP OGG1 Ser326Cys, o gen?tipo Cys/Cys esteve mais frequente (P<0.05) nos casos de MB. A frequ?ncia do gen?tipo PARP-1 Val/Val foi mais alta no grupo controle (P<0.05). A ocorr?ncia combinada dos SNPs foi significativamente alta nos pacientes com MB, indicando que estes SNPs podem estar associados ? doen?a. Os portadores do alelo APE1 148Glu ou OGG1 326Cys apresentaram um n?mero maior de s?tios sens?veis ? Fpg, sugerindo que os SNPs afetam a atividade de reparo do DNA. Altera??es na s?ntese de IgG foram observadas na presen?a dos SNPs APE1 Asn148Glu, OGG1 Ser326Cys ou PARP-1 Val762Ala. Redu??es nos n?veis de IL-6, IL-1Ra, MCP-1/CCL2 e IL-8/CXCL8 foram encontradas na presen?a do alelo APE1 148Glu em amostras de pacientes com MB, no entanto n?o foram encontradas diferen?as nos n?veis de NF-?B e c-Jun considerando os gen?tipos e os grupos analisados. Utilizando APE1 como modelo, foi desenvolvido um sistema que possibilita a express?o e caracteriza??o funcional das enzimas polim?rficas estudadas e seus efeitos na c?lula, por meio de clonagem, utilizando o vetor pIRES2-EGFP e cDNA de APE1, transfec??o celular da constru??o obtida, inibi??o por siRNA de APE1 end?gena e genotipagem de culturas celulares. Em conclus?o, foram obtidas evid?ncias de um efeito significativo dos SNPs nos genes de reparo de DNA na regula??o da resposta imunol?gica. Este ? um trabalho pioneiro na ?rea, que demonstra a associa??o de variantes das enzimas da via BER com uma doen?a infecciosa em humanos, sugerindo que os SNPs estudados podem afetar a resposta imune e o impacto do n?vel de estresse oxidativo durante a infec??o cerebral. Desta forma, novos meios de an?lise funcional devem ser desenvolvidos para estudo de prote?nas polim?rficas e suas intera??es neste contexto / 2020-01-01

Hematopoietic tumors are the most common neoplastic disorders in felines. Many of these tumors are associated with infection by feline leukemia virus (FeLV) and one of the described mechanisms is the integration of viral material into the feline genome, which can lead to genomic instability and consequent alteration of genes related to proliferation control and cell death. When larger DNA fragments are affected, such changes can be observed by cytogenetic analysis. The present study aimed to observe cytogenetic changes in felines with hematopoietic neoplasms. The study was performed in eight felines, seven of them with a diagnosis of leukemia or lymphoma. The control consisted of a healthy feline FeLV negative with normal karyotype. At least 10 metaphases of each animal were analyzed. Additionally, 1000 lymphocytes of these two patients, were analyzed and classified cytologically by their viability (necrosis, apoptosis), mitotic state (mononuclear, binucleate (BN), mitotic multinucleate) and their chromosomal damage or instability state (presence of micronucleus (MN) in mononuclear, binucleate, as well as nuclear buds (NBUD). The results of this observation were statistically analyzed by the Wilcoxon paired test. In this chromosomal analysis two of these animals presented monosomy of the E3 chromosome, one with diagnosis of acute myeloid leukemia of the M6a (LMA-M6a) FAB subtype and another with multicenter lymphoma (LM). There were significant differences in LMA-M6a scores (N = 7, Z = 2.36, p = 0.01) and LM scores (N = 8, Z = 2.52, p = 0.01) when group control. However, there was no difference between AML and lymphoma (N = 8, Z = 0.07, p = 0.94). The E3 chromosome has 1401 genes, several related to cell cycle control (Plk1, Sun, Mad1l1, Mcm7), DNA repair (Pms2, Usp42), tumor suppression (Bcl7b). The loss of DNA fragments, such as the loss of the E3 chromosome in the two patients described, led to the haploinsufficiency of important genes for the cell cycle, and this could be a cause of genomic instability and consequently susceptibility to the development of cancer. The observation of cytogenetic alterations, in this way, allows a better understanding of the cancer in the feline species and translational research. / Os tumores hematopoiéticos são os distúrbios neoplásicos mais comuns