Submitted by Maryse Santos (maryseeu4@gmail.com) on 2016-09-02T15:23:02Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Paula Taquita Serra.pdf: 5828635 bytes, checksum: 30c415dfffb3ecb7f7e2e64439a68ae5 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-16T12:20:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Paula Taquita Serra.pdf: 5828635 bytes, checksum: 30c415dfffb3ecb7f7e2e64439a68ae5 (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2016-09-16T12:24:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Paula Taquita Serra.pdf: 5828635 bytes, checksum: 30c415dfffb3ecb7f7e2e64439a68ae5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-16T12:24:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Final Paula Taquita Serra.pdf: 5828635 bytes, checksum: 30c415dfffb3ecb7f7e2e64439a68ae5 (MD5) Previous issue date: 2013-09-04 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Introduction: Shigellosis is a bacillary dysentery caused by Shigella, a gramnegative intracellular human pathogen. One of most common animal models to evaluate Shigella’s immune response is mice pulmonary infection due easy manipulation and similar gut responses. At this study, we have hypothesized how clinical strains isolated from Shigellosis patients had differential immune response expression when compared to standards strains (M90T). Our main proposition was analyze four clinical Shigella strains with distinct virulence genes and M90T immune responses at murine invasion after 24 and 48h infection. Methods: Shigella Clinical Strains were selected through presence of specific virulence genes by PCR. Primers related to immune system were designed. Clinical strains and M90T Shigella were submitted to expression at Fluidigm (Bioamark Platform). Results were analyzed in statistical software R. Results: We grouped analyzed mRNA in five gene sets: Pro Inflammatory (CXCL15, IL-1β, IL-6, IFN-β, TNF-α), Anti Inflammatory (TGF-β1, TGF- β2 e TGF-β3), Innate Response (NOD 1, NOD 2, TLR4 e TLR9), Adaptive Response (Th1-like, IFN-γ, IL-17A e IL-17B) and Macrophage (NOS, H2 -Aβ1, H2-Eβ, H2-K1, MHC-like 2). As main results, all clinical strains displayed a moderate mRNA expression in 24h infection which gets higher in 48h, while M90T standard had opposite regulation with lower mRNA rates in 48h infection, suggesting major differences between well characterized standards and clinical strains. Clinical strain #5 did not alter mRNA expression in 24 and 48h at adaptive immune response genes, suggesting low invasion rates and host control at initial steps of infection. Clinical strain #11 demonstrates high macrophage activity by superior expression levels of IFN-γ and NOS. Strains #14 and #27 suggest potential of Th1 protection through high MHC-like II and Th1 mRNA expression when compared to all other strains and standard control. Presence of IL-17 high expression in strain #27 demonstrates a possible relation with Th17 cells. The immunological potential of strain #27 may have relationship with Shigella enterotoxins (shET1A, shET1B, and shET2). Enterotoxins presence was confirmed by PCR and results shows this complete set is absent in all other strains studied. Conclusion: The differences between clinical strains and standards were evident at this study. Clinical strain 27 appears as a great candidate to future studies and may provide new perspectives about differences among invasion and immune response seen in the clinical practice. / Shigelose é uma disenteria bacilar causada pela Shigella, um patógeno Gram negativo e intracelular. Um dos modelos animais mais comuns para avaliar a resposta imune da Shigella é a infecção pulmonar em camundongos devido a fácil manipulação e similaridade com as respostas intestinais. Neste estudo, nós levantamos a hipótese de como cepas clínicas isoladas de pacientes com shigelose possuem expressão de resposta imune diferencial quando comparados com cepas padrões (M90T). Nossa principal proposta foi analisar quatro cepas de Shigella clínicas com diferentes genes de virulência e a cepa padrão M90T quanto as respostas imunes após invasão murina em 24 e 48h. Métodos: Cepas clínicas de Shigella foram selecionadas pela presença de genes de virulência específicos por PCR. Primers relacionados ao sistema imune foram desenvolvidos. As cepas clínicas e a padrão foram submetidas à análise de expressão gênica pelo Fluidigm (Bioamark Platform). Os resultados foram analisados em programa estatístico R. Resultados: Nós agrupamos os mRNA em cinco grupos: Pró Inflamatórios (CXCL15, IL-1β, IL-6, IFN-β, TNF-α), Anti Inflamatórios (TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3), Resposta Inata (NOD 1, NOD 2, TLR4 e TLR9), Resposta adaptativa (Th1-like, IFN- γ, IL-17A e IL-17B) e Macrófago (NOS, H2 -Aβ1, H2-Eβ, H2-K1, MHC-like 2). Como principais resultados, todas as amostras clínicas demonstraram uma expressão mRNA em 24h de infecção que foi gradativamente aumentado após 48h, enquanto a cepa padrão M90T teve a regulação oposta com taxas de mRNA em 48h, sugerindo grandes diferenças entre as respostas a cepas clínicas e a padrões bem caracterizados. A cepa clínica #5 não alterou a expressão de mRNA em 24 e 48h nos genes da resposta adaptativa, sugerindo baixas taxas de invasão e controle do hospedeiro nas etapas iniciais da infecção. A cepa clínica #11 demonstrou alta atividade macrofágica devido a maior expressão de IFN-γ e NOS. A cepa #14 e #27 demonstraram um possível potencial de proteção Th1 devido a alta expressão mRNA para MHC-like II e Th1 quando comparado a outras cepas e o controle positivo. A presença de alta expressão de IL-17 na cepa #27 relação com células Th17. O potencial imunológico da cepa #27 pode ter relação com as enterotoxinas (shET1A, shET1B e shET2). A presença do conjunto completos destas enterotoxinas foi confirmado na cepa #27 por PCR. Conclusão: As diferenças entre cepas clínicas e padrões foram evidentes neste estudo. Cepa clínica 27 parece ser uma ótima candidata para estudos futuros e pode prover novas perspectivas para as diferenças de invasão e resposta imune vista nos hospitais.

