Orientador: Liana Maria Cardoso Verinaud / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T19:49:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Souto_PaulaCristinadeSouza_D.pdf: 7669317 bytes, checksum: eeec29689d95e50ddec45928c2c76343 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico que cresce na forma miceliar a temperatura ambiente e na forma de levedura a 35-37ºC. Recentemente, no laboratório de Imunopatologia do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biologia da Unicamp, foi observado que uma amostra da cepa virulenta Pb18 crescia de forma diferente das outras. A análise preliminar desta cultura mostrou que o fungo se apresentava, exclusivamente, em formas intermediárias entre levedura e micélio. Assim, este trabalho teve como objetivo a caracterização parcial deste isolado atípico através da comparação com a cepa selvagem. Para tanto, foram analisados: a morfologia do isolado a 25 e 37ºC; a composição de proteínas de parede celular; o desenvolvimento da doença e a resposta imunológica adaptativa em camundongos BALB/c. Os resultados mostraram que este isolado não alterou a sua forma de crescimento, independente da temperatura de cultivo ou da passagem por animal. Através da análise das proteínas de parede celular observou-se ausência de expressão de algumas proteínas e baixa concentração da glicoproteína 43 (gp43) no fungo atípico quando comparado com o selvagem. A infecção causada por este isolado atípico foi mais branda do que aquela observada com a cepa virulenta Pb18, com completa resolução das lesões de disseminação. Entretanto, não foi possível determinar diferenças na avaliação da resposta imune adaptativa dos animais infectados com os diferentes isolados. Apesar da necessidade de mais estudos, estes resultados indicam que o isolado atípico pode vir a ser uma importante ferramenta para o estudo da biologia do fungo e sua relação com o hospedeiro / Abstract: P. brasiliensis is a dimorphic fungus that grows in mycelial phase at room temperature and in yeast form at 35-37°C. Recently, in the Immunopathology Laboratory of the Department of Microbiology and Immunology (Biology Institute/Unicamp), it was observed that a sample of the virulent strain Pb18 grew in a different way from other ones. Preliminary analysis of this culture showed that the isolated exhibited, exclusively, an intermediate form of pseudohyphae. That way, the objective of this work was the partial characterization of the atypical isolated (Pb18PH) through the comparison with the wild strain Pb18. For this, there were analyzed: the morphology of the isolated to 25 and 37ºC; the composition of cell wall proteins; the disease development and the adaptative immune response in BALB/c mice. The results showed that Pb18PH didn't alter their growth form, independently of the cultivation temperature or the passage through animal. By the analysis of the cell wall proteins, it was observed that Pb18PH didn't express some proteins and presented low concentration of the glicoprotein 43 (gp43) when compared with the wild one. The infection caused by this atypical isolated was softer than that observed with the virulent strain Pb18. Besides, it was noted the complete resolution of disseminated lesions. However, it was not possible to determine differences in the adaptative immune response evaluation of the animais infected with the different isolated. To despite the need of more studies about this atypical isolated, our results indicate that Pb18PH would come to be an important tool for the study of the fungus biology and their relationship with the host / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T18:42:14Z No. of bitstreams: 2 Tese - Luiz Augusto Pereira - 2008.pdf: 11628724 bytes, checksum: 97ca17282a858a05078e31d8a06bfefe (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-01-29T18:42:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Luiz Augusto Pereira - 2008.pdf: 11628724 bytes, checksum: 97ca17282a858a05078e31d8a06bfefe (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-29T18:42:52Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Luiz Augusto Pereira - 2008.pdf: 11628724 bytes, checksum: 97ca17282a858a05078e31d8a06bfefe (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2008-09-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioides brasiliensis, an important human pathogen causative of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with broad distribution in Latin America. Adhesion to and invasion of host cells are essential steps involved in the infection and dissemination of pathogens. Furthermore, pathogens use their surface molecules to bind to host extracellular matrix components to establish infection. An adhesin of P. brasiliensiswas isolated from two dimensional electrophoresis and characterized. Peptides obtained by partial sequencing of the isolated protein, which presenteda molecular mass of 29 kDa and pI 