em felinos. Muitos desses tumores estão associados à infecção pelo vírus da leucemia felina (FeLV) e um dos mecanismos descritos é pela integração de material viral no genoma felino, que pode levar à instabilidade genômica e consequente alteração de genes relacionados com o controle da proliferação e morte celular. Quando fragmentos maiores de DNA são afetados, tais alterações podem ser observadas pela análise citogenética. O presente estudo objetivou observar as alterações citogenéticas em felinos com neoplasias hematopoiéticas. O estudo foi realizado em oito felinos, sete destes com diagnóstico de leucemia ou linfoma. O controle foi constituído por um felino saudável FeLV negativo com cariótipo normal. Foram analisadas no mínimo 10 metáfases de cada animal. Adicionalmente, destes dois pacientes foram analisados 1.000 linfócitos e classificados citologicamente pelo seu estado de viabilidade (necrose, apoptose), seu estado mitótico (mononucleado, binucleado (BN), multinucleado, mitótico) e seu dano cromossômico ou estado de instabilidade (presença de micronúcleo (MN) em célula mononucleada, binucleada, bem como brotos nucleares (NBUD). Os resultados dessa observação foram analisados estatisticamente pelo teste pareado de Wilcoxon. Nesta análise cromossômica dois destes animais apresentaram monossomia do cromossomo E3, um com diagnóstico de leucemia mieloide aguda do subtipo FAB M6a (LMA-M6a) e outro com linfoma multicêntrico (LM). Houve diferença significativa nas contagens de LMA-M6a (N=7; Z=2,36; p=0,01) e de LM (N=8; Z=2,52; p=0,01) quando comparados com o grupo controle. No entanto, não houve diferença entre LMA e linfoma (N=8; Z=0,07; p=0,94). No cromossomo E3 são descritos 1401 genes, sendo vários relacionados com controle de ciclo celular, (Plk1, Sun, Mad1l1, Mcm7), reparo de DNA (Pms2, Usp42) e supressão tumoral (Bcl7b).A perda de fragmentos de DNA, como o cromossomo E3 nos dois pacientes descritos, que leva a haploinsuficiência de genes importantes para o ciclo celular, poderia ser a causa de instabilidade genômica e, consequentemente suscetibilidade ao desenvolvimento do câncer. A observação de alterações citogenéticas, dessa forma, possibilita o melhor entendimento do câncer na espécie felina e serve como subsídio para a pesquisa translacional.

Submitted by Maria Creuza Silva (mariakreuza@yahoo.com.br) on 2013-10-07T18:30:57Z No. of bitstreams: 1 Diss MP Dulce Almeida. 2013.pdf: 1267001 bytes, checksum: 0b69cc06714872b88f9c86e9c7fb78c6 (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Creuza Silva(mariakreuza@yahoo.com.br) on 2013-10-07T18:31:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Diss MP Dulce Almeida. 2013.pdf: 1267001 bytes, checksum: 0b69cc06714872b88f9c86e9c7fb78c6 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-07T18:31:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Diss MP Dulce Almeida. 2013.pdf: 1267001 bytes, checksum: 0b69cc06714872b88f9c86e9c7fb78c6 (MD5) Previous issue date: 2013 / Esse estudo avaliou os efeitos do tratamento endodôntico de dentes não vitais realizado em sessão única em comparação com o de múltiplas sessões. Utilizou-se de busca eletrônica nas bases de dados Web of Science e Medline de ensaios clínicos randomizados para o tratamento endodôntico de dentes não vitais, comparativos para ambas as técnicas, que foram selecionados a partir de critérios de rigor metodológico. As referências dos estudos de revisões sistemáticas e meta-análises sobre a temática também foram analisadas. Os efeitos estudados foram o reparo periapical de lesões detectáveis radiograficamente, o controle microbiano e a dor pós-obturação. Dezessete ensaios clínicos randomizados (ECR) foram incluídos. Essa meta-análise apontou que o tratamento em única sessão promoveu maior reparo periapical, contudo este não foi estatisticamente significante [RR=1.04, IC95% (0.97-1.12)]. O tratamento endodôntico em única sessão apontou 21% menor dor pós-obturação que o tratamento em múltiplas sessões e esta diferença foi significante [RR= 0.79, IC95% (0.66-0.94)]. Em relação ao controle microbiano, a frequência