Submitted by Rosangela Silva (rosangela.silva3@unioeste.br) on 2018-05-24T18:44:26Z No. of bitstreams: 2 Ana Cláudia Malagutti Corsato.pdf: 1319419 bytes, checksum: c4de080588607227096826021e800839 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-24T18:44:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Ana Cláudia Malagutti Corsato.pdf: 1319419 bytes, checksum: c4de080588607227096826021e800839 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-03-05 / The Diatraea saccharalis is the pest responsible for a great economic loss to the cultivation of sugar cane. As well as others members of Lepidoptera order, the D. saccharalis has a fast and efficient immune innate response, characterized by primary defense barrier, cellular immune response and humoral immune response. The antimicrobial peptides (AMPs) are included in humoral immune response that show cationic and amphiphilic characteristics besides its low molecular weight, what makes them potentially therapeutic agents. In this study were analyzed proteins with low molecular weight differently expressed in the hemolymph of D. saccharalis, after the interval of six and twelve hours of humoral immune response induction with different microorganisms compared to non-challenged worms (control). The 5th instar worms were divided in groups (n= 50) and submitted to six and twelve hours of septic challenges: control (group 1), challenged by Bacillus subtilis ATCC 6623 (group 2), challenged by Escherichia coli ATCC 11229 (group 3), and challenged by Beauveria bassiana 88 strain (group 4). In each worm was inoculated a known concentration of microorganism, and after the established time, the hemolymph was collected. The low molecular weight proteins were obtained submitting each hemolymph sample to an extraction solution containing Methanol, Acetic Acid and Water. After that, the protein extracts were concentrated in columns and protein dosage was realized in 280 nm. About 500 μg of proteins were submitted to two-dimensional electrophoresis (2-DE). The spots were excised from gels, digested with Tripsin and submitted to MALDI-ToF/ToF type mass spectrometry. The identification of protein orthologs was realized using the obtained data against the data available on the MASCOT online server (Matrix science), with the database (NCBI and Swiss rot) specified for Drosophila melanogaster and an internal database of Lepidoptera. The TagIdent tool was utilized for searching proteins through their molecular weight and isoelectric point. It was possible to identify eighteen proteins, of which twelve demonstrated to be involved with immune response in D. saccharalis. The six hours septic challenge with B. subtilis was responsible for modification of expression of Peptidoglycan recognition protein (PGRP), for increase of expression of Chitin-binding protein and for induction of expression of proteins like the Attacin-A and the Serine-protease inhibitor-like. The six hours septic challenge with E. coli increased the expression of a putative defense protein. The twelve hours septic challenge using B. subtilis and E. coli were responsible for increase of expression of Lysozyme. The six hours septic challenge with B. bassiana induced of expression of a Cecropin A2 and a Drosomycin-like. On the order hand, after twelve hours of fungal challenge, there was the induction of expression of multifunctional protein Apolipophorin-3. It was concluded that the septic challenge with different microorganisms were capable of change the expression of some proteins involved in the immune response in D. saccharalis, significant for understanding this process as well as for pointing the substances with antimicrobial functions. / A Diatraea saccharalis é a praga responsável por grandes perdas econômicas à cultura da cana-de-açúcar. Assim como outros integrantes da ordem Lepidoptera, a D. saccharalis possui resposta imunológica inata rápida e eficiente, constituída por barreira primária de defesa, resposta imune celular e resposta imune humoral. Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) são parte da resposta imune humoral que apresentam características catiônicas e anfifílicas, além de sua massa molecular baixa, o que os tornam potenciais agentes terapêuticos. Neste estudo foram analisadas proteínas com baixa massa molecular, diferencialmente expressas na hemolinfa da D. saccharalis, após os intervalos de 6 e 12 horas de indução da resposta imune humoral com diferentes microrganismos em comparação às lagartas não desafiadas (controle). As lagartas em 5º instar foram divididas em grupos (n= 50) e submetidas a desafios sépticos de 6 e 12 horas: controle (grupo 1), desafiadas por Bacillus subtilis ATCC 6623 (grupo 2), desafiadas por Escherichia coli ATCC 11229 (grupo 3) e desafiadas por Beauveria bassiana cepa 88 (grupo 4). Em cada lagarta foi inoculada uma concentração conhecida do microrganismo e, após o tempo estabelecido, a hemolinfa foi coletada. As proteínas de baixa massa molecular foram obtidas submetendo cada amostra de hemolinfa a uma solução de extração contendo Metanol, Ácido Acético e Água. Posteriormente, os extratos proteicos foram concentrados em colunas e a dosagem proteica realizada em 280 nm. Aproximadamente 500 μg de proteínas foram submetidas à eletroforese bidimensional (2-DE). Os spots foram retirados dos géis, digeridos com Tripsina, e submetidos à espectrometria de massas do tipo MALDI-ToF/ToF. A identificação das proteínas ortólogas foi realizada utilizando os dados obtidos contra os dados disponíveis no servidor online MASCOT (Matrixscience), especificando a base de dados (NCBI e Swissprot) para Drosophila melanogaster e um banco interno de Lepidoptera. A ferramenta TagIdent foi utilizada para a busca de proteínas por meio de suas massas moleculares e ponto isoelétrico. Foram identificadas dezoito proteínas, das quais doze se mostraram envolvidas com a resposta imune em D. saccharalis. O desafio séptico de 6 horas com B. subtilis