5.8, were subjected to sequence analysis of their amino acids, that revealed strong homology to triose phosphate isomerase (TPI) from several sources. The complete cDNA and gene encoding TPI of P. brasiliensis (PbTPI) were characterized and both contained an open reading frame predicted to encode a 249 amino acid protein that presented all the peptides characterized in the native PbTPI. The complete coding PbTPI cDNA was cloned and over expressed in Escherichia coli host. The purified recombinant TPI was used to produce polyclonal antibody in rabbit. By immunoelectron microscopy and Western blot analysis, TPI was detected in the cell wall and the cytoplasm of the yeast phase of P. brasiliensis. The expression of PbTPI was analyzed in transition from mycelia to yeast phase. The native PbTPI is preferentially expressed in the yeast parasitic phase of P. brasiliensis. The recombinant PbTPI was found to bind to laminin and fibronectin in ligand far-Western blot assays. TPI binds preferentially to laminin, as determined by peptide inhibition assays. Of special note, the treatment of P. brasiliensisyeast cells with anti-PbTPI polyclonal antibody and the incubation of pneumocytes and VERO cells with the recombinant protein promoted inhibition of adherence and internalization of P. brasiliensisto those in vitrocultured cells. These observations indicate that TPI could be contribute to the adhesion of the microorganism to host tissues and to the dissemination of infection. / Paracoccidioides brasiliensis é um importante patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica com ampla distribuição na América Latina. A adesão e a invasão de células são eventos essenciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. Para isso, patógenos utilizam suas moléculas de superfície para se ligar a componentes da matriz extracelular e estabelecer a infecção. Uma proteína antigênica de P. brasiliensisfoi isolada a partir do gel de eletroforese bidimensional de proteínas totais do fungo e caracterizada. Peptídeos obtidos por sequenciamento parcial da proteína de 29 kDa e pI 5.8 mostraram homologia com triose fosfato isomerase (TPI) de diversos organismos. O cDNA e o gene completos que codificam para TPI de P. brasiliensis (PbTPI) foram caracterizados, e ambos contém uma ORF que codifica para uma proteína com 249 aminoácidos que apresenta todos os peptídeos caracterizados na PbTPI nativa. O cDNA completo que codifica para PbTPI foi expresso em Escherichia coli. A proteína recombinante TPI foi utilizada para produção de anticorpo policlonal em coelho. Através de imunomicroscopia de transmissão eletrônica e análises por Western blotting, foi detectada a presença da TPI, na parede celular de leveduras de P. brasiliensis e no citoplasma. A expressão da PbTPI foi analisada na transição das fases de micélio para levedura. A PbTPI nativa está preferencialmente expressa na fase parasitária de P. brasiliensis. A PbTPI recombinante foi capaz de se ligar a laminina e fibronectina em ensaios de Western blotting de afinidade. PbTPI se liga preferencialmente a laminina, como foi determinado por ensaio de inibição com peptídeos sintéticos. Uma observação importante, é que tanto o tratamento de P. brasiliensiscom anticorpo anti-PbTPI, quanto de pneumócitos e células VERO tratados com a TPI recombinante, promoveram considerável inibição da aderência e internalização de P. brasiliensisàs células cultivadas in vitro. Essas observações indicam que a TPI possivelmente contribui para a adesão do microrganismo aos tecidos do hospedeiro e para a disseminação da infecção.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Este estudo relaciona aspectos sobre conservação de peixes-boi (Trichechus inunguis) e ariranhas (Pteronura brasiliensis) no baixo rio Branco, Parque Nacional do Viruá, Roraima. O objetivo geral foi verificar o estado de conservação e saber se existem ameaças em contra destas espécies. O estudo foi desenhado em duas partes: entrevistas aos antigos moradores e pescadores da região e verificação destes dados num transecto de 53 km pelo rio Iruá. Quanto às entrevistas foram utilizados testes de qui-quadrado para saber se há homogeneidade nas respostas. Os resultados mostram que as pessoas têm um bom conhecimento sobre os locais de uso, e alguns comportamentos das espécies. Ressacas, lagos e remansos foram os locais mais mencionados para o peixe-boi, assim como barrancos e igapós para as ariranhas. Rastros de consumo em Ciperáceas subaquáticas são os sinais de presença mais fortes no rio iruá da ocorrência do peixe-boi. Tocas latrinas e paradouros distribuídos em barrancos e igapós mostram que ariranhas utilizam bem o canal do rio, tendo uma ocupação de 23% delas. São discutidos aspectos relacionados à Unidade de Conservação e ao entorno dela. Por enquanto, peixes-boi e ariranhas não estão ameaçadas na área de estudo, mas, devem ser intensificadas as ações de controle e fiscalização, apoiados os estudos in situ com estas espécies, e divulgados programas de educação ambiental e sensibilização tanto a nível local como do estado de Roraima.