de amostras positivas antes da obturação foi maior no grupo tratado em única sessão, entretanto, a diferença não foi estatisticamente significante [RR=2.48, IC95% (0.67-1.97)]. O tratamento endodôntico em única sessão não apresentou diferença em termos de reparo periapical e controle microbiano e provocou menor dor pós-obturação em relação ao tratamento em múltiplas sessões. Nesse sentido, do ponto de vista da saúde pública, poderia ser sugerida a adoção do tratamento endodôntico em sessão única. Entretanto, diante das limitações metodológicas dos estudos e da importância deste protocolo para a ampliação do acesso e da resolutividade, recomenda-se a realização de mais estudos clínicos para melhor avaliação dessa tecnologia na saúde pública. / Salvador

Submitted by Leonardo Lemos da Silveira Santos (leonardo.lemos@uol.com.br) on 2014-04-13T16:05:59Z No. of bitstreams: 1 Tese - versão final.pdf: 70383258 bytes, checksum: 374e2aa147ed745fc2d547c2729da175 (MD5) / Approved for entry into archive by PAMELA BELTRAN TONSA (pamela.tonsa@fgv.br) on 2014-04-14T10:59:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese - versão final.pdf: 70383258 bytes, checksum: 374e2aa147ed745fc2d547c2729da175 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-04-14T12:49:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese - versão final.pdf: 70383258 bytes, checksum: 374e2aa147ed745fc2d547c2729da175 (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / De maneira geral, a ideia central da presente tese é compreender como as organizações se organizam, ou seja, acontecem, constituem-se como tal, em tempo real. Para isso, do ponto de vista empírico tomei como referência o dia-a-dia de uma oficina ferroviária, especificamente a área responsável pelo reparo leve de locomotivas. Do ponto de vista ontológico, epistemológico e teórico optei por adotar como referência básica a proposta de Theodore Schatzki. Schatzki propõe uma ontologia das práticas sociais em que o site do social (ou, o contexto no qual a coexistência humana se desenrola) é composto por uma malha não só de nexos de práticas (fazeres e dizeres corporais humanos), mas também de arranjos materiais (objetos, artefatos, corpos). Nessa perspectiva, as organizações em geral poderiam ser entendidas como configurações de malhas de práticas#arranjos materiais. Assim, de forma mais específica procurei analisar – principalmente através do cotidiano dos mecânicos/eletricistas – os fazeres e dizeres corporais e os arranjos materiais envolvidos na prática de reparo e manutenção de locomotivas e que conformavam a oficina. O trabalho de campo, de caráter etnográfico, baseou-se em 6 meses de observação do dia-a-dia da oficina. Além da observação, construí dados através do registro de imagens (fotografias), da consulta a documentos e de entrevistas. A partir daí pude mostrar que a ‘oficina’ (em particular, ou uma organização, em geral), como um fenômeno social, poderia ser tratada como uma malha práticas#arranjos materiais. Apontei que as diferentes atividades (fazeres e dizeres) de programação da manutenção, de alocação de mão de obra, de identificação de defeitos, de inspeção, regulagem e troca de peças e componentes etc, executadas pelos programadores do PCM, pelos líderes de turma e supervisores, pelos especialistas do GAF, pelos mecânicos/eletricistas em meio a, e através de diferentes arranjos (elementos) materiais como o ‘escritório’, a ‘mesa’, os galpões, as valas, a sala de reunião, o sistema de gestão da manutenção, as ‘notas’, as planilhas do GAF, as ART´s e PT´s, a locomotiva, as peças e componentes, as ferramentas, para garantir a disponibilidade e a confiabilidade das locomotivas, bem como a segurança dos funcionários, é que dão ‘vida’ (animam) e ‘materializam’ a ‘oficina’. A partir do que pude observar no campo, recorri também à noção de ciborgue e cyborganization para descrever e aprofundar como elementos humanos (mecânicos/eletricistas) e não humanos (locomotivas, peças, componentes) intra-agiam. Transitei ainda pelo campo do embodiment tendo em vista que passei a me dar conta de