foi responsável pela alteração na expressão da proteína de reconhecimento de peptideoglicano (PGRP), pelo aumento da expressão da proteína ligadora de quitina e pela indução da expressão de proteínas como a Atacina-A e a proteína inibidora de serino-protease. O desafio imunológico de 6 horas com E. coli levou ao aumento da expressão de uma provável proteína de defesa. Os desafios de 12 horas utilizando as bactérias B. subtilis e E. coli se mostraram responsáveis pelo aumento da expressão da Lisozima. O desafio de 6 horas com B. bassiana causou indução da expressão de uma Cecropina A2 e uma possível Drosomicina. Por sua vez, após o desafio fúngico de 12 horas, houve a indução da expressão da proteína multifuncional Apolipoforina-3. Concluiu-se que desafios sépticos com diferentes microrganismos foram capazes de alterar a expressão de algumas proteínas envolvidas na resposta imune em D. saccharalis, importantes para o entendimento deste processo e também para o apontamento de substâncias com funções antimicrobianas.

O desenvolvimento de uma resposta imune adequada é um processo extremamente importante para a manutenção da homeostase do organismo. Uma série de processos são desencadeados a partir do primeiro contato com micro-organismos patógenos até a efetivação da resposta imune de memória. Todos esses processos envolvem a participação e a complexa atuação de mediadores como as citocinas inflamatórias e também citocinas regulatórias, que exercerão efeitos controlando o processo inflamatório. Diversos mecanismos moleculares, subjacentes à resposta inflamatória, ainda não estão totalmente compreendidos, como por exemplo o controle da expressão de genes inflamatórios exercido pela IL-10. Os processos envolvidos na resposta inflamatória são mantidos às custas do consumo de nutrientes, dentre eles podemos destacar o aminoácido glutamina, que atua em nível molecular, fornecendo nitrogênio para a formação do material genético e fonte energética para determinadas células do sistema imunológico como os macrófagos. Portanto, neste trabalho, investigamos os efeitos da IL-10 na modificação de nucleossomos, evidenciando o papel dessa citocina em regular a expressão de genes inflamatórios em macrófagos. Avaliamos também a função da glutamina, modulando a expressão de RNAm de citocinas inflamatórias e regulatórias dessas células. E por último, desenvolvemos um modelo de restrição alimentar em camundongos, nos quais avaliamos os efeitos desse modelo considerando-se alguns aspectos hematológicos e estudamos as alterações na resposta inflamatória em células esplênicas e do peritônio, bem como avaliamos a suplementação de glutamina in vitro na produção das citocinas (IL-12, TNF-alfa, IL-10) e a expressão do fator de transcrição NFkB. Os resultados compilados mostraram que a IL-10 leva a uma rápida redução da acetilação de nucleossomos, modulando a arquitetura da cromatina de genes inflamatórios como a IL-12. A glutamina modula a expressão de citocinas inflamatórias, regulando positivamente a expressão de IL-10 e Interferon beta. E a restrição alimentar induz a redução de citocinas proinflamatórias (IL-12 e TNF-α), influenciadas pelo aumento da produção de IL-10 e finalmente a suplementação com glutamina não interfere nesses parâmetros nas células peritoneiais e esplênicas do grupo submetido à restrição alimentar. Conclusão: a IL-10 modula a expressão gênica através da modificação de nucleossomos em macrófagos derivados da medula; a glutamina modula a expressão de IL-10 inibindo a resposta inflamatória, e a restrição alimentar modula alguns aspectos hematológicos e possui propriedades anti-inflamatórias. / The development of an appropriate immune response is an important process to the organism\'s homeostatic maintenance. A series of processes are triggered upon the very first contact with pathogens, up to the immunological memory establishment. These processes implicate in the participation of complex mediators, such as inflammatory and regulatory cytokines that will control the inflammatory process. Some mechanisms underlying the inflammatory response are not totally understood, the control of inflammatory genes exerted by IL-10 is an example. The processes involved in the inflammatory response are kept with nutrients expense, among these nutrients we can highlight the amino acid glutamine. It acts in a molecular level, supplying nitrogen to genetic material formation and as an energy supply for immune cells such as macrophages. Thus, we investigated the IL-10 effects on nucleosome modifications evidencing this cytokine role regulating inflammatory genes expression in macrophages. We also evaluated glutamine functions modulating inflammatory and regulatory cytokines mRNA expression on these cells. Ultimately, we developed a dietary restriction animal model where we evaluated it\'s effects on selected haematological aspects, analyzing the alteration in the inflammatory response of splenic and peritoneal cells. We also evaluated in vitro glutamine supplementation assessing cytokines production (IL-12, TNF-α, and IL-10) and the expression of NFkB transcription factor. The compiled results a expressive reduction in nucleosome acetylation modifying the chromatin architecture of inflammatory genes such as IL-12 and IL-6. Glutamine modulates inflammatory cytokines gene expression upregulating the expression of IL-10 and interferon beta. The dietary restriction reduces proinflammatory cytokines production (IL-12 and TNF-α), these results are influenced by the upregulated IL-10 production, glutamine supplementation have no effect on these parameters in the dietary restriction group. In conclusion, we can infer that IL-10 modulates gene expression trough nucleosome modification in bone marrow derived macrophages, glutamine has a potential effect on IL-10 expression, inhibiting the inflammatory response and dietary restriction modifies hematological parameters, presenting anti-inflammatory properties.