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Este estudo é sobre aspectos ecológicos de ariranhas (Pteronura brasiliensis) do baixo rio Branco, Parque Nacional do Viruá, Roraima. O objetivo geral foi verificar se os parâmetros ecológicos da comunidade estudada uso do espaço e comportamento são semelhantes às demais comunidades de ariranhas relatadas na literatura. O estudo foi conduzido num transecto de 53 km no rio Iruá, da foz para montante. Foi possível identificar os espaços utilizados para tocas, latrinas e paradouros. As ariranhas utilizam os seguintes locais: margens dos rios e barrancos do dique marginal para construção de tocas; áreas expostas sobre o barranco são limpas para servirem de latrinas; e os bancos de areias e troncos são usados para descanso ou patrulhamento das áreas (paradouros). Foram observadas 1-4 entradas por toca, cuja forma é oval. Com relação à freqüência de uso das tocas, 23% destas estavam sendo ocupadas pelas ariranhas. Cerca de 25% das latrinas estavam associadas às tocas. Foram identificados 4 grupamentos de tocas no transecto. As tocas foram categorizadas como uso (9), em desuso (23) e destruídas (5). Os grupos de ariranhas foram observados em 13 ocasiões (avistamentos), variando entre 1-12 indivíduos por grupo. A freqüência de avistamentos foi 1 a cada 8 km aproximadamente. Foram identificados dois grupamentos de ariranhas, o primeiro perto da foz, composto por até 5 indivíduos; o segundo grupamento mais distante da foz, com grupos compostos por mais de 5 indivíduos. Entre os dois grupos há uma área onde não foram avistadas ariranhas. Dois tipos de expressões comportamentais foram observados nas ariranhas, com relação a vocalização e movimentos do corpo. São discutidos aspectos relacionados a estes parâmetros; no geral os padrões observados nos grupos de ariranhas da área de estudo concordam com a literatura.

Orientadores: Ronei Luciano Mamoni, Maria Heloisa de Souza Lima Blotta / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-19T12:51:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paiao_MunirRegini_M.pdf: 7191608 bytes, checksum: f8a5e81d9fd9e880ec841934fe773e2d (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A participação de células produtoras de IL-17 (Th17) na resposta imunológica contra infecções causadas por fungos tem sido recentemente objeto de grande interesse. A principal função da IL-17 é a ativação e atração de neutrófilos para o local de infecção. Lesões de pacientes com paracoccidioidomicose (PCM), a micose sistêmica mais importante no Brasil, são caracterizadas por um infiltrado inflamatório rico em neutrófilos. Entretanto, neutrófilos de pacientes com PCM apresentam uma resposta fungicida diminuída, quando comparada à observada em indivíduos saudáveis. O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito do tratamento com IL-17 e IL-23 sobre a atividade fungicida, bem como sobre a capacidade migratória e inflamatória de neutrófilos. Neutrófilos de indivíduos saudáveis e de pacientes com a forma adulta multifocal da doença foram isolados e estimulados com citocinas recombinantes (rh-IL17 e/ou rh-IL23). Após o estímulo as células foram avaliadas quanto a expressão de receptores de quimiocinas (CXCR1 e CXCR2) e moléculas de adesão (CD54 e CD62L). Os neutrófilos também foram avaliados quanto a sua capacidade de adesão em Células Endoteliais Pulmonares Humanas (HLEC), sua resposta migratória a diferentes concentrações de CXCL8 e sua capacidade fungicida, e sobre a produção de H2O2, matriz metaloproteinase 9 (MMP-9) e citocinas inflamatórias (IL-6, TNF-? e IL-1?). Os resultados demonstraram que células estimuladas com IL-17 e/ou IL-23 apresentaram uma expressão aumentada de receptores de quimiocina e moléculas de adesão, associadas com uma capacidade aumentada de adesão e migração. Além disso, observamos que neutrófilos estimulados com ambas as citocinas exibiram uma antifúngica diminuída relacionada com produção diminuída de H2O2, ao lado de uma produção aumentada de MMP-9, IL-6 e IL-1?. Os dados obtidos nos permitem concluir que citocinas relacionadas à resposta Th17 (IL-17 e IL-23) podem desempenhar um papel importante na contenção da infecção causada pelo P. brasiliensis, uma vez que predominam em sua forma mais branda e localizada, a forma adulta. Essas citocinas poderiam atuar de forma semelhante àquela observada em outras infecções fúngicas, induzindo uma resposta inflamatória local e ativando células do sistema imunológico inato. Apesar de sua importância, a produção crônica dessas citocinas, e sua atuação sobre os neutrófilos, podem induzir uma resposta inflamatória exacerbada que em última instância seria responsável pela destruição tecidual observada principalmente nas formas crônicas da doença / Abstract: The participation of IL-17 producing cells in the immune response to fungi has been recently described. The main function of IL-17 is the activation and attraction of neutrophils to infection sites. Lesions of patients with paracoccidioidomycosis (PCM), the most important systemic mycosis in Brazil, are characterized by an inflammatory infiltrate rich in neutrophils, that shows an impaired fungicidal activity when compared to cells from healthy individuals. The aim of this study was to evaluate the effect of IL-17 and IL-23 on the fungicidal activity, as well as on the migratory and inflammatory ability of neutrophils. Neutrophils from healthy controls and patients with the multifocal adult form of PCM were isolated and stimulated with rhIL-17 and/or rhIL-23. Stimulated cells were evaluated for their expression of chemokine receptors (CXCR1 and CXCR2), and adhesion molecules (CD54 and CD62L), as well as, for their capacity of adhesion on Human Lung Endothelial Cells (HLEC) and for their migratory ability in response to CXCL8. We also evaluated the effect of these cytokines treatment on fungicidal activity and on the production of H2O2, matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and inflammatory cytokines (IL-6, TNF-alpha and IL-1-beta). Neutrophils exposed to IL-17 and/or IL-23 increased their expression of CXCR1 and CXCR2 and adhesion molecules, which were associated with an increased adhesive and migratory capacity. Furthermore, the treatment of neutrophils with IL-17 and IL-23 had a suppressive effect on their fungicidal activity, characterized by a diminished production of H2O2, but increased their production of MMP-9 and inflammatory cytokines. These data indicate that Th17 related cytokines (IL-17 and IL-23) can participate in the initial resistance to the infection caused by P. brasiliensis, once they are predominant in the milder and localized form of the disease, the adult form. As in other fungal infections, IL-17 (and IL-23) can induce a local inflammatory response and the activation of innate immune cells. However, when chronically produced these cytokines can induce an exacerbated inflammatory response, mainly acting on neutrophils, which can be responsible for the tissue damage observed in the chronic form of the disease / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

No description available.

Estudos em nosso laboratório caracterizaram camundongos B10.A como susceptíveis e camundongos A/J como resistentes à infecção pulmonar pelo P. brasiliensis. Para investigar o papel das células PMN na paracoccidioidomicose (PCM) pulmonar, camundongos B10.A e A/J foram depletados destas células através da inoculação in vivo por via intraperitoneal (i.p.) do anticorpo monoclonal anti-células PMN e infectados pela via intratraqueal (i.t.) com um milhão de leveduras viáveis. Camundongos-controle receberam doses equivalentes de IgG normal de rato. A depleção de granulócitos diminuiu o tempo de sobrevida dos animais B10.A, mas não dos animais A/J. Quando comparados com os animais não depletados, camundongos resistentes apresentaram aumento da carga fúngica no pulmão somente no dia 7 pós-infecção. Ao contrário, camundongos susceptíveis depletados de PMN apresentaram números mais elevados de células leveduriformes no pulmão, fígado e baço nos dias 7, 15, 30 e 120 pós-infecção, com relação aos seus grupos-controle tratados com IgG. A depleção dos granulócitos, entretanto, não alterou as reações de hipersensibilidade do tipo tardio (HTT) desenvolvidas por ambas as linhagens de animais. Considerando a resposta imune humoral, a depleção de células PMN levou à maior produção de anticorpos específicos em animais B10.A (Ig Total, IgG1, IgA e IgG3) e em animais A/J (Ig Total, IgG2a, IgG2b e IgG3). A depleção também alterou o padrão de citocinas pulmonares. Nos animais B10.A-tratados foram encontradas concentrações mais elevadas de IL-12 aos 15 dias e de IL-4 aos 120 dias pós-infecção, em comparação aos animais controle. Níveis de IL-12 significativamente mais altos foram detectados no grupo de animais A/J-depletados aos 7 e 120 dias e o IFN-γ foi detectado em níveis mais elevados em todo o curso da doença. Então, a depleção de PMN induz níveis mais altos de anticorpos e um ambiente mais pró-inflamatório no local da infecção. De acordo com esses dados, pudemos verificar que os neutrófilos são células importantes na defesa do hospedeiro à infecção pelo P.brasiliensis. Entretanto, o efeito protetor desta população celular depende do patrimônio genético do hospedeiro e é mais marcante na linhagem susceptível de camundongos. Neste trabalho também investigamos o efeito da depleção in vivo de leucócitos PMN na imunidade adquirida e protetora desenvolvida pela pré-imunização de animais B10.A. Assim, os camundongos foram previamente imunizados pela via s.c., depletados ou não de células PMN e desafiados i.t. com 1 milhão de células leveduriformes. Não