que as intra-ações com as máquinas eram frequentemente experimentadas pelos mecânicos/eletricistas como corporais envolvendo posturas, movimentos e vivências. Nesse caso as capacidades perceptivas-sensoriais emergiram como elementos decisivos para que os mecânicos/eletricistas conseguissem realizar o seu trabalho. Argumento portanto que, no caso que estudei, o corpo-(mecânico/eletricista) é também sujeito, tem também papel ativo na vida organizacional, é capaz de produzir (e não só reproduzir) práticas. / This thesis aims to analyse how organizations happens, constitute themselves as such in real time. Empirically, this was done based on intensive fieldwork carried out in the area responsible for repairing locomotives in one of the largest railway workshop in Brazil. From the ontological, epistemological and theoretical perspective I adopted Theodore Schatzki´s version of social practices as the basic reference. Schatzki proposes an ontology of social practices – called site ontology - to which the social site (or the context in which human coexistence unfolds) is composed of nexuses of practices (bodily doings and sayings) and material arrangements (objects, artifacts, bodies). In this approach, organizations could be understood as meshs configurations of practices and material arrangements. More specifically, I tried to analyze - mainly from the mechanics/electricians perspective - the bodily doings and sayings and materials arrangements involved in performing locomotives repair and maintenance activities that gives life to the workshop. The fieldwork, conducted through ethnographic methods, was based on 6 months of direct observation of the workshop day-to-day. Besides observation, data was gathered by images (photographs), documents and interviews. Following the actors and their practices I could show that the ‘workshop’ (in particular and any organization, in general), as a particular social phenomenon, could be treated as a mesh of practices and materials arrangements. I pointed out that the different activities (doings and sayings) of maintenance scheduling, allocation of manpower, identification of machines problems, inspection, adjustment and replacement of parts and components, performed by the maintenance programmers, the leaders and supervisors of teamworks, by the fails analysts, mechanical/electricians, whithin, and through different material arrangements (and elements) as the ‘office’, ‘the table’, the sheds, the ditches, the meeting room, the maintenance management system, the failures analysts worksheets, the Risk Analysis and Permissions of Work, locomotives, their parts and components, tools, to ensure the availability and reliability of locomotives, as well as the safety of employees, are what actually give ’life’ (animate) and ‘materialize’ ‘the workshop’. From what was observed in the field, I also used the notion of cyborg and cyborganization to describe and discuss how humans (mechanics/electricians ) and nonhuman (locomotives, parts, components ) not simply inter-act, but intra-acted. I revisited the concept of embodiment given that I realized in the fieldwork that the intra-actions with the machines were often lived by mechanics/electricians as involving bodily postures, movements and experience. In this case the sensory-perceptual abilities emerged as a decisive element to mechanics/electricians carry out their work activities. I also argue that the (mechanics/eletricians)-body is also subject, has an active role in organizational life, is capable of produce (not just reproduce) practices