Os b-glucanos são formados por polissacarídeos estruturais da parede celular de leveduras (Saccharomyces cerevisiae), alguns cereais em grãos e fungos. Os b-glucanos apresentam a molécula de glicose ligada ao carbono nas posições b-1,3 e pode apresentar cadeias laterais com o resíduo de glicose ligado nas posições b-1,6. O b-glucano tem sua ação benéfica como antiinflamatório, antitumoral, hipocolesterolêmico e hipoglicêmico. A inocuidade do b-glucano solubilizado nesse trabalho foi demonstrada in vitro, em cultivo celular de fibroblastos de embriões de galinhas SPF, e confirmado in vivo após a injeção no músculo peitoral de frangos. O b-glucano é um modulador biológico devido sua capacidade de em aumentar a resposta imune inata, aumentando os mecanismos inespecíficos de defesa dos animais. O b-glucano solúvel na dose de 240 mg/ave, associado ao diluente da vacina de Marek, apresentou efeito imunomodulador na resposta imune humoral. Os níveis de IgG no plasma foram detectados pela técnica de ELISA, e a resposta imune celular foi avaliada pela detecção de IFNg-, IL-2 e IL-6 em frangos vacinados com vacina recombinante e viva contra doença de Gumboro. O b-glucano solúvel nesse experimento demonstrou ser um potente imunoadjuvante após aumentar a resposta imune humoral e celular para os antígenos da doença infecciosa da Bursa, quando associado em vacinas recombinantes e vivas. / The b-glucans are structural polysaccharides from yeast cell wall (Saccharomyces cerevisiae), some cereal grains and fungi. The b-glucans have a glucose molecule carbon linked in sites b-1,3 and they have side chains of glucose residue in sites b-1,6. The b-glucans have a helpful effect as anti-inflammatory, antitumoral, hypoglycemic and hypocholesterolemic activity .The safety of b-glucan water-soluble obtained in this work was demonstrated in vitro, using specific-pathogen-free (SPF) cell culture chicken embryo fibroblast and it was confirmed in vivo after injection in chicken pectoral muscle. The b-glucan is a biological modulator due to its ability to increase the innate immune response. The soluble b-glucan in 240 mg/bird dose, associated to Marek\'s disease vaccine diluents showed immunomodulatory effect in humoral immune response. The IgG plasma levels were detected by ELISA method, and the cellular immune response was evaluated by detection IFN-g, IL-2 and IL-6 in vaccinated chickens with recombinant and live vaccines against Gumboro\'s disease using Real-Time PCR technique. The soluble b-glucan used in this trial demonstrated a powerful immune-adjuvant effect enhancing the cellular and humoral immune response against Bursal disease, when associated to recombinant vaccine and live vaccines.

Durante a infecção por Trypanosoma cruzi, o sistema endócrino exerce importante influência no direcionamento da resposta imune do hospedeiro. A prolactina é um dos diversos hormônios envolvidos em uma série de complexas interações com o sistema imunológico, participando diretamente do processo de imunorregulação. As pesquisas relacionadas com a administração de hormônios em modelos experimentais infectados por T. cruzi visam comprovar a modulação dos mecanismos de defesa por estas substâncias e contribuem para a busca de novas terapias auxiliares e melhorias no tratamento convencional da Doença de Chagas. O objetivo deste trabalho foi elucidar o papel da prolactina na modulação do sistema imune durante a fase aguda da doença de Chagas experimental, através da administração desta substância em ratos Wistar jovens infectados com a cepa Y de T.cruzi. O envolvimento e o perfil de ativação das células de defesa durante a infecção aguda foram analisados, utilizando-se ensaios de linfoproliferação, apoptose de linfócitos e análise de marcadores celulares. Além disso, outros parâmetros imunológicos também foram avaliados, entre eles, citocinas intracelulares IFN-?, TNF-?, IL-4 e IL-10, quimiocina MCP-1 e óxido nítrico. Os animais submetidos ao tratamento com prolactina apresentaram redução significativa na parasitemia sanguínea, bem como diminuição na apoptose celular e elevados percentuais de células essenciais na resposta imune do hospedeiro frente ao parasita. Desta forma, os dados obtidos neste trabalho demonstram os efeitos estimulatórios da prolactina e corroboram a ideia da utilização de substâncias imunomoduladoras no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas, que possam promover o equilíbrio da resposta imune do hospedeiro frente à infecção, prevenindo os possíveis danos teciduais observados tanto na fase aguda como crônica da doença de Chagas. / During the course of infection by Trypanosoma cruzi, the host immune system is involved in distinct, complex interactions with the endocrine system, and prolactin (PRL) is one of several hormones involved in immunoregulation. Numerous studies have demonstrated that the modulation of the immune system with the administration of regulatory hormones in different experimental models infected with T. cruzi, are very important inciting the investigation of new therapies for Chagas\' disease. The role of PRL as a possible factor in the modulation of the immune response was the target of this study using as animal model young rats infected with the Y strain of T. cruzi, in the attempt to demonstrate the relationship between the neuroendocrine system and the immune response involved in the acute phase of the experimental Chagas\' disease. For this purpose, some immune parameters were analyzed: dosages of cytokines IFN-?, TNF-?, IL-4, IL-10 and chemokine MCP-1, phenotypic analysis of cell subsets by flow cytometry, production of nitric oxide, lymphoproliferation and apoptosis of splenocytes. Therapy with PRL caused a significant decrease in parasitemia during the acute phase. PRL also triggered an increase in the percentage of cells of the innate and adaptive immune response and decreased apoptosis. Thus, the data obtained in this study corroborate the idea of using substances such as PRL in the development of new therapeutic strategies that can modulate the inflammatory response, contributing to the balance of the host body against infection, preventing the possible tissue damage observed in both acute and chronic Chagas\' disease.