foram detectadas diferenças significativas na contagem de fungos viáveis do pulmão, fígado e baço, entre os grupos imunizados tratados ou não com o AcM anti-PMN. A depleção não alterou a produção de anticorpos específicos, porém aumentou significativamente a síntese de IL-3, bem como a reatividade de HTT. Portanto, nossos resultados mostraram que, diferentemente da imunidade natural, os leucócitos PMN não exercem um papel protetor na fase adquirida da resposta imune à infecção com o P.brasiliensis. / Previous studies in our laboratory defined susceptible (B10.A) and resistant (A/J) mice to pulmonary P.brasiliensis infection. To investigate the role of PMN cells in pulmonary PCM, resistant and susceptible mice were depleted in vivo of these cells by intraperitoneal (i.p.) injection of a granulocyte-depleting monoclonal antibody and infected intratracheally (i.t) with one million yeast cells. Control mice received equivalent doses of normal rat IgG. PMN depletion decreased survival times of B10.A, but not of A/J infected mice. When compared with the non-depleted counterparts, resistant mice presented increased fungal loads in the lung only at day 7 after infection. On the contrary, PMN-depleted susceptible mice presented higher number of yeast cells in the lung, liver and spleen at days 7, 15, 30 and 120 after infection than their IgG-treated controls. PMN cells depletion, however, did not alter the DTH reaction developed by both mouse strains. Regarding humoral immune response, PMN cells depletion caused increased production of specific antibodies in B10.A (Total Ig, IgG1, IgA and IgG3) and A/J (Total Ig, IgG2a, IgG2b and IgG3) mice. Levels of pulmonary cytokines were also altered after PMN depletion. B10.A-treated mice presented increased levels of IL-12 and IL-4 at days 15 and 120 post-infection, respective/y. In A/J-depleted mice, augmented levels of IL-12 were detected at days 7 and 120 after infection; IFN-γ, however, was produced in higher levels during whole course of infection. Thus, PMN depletion induces higher levels of specific antibodies and enhanced pro-inflammatory milieu at the site of infection. As a whole, our data on PMN depletion at the onset of infection showed that neutrophils are important cells in host defense to P.brasiliensis infection. However, the effect of PMN depletion depends on the genetic background of the host and has a more pronounced effect in the susceptible strain of mice. We have also assessed the effect of in vivo depletion of the leukocytes on the acquired phase of immunity developed by B10.A mice previously immunized by the subcutaneous (s.c.) route were depleted or not of PMN cells and challenged i.t. with one million yeast cells. No differences were detected in the CFU counts in the lung, liver and spleen between untreated and PMN depleted vaccinated mice. PMN depletion also did not alter the production of specific antibodies but enhanced IL-3 synthesis as well as DTH reactivity. In conclusion, our results showed that, differently from natural immunity, PMN cells do not play a protective role in the acquired phase of immune response to P.brasiliensis infection.

A hiporreatividade das células T observada na resposta imune a antígenos de P. brasiliensis de pacientes com paracoccidioidomicose ativa deve contribuir para o não controle da doença, levando à disseminação do fungo. É, na maioria das vezes, reversível com tratamento antifúngico. Os mecanismos que levam a esta hiporreatividade não são bem conhecidos. No entanto, foram demonstrados em resultados prévios em nosso laboratório que células mononucleares de pacientes frente a gp43 apresentam níveis elevados de apoptose. Para tentarmos explicar esse mecanismo, nossa primeira hipótese foi de avaliar se a ativação celular desses pacientes estavam sendo prejudicada por uma ativação inadequada induzida pela expressão alterada de moléculas co-estimulatórias como CD80, CD86, CD28, CD152, ICOS e PD-1. A expressão dessas moléculas foi avaliada em células T e monócitos de pacientes com doença ativa (n = 7...) e controles curados (n = 2...) de um episódio prévio de PCM, mantidas em cultura com antígeno metabólico de Candida albicans (CMA), gp43 ou sem estímulo após 4 dias em cultura. Os resultados obtidos demonstraram que a expressão do CD28 foi comparável entre doentes e controles, e que a expressão de CD152, PD-1 e ICOS, que preferencialmente exercem um papel negativo na sinalização celular, foi maior em células T de pacientes, estimuladas ou não, quando comparadas com células de indivíduos controles. Em paralelo, foram realizados experimentos com a adição dos respectivos anticorpos bloqueadores, que, no entanto, não restabeleceu a proliferação celular dos pacientes. A expressão das moléculas CD80 e CD86 na superfície dos monócitos foi similar em pacientes e controles. Já a expressão dessas moléculas na superfície de linfócitos foi maior nos pacientes tanto em células