O câncer é a primeira causa de mortes por doença, após 1 ano de idade, até o final da adolescência, excetuando aquelas relacionadas aos acidentes e à violência. A Leucemia Linfoide Aguda (LLA) afeta células linfoides e agrava-se rapidamente. São os tumores mais frequentes na infância e representam um terço de todas as neoplasias malignas nesta faixa etária. Em média, a taxa de cura excede 70%, todavia, apesar dos avanços das últimas décadas, os índices de crianças que apresentam recidiva da doença continua significativo. Danos endógenos ao DNA ocorrem numa frequência altíssima, além dos danos causados por terapias antitumorais. Alteração no reparo ao dano do DNA pode induzir mecanismos de resistência ao tratamento quimioterápico, resultando em aumento do reparo de lesões do DNA. Reparo por Excisão de Nucleotídeos (NER) é a via de reparo de DNA mais versátil e flexível nas células. Seus componentes estão sendo estudados como biomarcadores de prognóstico e terapias-alvo. No entanto, alguns relatórios têm abordado danos de DNA em Leucemia Linfoide Aguda (LLA) pediátrica. Neste estudo, realizamos um estudo de acompanhamento observacional em pacientes pediátricos para avaliar os danos do DNA pelo Ensaio Cometa Alcalino e expressão gênica da via de NER durante a indução da quimioterapia. Amostras de medula óssea (MO) ao diagnóstico, dia 15 (D15) e 30 (D30) do tratamento foram coletadas de 28 pacientes com LLA. Não houve aumento no índice de dano. No entanto, houve uma redução de células com baixo danos na comparação do D35 com o diagnóstico. Este resultado se confirmou em pacientes que apresentaram doença residual mínima positiva. A via de NER permaneceu constante, no entanto, em um único paciente, foi observada uma diminuição significativa da expressão dos genes, talvez devido ao silenciamento ou a regulação negativa das vias de reparo. Níveis de danos e reparação do DNA podem influenciar o resultado clínico, estar envolvidos na resistência aos fármacos e potencializar o risco de recidiva. Este é o primeiro estudo que avalia o dano ao DNA em amostras de MO de pacientes pediátricos com LLA. Apesar do pequeno número de pacientes alocados para o estudo, a partir dos achados é possível concluir que complexos de reparo merecem ser investigados a curto e a longo prazo. Acompanhamento dos resultados do paciente vai ajudar a elucidar a implicação dos nossos achados em taxas de cura e de recidiva. / Cancer is the leading cause of death by disease after 1 year old until the end of adolescence, except those related to accidents and violence. Acute Lymphoid Leukemia (ALL) affects lymphoid cells and worsens quickly. They are the most frequent tumors in childhood and account for a third of all malignancies in this age group. On average, the cure rate exceeds 70%, however, despite the progress of recent decades, rates of children with disease recurrence remains significant. Endogenous DNA damage occurs at a very high frequency, in addition to the damage caused by anti-tumor therapies. Change in the repair of DNA damage can induce resistance mechanisms to chemotherapy, resulting in increased repair of DNA lesions. Nucleotide Excision Repair (NER) pathway is the more versatile and flexible DNA repair in cells. Its components are being studied as prognostic biomarkers and targeted therapies. However, there are some reports of DNA damage in pediatric Acute Lymphoid Leukemia (ALL). In this study, we conducted an observational follow-up study in pediatric patients to assess DNA damage by alkaline comet assay and gene expression of NER pathway during induction chemotherapy. Bone marrow (BM) samples at diagnosis, 15th (D15) and 30th (D30) of treatment were collected from 28 patients with ALL. There was no increase in damage index. However, there was a reduction of cells with low damage in comparison to the D35 diagnosis. This result was confirmed in patients with positive minimal residual disease. The NER pathway remained constant, however, in one patient, a significant decrease of gene expression was observed perhaps due to the silencing or down-regulation of repair pathways. Damage levels and DNA repair can influence the clinical result and may be involved in drug resistance and enhance the risk of recurrence. This is the first study to assess DNA damage in BM samples of pediatric patients with ALL. Despite the small number of patients allocated to the study, from the findings we conclude that repair complex deserves to be investigated in the short and long term. Monitoring patient’s outcomes will help to access the implication of our findings in cure and relapse rates.