O presente estudo objetivou-se avaliar o perfil das citocinas como indicador prognóstico em diferentes protocolos de tratamento da mamite bovina. De um total de 130 vacas em lactação da raça holandesa foram selecionadas cinco vacas sem alteração ao exame do leite (C-), cinco vacas sem grumos no leite, mas com CMT positivo e 30 vacas com mamite clínica. Os animais com mamite clínica foram alocados em três grupos. O grupo G1 (n=10) recebeu tratamento com antibiótico sistêmico (enrofloxacina), enquanto o grupo G2 (n=10) recebeu somente antibiótico intramamário (sulfato de cefquinoma) e o grupo G3 (n=10) foi tratado com os dois princípios (enrofloxacina sistêmico e sulfato de cefquinoma intramamário). Os grupos controle foram formados respectivamente por animais negativos para as duas provas (C1; n=5), e negativos para a prova de fundo escuro e positivos para CMT (C2; n=5). Amostras de leite e sangue foram colhidas antes do tratamento (M0) e no segundo (M1), quinto (M2) e décimo segundo dia (M3) após o término do tratamento para serem submetidas a exame bacteriológico do leite, antibiograma do leite, dosagem de citocinas no leite e no sangue (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α INF-γ) e dosagem de imunoglobulinas no leite e no sangue (IgG1, IgG2, IgM e IgA). Foi verificada a normalidade da distribuição dos resultados, utilizando-se teste de Anderson-Darling. Para a avaliação das diferenças entre as médias dos resultados obtidos, foram realizados os testes de análise de variância ANOVA One-way (Unstacked) (para dados com distribuição normal) e Mann-Whitney (para dados que não apresentaram distribuição normal), sendo as análises consideradas significativas as que apresentaram P≤0,05. Todos os animais do G3 apresentaram cura clínica e 80% cura bacteriológica nos momentos subsequentes ao tratamento (M1a M3). Ao se avaliar a resposta imunológica desse grupo, notou-se primeiramente o aumento de IL-6 sérico no M1 acompanhado de IgG1 e IgG2, os quais juntamente com o aumento de IL-4 e TNF-α perpetuaram a inflamação até o M2, enquanto que na glândula mamária já se iniciava a resolução da inflamação com o aumento de IL-10. Por outro lado, os animais do grupo G2 apresentaram cura clínica e bacteriológica no M1, porém esta não se manteve. Imunologicamente, após o tratamento, o perfil predominante desse grupo foi o Th2 com aumento de IgG1 e IL-4. Ao final do experimento, alguns animais do grupo G2 voltaram a manifestar a doença clinicamente, e tal fato foi acompanhado da diminuição das concentrações de IL-4, IgG1 e de IL-6 no leite. Nos animais do grupo G1 houve cura clínica não absoluta e 40% de cura bacteriológica no M3. Imunologicamente, observou-se altos níveis de IL-6 e IL-8 no leite durante todo o período de tratamento e diminuição de IgG2 sérico no M3 correlacionado negativamente com a IgG2 láctea, caracterizando uma resposta local tardia. Os resultados permitem inferir que o acompanhamento por mais de duas semanas da dinâmica da resposta imunológica depende da eficiência do protocolo antimicrobiana para se estabelecer um prognóstico. Além disso, a definição precoce da resposta imune pode ser dificultada pelo mais intenso tratamento antimicrobiano observado nos animais do tratamento combinado (G3) sendo insuficiente para debelar precocemente a infecção quando usado um tratamento antimicrobiano ineficiente. / The present study aimed to evaluate the cytokine profile as a prognostic in different treatment of bovine mastitis indicator. A total of 130 lactating cows of Holstein cows five without change to the examination of milk (C -), five cows in milk without lumps , but with positive CMT and 30 cows with clinical mastitis were selected . Animals with clinical mastitis were divided into three groups. The G1 (n = 10) received treatment with systemic antibiotics (enrofloxacin), while the G2 (n = 10) received only antibiotic intramammary (Cefquinome sulfate) and G3 (n = 10) group was treated with the two principles (systemic enrofloxacin and intramammary cefquinome sulfate). Control groups were formed respectively by the two negative tests (C1, n = 5) animals, and negative for evidence of dark and positive background for CMT (C2, n = 5). Milk and blood samples were collected before treatment (M0) and second (M1) , fifth (M2) and the twelfth day (M3) after completion of treatment to undergo bacteriological examination of milk , milk antibiogram, dosage cytokines in milk and blood (IL-1 , IL-2 , IL-4 , IL-6 , IL-8 , IL-10 , TNF- α IFN- γ ) and serum immunoglobulin in milk and blood (IgG1 , IgG2 , IgM and IgA) . Normal distribution of the results was verified using the Anderson- Darling test. For the evaluation of differences between