estimuladas como não estimuladas. O bloqueio com os respectivos anticorpos no dia 0 inibiu a resposta tanto com gp43 como com CMA, porém de forma diferenciada. Nos pacientes e controles a inibição da molécula CD86 diminuiu a resposta tanto para gp43 como para CMA e a inibição da molécula CD80 diminuiu a resposta proliferativa apenas para gp43, e somente no grupo controle, sugerindo que os diferentes antígenos exigem diferentes moléculas durante o processo de apresentação antigênica. A adição desses anticorpos no 4o dia da cultura não modificou a resposta linfoproliferantiva dos pacientes e controles. Nossos dados favorecem a hipótese, derivada de outros modelos de exposição crônica a antígenos exógenos, de que a exposição repetida a antígenos de P. brasiliensis por um longo período in vivo, verificada nos pacientes com paracoccidioidomicose, levam as células T a um estado de tolerância adaptativa, que dificilmente é revertida in vitro. A partir desses resultados analisamos a participação da apoptose de células T nesse provável estado de tolerância nas células dos pacientes. Observamos que a expressão da molécula anti-apoptótica Bcl-2 está diminuída nas células T de pacientes previamente estimuladas comparadas com as células dos controles, e mesmo após o reestímulo in vitro a diminuição da expressão dessa molécula persiste. Desta forma, a diminuição da expressão da molécula Bcl-2 ex vivo nas células T de pacientes sugere fortemente que essas células estão vulneráveis a apoptose. Para corroborar esta hipótese, analisamos a expressão das caspases 8 e 9 na forma ativa. Inicialmente, analisamos a expressão destas moléculas em células mononucleares de pacientes e controles mantidas em cultura por 4 dias com e sem estímulo de CMA e gp43 e observamos que as células dos controles expressam maiores níveis de ambas moléculas em relação as células dos pacientes. Esses resultados foram surpreendentes uma vez que o aumento da expressão de moléculas que estariam direcionando as células para apoptose era esperado em células de pacientes e não de controles. Para explicar este resultado sugerimos a possibilidade (hipótese já apareceu várias vezes) de que as células dos pacientes poderiam estar entrando em apoptose num estágio mais inicial, antes do quarto dia. Por isso realizamos experimentos adicionais em que analisamos a expressão dessas caspases ex vivo. Com essa análise observamos que células TCD3+ de pacientes expressam altos níveis tanto de caspase 8 como caspase 9 comparadas às células de controles. Esses resultados podem ajudar a explicar porque nos ensaios para a análise da resposta proliferativa de pacientes com acréscimo de anticorpos bloqueadores de moléculas coestimulatórias, não houve reconstituição da resposta especifica a gp43: essas células estariam pré-ativadas e pré-programadas para entrarem apoptose, e, portanto, refratárias a tratamentos in vitro, como já descrito em células em estado de tolerância adaptativa. / The T-cell hypoproliferative reactivity observed in the immune response to P. brasiliensis antigens of patients with active paracoccidioidomycosis probably contributes to the failure of the host in controlling the infection, leading to a disseminated disease. It is, however, largely reversible with treatment in most patients. The mechanisms leading to this hyporresponsiveness are not well known. We have previously demonstrated that patients\' mononuclear cells in presence of gp43 exhibit enhanced apoptotic levels. I an attempt to explain such findings, we hypothethized that these cells were inadequately activated due to altered costimulatory molecules expression, such as CD80, CD86, CD28, CD152, ICOS e PD-1. Expression of these molecules were evaluated on T-cells and monocytes of the peripheral blood of patients with active, disseminated PCM (n = 7...), and healthy individuals with a past history of treated and cured PCM (n = 2...). These cells were cultured in presence of a Candida albicans metabolic antigen (CMA), gp43, or kept without exogenous stimuli for 4 days. Our results show tgat the expression of CD28 was comparable between patients an controls\' cells, and that CD152, PD-1 e ICOS, all of which known to deliver negative costimulatory signaling and to arrest cell cycle entry, were overexpressed in patients\' T-cells. In parallel, we performed additional experiments where the respective costimulatory signalings were blocked by addition of blocking antibodies specific to each of these molecules. Whatever the blocking antibody used, there was no reversal of the hypoproliferative state of patients\' T-cells. However, while the expression of the CD80 and CD86 molecules on monocytes was similar between controls and patients, their expression on T-cells was significantly higher in patients. Adding the respective blocking antibodies at day zero of the culture, we could observe that both the gp43 and the CMA responses were inhibited, but