Els resultats que es presenten en aquesta memòria aporten informació que ens permet donar un pas més en el coneixement de la regulació transcripcional del gen pfkfb3 i conseqüentment de la via glucolítica.En primer lloc, hem localitzat els elements de resposta de HIF-1 al promotor del gen i hem observat que aquests eren essencials per a la resposta a la hipòxia en cèl·lules de glioblastoma humà (T98G) i en fibroblasts embrionaris de ratolí (mEF). Seguidament, hem corroborat la implicació de la progesterona en la regulació del gen pfkfb3, que inicialment havien descrit Hamilton i col·laboradors {Hamilton, 1997 #93}. Hem posat de manifest l'augment d'expressió d'uPFK-2 i del seu mRNA en cèl·lules de càncer de mama (T47D) incubades amb la hormona. A més a més, hem determinat que aquest increment era degut a l'acció dels receptors de progesterona (PR, progesterone receptors). Hem localitzat una possible seqüència consens per aquests receptors (PRE, progesterone response element) al promotor del gen pfkfb3, però encara no hem pogut demostrar si el paper que exerceix la progesterona en la regulació d'aquest gen és a nivell transcripcional o a nivell d'estabilització del seu mRNA. Per comprovar els resultats obtinguts en cèl·lules aïllades, hem estudiat la regulació del gen pfkfb3 in vivo, utilitzant com a model d'experimentació animal la soca de ratolins C57/BL6. Els hem tractat amb STZ i hem observat l'increment d'expressió del mRNA del gen pfkfb3, d'uPFK-2, i de la concentració de Fru-2,6-P2 en el fetge d'animals diabètics. Paral·lelament, hem realitzat l'estudi de la regulació transcripcional del promotor del gen pfkfb3, in vivo, utilitzant la tècnica de transferència gènica per hidrodinàmia. Els resultats obtinguts demostren l'augment de la transcripció del gen en el fetge dels ratolins diabètics en condicions de dejuni. A més, hem realitzat estudis immunohistoquímics dels fetges diabètics i controls, demostrant que l'expressió del gen pfkfb3 es produeix principalment en els hepatòcits proliferants de la zona perivenosa del fetge dels ratolins diabètics. També hem estudiat les vies de senyalització que porten a l'augment d'expressió del gen pfkfb3, demostrant que la via PI3K/Akt/mTOR (activa en aquestes cèl·lules altament proliferants) hi té un paper essencial. Aquests resultats obtinguts sobre la regulació del gen pfkfb3, juntament amb els que ja s'havien descrit {Hamilton, 1997 #93}; {Chesney, 1999 #96}; {Atsumi, 2002 #110}; {Riera, 2002 #113}; {Minchenko, 2002 #144}; {Riera, 2003 #114}; {Bando, 2005 #102}; {Telang, 2006 #106}, ens confirmen la importància que té el fenotip glucolític en les cèl·lules proliferants o tumorals. El gen pfkfb3 controla la síntesi de la Fru-2,6-P2 que, com s'ha explicat a la introducció, és l'activador al·lostèric més potent de l'enzim PFK-1. Per tant, podem considerar que el gen pfkfb3 és clau per a la regulació de la via glucolítica, de manera que el seu augment d'expressió en diferents tipus de cèl·lules proliferants i tumorals condueix a l'activació d'aquesta via i, conseqüentment, afavoreix el canvi cap a un fenotip glucolític.

[EN] The four highly related family genes NGATHA (NGA), which encode transcription factors with a B3 DNA-binding domain, are functionally redundant in the development of the style and stigma in a dose-dependent manner. While the single mutants in the NGA genes only show very subtle or no defects in carpel morphology, the multiple mutants exhibit greater defects in the development of the apical part of the gynoecium, which is completely altered in the quadruple mutant. This phenotype is related with the lack of activation, in the apical part of the gynoecium, of the YUCCA genes, which encode enzymes involved in auxin synthesis. The phenotype of the nga mutants is very similar to the mutants in the SHORT INTERNODES/STYLISH (SHI/STY) genes, and it has been shown that NGA and STY work together to promote style specification, directing the YUC-mediated auxin synthesis in the apical part of the gynoecium (Trigueros et al., 2009). In addition, the phenotypes of the nga mutants and of the plants over-expressing NGA, resemble those observed in genotypes with altered expression of genes with relevant functions in gynoecium morphogenesis. Thus, it can be inferred that the NGA genes have a key role in gynoecium morphogenesis, though their genetic interaction with the network of genes controlling this process is still unclear; therefore, in this thesis we have carried out a detailed genetic analysis to determine the position and role of NGA genes in this network. With this aim, our first approach has been to identify and characterize regulators of the expression of NGA genes. As the four NGA genes show almost identical expression patterns, it seemed likely that they shared common regulators. For that reason, we made a bioinformatic analysis of the promoter regions of the NGA genes looking for conserved regions. In this analysis we identified two conserved regions and we have used these conserved domains to carry out yeast one-hybrid screenings of Arabidopsis cDNA libraries. These screenings led to the identification of a transcription factor from the SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL) family and three from the TEOSINTE BRANCHED1, CYCLOIDEA, AND PROLIFERATING CELL FACTORS (TCP) family as candidates to regulate NGA expression. After the identification of these candidates, different molecular analysis have been carried out to confirm the binding of these transcription factors to the promoters of the NGA genes. To validate their genetic interaction we have also characterized mutants and over-expression lines of these candidates, as well as genetic combinations of these mutants with reporter and loss- and gain-of-function lines of the NGA genes. In addition, in this thesis we were interested in analyzing in detail the genetic interactions of NGA genes with other genes with a key role in the development of the gynoecium apical tissues. We had observed that over-expression lines of HEC1, HEC3 and NGA3, showed similar phenotypes in the fruit: reduced ovaries and enlarged apical regions and gynophores, similar phenotypes to those of mutants affected in auxin signaling. For that reason, a great part of our analysis has been focused to elucidate the regulatory hierarchy between both factors NGA and HEC. To study this we have carried out genetic analysis combining reporter lines of these genes with mutants in NGA or HEC or with their over-expression lines. We have also carried out several molecular assays which had allowed us to conclude that both factors act at the same level, forming part of a transcriptional complex with cooperative activity. Finally, though similar genetic and molecular analysis in which other genes of the bHLH transcription factor family have been included, we have inferred the participation of the NGA proteins in a high-order complex, possibly composed by NGA, HEC and the IND and SPT proteins, which would be required