the means of the results obtained , tests of ANOVA One -way (unstacked) (for data with normal distribution) and Mann - Whitney test ( for data that were not normally distributed) were performed and the analyzes considered significant if P ≤ 0.05 showed that . All G3 animals showed clinical cure and bacteriological cure in 80 % subsequent to treatment time (M1a M3). In evaluating the immune response of this group was noted primarily increased serum IL-6 in M1 together with IgG1 and IgG2, which together with the increased IL -4 and TNF- α to perpetuate inflammation M2 while mammary gland that has already started the resolution of inflammation with increased IL-10. On the other hand, the G2 group showed clinical and bacteriological cure in M1, but this was not maintained. Immunologically, after treatment, the predominant profile of this group was to increase the Th2 IgG1 and IL-4. At the end of the experiment, some animals from G2 again manifesting the disease clinically, and this fact was accompanied by decreased concentrations of IL - 4 , IgG1 and IL - 6 in milk. In animals of G1 there was no absolute clinical cure and bacteriological cure 40 % of the M3. Immunologically , it was observed high levels of IL-6 and IL-8 in the milk during the treatment period and a decrease in serum IgG2 M3 negatively correlated with milk IgG2 , featuring a late local response . The results may imply that monitoring for more than two weeks of the dynamics of the immune response depends on the efficiency of the antimicrobial protocol to establish a prognosis. In addition, the early definition of the immune response may be complicated by better antimicrobial treatment of animals observed in combined treatment (G3) being insufficient to overcome the infection early inefficient when used antimicrobials.

Orientador: Vitor Baranauskas / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-20T09:27:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_AdrieldosSantos_M.pdf: 1300108 bytes, checksum: bcd1099ef486cc4a2842627fe2b4df57 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A administração "in vivo" de nanotubos de carbono "multi-walled" (MWCNT's), mesmo sem serem funcionalizados, estimula o aparecimento de uma reposta imune em camundongos normais. Nesse trabalho nós fornecemos evidências de que essas nanopartículas de carbono também estimulam a resposta imune em camundongos portadores de tumor. Os MWCNT's (100 ?g) diluídos em PBS contendo 0,1 % de Pluronic 127 foram inoculados sistemicamente em camundongos portando tumores cujos tamanhos atingiram 5 milímetros (mm) e a resposta imune foi avaliada nos linfonodos desses animais. Observamos que os tumores de animais que receberam as nanopartículas não cresceram como os tumores dos animais não tratados. A discreta inibição do crescimento do carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) foi acompanhada pela ativação de linfócitos T CD8+ tanto em número quanto em função. A ativação da função citotóxica dos linfócitos T CD8+ pode ser explicada pelo aumento da expressão de citocinas pertencentes à família da IL-12, principalmente IL-27, que é descrita como a citocina envolvida na estimulação da citotoxicidade de linfócitos T CD8+. Nossos dados demonstraram que nanotubos de carbono "multi-walled", mesmo sem funcionalização estimula resposta imunológica antitumoral / Abstract: The "in vivo" administration of multi walled carbon nanotubes (MWCNT's) even without functionalization stimulates the immune response of naïve mice. Here we provide evidence that these carbon nanoparticles also stimulated the immune response of tumor-bearing mice. The MWCNT's (100 ?g) diluted in PBS with 0,1% of Pluronic 127 were inoculated systemically in mice with tumor that reached 5 mm and the immune response was evaluated in the lymph nodes. We observed that the tumors that received the nanoparticles did not grow as the untreated tumor. The discrete inhibition of the growth of the Lewis Lung Carcinoma (3LL) was accompanied by activation of CD8 T lymphocytes both in number and in function. The activation of the cytotoxic function of CD8 T lymphocytes may be explained by the increase of expression of cytokines belongs to the IL-12 family, mainly the IL-27, which is described as a cytokines involved in the stimulation of CD8 T lymphocytes cytotoxic function. Our data demonstrated that MWCNT even without functionalization stimulated the antitumor immune response / Mestrado / Eletrônica, Microeletrônica e Optoeletrônica / Mestre em Engenharia Elétrica