differentially according to the antibody employed. In both patients and controls the blocking CD86 signaling decreased the response to gp43 and CMA of patients and controls, while blocking of CD80 signaling decreased only the response to gp43, and only in the control group. These data suggest that different antigens may have different costimulatory requirements for antigen presentation. Addition of the antibodies at the ay 4 of culture did not restore the lymphoproliferative response or modified the response of the controls. Our results suggest that the hypothesis, raised from other models of prolonged foreign antigen exposure, that repetitive and persistent in vivo exposure to fungal antigens, which is described in patients with PCM, lead the T-cells to a adaptive tolerant state, which is hardly reverted in vitro. We then investigated the fate of such putatively tolerized patients\' cells, by analyzing the role that apoptosis may have in this tolerant state. We observed that expression of the antiapoptotic molecule Bcl-2 was lower in patients\' cells, even when the cells were in vitro reestimulated with CMA and gp43, suggesting that the cells are more susceptible to undergo apoptosis. When then analyzed the expression of the active form of the caspase 8 and 9 molecules. We first analyzed their expression on cells kept in cultures for 4 days with or without stimuli. Unexpectedly, we observed that controls\' cells, and not patients\' cells, exhibited higher levels of expression of both molecules. To explore further these data, we tested the hypothesis that the patients\' cells were already undergoing apoptosis at an earlier than 4 days stage. Caspases expression were therefore analyzed ex vivo. In fact, we observed that TCD3+ cells exhibited markedly enhanced caspase 8 and expression as compared to controls\' cells. These findings may help to explain why we failed to redress the proliferative responses to gp43 in the experiments where blocking antibodies were added: these cells would be committed to apoptotic death, thus refractory to in vitro manipulations, as described for adaptively tolerant T-cells.

A lesão granulomatosa é caracterizada como um agregado compacto de fagócitos maduros formado em resposta à um estímulo persistente. Os mediadores pró-inflamatórios da família da IL-1, ao promoverem a ativação da imunidade inata e o remodelamento tecidual descontrolados, geram a fisiopatologia da paracoccidioidomicose, doença pulmonar granulomatosa causada pelo fungo P. brasiliensis. A principal via inflamatória envolvida na secreção de IL-1?, IL-18 e IL-1? é a ativação dos inflammasomas, complexos protéicos conhecidos pela sua capacidade de ativar proteoliticamente a enzima caspase-1. Neste estudo abordamos os mecanismos subjacentes às vias canônica e não canônica do inflamassoma, avaliando a importância funcional das caspases 1, 11 e 8 na resistência do hospedeiro durante a infecção por P. brasiliensis. Demonstramos que a resposta imunológica protetora mediada pelo IFN-?, após a liberação de IL-18 pela via da caspase-1, é o principal mecanismo responsável pelo controle fúngico quando o dano celular desencadeado pelo fungo é reconhecido pelo inflamassoma de NLRP3. No entanto, apesar do papel importante da caspase-1 na maturação da IL-1?, a falta de caspase-1 apenas reduz parcialmente os níveis de IL-1? durante a infecção por P. brasiliensis. Ao contrário do esperado, a deficiência de caspase-11 não prejudicou a produção de IL-1?, mas em vez disso, preveniu, na célula, a morte por piroptose e a secreção IL-1?, citocina importante para restringir o crescimento fúngico através da síntese de IL-17. Por fim, observamos que a ativação de caspase-8 pela sinalização de dectina-1 / Syk, além de mediar a maturação da IL-1?, que acontece de maneira independente de caspase-1 e 11, é necessária também para o funcionamento eficiente da via canônica de caspase-1, demonstrando uma rede interligada entre as vias canônica de caspse-1 e não canônica de caspase-8 para coordenar o processamento da IL-1?. Em conjunto, nossos resultados mostram contribuições distintas das vias canônica e não canônica do inflamassoma na produção de citocinas da família da IL-1, enfatizam a versatilidade desta plataforma em recrutar várias proteínas efetoras para adequar a resposta imunológica antifúngica e evidenciam a complexidade envolvida nas interações patógeno-hospedeiro. / Granuloma is a lesion characterized by a compact aggregate of mature phagocytes arising in response to a persistent stimulus. By driving uncontrolled innate immunity and tissue remodelling, IL-1 family pro-inflammatory mediators govern the pathophysiology of paracoccidioidomycosis, a granulomatous lung disorders caused by Paracocccidioides brasiliensis. A major inflammatory pathway involved in IL-1?, IL-18 e IL-1? secretion is the activation of inflammasomes, large multimolecular complexes best known for their ability to control activation of the proteolytic enzyme caspase-1. In this study we addressed the mechanisms that underlie canonical and non-canonical inflammasome pathways, assessing the functional importance of caspase-1, caspase-11 and caspase-8 in the regulation of inflammasome-mediated host resistance during P. brasiliensis infection. We found that IFN-?-mediated protective immune response following by caspase-1- dependent IL-18 release after is the key mechanism responsible for the fungal control after P. brasiliensis-induced cell damage recognition by NLRP3 canonical inflammasome pathway. Nonetheless, despite the important role of caspase-1 in the IL-1? maturation, the lack of caspase-1 only partially reduced IL-1? levels during P. brasiliensis infection. Unlike caspase-1, caspase-11 deficiency did not impair IL-1? production, cytokine strictly secreted by canonical caspase-1 inflammasome pathway. Instead, P. brasiliensis-triggered caspase-11 activation in an ill-defined manner leads to a rapid pore-mediated cell lysis and is required for IL-1? production during P. brasiliensis infection. IL-1?, in turn, is important for promoting the restriction of fungal growth trough IL-17-based inflammation. Finally, the caspase-8 induction by dectin-1/Syk signaling besides playing a role in mediating the caspase-1/11-independent IL-1? maturation is also required to efficient canonical caspase-1 inflammasome pathway, demonstrating a connected network between non-canonical caspase-8 and canonical caspase-1 inflammasome pathways to coordinate IL-1?. Taken together, our results revealed distincts contributions of both canonical and non-canonical inflammasome pathways in IL-1 family cytokine production and emphasizes the versatility of this platform to recruit several effector proteins to tailor the antifungal immune response, sheding new light on the complexity of this hostpathogen interaction.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:42:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MariaFPV.pdf: 6083202 bytes, checksum: 8b9199df5753800b615ab0a90bae3e8e (MD5) Previous issue date: 2007-12-10 / Heavy metals can cause problems of human poisoning by ingestion of contaminated food, and the environment, a negative impact on the aquatic fauna and flora. And for the presence of these metals have been used for aquatic animals biomonitoramento environment. This research was done in order to assess the environmental impact of industrial and domestic sewage dumped in estuaries potiguares, from measures of heavy metals in mullet. The methods used for these determinations are those in the literature for analysis of food and water. Collections were 20 samples of mullet in several municipality of the state of Rio Grande do Norte, from the estuaries potiguares. Were analyzed the content of humidity, ash and heavy metals. The data were subjected to two methods of exploratory analysis: analysis of the main components (PCA), which provided a multivariate interpretation, showing that the samples are grouped according to similarities in the levels of metals and analysis of hierarchical groupings (HCA), producing similar results. These tests have proved useful for the treatment of the data producing information that would hardly viewed directly in the matrix of data. The analysis of the results shows the high levels of metallic species in samples Mugil brasiliensis collected in Estuaries /Potengi, Piranhas/A?u, Guara?ra / Papeba / Ar?s and Curimata? / Os metais pesados podem provocar problemas de intoxica??o humana pela ingest?o de alimentos contaminados e para o meio ambiente, uma repercuss?o negativa ? fauna e flora aqu?ticas. E para detectar a presen?a destes metais t?m-se utilizado animais aqu?ticos para o biomonitoramento ambiental. Esta pesquisa foi feita com o intuito de se avaliar o impacto ambiental de esgotos dom?sticos e industriais despejados nos estu?rios potiguares, a partir das medidas de metais pesados em tainha. Os m?todos utilizados para estas determina??es s?o aqueles constantes da literatura para an?lise de alimentos e de ?gua. Foram coletas 20 amostras de tainha em diversos munic?pios do Estado do Rio Grande do Norte, oriundas dos estu?rios potiguares. Foram analisados os teores de umidade, cinzas e metais pesados. Os dados foram submetidos a dois m?todos de an?lises explorat?rios: an?lise de componentes principais (PCA), que proporcionou uma interpreta??o multivariada, mostrando que as amostras s?o agrupadas de acordo com as similaridades de teores de metais e an?lise hier?rquica de agrupamentos (HCA), produzindo resultados semelhantes. Estas an?lises mostraram-se ?teis para o tratamento dos dados produzindo informa??es que dificilmente seriam visualizados diretamente na matriz de dados. A an?lise dos resultados mostra os altos teores de esp?cies met?licas em amostras coletadas em tainhas nos Estu?rios Potengi, Piranhas/A?u, Guara?ra/Papeba/Ares e Curimata?