for correct auxin signaling during gynoecium morphogenesis and stigma development in Arabidopsis thaliana. / [ES] La familia de los genes NGATHA (NGA) está formada por cuatro genes que codifican factores de transcripción de tipo B3 (Álvarez et al., 2006). Los genes NGA son funcionalmente redundantes en el desarrollo del estilo y el estigma de una manera dosis-dependiente, mientras que los mutantes individuales no presentan defectos en la morfología del carpelo, los mutantes múltiples presentan defectos cada vez mayores en el desarrollo de la parte apical del gineceo que está completamente alterada en el cuádruple mutante. Este fenotipo mutante está relacionado con la falta de activación en el dominio apical del gineceo de los genes YUCCA (YUC), que codifican enzimas de la ruta de biosíntesis de auxinas. Los fenotipos mutantes de NGA son muy similares a los causados por las mutaciones en la familia SHORT INTERNODES/STYLISH (SHI/STY) y se ha mostrado que NGA y STY promueven la especificación del estilo, dirigiendo la síntesis de auxinas mediada por YUC en el dominio apical del gineceo (Trigueros et al, 2009). Por otro lado, los fenotipos de los mutantes y de las líneas de sobreexpresión de NGA recuerdan a los fenotipos observados en fondos donde la expresión de otros genes con funciones relevantes en la morfogénesis del gineceo está alterada. Así, es posible inferir que los genes NGA tienen un papel clave en este proceso, aunque su relación genética con otros factores importantes en el mismo no está clara, por lo que en la presente tesis hemos pretendido realizar un análisis genético detallado para determinar su posición y papel en estas rutas. La primera aproximación que hemos abordado ha sido determinar posibles reguladores de estos genes. Como los genes NGA muestran patrones de expresión similares parecía probable que tuvieran reguladores comunes, por lo que mediante un análisis informático de los promotores de los genes NGA identificamos dos regiones conservadas en todos los promotores y hemos utilizado estos dominios conservados para llevar a cabo ensayos de híbrido simple en levadura identificando como posibles reguladores a un factor de la familia de los SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE (SPL), y a tres miembros de la familia TEOSINTE BRANCHED1, CYCLOIDEA, AND PROLIFERATING CELL FACTORS (TCP). Tras la identificación de los reguladores candidatos, se han llevado a cabo análisis moleculares para confirmar la unión de estos a los promotores de los genes NGA. Y hemos caracterizado los mutantes y las líneas de sobreexpresión de estos posibles reguladores, así como las combinaciones genéticas de los mutantes correspondientes con las líneas reportadoras de NGA y con mutantes de pérdida y ganancia de función NGA para validar su interacción genética. Además en esta tesis doctoral nos interesaba profundizar en el análisis de las interacciones genéticas de NGA y otros factores clave en la morfogénesis de los tejidos apicales del gineceo. Habíamos observado que las líneas de sobreexpresión de HECATE1 (HEC1), HEC3 y NGA3 presentaban fenotipos similares en el fruto: ovarios reducidos, regiones apicales aumentadas y ginóforos largos, fenotipos similares a los de mutantes afectados en la señalización de auxinas. Para investigar la posible relación funcional entre NGA y HEC hemos llevado a cabo análisis genéticos combinando las líneas reportadoras de estos genes con los mutantes nga o hec, o con las líneas de sobreexpresión; y hemos realizado diferentes ensayos moleculares, mediante los cuales hemos comprobado que ambos factores actúan al mismo nivel formando parte de un complejo transcripcional con actividad cooperativa. Finalmente, mediante análisis genéticos y moleculares similares en los que hemos incluido otros genes de la familia bHLH, hemos deducido la necesaria participación de las proteínas NGA en un complejo de mayor orden formado por NGA, HEC y también los factores IND y SPT, que sería necesario para la correcta señalización de auxinas durante la morfogénesis del gine / [CAT] Els quatre gens NGATHA (NGA), que codifiquen factors de transcripció de tipus B3 (Álvarez et al., 2006), són funcionalment redundants en el desenvolupament de l'estil i l'estigma d'una manera dosi-depenent, mentre que els mutants individuals no presenten defectes en la morfologia del carpel, els mutants múltiples presenten defectes cada vegada majors en el desenvolupament de la part apical del gineceu que està completament alterada en el quàdruple mutant. Aquest fenotip mutant està relacionat amb la falta d'activació en el domini apical del gineceu dels gens YUCCA (YUC), que codifiquen enzims de la ruta de biosíntesi de auxines. Els fenotips mutants de NGA són molt similars als causats per les mutacions en la família SHORT INTERNODES / STYLISH (SHI / STY) i s'ha mostrat que NGA i STY promouen l'especificació de l'estil, dirigint la síntesi d'auxines mediada per YUC al domini apical del gineceu (Trigueros et al, 2009). D'altra banda, els fenotips dels mutants i les línies de sobreexpressió de NGA recorden als fenotips observats en fons on l'expressió d'altres gens amb funcions rellevants en la morfogènesi del gineceu està alterada. Així, és possible inferir que els gens NGA tenen un paper clau en aquest procés, encara que la seua relació genètica amb altres factors importants en el mateix no està clara, pel que en la present tesi hem volgut realitzar una anàlisi genètica detallat per determinar la seva posició i paper en aquestes rutes. La primera aproximació que hem abordat ha sigut determinar possibles reguladors d'aquests gens. Com els gens NGA mostren patrons d'expressió similars semblava probable que tinguessin reguladors comuns, pel que mitjançant una anàlisi informàtic dels promotors dels gens NGA identificarem dos regions conservades en tots els promotors i hem utilitzat aquests dominis conservats per dur a terme escrutinis de híbrid simple en llevat identificant com a possibles reguladors a un factor de la família dels SQUAMOSA PROMOTOR BINDING PROTEIN-LIKE (SPL), i a tres membres de la família TEOSINTE BRANCHED1, CYCLOIDEA, AND PROLIFERATING CELL FACTORS (TCP). Després de la identificació dels reguladors candidats, s'han dut a terme anàlisis moleculars per confirmar la unió d'aquests als promotors dels gens NGA. I hem caracteritzat mutants i les línies de sobreexpressió d'aquests possibles reguladors, així com les combinacions genètiques dels mutants corresponents amb les línies reportadores de NGA i amb mutants de pèrdua i ganància de funció NGA per validar la seua interacció genètica. A més en aquesta tesi doctoral ens interessava aprofundir en l'anàlisi de les interaccions genètiques de NGA i altres factors clau en la morfogènesi dels teixits apicals del gineceu. Havíem observat que les línies de sobreexpressió de HECATE1 (HEC1), HEC3 i NGA3 presentaven fenotips similars en el fruit i que aquestos fenotips eren semblants als de mutants afectats en la senyalització de auxines. Per investigar la possible relació funcional entre NGA i HEC hem dut a terme anàlisis genètiques combinant les línies reportadoras d'aquests gens amb els mutants nga o hec, o amb les línies de sobreexpressió; i hem realitzat diferents assajos moleculars, mitjançant els quals hem comprovat que tots dos factors actuen al mateix nivell formant part d'un complex transcripcional amb activitat cooperativa. Finalment, mitjançant anàlisis genètiques i moleculars similars en què hem inclòs altres gens de la família bHLH, hem deduït la necessària participació de les proteïnes NGA en un complex de major ordre format per NGA, HEC i els factors IND i SPT, que seria necessari per a la correcta senyalització de auxines durant la morfogènesi del gineceu i la formació de l'estigma en Arabidopsis thaliana. / Ballester Fuentes, P. (2016). Los genes NGATHA: análisis genético y molecular de su papel en la morfogénesis del gineceo de Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/72867 / TESIS

CATALÀ:L'enzim carnitina palmitoïltransferasa1 (CPT1), localitzat a la membrana mitocondrial externa, constitueix el principal punt de control de l'entrada d'àcids grassos de cadena llarga (LCFA) al mitocondri i és clau en el manteniment d'àcids grassos circulants. Existeixen tres isotips descrits (CPT1A, CPT1B i CPT1C) que codifiquen per enzims amb diferents característiques cinètiques i patrons d'expressió.1.- Mecanismes de control transcripcional del gen CPT1B humà.El promotor humà de la CPT1B inclou un element de resposta a PPAR i un lloc d'unió a MEF-2. Hem investigat el paper d'aquests elements de resposta i la possible interacció entre PPARα i MEF2C en la regulació transcripcional d'aquest promotor. Dels resultats obtinguts podem concloure que la resposta del promotor a PPARα depèn: del context cel·lular, de l'element de resposta a MEF-2 i de la disposició espacial d'aquest respecte al PPRE. La combinació d'aquests elements cis en el promotor de la CPT1B indueix l'expressió màxima del gen en resposta a diferents senyals. La concurrència de senyals metabòlics i miogènics en aquest promotor genera una conformació transcripcional permissiva d'aquest promotor que porta a una activació sinèrgica del promotor en aquells teixits on es troben els corresponents factors de transcripció (MEF2C, PPARα/RXRα) i el substrat metabòlic de l'enzim, els àcids grassos que activen PPARα. En la mateixa una regió promotor una zona rica en GC capaç d'unir Sp1 ha resultat fonamental per l'expressió basal del gen i per la transactivació per PPARα però no per la de PPARδ. 2.- Relació estructura/funció de l'enzim CPT1 de porc.A nivell cinètic, les CPT1A mostren una alta afinitat per la carnitina i una baixa sensibilitat al malonil-CoA mentre que les CPT1B presenten característiques contràries. Una excepció a aquesta relació és la CPT1A de porc (PLCPT1) que es comporta com una quimera natural entre els isotips A i B, presentant afinitats pels substrats similars a les CPT1A i una IC50 pel malonil-CoA típica de les CPT1B. Utilitzant quimeres entre la CPT1A de rata i la CPT1A de porc hem demostrat que l'extrem C-terminal de les CPT1A es comporta com un únic domini que dicta la sensibilitat total a malonil-CoA de l'enzim. El grau de sensibilitat a l'inhibidor ve determinat per l'estructura adoptada per aquest domini. Utilitzant mutants delecionats hem mostrat que la sensibilitat a malonil-CoA també depèn de la interacció d'aquest únic domini carboxil amb els primers 18 aminoàcids de la proteïna. D'aquests resultats podem concloure que les CPt1A de rata i porc presenten diferent sensibilitats a malonil-CoA perquè els primers 18 aminoàcids dels enzims interaccionen diferent amb el domini C-terminal.Hem aïllat l'isotip muscular de la CPT1 de porc (PMCPT1), una proteïna de 772 aminoàcids molt similar a les CPT1B. Expressada en Pichia pastoris la CPt1B de porc ha resultat ser un enzim amb característiques cinètiques pròximes a les CPT1A. 3.- Efecte de C75 sobre el sistema CPT. Els enzims CPT1 i CPT2 són components del sistema llançadora CPT. Aquest sistema es troba finament regulat pels nivells de malonil-CoA, un inhibidor reversible de la CPT1. Per la seva capacitat d'inhibir la sintasa d'àcids grassos (FAS), el C75 és capaç d'incrementar els nivells intracel·lular de malonil-CoA intracel·lular. Paradoxalment també activa l'oxidació d'àcids grassos de cadena llarga. Per tal d'identificar la diana exacta del C75 en el sistema CPT vam analitzar l'activitat enzimàtica de CPT1A, CPT1B i CPT2 davant el tractament amb C75. Els resultats d'aquests experiments indiquen que el C75 actua sobre el sistema CPT activant CPT1A, CPT1B i CPT2 de manera independent de malonil-CoA. / The outer mitochondrial membrane enzyme carnitine palmitoyltransferase1 (CPTI) catalyzes the initial and regulatory step in the β-oxidation of long-chain fatty acids. There are three characterized isotypes: CPT1A, CPT1B and CPT1C. The human CPT1B promoter includes a functional PPAR responsive element and a myocite-specific site that binds MEF2C. We investigated the roles of these sites and the potential interaction between PPARα and MEF2C regulating this promoter. The combination of cis elements in the promoter of the CPT1B maximally induces the expression of this gene in response to a combination of signals. The concurrence of myogenic and metabolic signals generates a transcriptionally permissive conformation of the promoter that gives rise to a synergistic transcription of the gene in tissues containing the corresponding transcription factors and fatty acids that activate PPARα.Kinetic hallmarks of the CPT1A are high affinity for carnitine and low sensitivity to malonyl-CoA inhibition, while the opposite characteristics are intrinsic to the CPT1B isotype. Pig and rat CPT1A share common Km values for their substrates but differ in their sensitivity to malonyl-CoA inhibition. Using chimeras between rat CPT1A and pig CPT1A, we show that the C-terminal region behaves as a single domain, which dictates the overall malonyl-CoA sensitivity of this enzyme. Using deletion mutation analysis, we show that malonyl-CoA sensitivity also depends on the interaction of this single domain with the first 18 N-terminal amino acid residues. Pig and rat CPT1A have different malonyl-CoA sensitivity, because the first 18 N-terminal amino acids interact differently with the C-terminal domain. Pig CPT1B is a protein of 772 amino acids that shares extensive sequence identity with CPT1B. Expressed in Pichia pastoris, pig CPT1B shows kinetic characteristics similar to those of the CPT1A isotype. CPT1 and CPT2 enzymes are components of the CPT shuttle system. This system is tightly regulated by malonyl-CoA. Because of its ability to inhibit fatty acid synthase, C75 is able to increase malonyl-CoA intracellular levels. Paradoxically it also activates β-oxidation. To identify the exact target of C75 within the CPT system, we expressed CPT1 and CPT2 in Pichia pastoris. We show that C75 acts on recombinant CPT1A, CPT1B and CPT2.

Els peixos carnívors presenten baixa capacitat per metabolitzar carbohidrats i per mantenir la glucèmia. En aquests organismes, la baixa capacitat per metabolitzar carbohidrats condueix a estats d’hiperglicèmia més marcats i sostinguts que els descrits per a mamífers, després de l’administració de glucosa o la ingesta de dietes amb elevat contingut de carbohidrats. L’alanina aminotransferasa (ALT) catalitza la transaminació reversible entre L-alanina i α-cetoglutarat per formar L-glutamat i piruvat. Mitjançant la interconversió d’aquests quatre metabòlits, l’ALT esdevé un nexe d’unió entre el metabolisme d’aminoàcids i el de carbohidrats. En estudis previs del nostre grup es va descriure la presència de tres isoformes ALT en S. aurata, els isoenzims citosòlics, cALT1 i cALT2, i la isoforma mitocondrial mALT. L’expressió hepàtica de cALT2 incrementa en situacions gluconeogèniques, mentre que la de cALT1 és predominant durant el període postprandial per a l’utilització dels nutrients de la dieta. L’objectiu d’aquest treball és incrementar el coneixement del metabolisme intermediari en peixos i així permetre realitzar futures intervencions biotecnològiques amb la intenció de millorar la utilització metabòlica dels nutrients de la dieta. Per comprendre millor la funció d’mALT vam estudiar la distribució tissular, la caracterització cinètica i la regulació nutricional i hormonal de l’expressió d’mALT en S. aurata. Addicionalment, vam analitzar l’expressió tissular i la regulació hormonal dels enzims aspartat aminotransferasa mitocondrial (AST2), glutamat deshidrogenasa (GDH) i glutamina sintetasa (GlnS), relacionats tots ells amb el metabolisme d’aminoàcids. En orades alimentades, mALT, GDH i GlnS s’expressen majoritàriment a fetge, intestí i ronyó. Els nostres estudis indiquen que l’expressió de mALT, GDH, AST2 i GlnS és elevada en animals alimentats, mentre que disminueix en condicions associades amb la gluconegènesi, com ara el dejú i el tractament amb estreptozotocina (STZ). Estudis cinètics de l’activitat enzimàtica mALT indiquen que l’enzim catalitza de manera més eficient la conversió d’L-alanina a piruvat, que no pas la reacció inversa. Per conèixer el mecanisme molecular implicat en la regulació transcripcional de l’expressió d’mALT, vam aïllar el promotor mALT d’orada, i vam mostrar que HNF4α incrementa la transcipció d’mALT per unió a una caixa HRE. El dejú i l’administració d’STZ disminuïren els nivells d’HNF4α en ronyó d’S. aurata, portant a un descens en la transcripció d’mALT. Els nostres resultats suggereixen que HNF4α té un paper important en la regulació transcripcional del gen mALT en ronyó d’S. aurata. En conclusió, els nostres resultats suggereixen que mALT i cALT1, que presenten una distribució tissular i un patró d’expressió en dejú i tractament amb STZ similars, podrien cooperar per direccionar els aminoàcids de la dieta al mitocondri per destinar-los a l’obtenció d’energia. Per tant, ALT es podria utilitzar com a diana per realitzar una intervenció biotecnològica a fi de reduir la utilització de proteïnes amb finalitats energètiques i optimitzar així l’ús dels nutrients de la dieta en el cultiu de peixos. / Carnivorous fish have poor ability to use dietary carbohydrates and to control the blood glucose levels. Compared with mammals, these animals show prolonged hyperglycemia after a glucose load or when feeding on high carbohydrate diets. Alanine aminotransferase (ALT) links carbohydrate and amino acid metabolism through catalyzing the reversible transamination between L-alanine and 2-oxoglutarate to form pyruvate and L-glutamate. Our group, in previous studies showed the presence of three ALT isoforms in Sparus aurata: the cytosolic isoenzymes cALT1 and cALT2 and a mitochondrial isoform, mALT. In fish liver, increased expression of cALT2 is associated to enhanced gluconeogenesis while cALT1 is predominant during the postprandial utilization of dietary nutrients. The aim of the present study was to increase the current knowledge of fish intermediary metabolism to allow future biotechnological actions in order to improve metabolic utilization of dietary nutrients. To better understand the functional role of mALT we analysed the tissue distribution, kinetic characterization and nutritional and hormonal regulation of mALT expression in S. aurata. Furthermore, cloning and characterization of the mALT promoter was also addressed. Additionally, tissue expression and nutritional regulation of glutamate dehydrogenase (GDH), mitochondrial aspartate aminotransferase (AST2) and glutamine synthetase (GlnS), also involved in amino acid metabolism, was followed. In S. aurata under feeding conditions, mALT, GDH and GlnS are mainly expressed in liver, intestine and kidney. Our studies indicate that the expression of mALT, GDH, AST2 and GlnS is increased in fed animals, while decreased in conditions associated with gluconeogenesis, such as fasting or treatment with streptozotocin (STZ). Kinetic analysis of mALT enzyme activity indicated that this enzyme catalyses more efficiently the conversion of L-alanine to pyruvate than the reverse reaction. To understand the molecular mechanism underlying the transcriptional regulation of mALT expression, we isolated the S. aurata mALT promoter, and showed that HNF4α enhances mALT transcription through binding to an HRE box. Starvation and administration of STZ decreased HNF4α levels in the kidney of S. aurata, leading to downregulation of mALT transcription. Our results suggest that HNF4α may play an important role in the transcriptional regulation of mALT gene in kidney of S. aurata. In conclusion, our findings suggest that mALT and cALT1, which present a similar tissue distribution and pattern expression under starvation and STZ-treatment, can cooperate to redirect dietary amino acids to the mitochondria for energetic pourposes. This points to ALT as a target for a biotechnological action to spare protein and optimize the use of dietary nutrients for fish culture.

Hcm1, es un factor transcripcional de la familia de los forkhead en Saccharomyces cerevisiae. Los factores forkhead se encuentran evolutivamente conservados, desde levaduras hasta humanos. En mamíferos estos factores regulan diversos procesos, entre ellos el ciclo celular, la supervivencia y la proliferación en respuesta a factores de crecimiento. Además, los factores FoxM, FoxO y sus ortólogos, participan en procesos como el envejecimiento y en enfermedades como el cáncer. Los estudios sobre Hcm1 en S. cerevisiae, indican que este factor es un regulador de la formación del spindle pole y de la expresión del cluster de genes necesarios en la fase S del ciclo celular. En el presente trabajo se estudió la regulación de Hcm1 sobre nuevos procesos celulares. En primer lugar, se demostró que Hcm1 regula positivamente la masa mitocondrial, el número de copias de ADN en esta organela y su actividad metabólica. Además, induce la metabolización de la glucosa favoreciendo el proceso oxidativo sobre la fermentación. Este cambio metabólico inducido por Hcm1, viene acompañado por una mayor resistencia celular al estrés. Además, se demostró que Hcm1 responde al estrés oxidativo aumentando su localización nuclear y su actividad transcripcional. Esta misma respuesta se observó cuando las células eran sometidas a restricción de glucosa o nitrógeno. En esta dirección estudiamos los mecanismos regulatorios de estas respuestas y se determinó que Sir2, una histona deacetilasa NAD+-dependiente relacionada con el envejecimiento y el silenciamiento genético, interacciona con Hcm1 y regula la respuesta a estrés de Hcm1. Paralelamente, analizamos la implicación de las vías AMPK y TOR/Sch9 en la regulación de Hcm1. De esta manera, demostramos que ambas vías son reguladoras de la respuesta de Hcm1 a restricción nutricional, ya que experimentos in vitro indicaron que Snf1 y Sch9 fosforilan Hcm1. El análisis de la expresión génica en la cepa salvaje y en el mutante hcm1, en diferentes puntos de la curva de crecimiento del cultivo, indicó que genes que se inducen durante esta cinética, y que están relacionados con el estrés y el metabolismo, son regulados por este factor. Los resultados obtenidos en este trabajo, permiten concluir que, además de su implicación en el ciclo celular, Hcm1 es un factor clave en la adaptación temprana de las células a la restricción nutricional y en la posterior entrada en fase diáuxica, a través de la inducción de metabolismo oxidativo mitocondrial y la respuesta a estrés. / Hcm1 is a forkhead transcription factor in Saccharomyces cerevisae. The forkhead factors are evolutionary conserved from yeast to human. In mammals, these factors regulate different processes, among them, cell cycle, cell survival and cell proliferation in response to growth factors. Moreover, FoxO, FoxM and their orthologues have been related to the aging process and cancer. Studies on Hcm1 in S. cerevisae indicate that this factor is related to spindle pole dynamics and the regulation of the cluster of genes required during the S phase of the cell cycle. In this work we studied Hcm1 implication on novel cellular processes. First, we demonstrated that Hcm1 positively regulates mitochondrial mass, mtDNA copy and mitochondrial activity. In addition, Hcm1 favours oxidative metabolism of glucose over its fermentation. This metabolic shift, is accompanied by an increase in cellular stress resistance. In response to oxidative stress treatments, Hcm1 shifts to the nucleus and its transcriptional activity is activated. A similar Hcm1 response was observed when the cells were submitted to glucose or nitrogen restriction. Additionally, we analyzed the regulatory mechanisms behind these responses. We demonstrated that Sir2, a NAD+ dependent histone deacetylase involved in aging and genetic silencing, interacts with Hcm1 and regulates its response to oxidative stress. In parallel, we analyzed the role of AMPK and TOR/Sch9 pathways on Hcm1 regulation. In this context, we observed that both pathways regulate Hcm1 in response to nutrient restriction in vivo. Moreover, Snf1 and Sch9 phosphorylate Hcm1 in vitro. Gene expression analysis on wild type cells and in hcm1 mutant at different points along the growth curve, indicated that genes that are upregulated during this kinetic and are related to stress response and metabolism, are regulated by Hcm1. Taken together, our results indicate that Hcm1 not only regulates cell cycle dynamics, but is also a key factor in the early adaptation of the cells to nutrient deficiency and later, to the entry into the diauxic phase. This adaptation is mediated by Hcm1 induction of oxidative metabolism and stress response.

L’Splicing de les molècules d’ARN és el procés pel qual les seqüències interposades (“introns”) s’eliminen, i les seqüències restants es concatenen per a formar l’ARN madur. La investigació recent mostra que gairebé tots els gens amb splicing es veuen afectats per splicing alternatiu. Aquí, en primer lloc definim la longitud mínima d’un oligomer d’ARN per a funcionar com a lloc d’unió d’un factor d’splicing. A continuació, explorem la capacitat d’aquests oligomers per a predir estructures completes exó-intró. Destaquem els oligomers que són més informatius per a això, i demostrem que la mateixa precisió com en enfocaments anteriors es pot aconseguir amb menys oligomers. L’observació de que aquest enfocament és lluny de predir amb exactitud tota l’estructura exó-intró ens va portar a investigar els factors que juguen un paper en l’splicing co-transcripcional. Demostrem que els nucleosomes es col.loquen preferentment en els exons i plantegem la hipòtesi que juguen un paper en les decisions de l’splicing. A continuació, introduïm el “completed splicing index” i concluem que l’splicing co-transcripcional és molt generalitzat. A més, l’splicing co-transcripcional mostra vincles amb l’organització de la cromatina. A la llum d’aquests resultats, es van supervisar els canvis de la cromatina en exons diferencialment inclosos en dos teixits. Hem descobert una varietat de marques de les histones, però no totes, mostrant un comportament significativament diferent en els exons més inclosos i més exclosos. Las marques més destacades que apareixen són H3K9ac i dos estats de metilació de lisina 4. / Splicing of RNA molecules is the process, by which intervening sequences (“introns”) in the primary transcript are excised, and the remaining sequences (“exons”) are concatenated to form the mature RNA. Recent evidence shows that almost all spliced genes are affected by alternative splicing. Here, we define the minimal length of RNA oligomers that can sensibly be called splicing factor binding sites. Then, we explore the capacity of these oligomers to predict complete exon-intron structures. We highlight those oligomers that are most informative for this and show, that equal accuracy as in previous approaches can be achieved with less RNA oligomers. The observation, that this approach falls short of accurately predicting the entire exon-intron structure, led us to investigate determinants linked to co-transcriptional splicing. We show that nucleosomes are preferentially positioned on exons and hypothesize that they play a role in splicing decisions. We then introduce the “completed splicing index” and conclude that co-transcriptional splicing is very wide-spread in humans. Furthermore co-transcriptional splicing exhibits links to chromatin organization. In the light of these results, we go on to monitor chromatin changes on differentially included exons in pair-wise tissue comparisons. We find a variety of histone marks, but not all, showing significantly different behavior on up- and downregulated exons. The most prominently appearing marks are H3K9ac and two lysine 4 methylation states.

[ES] Los cilios son estructuras eucariotas complejas conservadas evolutivamente que, proyectando desde la superficie de las células, desempeñan un gran número de funciones biológicas. Los cilios se clasifican tradicionalmente en móviles o sensoriales y en su composición intervienen cientos de proteínas. Este conjunto de genes que codifican para los componentes ciliares se conoce como cilioma. Las mutaciones en el cilioma subyacen a un grupo cada vez mayor de enfermedades multisistémicas altamente pleiotrópicas denominadas globalmente como ciliopatías. Estas enfermedades se caracterizan, entre otros síntomas, por retraso mental, defectos sensoriales y/o trastornos metabólicos. A pesar de que se estima que 1 de cada 1.000 personas está afectada por estas enfermedades, las bases moleculares de las ciliopatías son todavía poco conocidas. El adecuado ensamblaje y funcionalidad del cilio requieren de la expresión estrechamente coordinada de los componentes del cilio; sin embargo, se sabe poco sobre la lógica reguladora que controla la transcripción del cilioma. La mayoría de los genes del cilioma son compartidos tanto por cilios móviles como sensoriales. Los factores de transcripción (FTs) de la familia RFX tienen un papel evolutivamente conservado en la regulación transcripcional del cilioma tanto móvil como sensorial. En los vertebrados, la transcripción del cilioma móvil también está regulada directamente por FoxJ1, un FT de la familia forkhead (FKH). Sin embargo, hasta la fecha, se desconocen los FTs que actúan junto a RFX en la transcripción del cilioma sensorial en cualquier organismo. En este trabajo, hemos identificado a FKH-8, un FT de la familia FKH, como selector terminal del cilioma sensorial de C. elegans. fkh-8 se expresa de forma consistente en las sesenta neuronas sensoriales ciliadas de C. elegans, se une a las regiones reguladoras de los genes del cilioma sensorial, también es necesario para la correcta expresión de los genes del cilioma y actúa de forma sinérgica con el conocido regulador maestro de la ciliogénesis DAF19/RFX. En consecuencia, los mutantes para fkh-8 muestran una amplia gama de defectos de comportamiento en una plétora de paradigmas sensoriales, incluyendo la olfacción, la gustación y la mecano-sensación. Así, hemos identificado, por primera vez, un FT que actúa junto con los FTs de la familia RFX en la regulación directa del cilioma sensorial. Además, nuestros resultados, junto con trabajos anteriores, muestran que los FTs FKH y RFX actúan conjuntamente en la regulación de los cilios tanto móviles como sensoriales, lo que sugiere que esta lógica reguladora podría ser un rasgo evolutivo antiguo anterior a la subespecialización funcional de los cilios. Finalmente, esperamos que los resultados de nuestro trabajo ayuden a entender mejor las bases biológicas de las ciliopatías huérfanas / [CA] Els cilis són estructures eucariotes complexes conservades evolutivament que, projectant des de la superfície de les cèl·lules, exerceixen un gran nombre de funcions biològiques. Els cilis es classifiquen tradicionalment en mòbils o sensorials i en la seua composició intervenen centenars de proteïnes. Aquest conjunt de gens que codifiquen per als components ciliars es coneix com el cilioma. Les mutacions en el cilioma subjauen a un grup cada vegada major de malalties multisistèmiques altament pleiotròpiques denominades globalment com ciliopaties. Aquestes malalties es caracteritzen, entre altres símptomes, per retard mental, defectes sensorials i/o trastorns metabòlics. A pesar que s'estima que 1 de cada 1.000 persones està afectada per aquestes malalties, les bases moleculars de les ciliopaties són encara poc conegudes. L'adequat assemblatge i funcionalitat del cili requereixen de l'expressió estretament coordinada dels components del cili; no obstant això, se sap poc sobre la lògica reguladora que controla la transcripció del cilioma. La majoria dels gens del cilioma són compartits tant per cilis mòbils com sensorials. Els factors de transcripció (FTs) de la família RFX tenen un paper evolutivament conservat en la regulació transcripcional del cilioma tant mòbil com sensorial. En els vertebrats, la transcripció del cilioma mòbil també està regulada directament per FoxJ1, un FT de la família forkhead (FKH). No obstant això, fins hui, es desconeixen els FTs que actuen al costat de RFX en la transcripció del cilioma sensorial en qualsevol organisme. En aquest treball, hem identificat a FKH-8, un FT de la família FKH, com a selector terminal del cilioma sensorial de C. elegans. fkh-8 s'expressa de manera consistent en les seixanta neurones sensorials ciliades de C. elegans, s'uneix a les regions reguladores dels gens del cilioma sensorial, també és necessari per a la correcta expressió dels gens del cilioma i actua de manera sinèrgica amb el conegut regulador mestre de la ciliogènesi DAF-19/RFX. En conseqüència, els mutants per a fkh-8 mostren una àmplia gamma de defectes de comportament en una plètora de paradigmes sensorials, incloent la olfacció, la gustació i la mecano-sensació. Així, hem identificat, per primera vegada, un FT que actua juntament amb els FTs de la família RFX en la regulació directa del cilioma sensorial. A més, els nostres resultats, juntament amb treballs anteriors, mostren que els FTs FKH i RFX actuen conjuntament en la regulació dels cilis tant mòbils com sensorials, la qual cosa suggereix que aquesta lògica reguladora podria ser un tret evolutiu antic anterior a la subespecialització funcional dels cilis. Finalment, esperem que els resultats del nostre treball ajuden a entendre millor les bases biològiques de les ciliopaties òrfenes. / [EN] Cilia are complex evolutionary conserved eukaryotic structures that, projecting from cell surfaces, perform a variety of biological roles. Cilia are traditionally classified into motile or sensory and hundreds of proteins take part in their composition. This set of genes coding for ciliary components is known as the ciliome. Mutations in the ciliome underlie an ever-growing group of highly pleiotropic multisystemic diseases globally termed as ciliopathies. These diseases are characterized, among other symptoms, by mental retardation, sensory defects and/or metabolic disorders. Despite an estimated 1 in 1,000 people affected by these diseases, the molecular bases of the ciliopathies are still poorly understood. Proper cilium assembly and functionality requires the tightly co-regulated expression of ciliary components; however, little is known about the regulatory logic controlling ciliome transcription. Most ciliome genes are shared between motile and sensory cilia. RFX transcription factors (TFs) have an evolutionarily conserved role in the transcriptional regulation of both motile and sensory ciliome. In vertebrates, transcription of motile ciliome is also directly regulated by FoxJ1, a Forkhead (FKH) TF. However, to date, TFs working together with RFX in the transcription of the sensory ciliome are unknown in any organism. In this work, we have identified FKH-8, a FKH TF, as a terminal selector of the sensory ciliome in C. elegans. fkh-8 is consistently expressed within the sixty ciliated sensory neurons of C. elegans, it binds the regulatory regions of the sensory ciliome genes, it is also required for correct ciliome gene expression and acts synergistically with the known master regulator of the ciliogenesis DAF-19/RFX. Accordingly, fkh-8 mutants display a wide range of behavioural defects in a plethora of sensory mediated paradigms, including olfaction, gustation, and mechano-sensation. Thus, we have identified, for the first time, a TF that acts together with RFX TFs in the direct regulation of the sensory ciliome. Moreover, our results, together with previous work, show that FKH and RFX TFs act together in the regulation of both motile and sensory cilia, suggesting this regulatory logic could be an ancient trait pre-dating functional sub-specialization of cilia. Finally, we hope our results could help better understand the biological basis of orphan ciliopathies. / This thesis project has been made possible thanks to a pre-doctoral fellowship from the FPI Programme (BES-2015-072799) conferred by the (now extinct) Spanish Ministry of Economy & Competitivity. The following grants also provided a funding frame throughout the whole research process: “Estudio de los mecanismos transcripcionales que regulan la diferenciación de las neuronas monoaminérgicas y su conservación evolutiva.” SAF2014-56877-R “Dissecting the gene regulatory mechanisms that generate serotonergic neurons and their link to mental disorders.” ERC-St 281920 “Programas de regulación transcripcional asociados a enfermedades genéticas.” SAF2017-84790-R “Regulatory rules and evolution of neuronal gene expression.” ERC-Co 101002203 / Brocal Ruiz, R. (2022). Transcriptional Regulatory Logic of Cilium Formation in C. Elegans [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/181667 / TESIS

En este trabajo de tesis doctoral se ha utilizado el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae para estudiar cómo las células eucariotas responden a nivel molecular y se adaptan eficazmente a cambios en la concentración osmótica del medio. Este hecho suscita gran interés en la industria de las fermentaciones; también en la agricultura, dado el creciente problema de salinidad de los suelos. Los resultados obtenidos a través de la utilización de técnicas bioquímicas y de biología molecular demuestran que en situaciones de estrés, las células de levadura ajustan sus niveles de ergosterol a través de la activación de una compleja cascada de regulación transcripcional. Este descubrimiento ha revelado nuevos datos que ayudan a entender mejor la homeostasis de esteroles. Este proceso es fisiológicamente similar al que ocurre en células de mamíferos, donde es fundamental mantener los lípidos a niveles óptimos, ya que alteraciones en los mismos pueden dar lugar a enfermedades como la obesidad, diabetes tipo 2 o arterioesclerosis. Por otra parte, muchas infecciones fúngicas en individuos inmunodeprimidos se tratan mediante el empleo de drogas que actúan sobre enzimas de la ruta de biosíntesis de ergosterol, lo que sostiene la relevancia del estudio de la regulación de la síntesis de este lípido de membrana. Por último, el análisis genómico mediante ensayos ChIP-Chip y ChIP-Seq de algunos de los principales reguladores implicados en la compleja respuesta a estrés osmótico, aporta nueva información para comprender cómo los organismos, a través de la evolución, han organizado diferentes -pero estrechamente vinculados- módulos de regulación para hacer frente rápidamente a situaciones de estrés. / Martínez Montañés, FV. (2010). Adaptación a estrés osmótico en Saccharomyces cerevisiae: Caracterización genómica de factores de transcripción involucrados y represión de la biosíntesis de ergosterol [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/9311 / Palancia

[ES] Las proteínas DELLA son elementos centrales de la ruta de señalización por giberelinas (GAs), donde actúan como represores de las respuestas a GAs. En angiospermas, se ha observado que las DELLAs interaccionan con cientos de factores de transcripción y otros reguladores transcripcionales, modulando de este modo la expresión génica. Por lo tanto, la participación generalizada de las GAs a lo largo del ciclo vital de las plantas es una consecuencia directa de la promiscuidad de las proteínas DELLA y de su rol como reguladores transcripcionales clave. Aunque las DELLAs se encuentran en todas las plantas terrestres, solo son reguladas por GAs en traqueofitas, en las cuales se han centrado la mayoría de los estudios previos. El trabajo aquí presentado pretende descifrar en qué punto de la evolución las DELLAs adquirieron las características moleculares que las convierten en "hubs", y qué ventajas biológicas podrían estar relacionadas con la evolución de las DELLAs. En el primer capítulo, describimos análisis comparativos de redes de co-expresión génicas asociadas a DELLA en especies vasculares y no vasculares, y proponemos que las DELLAs tienen un papel crítico en la conformación de panoramas transcripcionales. Desde su aparición en el ancestro de las plantas terrestres, conectaron múltiples programas transcripcionales que serían independientes sin ellas, mejoraron la eficiencia de la transmisión de información y aumentaron el nivel de complejidad en la regulación transcripcional. También observamos que este efecto se incrementó tras su integración en la señalización por GAs. En el segundo capítulo, proporcionamos pruebas experimentales más sólidas que extienden esta conclusión. Usando una combinación de rastreos de doble híbrido en levadura dirigidos, con DELLAs de diferentes posiciones en el linaje vegetal, y complementación heteróloga en plantas de Arabidopsis y Marchantia, mostramos que la promiscuidad es una característica conservada en todas las proteínas DELLA examinadas; lo cual sugiere que esta propiedad puede haber estado codificada en la DELLA ancestral, y después se mantuvo a lo largo de la evolución, con episodios de co-evolución entre las DELLAs y sus interactores. Finalmente, la comparación de dianas transcripcionales de las DELLAs en diferentes especies muestra la llamativa conservación de un pequeño conjunto de funciones reguladas por DELLAs en plantas vasculares y no vasculares -incluyendo la respuesta a factores de estrés-, mientras que análisis comparativos de promotores indican que las dianas específicas de cada especie aparecen mediante al menos dos mecanismos: el establecimiento de nuevas interacciones de la DELLA, y el acceso a nuevos promotores diana a través de interactores conservados. En resumen, proponemos que las DELLAs son proteínas intrínsecamente promiscuas, con propiedades de "hub" en virtualmente todas las plantas, y la conservación de sus dianas transcripcionales depende en gran medida de la evolución de sus interactores. La conservación de las propiedades de "hub" de las proteínas DELLA las convierte en dianas biotecnológicas ideales, ya que la mayoría del conocimiento generado en una especie podría ser fácilmente adaptado a otras especies relativamente lejanas. / [CA] Les proteïnes DELLA són elements centrals de la ruta de senyalització per gibberel·lines (GAs), on actuen com a repressors de les respostes a GAs. En angiospermes, s'ha observat que les DELLAs interaccionen amb centenars de factors de transcripció i altres reguladors transcripcionals, modulant d'aquesta manera l'expressió gènica. Per tant, la participació generalitzada de les GAs al llarg del cicle vital de les plantes és una conseqüència directa de la promiscuïtat de les proteïnes DELLA i del seu rol com a reguladors transcripcionals clau. Tot i que les DELLAs es troben en totes les plantes terrestres, només són regulades per GAs en traqueofites, en les quals s'han centrat la majoria dels estudis anteriors. El treball ací presentat pretén desxifrar en quin punt de l'evolució les DELLAs van adquirir les característiques moleculars que les converteixen en "hubs", i quins avantatges biològics podrien estar relacionats amb l'evolució de les DELLAs. En el primer capítol, descrivim anàlisis comparatius de xarxes de co-expressió gèniques associades a DELLA en espècies vasculars i no vasculars, i proposem que les DELLAs tenen un paper crític en la conformació de panorames transcripcionals. Des de la seua aparició en l'ancestre de les plantes terrestres, van connectar múltiples programes transcripcionals que serien independents sense elles, van millorar l'eficiència de la transmissió d'informació i augmentar el nivell de complexitat en la regulació transcripcional. També observem que aquest efecte es va incrementar després de la seua integració en la senyalització per GAs. En el segon capítol, proporcionem proves experimentals més sòlides que estenen aquesta conclusió. Usant una combinació de rastrejos de doble híbrid en rent dirigits, amb DELLAs de diferents posicions en el llinatge vegetal, i complementació heteròloga en plantes d'Arabidopsis i Marchantia, vam mostrar que la promiscuïtat és una característica conservada en totes les proteïnes DELLA examinades; la qual cosa suggereix que aquesta propietat pot haver estat codificada en la DELLA ancestral, i després es va mantenir al llarg de l'evolució, amb episodis de co-evolució entre les DELLAs i els seus interactors. Finalment, la comparació de dianes transcripcionals de les DELLAs en diferents espècies mostra la cridanera conservació d'un petit conjunt de funcions regulades per DELLAs en plantes vasculars i no vasculars -incloent la resposta a factors de estrès-, mentre que anàlisis comparatius de promotors indiquen que les dianes específiques de cada espècie apareixen mitjançant al menys dos mecanismes: l'establiment de noves interaccions de la DELLA, i l'accés a nous promotors diana a través d'interactors conservats. En resum, proposem que les DELLAs són proteïnes intrínsecament promíscues, amb propietats de "hub" en virtualment totes les plantes, i la conservació de les seues dianes transcripcionals depèn en gran mesura de l'evolució dels seus interactors. La conservació de les propietats de "hub" de les proteïnes DELLA les converteix en dianes biotecnològiques ideals, ja que la majoria del coneixement generat en una espècie podria ser fàcilment adaptat a altres espècies relativament llunyanes. / [EN] DELLA proteins are central elements of the gibberellin (GA) signaling pathway, where they act as repressors of GA responses. In angiosperms, DELLAs have been shown to interact with hundreds of transcription factors and other transcriptional regulators, thereby modulating gene expression. Hence, the widespread involvement of GAs along the plant life cycle is a direct consequence of the promiscuity of DELLA proteins and their role as key transcriptional regulators. Although DELLAs can be found in all land plants, they are only regulated by GAs in tracheophytes, where most of the previous studies have been focused. The work presented here aims to decipher at which point in evolution did DELLAs acquired the molecular features that render them as 'hubs', and what biological advantages could be related with DELLA evolution. In the first chapter, we describe comparative analyses of DELLA-associated gene co-expression networks in vascular and non-vascular species and propose that DELLAs have a critical role in the conformation of transcriptional landscapes. Upon their emergence in the ancestor of land plants, they connected multiple transcriptional programs that would be independent without them, improved the efficiency of information transmission and increased the level of complexity in transcriptional regulation. We also observed that this effect was enhanced after their integration in GA signaling. In the second chapter, we provide stronger experimental evidence that extends this conclusion. Using a combination of targeted yeast two-hybrid screenings with DELLAs from different positions in the plant lineage, and heterologous complementation in Arabidopsis and Marchantia plants, we show that promiscuity is a conserved feature in all the examined DELLA proteins, which suggests that this property might have been encoded in the ancestral DELLA, and then maintained along evolution, with episodes of co-evolution between DELLAs and their partners. Finally, comparison of DELLA transcriptional targets in different species shows a striking conservation of a small set of functions regulated by DELLAs in vascular and non-vascular plants -including the response to stress factors-, while comparative promoter analysis indicates that species-specific DELLA targets emerge through at least two mechanisms: establishment of novel DELLA interactions, and the access by conserved partners to new target promoters. In summary, we propose that DELLAs are intrinsically promiscuous proteins, with hub properties in virtually all land plants, and the conservation of their transcriptional targets largely depends on the evolution of their interactors. The conservation of the hub properties of DELLA proteins makes them ideal biotechnological targets, as most of the knowledge generated in one species could be readily adapted to other relatively distant species. / Esta tesis doctoral ha sido posible gracias a un contrato predoctoral FPU del Ministerio de Educación (FPU2014-01941). / Briones Moreno, A. (2020). Evolution of DELLA proteins as transcriptional hubs in plants [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/159378 / TESIS

Els factors de transcripció de la família Snail són fonamentals en la "transició epiteli-mesènquima", procés morfogènic essencial en el desenvolupament embrionari i en els fenòmens metastàsics tumorals.En els mamífers l'activitat d'Snail és modulada per dos mecanismes. (i) En el promotor humà es troben regions definides de resposta a factors repressors, predominants en les cèl·lules epitelials, i elements diferenciats de resposta a inductors de la "transició epiteli-mesènquima". (ii) L'activitat d'Snail és condicionada també per la seva localització subcel·lular, modulada per mecanismes no transcripcionals: la fosforilació d'Snail determina si és o no exclós del nucli. Al citosol no pot actuar com a repressor transcripcional però pot interaccionar amb la xarxa microtubular, que estabilitza i en condiciona el dinamisme. Això coincideix amb l'activació de la GTPasa RhoA i la reorientació dels filaments de vimentina, fets associats a l'adquisició de capacitat migratòria. L'efecte com a repressor transcripcional i la modulació del dinamisme microtubular són possiblement esdeveniments coordinats necessaris per al rol biològic d'Snail en mamífers. / Snail family of transcription factors is fundamental to the "epithelial-mesenchymal transition", morphogenic process essential to embryonic development and metastatic phenomena in tumors.Snail's activity is modulated in two ways in mammals. (i) The human promoter harbors definite regions that respond to repressor factors, which prevail in epithelial cells; and differentiated elements that respond to known inducers of the "epithelial-mesenchymal transition". (ii) Snail's activity is also conditioned by its subcellular localization, mechanism not dependent on its transcriptional control: Snail phosphorylation determines whether Snail is excluded or not from the nucleus. When in the cytosol, Snail is unable to act as a transcriptional repressor, but however binds to the microtubular meshwork, which becomes stabilized and whose dynamism is conditioned as a result. This fact coincides with the activation of the RhoA GTPase and reorientation of vimentin filaments, both phenomena being related to the acquisition of cell motility. The transcriptional repressor and the microtubule dynamics effects are probably two coordinated events necessary to Snail's biological role in mammals.