A malária continua sendo um dos maiores problemas de saúde pública no mundo e apesar dos muitos esforços no combate a doença, as estratégias disponíveis hoje ainda não foram capazes de controlar com eficiência sua disseminação global. Por isso o desenvolvimento de uma vacina é de extrema importância. Devido a complexidade do ciclo do parasita, consideramos que uma formulação vacinal eficaz para a indução de resposta imune protetora contra o P. vivax deverá conter regiões de antígenos de vários estágios do parasita. Dentre os vários antígenos da fase sanguínea do plasmódio identificados, o Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA1), a porção C-terminal da Proteína 1 de Superfície do Merozoíto (MSP119) e as proteínas da família MSP3 têm se mostrado promissores. Portanto, o objetivo deste estudo foi caracterizar a resposta imune celular induzida em camundongos pela imunização experimental com antígenos de P. vivax candidatos a vacina, tendo como foco principal a combinação das proteínas AMA1, MSP119 e MSP3β. Inicialmente, as imunizações experimentais com a combinação dos 3 antígenos foram realizadas na presença de Adjuvante Incompleto de Freund (AIF) em camundongos C57BL/6. Os camundongos imunizados não apresentaram respostas significativas com proliferação e secreção de IFN-γ por linfócitos T CD4+ e CD8+ após estimulação in vitro com as proteínas recombinantes ou peptídeos sintéticos baseados na proteína AMA1. Por outro lado, o adjuvante Poly (I:C) mostrou-se mais eficiente na indução de resposta proliferativa por linfócitos T CD4+, quando testado com a proteína MSP119-PADRE. Assim, selecionamos este adjuvante para dar continuidade às imunizações experimentais com a combinação de antígenos. Por ELISPOT, foi possível demonstrar que a co-administração dos 3 antígenos foi capaz de estimular células produtoras de IFN-γ em resposta à todos os antígenos testados. Também foi nosso objetivo avaliar a produção de IFN-γ após imunização de linhagens distintas de camundongos com uma proteína quimérica recentemente produzida em nosso laboratório (AMA1-MSP119). Em C57BL/6, a produção de IFN-γ foi significativamente maior no grupo imunizado com a proteína de fusão, quando comparado com o grupo que recebeu a co-adminstração dos dois antígenos, mostrando que a utilização de proteínas fusionadas pode solucionar possíveis problemas de competição antigênica. Em conjunto, nossos dados demonstram que a utilização de múltiplos antígenos fusionados, ou co-administrados, pode ser uma estratégia promissora de vacinação contra a malária. / Malaria remains as a major public health problem worldwide. In spite of the efforts for prevention, the strategies available today have not succeeded to control its global distribution. Therefore, the development of a vaccine is extremely important. Due to the complexity of the parasite cycle, we consider that an effective vaccine formulation to induce protective immune response against P. vivax should contain regions of antigens from several stages of the parasite. Among the different blood stage antigens of Plasmodium identified, the Apical Membrane Antigen 1 (AMA1), the C-terminal portion of the Merozoite Surface Protein 1 (MSP119) and MSP3 family proteins have shown promising results. Therefore, the aim of this study was to characterize the cellular immune response induced in mice by experimental immunization with antigens from P. vivax vaccine candidates, focusing mainly on the combination of proteins AMA1, MSP119 and MSP3β. Initially, the experimental immunizations with the combination of the three antigens were performed in the presence of Incomplete Freund\'s Adjuvant (IFA) in C57BL/6 mice. Immunized mice displayed no significant proliferative responses and secretion of IFN-γ by CD4+ and CD8+ T lymphocytes after in vitro stimulation with recombinant proteins or synthetic peptides based on the AMA1 protein. In contrast, Poly (I:C) adjuvant was more efficient inducing CD4+ T lymphocytes proliferative response to the MSP119-PADRE protein. Thus, we selected this adjuvant to continue the experimental immunizations with the different antigen combinations. The ELISPOT results demonstrated that co-administration of the 3 antigens stimulated IFN-γ producing cells in response to all antigens tested. We also assessed the production of IFN-γ after immunization of distinct mouse strains with a chimeric protein produced recently in our laboratory (AMA1-MSP119). In C57BL/6, IFN-γ production was significantly higher when we used spleen cells from mice immunized with the fusion protein, when compared with cells from mice that received the co-administration of two antigens, showing that the use of fused proteins can solve possible antigenic competition problems. Together, our data demonstrate that the use of multiple fused or co-administered antigens may be a promising strategy for malaria vaccination.

Camundongos da linhagem BALB/ c foram infectados com 5x106 leveduras de S. schenckii e acompanhados durante vinte e oito dias de infecção. Através da contagem do número de UFC nos baços fígados verificou-se que a carga fúngica nos órgãos dos animais diminui drasticamente na segunda semana de infecção. O teste ELISA revelou que nos órgãos destes animais a citocina IL-10 produzida em níveis mais elevados durante toda a infecção, assim modulando o controle da infecção. O padrão de proteínas secretadas pelas células leveduriformes de S. schenckii quando cultivadas em meio de cultura líquido e visualizado através de SDS-PAGE, apresentou bandas com pesos moleculares entre 97kDa e 20,1 kDa. Uma banda de 70 kDa foi reconhecida pelos soros dos animais infectados somente após a segunda semana de infecção e persistiu até o final desta. Os níveis de Ig total produzidos contra o antígeno solúvel e a proteína de 70 kDa aumentaram na segunda semana infecção e os títulos mantiveram-se durante a infecção. A isotipagem dos anticorpos revelou a predominância dos isotipos IgG1 e IgG3 para os dois antígenos testados. Notou-se que o aumento dos níveis de Ig contra o exoantígeno e a proteína imunorreativa de 70kDa, assim como o reconhecimento desta proteína, ocorreu inversamente proporcional à diminuição da carga fúngica nos órgão dos animais infectados. As proteínas secretadas pelas leveduras de S. schenckii, principalmente a proteína de 70 kDa, são capazes de ativar uma resposta humoral e conseqüente produção de altos níveis anticorpos e inibir a fagocitose do fungo pelos macrófagos. Desta maneira, estes antígenos modulam a resposta imune na esporotricose e contribuem para a patogenicidade do fungo. / BALB/c mice had been infected with 5xl06 yeasts of S. schenckii and followed during twenty and eight days of infection. Through the counting of the number of UFC in the livers and spleens it was verified that the fungaI load in the organs of the animais decreased drastically in the second week of infection. The ELISA test disclosed that in the organs of these animaIs the cytokine IL-10 was produced in leveIs more raised during alI the infection, thus modulating the control of the infection. The protein standard secreted for the yeasts of S. schenckii when cultivated in liquid medium and visualized through SDS-PAGE, it presented bands with molecular weights between 97 and 20,1 kDa. A band of 70 kDa was recognized for the sera of the infected animals after the second week of infection and persisted until the end of this. The leveIs of total Ig produced against the exoantigen and the protein of 70 kDa had increased in the second week of infection and the titers had been remained during the infection. The isotyping of the antibodies disclosed the predominance of the IgG1 and IgG3 for two tested antigens. One noticed that the increase of the leveIs of Ig against antigens and the recognition of the protein of 70 kDa occurred parallel with the reduction of the fungal load in the organs of the infected animals. The proteins secreted by the yeasts of S. schenckii, mainly the protein of 70 kDa, they are capable to activate a humoral response and consequent production high leveIs of antibodies and to inhibit phagocytosis of the fungi for the macrophages. In this way, these antigens modulate the immune response in sporotricosis and contribute for the pathogenic potential of fungi.

Orientador: Ricardo de Lima Zollner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T22:53:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brito_RhubiaBethaniaSocorroLemosde_M.pdf: 1643193 bytes, checksum: 3883ffa4fdb888928db0d59dc9e0a674 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A imunoterapia é a estratégia empregada no tratamento das doenças alérgicas que, quando bem indicada, é considerada eficaz com redução dos sintomas. Apesar disso, uma das desvantagens é a possibilidade de surgirem reações sistêmicas adversas durante o tratamento. Dentro do contexto de inovação tecnológica, o surgimento da nanotecnologia oferece a perspectiva de novas formas de elaboração de vacinas e imunoterápicos, com estruturas com propriedades de encapsulação da droga/alérgeno permitindo a construção de sistemas de liberação controlada. Dentre os diversos sistemas em estudo, as microesferas de PLGA apresentam-se como promissores, uma vez que têm a propriedade de, juntamente com o antígeno/alérgeno, modular a resposta imune por meio das células apresentadoras de antígenos que os fagocitam, propiciando apresentação antigênica lenta e gradual. Com objetivo de estudarmos a resposta imune de camundongos BALB/c previamente sensibilizados com ovalbumina (OVA, antígeno Th2), injetamos dose única de microesferas de PLGA encapsuladas com OVA e microesferas vazias como controle. Os animais eram sacrificados 30, 60, 90 e 120 dias pós-injeção das microesferas. Após os 120 dias de observação, nossos resultados sugerem que as microesferas encapsuladas com OVA, promovem modulação de resposta com perfil misto Th2/Th1, com elevação predominante da citocina IFN-? e tendência de elevação de IL-12. Além disso, pode-se observar diminuição significativa dos níveis séricos da subclasse IgG1 representativa da resposta Th2, embora a IgE permaneça inalterada / Abstract: The immunotherapy is a strategy used in the treatment of allergic diseases when properly indicated is considered efficient with reduction of the symptoms. In spite of that, one of its disadvantages is the possibility to adverse systemic reactions appear during the treatment. In the context of technological innovation, the sprouting of the nanotechnology offers the perspective of new forms of immunotherapies using structures with properties of encapsulation allergen/drug allowing the construction of controlled delivery systems. Amongst the different systems in study, the PLGA microspheres seem to be promising. Microspheres with the encapsulated allergen/antigen, modulate the immune response through the antigens presenters cells that phagocyte them, propitiating slow and gradual antigenic presentation. Aiming to study the immune response of BALB/c mice previously sensitized with ovalbumin (OVA, Th2 antigen), we inject single dose of PLGA microspheres encapsulated with OVA and empty microspheres as control. The animals were sacrificed 30, 60, 90 and 120 days after-injection of the microspheres (ME-PLGA). Followed the 120 days of observation, our results suggest that microspheres encapsulated with OVA promote modulation of immune response with mixing profile Th2/Th1, however with statistical significant increase of cytokines IFN-_?and tendency of IL-12 increase. Moreover, it can be observed statistical significant reduction of the serum levels of IgG1 subclass representative of the Th2 profile, although the IgE remains unchanged. / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica